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Biochemistry

Um duplo humanizado BLT-MICE modelo caracterizando um estável humano-como o intestino Microbiome e sistema imunológico humano

doi: 10.3791/59773 Published: August 30, 2019

Summary

Nós descrevemos um método novo para gerar os BLT-ratos humanizados dobro que caracterizam um sistema imune humano funcional e um microbioma humano-como enxertado estável do intestino. Este protocolo pode ser seguido sem a necessidade para ratos germe-livres ou facilidades gnotobióticos.

Abstract

Camundongos humanizados (Hu-camundongos) que apresentam um sistema imunológico humano funcional mudaram fundamentalmente o estudo de patógenos e doenças humanas. Podem ser usados para modelar as doenças que são de outra maneira difíceis ou impossíveis de estudar nos seres humanos ou em outros modelos animais. O microbioma intestinal pode ter um profundo impacto na saúde humana e na doença. No entanto, o microbioma do intestino murino é muito diferente do encontrado em humanos.  Há uma necessidade para os modelos pre-clínicos melhorados do Hu-ratos que têm um microbioma humano enxertado do intestino. Conseqüentemente, nós criamos Hu-ratos dobro que caracterizam um sistema imunitário humano e um microbioma humano-como estável do intestino. Aceno. Os camundongos CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG) são um dos melhores animais para a humanização devido ao seu alto nível de imunodeficiência. No entanto, camundongos NSG livres de germes e vários outros modelos de camundongos sem germes importantes não estão atualmente disponíveis comercialmente. Além disso, muitas configurações de pesquisa não têm acesso a instalações gnotobióticas, e trabalhar condições gnotobióticas muitas vezes pode ser caro e demorado. Importante, os ratos germe-livres têm diversas deficiências imunes que existem mesmo depois que o Engraftment dos micróbios. Conseqüentemente, nós desenvolvemos um protocolo que não exija animais germe-livres ou facilidades gnotobióticos. Para gerar ratos Hu-duplos, camundongos NSG foram tratados com radiação antes da cirurgia para criar camundongos de medula óssea, fígado, Thymus-humanizados (Hu-BLT). Os ratos foram tratados então com os antibióticos do espectro largo para esgotar o microbioma murino pre-existing do intestino. Após o tratamento antibiótico, os camundongos receberam transplantes fecais com amostras de doadores humanos saudáveis via gavagem oral. Os ratos dobro do Hu-BLT tiveram perfis originais do gene de 16S rRNA baseados na amostra fornecedora humana individual que foi transplantada. Importante, o microbioma humano-como transplantado era estável nos ratos dobro do Hu-BLT para a duração do estudo até 14,5 semanas após o transplante.

Introduction

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Camundongos humanizados (Hu-camundongos) transformaram o estudo de muitos aspectos da saúde humana e da doença, incluindo hematopoiese, imunidade, câncer, doença auto-imune e doenças infecciosas1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Estes Hu-ratos têm a vantagem distinta sobre outros modelos do rato que têm um sistema imune humano funcional e podem ser contaminados com os micróbios patogénicos específicos humanos. No entanto, a importância do microbioma intestinal tem sido demonstrada pelo seu papel em muitas doenças humanas, como obesidade, síndrome metabólica, doenças inflamatórias e câncer10,11,12, trezeanos. O sistema imunológico da mucosa e o microbioma intestinal são regulados reciprocamente para manter o intestino e a homeostase sistêmica. O sistema imunológico é moldado por antígenos apresentados pelo microbioma intestinal e reciprocamente o sistema imunológico desempenha um importante papel regulador na promoção de bactérias do intestino comensal e eliminando os patógenos14,15, 16. Entretanto, o microbioma do intestino de Hu-ratos não foi caracterizado bem e o microbioma murino do intestino difere substancialmente na composição e na função dos seres humanos17. Isso se deve às diferenças evolutivas, fisiológicas e anatômicas entre o intestino murino e humano, bem como outros fatores importantes, como a dieta, que podem influenciar os resultados experimentais dos modelos de doença de Hu-camundongos18. Conseqüentemente, além da classificação do microbioma murino do intestino de Hu-ratos, um modelo animal que caracteriza um sistema imunitário humano e um microbioma humano do intestino é necessário estudar as interações complexas da doença humana in vivo.

O estudo de doenças humanas diretamente em indivíduos humanos é muitas vezes impraticável ou antiético. Muitos modelos animais não podem ser usados para estudar patógenos humanos como o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). Os modelos de primatas não humanos são geneticamente superados, muito caros e não são suscetíveis a muitos patógenos humanos. Camundongos que foram derivados como germe livre (GF) e reconstituídos com Ademir intestinais semelhantes a humanos têm sido amplamente utilizados para estudar a saúde humana e a doença19,20. No entanto, estes animais não têm um sistema imunológico humano e trabalhar com animais GF requer instalações especializadas, procedimentos e conhecimentos especializados. Portanto, há a necessidade de melhores modelos pré-clínicos para estudar a complexa relação entre o microbioma intestinal e o sistema imunológico humano. Muitas cepas de camundongos, como NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG), não estão disponíveis comercialmente como GF. Os animais GF também podem sofrer de deficiências imunes de longa duração que não são completamente revertidas pelo Engraftment de micróbios21. Conseqüentemente, nós criamos um Hu-ratos dobro que caracterizam um sistema imune humano funcional e um microbioma humano-como estável do intestino circunstâncias específicas do micróbio patogénico livre (SPF). Para gerar ratos Hu-duplos, a cirurgia foi realizada em camundongos NSG para criar ratos de medula óssea, fígado, Timo humanizado (Hu-BLT). Os ratos de Hu-BLT foram tratados então com os antibióticos do espectro largo e deram então transplantações fecais com uma amostra humana saudável do doador. Nós caracterizamos o microbioma bacteriano do intestino de 173 amostras fecais de 45 ratos dobro do Hu-BLT e 4 amostras de doador fecal humanas. Os ratos dobro do Hu-BLT têm os perfis originais do gene de 16S rRNA baseados na amostra fornecedora humana individual que é transplantado. Importante, o microbioma humano-como transplantado era estável nos ratos para a duração do estudo até 14,5 semanas após o transplante. Além, os metagenomas previstos mostraram que os ratos dobro do Hu-BLT têm a capacidade funcional prevista diferente do que Hu-ratos que é mais similar às amostras do doador humano.

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Protocol

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Todos os métodos aqui descritos foram conduzidos de acordo com os protocolos institucionais de assistência animal e de pesquisa (IACUC) aprovados na Universidade de Nebraska-Lincoln (UNL). O IACUC na UNL aprovou dois protocolos relacionados à geração e utilização de camundongos Hu-BLT, incluindo ratos duplos Hu. Adicionalmente, o Comitê de supervisão de pesquisa científica (SROC) da UNL também aprovou o uso de células-tronco embrionárias humanas e tecidos fetais, que são adquiridos dos recursos avançados de biociência para os estudos de camundongos humanizados (SROC # 2016-1-002).

1. ratos habitação e manutenção

  1. Compra 6-8-Week velhos ratos NSG (NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj).
  2. Abrigar os camundongos condições SPF com troca de ar, pré-filtros e filtros HEPA (0,22 μm) em uma sala com temperatura, umidade e pressão controladas.
    1. Abrigar e manter os camundongos em gaiolas de microisoladores individuais autoclavados em um sistema de rack capaz de gerenciar a troca de ar com pré-filtros e filtros HEPA (0,22 μm).
  3. Realize todos os procedimentos e manipulações dos camundongos em uma capa de fumos de segurança biológica classe II tipo a2 que foi pré-tratada com 70% de etanol. Antes de trabalhar na sala de animais, chuveiro e mudança em esfrega limpa, terno Tyvek, capas de boot, tampa do cabelo, máscara facial, e luvas. Use um vestido de cirurgia sobre o terno Tyvek durante procedimentos cirúrgicos.
    Nota: a descontaminação por luz ultravioleta (UV) também é preferida antes dos procedimentos.
    1. Autoclave todos os instrumentos e reagentes, se possível e depois desinfectar antes de transferir para a capa de fumos.
    2. Durante os procedimentos, remova as gaiolas individualmente ventiladas dos animais do rack e desinfete antes de transferir para a capa de fumaça.
  4. Alimente os ratos uma dieta irradiada e forneça a água autoclavada. Fornecer alimentos irradiados AB libitum e suplemento com alimentos irradiados adicionais, conforme necessário. Mude a água autoclavada semanalmente ou conforme necessário.
    Nota: a água acidificada autoclavada pode igualmente ser usada. A dieta irradiada forneceu um prazo de validade de 6 meses após a manufatura.

2. geração de camundongos BLT humanizados

Nota: a geração de camundongos Hu-BLT tem sido descrita anteriormente22,23,24.

  1. No dia da cirurgia, dê a irradiação do corpo inteiro dos ratos em uma dose de 12 cGy/g do peso corporal.
  2. Prepare os ratos para a cirurgia.
    1. Dê a cada rato irradiado uma mistura de cetamina na concentração de trabalho de 100 mg/kg e xilazina na concentração de 12 mg/kg, que variou de 130-170 μL por rato com base no peso corporal por injeção intraperitoneal (IP) para anestesia. Para preparar 3 ml da mistura de cetamina e xilazina, adicione 0,27 mL de cetamina na concentração de 100 mg/mL e 0, 3 mL de xilazina na concentração de 100 mg/mL a 2,7 mL de soro fisiológico estéril e misture bem. Desinfecte a pele com 70% de isopropanol antes da injecção.
    2. Dê a cada rato irradiado buprenorfina 1 mg/kg de peso corporal (Half-Live 72 h, SR-LAB) por injecção subcutânea para uma gestão da dor de longa duração.
    3. Dê a cada rato irradiado 100 μL (858 μg) de cefazolin por injeção de IP para profilaxia antibiótica pré-operatória.
    4. Raspar o cabelo dos ratos usando cortadores de cabelo elétrico em torno do lado esquerdo lateral e medial do mouse no local cirúrgico mais tarde usado para expor o rim esquerdo.
    5. Verificar o nível adequado de anestesia por pedal Reflex (firme Toe pinch).
    6. Dar gás isoflurano em 3-5% se a anestesia adicional é necessária em qualquer ponto durante a cirurgia.
    7. Aplique a pomada oftálmica a ambos os olhos para impedir o desiccation córneo. Aplique a etiqueta da orelha se necessário.
  3. Realize a cirurgia para implantar os tecidos do fígado e do timo na cápsula renal esquerda.
    1. Desinfecte a pele no local cirúrgico aplicando a esfoliação de iodo a partir do centro do local cirúrgico e movendo-se para o exterior de forma circular. Repita este processo com 70% de isopropanol e uma terceira vez com iodo.
    2. Usando o fórceps, primeiramente carregue um fragmento fetal humano do tecido do fígado em um trocar. Então usando o fórceps, carregue um fragmento fetal humano do tecido do Timo no trocar. Em seguida, usando fórceps, carregar outro fragmento de tecido hepático humano fetal no trocarte. Os tecidos devem ser cortados para 1-1,6 mm3 para caber as dimensões internas do trocarte.
    3. Use fórceps para levantar a pele e usar tesouras para fazer um pequeno corte longitudinalmente. Estender o corte para 1.5-2 cm no lado esquerdo do mouse.
    4. Use fórceps para levantar a camada muscular e usar tesouras para fazer um pequeno corte longitudinalmente. Estenda o corte conforme necessário para expor o rim.
    5. Expor o rim delicadamente agarrando o tecido adiposo em torno do rim. Não toque diretamente no parênquima renal.
    6. Faça uma incisão de 1-2 mm na extremidade posterior da cápsula renal usando um bisturi.
    7. Insira lentamente o trocarte pré-carregado através da incisão paralela ao longo eixo do rim e libere os tecidos entre a cápsula renal e o rim.
    8. Retorne com cuidado o rim e as entranhas a sua posição normal. Use Suturas absorvíveis de 5/0 P-3 (P-13) com a agulha do círculo de 13mm 3/8 para fechar a camada do músculo e grampos cirúrgicos para fechar a pele.
  4. Após a cirurgia, põr o rato em uma gaiola autoclavada limpa do microisolador para a recuperação.
    1. Para minimizar a perda de calor durante a recuperação post-Surgical, põr a gaiola que contem os ratos em uma almofada de aquecimento que seja conectada a uma bomba de água que aqueça e circule a água.
    2. Monitore os ratos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a recumbência esternal.
  5. Dentro de 6 h da conclusão da cirurgia, através da cauda-veia, injete CD34 + pilhas de haste hematopoietic isoladas do tecido fetal humano do fígado.
    1. Aqueça os ratos com uma lâmpada de calor. Desinfecte a cauda com 70% de isopropanol e, em seguida, injectar 1,5 a 5 × 105 células estaminais/200 μl na veia da cauda.
    2. Pare qualquer sangramento da injeção e retorne os camundongos para a gaiola do microisolador e a gaiola do microisolador para o rack de gaiola.
      Nota: os camundongos pós-cirurgia são tipicamente alojados em conjunto, cinco por gaiola de microisolador, durante e após a recuperação. Entretanto, os ratos são alojados somente junto se todos receberam a cirurgia no mesmo dia.
  6. Verifique os ratos diariamente. Monitore cuidadosamente os grampos cirúrgicos e substitua-os conforme necessário. Monitore atentamente os camundongos para qualquer sinal de infecção ou desconforto. Forneça o alimento autoclavado no assoalho da gaiola do microisolador por alguns dias após a cirurgia.
  7. Retire os grampos cirúrgicos 7-10 dias após a cirurgia. Dar gás isoflurano em 3-5% para anestesiizar os camundongos. Retire cuidadosamente os grampos e aplique pomada antibiótica e alívio de dor no local.
  8. Permita 9-12 semanas para a reconstituição de pilhas imunes humanas, a seguir colete o sangue periférico da veia safena medial de cada um dos ratos humanizados.
    1. Contenha ratos conscientes usando uma contenção de cone de plástico apropriadamente dimensionada com uma abertura perto da cabeça do mouse para respirar e uma abertura perto da parte de trás do mouse para isolar uma perna. Coloque os ratos na cabeça do cone de contenção primeiro e, em seguida, puxe suavemente uma perna através da abertura da perna.
    2. Pulverize o lado medial do pé isolado com o isopropanol 70%, a seguir espalhe o antibiótico e a dor-aliviando a pomada no mesmo local.
      Nota: a pomada ajuda a revelar a localização da veia sem a necessidade de depilação e também auxilia na formação de gotas de sangue.
    3. Usando uma agulha de calibre 25 em um ângulo de 90 °, perfure a veia e colete 50-100 μL do sangue usando um tubo revestido EDTA da coleção do sangue. Pare o sangramento aplicando a pressão ao local com gaze estéril. Uma vez que o sangramento parou, retorne os ratos a sua gaiola.
      Nota: os volumes sanguíneos máximos recolhidos são tipicamente 50 μL por semana ou 100 μL a cada duas semanas.
    4. Use o sangue periférico coletado para testar o nível de reconstituição de células imunes humanas usando citometria de fluxo com anticorpos para hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.

3. tratamento antibiótico

  1. Antes do tratamento com antibióticos, colete amostras fecais pré-tratamento. Mova os ratos para uma nova gaiola de microisolador autoclavado.
  2. Prepare um coquetel fresco de antibióticos de largo espectro diariamente.
    1. Prepare 250 mL de água contendo metronidazol preparado na hora (1 g/L), neomicina (1 g/L), vancomicina (0,5 g/L) e ampicilina (1 g/L) para cada gaiola microisoladora de camundongos.
      Nota: Use água esterilizada ou estéril para o antibiótico suplementado água potável.
    2. Adicionar 9,2 g de açúcar de uva mistura de bebida adoçado a 250 mL de água suplementada com antibióticos.
      Nota: o uso de açúcar de uva adoçado mistura de bebidas máscaras o sabor amargo dos antibióticos e ajuda a prevenir a desidratação nos ratos.
    3. Mude o antibiótico e açúcar de uva adoçado Mix bebida suplementada água e colocar os ratos em uma nova gaiola autoclavada diariamente.
      Nota: camundongos são café e mudando as gaiolas diariamente impede que os camundongos de re-inocular-se com as bactérias do intestino.
    4. Para o Engraftment máximo do micróbio humano-como do intestino, forneça antibióticos por 14 dias. Durante o tratamento com antibióticos, monitore os camundongos para perda de peso e desidratação. A perda de peso é esperada durante os primeiros 3-4 dias e planaltos depois que para a duração do tratamento. Se a desidratação ocorrer, dê aos ratos solução salina ou de Ringers através da injeção intraperitoneal.
      Nota: outros protocolos do humanização do microbioma do intestino chamam para o gavagem oral dos antibióticos. Quando eficaz em esgotar as bactérias murino do intestino, nós encontramos que o método menos invasor de adicionar antibióticos à água bebendo põr menos esforço sobre nossos ratos humanizados e conduzido aos melhores resultados.

4. amostras de doadores e transplante fecal

  1. Prepare amostras fecais de doadores humanos.
    1. Use fontes adequadamente preparadas de material de transplante de microbiota fecal (FMT) para transplante fecal nos camundongos humanizados.
    2. Thaw FMT preparações e alíquotas-los em condições anaeróbias em uma câmara anaeróbia.
    3. Se desejado, nesta etapa misture partes iguais das amostras fecais juntas para criar uma amostra "humana" imparcial.
    4. Mantenha o congelamento e descongelamento do material de fmt a um mínimo, se alicitando ou misturar de amostras não é necessário, apenas descongelar imediatamente antes do procedimento.
  2. Transplante fecal humano
    1. Após a conclusão do tratamento antibiótico de 14 dias, mude a água bebendo à água autoclavada e mova os ratos em uma gaiola autoclavada nova. Pare as mudanças diárias da gaiola e implemente uma vez cada calendário de mudança da gaiola de 1-2 semanas.
    2. Dê dois transplantes fecais em 24 e 48 h pós-cessação de antibióticos.
    3. 24 h após o tratamento dos antibióticos, descongelar a quantidade necessária de material de FMT, dê a cada rato 200 μL de material de FMT através da gavagem oral. Repita o procedimento novamente em 48 h pós antibióticos.
    4. Espalhe todo o material FMT descongelado remanescente ou restante na pele dos ratos humanizados ou na cama da gaiola.

5. coleta fecal fresca da amostra

  1. Autoclave sacos de papel individuais antes de transferir para a capa de fumos.
  2. Na capa das emanações, põr um rato em cada saco de papel individual e permita que o rato defecate.
  3. Usando fórceps estéril, colete a amostra fecal em 1,5 mL de tubos plásticos e congele a-80 ° c. Devolva os ratos às gaiolas do microisolador.
    Nota: Este método de coleta de amostras fecais permite a coleta de amostra fecal fresca de camundongos individuais sem qualquer estresse induzindo manipulações.

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Representative Results

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A Figura 1 mostra um contorno dos métodos usados para criar camundongos Double Hu-BLT e descreve brevemente o processo de adição de um sistema imunológico humano funcional e um microbioma intestinal estável, semelhante ao humano, aos camundongos NSG. A Figura 2 mostra um exemplo de análise de citometria de fluxo de sangue periférico de um blt-mouse humanizado 10 semanas após a cirurgia. A Figura 3 mostra a abundância relativa das amostras de doadores fecais humanos usadas para transferir um microbioma intestinal para criar camundongos Hu-duplos. A Figura 4 mostra as alterações fenotípicas induzidas pelo tratamento antibiótico ao baço e cecum, semelhante ao observado em animais livres de germes. A Figura 5 mostra uma parcela da análise do componente principal (PCA) dos dados de sequenciamento do rRNA 16s que revelam os Hu-ratos duplos têm os Ademir humanos-como do intestino que são originais à amostra do doador humano.

Figure 1
Figura 1 : Criação de camundongos BLT humanizados duplos. A criação de camundongos Double Hu-BLT é um processo de duas etapas. O primeiro passo é entransplantar o sistema imunológico humano para os camundongos NSG. No dia da cirurgia, os camundongos NSG recebem irradiação para criar um nicho para células-tronco. Os camundongos são então implantados com tecidos de fígado e Timo fetal humano e injetados com células-tronco hematopoiéticas humanas. A reconstituição da célula imune humana é verificada em torno de 10 semanas após a cirurgia.  A segunda etapa é entransplantar o micróbio do intestino humano. Os camundongos são tratados com antibióticos para reduzir as bactérias pré-existentes do intestino murino. Camundongos são então administrados transplantes fecais para fornecer o micróbio intestinal do intestino humano. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Testando a reconstituição da célula imune humana em camundongos BLT humanizados duplos. Um exemplo da análise de citometria de fluxo de um sangue periférico de BLT-mouse humanizado 10 semanas após a cirurgia. A figura mostra a estratégia de gating usada para identificar a população do linfócito, as pilhas de mCD45-hCD45 +, as pilhas de CD19 + B, as pilhas de T CD3 +, as pilhas de t de CD4 +, e as pilhas de T CD8 +. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Perfis de amostra fecal de doadores humanos. Abundância relativa do 3 doador humano e misturado (todos os doadores) amostras mostradas ao nível da família. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Os ratos tratados com antibióticos assemelham-se a fenótipos sem germes. Hu-camundongos foram sacrificados após 9 dias de tratamento antibiótico (antibióticos) ou nenhum tratamento antibiótico (controle). Após o tratamento antibiótico, o phenotype dos ratos humanizados começa a assemelhar-se àqueles vistos em animais germe-livres. Como resultado do tratamento antibiótico, há uma redução no tamanho do baço (esquerda) e o cálio é ampliado (direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Os BLT-ratos humanizados dobro caracterizam microbiomes específicos do intestino do doador fecal. O lote do PCA de dados de seqüenciamento do rRNA 16s mostra após a transplantação fecal humana os ratos dobro do Hu-BLT caracterizam os Ademir do intestino que são originais ao doador fecal humano individual. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O protocolo descrito aqui é para a criação de ratos dobro do Hu-BLT que caracterizam um sistema imunitário humano funcional e um microbioma humano-como estável do intestino. Este protocolo pode ser adaptado a outros modelos de camundongos humanizados ou não humanizados sem a necessidade de animais GF e instalações gnotobióticas. Embora os métodos descritos aqui sejam relativamente simples, existem vários detalhes críticos que são importantes para a criação bem-sucedida de camundongos Double Hu-BLT. Os camundongos NSG são extremamente imunodeficientes e a prevenção de infecções é a chave para a sobrevivência a longo prazo dos camundongos. Tomamos as seguintes medidas para prevenir a infecção. Em primeiro lugar, os animais foram alojados em gaiolas de microisoladores individuais com filtros HEPA (0,22 μm) em um sistema de rack com gerenciamento de taxa de câmbio de ar em uma suíte dedicada. O manipulador de ar para o rack continha pré-filtros, juntamente com HEPA filtrada (0,22 μm) de fornecimento e ar de exaustão, bem como em tempo real on-line de monitoramento de gaiola de exaustão de temperatura do ar e umidade relativa. Em segundo lugar, todo mundo que entrou na sala de animais teve que tomar banho e usar esfrega limpa e sapatos, bem como colocar em luvas, terno Tyvek descartáveis, booties, capota de cabelo, e máscara facial. Em terceiro lugar, todos os procedimentos, incluindo mudanças na gaiola e adição de alimentos e água, foram realizados dentro de uma capa de fumos de segurança biológica classe II tipo a2 que foi pré-esterilizada com 70% de etanol e luz UV. Quarto, a técnica cirúrgica asséptica foi usada durante a cirurgia da sobrevivência, que incluiu o cirurgião e os assistentes que desgastam uma camada adicional de proteção que inclui um vestido e umas luvas da cirurgia. A cirurgia foi conduzida na capa de fumos desinfectados, utilizando apenas instrumentos estéreis, gazes e materiais de fechamento de feridas, mantendo a esterilidade de luvas e instrumentos ao longo da cirurgia. Finalmente, para prevenir a infecção e garantir a estabilidade do microbioma de intestino humano enenxertado, todos os alimentos e água dada aos camundongos era estéril. Todos os alimentos devem ser irradiados e toda a água deve ser autoclavada. Para minimizar a dor e a aflição, nós administramos o buprenorfina de ação prolongada por via subcutânea aos ratos antes da cirurgia. A combinação de Ketamine e de xylazine para a anestesia cirúrgica do rato é muito de confiança e pode durar aproximadamente por 30 minutos. Se isso não for longo-o suficiente, damos gás isoflurano para anestesiar ainda mais os ratos. Também é muito importante para manter a temperatura do corpo do mouse pós-cirurgia. Colocamos a gaiola na almofada de aquecimento aquecido até a injeção de células-tronco hematopoiéticas através da veia cauda. Naquele tempo, os ratos são recuperados da anestesia e retornados à cremalheira.

Para esgotar o microbioma do intestino murino e preparar-se para o transplante fecal humano, é importante sempre usar antibióticos preparados na hora e para alterar a água suplementada com antibióticos e gaiolas diariamente. Isto usará muitas gaiolas do microisolador durante todo o tratamento antibiótico de 14 dias, mas assegura-se de que os ratos não estejam sendo re-inoculados com o coprophagia. Durante o tratamento antibiótico, também é crítico para monitorar o peso corporal e saúde dos camundongos. Após a transplantação fecal, os ratos recuperam rapidamente todo o peso perdido. É importante minimizar todos os ciclos do congelar-descongelamento para o material da transplantação fecal e certificar-se de usar uma câmara anaeróbia se as amostras do alicitando são precisados. Ao criar camundongos Double Hu-BLT é importante minimizar o manuseio e o estresse induzido nos camundongos. Isso ajuda a prevenir a infecção e melhora a sobrevivência a longo prazo.

Inicialmente, tentamos tratar camundongos com anfotericina B antifúngica, mas achamos que os camundongos não toleraram muito bem o tratamento e não são mais usados. Nós também experimentamos com diferentes durações de tratamento antibiótico. Nós encontramos que quando uma maioria de bactérias murino do intestino parecesse ser esgotada após 7 dias dos antibióticos, o nível de Engraftment fornecedor é muito mais elevado após 14 dias do tratamento. Também tentamos administrar antibióticos através de gavagem oral duas vezes por dia. Entretanto, nós descobrimos que este método era demasiado invasor para nossos Hu-ratos. Mudamos para uma única programação diária de gavagem, mas os camundongos ainda pareciam ser estressados e insalubres. Verificou-se que o fornecimento de antibióticos na água potável foi o melhor método. Reduziu a manipulação e o esforço da quantidade aos ratos ao ainda reduzir adequadamente as bactérias murino do intestino. Nós fornecemos açúcar de uva mistura de bebida adoçado na água potável para garantir que os camundongos receberam uma dosagem adequada de antibiótico e para evitar a desidratação. Os ratos experimentam uma redução no peso corporal durante os primeiros 3-4 dias do tratamento antibiótico, mas fornecer líquidos extra através da injeção intraperitoneal não aumenta o peso corporal. Após a transplantação fecal, os ratos recuperam rapidamente o peso perdido.

Embora esse método seja capaz de gerar de forma revisível camundongos Hu-BLT duplos, existem algumas limitações ao modelo. A primeira coisa a considerar é Hu-os ratos têm a estrutura lymphoid menos organizada, incluindo o centro germinais, conduzindo à comutação reduzida da classe do anticorpo e à maturação limitada da afinidade. Entretanto, os ratos de NSG Hu-BLT têm a reconstituição imune sistemática e as respostas traduzível da pilha de T e podem ser usados para modelar muitas doenças humanas. Uma outra edição é o desenvolvimento potencial da doença do transplantar-contra-anfitrião (GVHD) em alguns Hu-ratos após diversos meses da reconstituição imune humana excessiva. Nós e outros observamos manifestações de DECH, como blefarite, alopecia, perda de peso e má oclusão, que devem ser cuidadosamente monitoradas25.

Existem vários esquemas documentados para a depletização de bactérias intestinais em camundongos com antibióticos26,27,28,29,30,31. Nós escolhemos o nosso coquetel de antibióticos devido à sua capacidade conhecida para atingir uma ampla gama de bactérias no intestino e porque encontramos vários exemplos de depleção bacteriana bem sucedida na literatura. Muitos casos publicados usam um curso muito menos rigoroso dos antibióticos mas em nosso estudo, nós encontramos que 14 dias são necessários para o Engraftment óptimo de um Microbiome humano-como do intestino. Quando nós experimentamos inicialmente um protocolo baseado em Hintze e outros, nós encontramos que o gavagem oral era demasiado invasor e que o tratamento antifúngico era prejudicial aos ratos26. Acreditamos que os camundongos NSG Hu-BLT são procedimentos únicos e menos invasivos são preferidos em comparação com outros camundongos mais robustos. Não utilizamos animais GF em nosso estudo. O uso de camundongos GF para estudar os efeitos do microbioma intestinal tem sido bem documentado, no entanto, estes animais não têm um sistema imunológico humano19,32. Além disso, admitimos que trabalhar com um modelo de camundongos GF NSG Hu-BLT criaria oportunidades interessantes para a pesquisa. Para um, estudando a reconstituição da pilha imune humana e a patogénese de micróbios patogénicos específicos humanos como HIV-1 sem a presença do microbioma do intestino poderia fornecer resultados interessantes. Mais, os modelos do GF podem permitir uma reconstituição mais completa de um microbioma humano-como do intestino que segue a transplantação fecal. No entanto, camundongos GF têm deficiências imunes de longa duração, mesmo após a reconstituição do microbioma intestinal21. Nosso modelo tem a vantagem de usar condições de habitação SPF, que são amplamente disponíveis e menos caro em comparação com as instalações GF. Nosso modelo também tem a vantagem de não perturbar os procedimentos normais de geração de ratos Hu-BLT cirurgicamente, porque não há necessidade de um ambiente completamente GF.

Nós acreditamos que este modelo duplo do rato do Hu-BLT é original que não somente pode ser usado para estudar a função imune humana e as doenças humanas, mas igualmente para determinar o impacto do microbioma do intestino na patogénese e no tratamento da doença in vivo. Com este protocolo, podemos criar de forma repossível camundongos Double Hu-BLT com perfis de microbioma do intestino específico do doador humano. Conseqüentemente, nós acreditamos que usar ratos dobro do Hu-BLT será benéfico às aplicações personalizadas futuras da medicina projetadas testar o impacto do microbioma do intestino em tratamentos para várias doenças humanas como HIV-1 e cancro. Em resumo, nosso modelo duplo dos ratos de Hu-BLT é um modelo pré-clínico importante e novo que caracteriza um sistema imune humano funcional e um microbioma humano-como estável do intestino para estudar a saúde humana e a doença.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Yanmin Wan, Guobin Kang e Pallabi Kundu por sua ajuda na geração de camundongos humanizados por BLT. Gostaríamos de reconhecer a UNMC Genomics Core Facility que recebe apoio parcial da rede de pesquisa Nebraska em genômica funcional NE-INBRE P20GM103427-14, a biologia molecular dos sistemas Neurosensoriais CoBRE P30GM110768, o Fred & Pamela Centro do cancer de Buffett-P30CA036727, o centro para a inovação da raiz e do Rhizobiome (CRRI) 36-5150-2085-20, e a iniciativa da pesquisa de Nebraska. Gostaríamos de agradecer à Universidade de Nebraska-Lincoln Life Sciences anexo e seus funcionários para a sua assistência. Este estudo é apoiado em parte pelos institutos nacionais de saúde (NIH) concede R01AI124804, R21AI122377-01, p30 MH062261-16A1 infecção por HIV crônica e envelhecimento em neuroaids (cadeia) centro, 1R01AI111862 para Q li.  Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, preparação do manuscrito ou decisão de publicação.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal Feeding Needles 18G Cadence Science 9928B
Clidox-s Activator Pharmacal Research Laboratories 95120F
Clidox-s Base Pharmacal Research Laboratories 96125F
DGM 108 cage rack Techniplast
Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L  Grainger 12R063
FMT Upper Delivery Microbiota Preparations  OpenBiome FMP30
Grape Kool-Aid Kraft Foods Inc.
hCD19-PE/Cy5 Biolegend 302209
hCD3-PE Biolegend 300408
hCD4-Alexa 700 Biolegend 300526
hCD45-FITC Biolegend 304006
hCD8-APC/Cy7 Biolegend 301016
Lactate Buffered Ringer's Solution Boston BioProducts Inc  PY-906-500 
mCD45-APC Biolegend 103111
Microvette 100 K3E Microvette 20.1278.100
Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment Neosporin
NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) The Jackson Laboratory 005557
PrecisionGlide 25 G Needle BD 305127
RS200 X-ray irradiator RAD Source Technologies
Sealsafe Plus GM500 microisolator cages Techniplast
Sterile Non-woven Gauze Fisherbrand 22-028-558
Teklad global 16% protein irradiated mouse chow Teklad 2916

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Um duplo humanizado BLT-MICE modelo caracterizando um estável humano-como o intestino Microbiome e sistema imunológico humano
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Daharsh, L., Zhang, J., Ramer-Tait, A., Li, Q. A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System. J. Vis. Exp. (150), e59773, doi:10.3791/59773 (2019).More

Daharsh, L., Zhang, J., Ramer-Tait, A., Li, Q. A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System. J. Vis. Exp. (150), e59773, doi:10.3791/59773 (2019).

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