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Biochemistry

Un modelo de dos colores BLT humanizados con un microbioma intestinal humano estable y un sistema inmune humano

doi: 10.3791/59773 Published: August 30, 2019

Summary

Describimos un método novedoso para generar ratones BLT dobles humanizados que cuentan con un sistema inmune humano funcional y un microbioma intestinal estable injertado similar al humano. Este protocolo se puede seguir sin necesidad de ratones libres de gérmenes o instalaciones gnotobióticas.

Abstract

Los ratones humanizados (hu-mice) que cuentan con un sistema inmunitario humano funcional han cambiado fundamentalmente el estudio de patógenos humanos y enfermedades. Se pueden utilizar para modelar enfermedades que de otro modo son difíciles o imposibles de estudiar en seres humanos u otros modelos animales. El microbioma intestinal puede tener un profundo impacto en la salud y la enfermedad humanas. Sin embargo, el microbioma intestinal murino es muy diferente al que se encuentra en los seres humanos.  Hay una necesidad de modelos preclínicos de hu-mice mejorados que tengan un microbioma intestinal humano injertado. Por lo tanto, creamos doble hu-mice que cuentan con un sistema inmunológico humano y microbioma intestinal humano estable. Cabeceo. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) ratones son uno de los mejores animales para la humanización debido a su alto nivel de inmunodeficiencia. Sin embargo, los ratones NSG libres de gérmenes y varios otros modelos importantes de ratones libres de gérmenes no están disponibles comercialmente. Además, muchos entornos de investigación no tienen acceso a instalaciones gnotobióticas, y trabajar en condiciones gnotobióticas a menudo puede ser costoso y lento. Es importante destacar que los ratones libres de gérmenes tienen varias deficiencias inmunitarias que existen incluso después del injerto de microbios. Por lo tanto, desarrollamos un protocolo que no requiere animales libres de gérmenes o instalaciones gnotobióticas. Para generar ratones de doble hu, los ratones NSG fueron tratados con radiación antes de la cirugía para crear ratones de médula ósea, hígado, timo humanizados (hu-BLT). Los ratones fueron tratados con antibióticos de amplio espectro para agotar el microbioma intestinal murino preexistente. Después del tratamiento con antibióticos, los ratones recibieron trasplantes fecales con muestras de donantes humanos sanos a través de gavage oral. Los ratones de doble hu-BLT tenían perfiles únicos del gen rRNA 16S basados en la muestra de donante humano individual que fue trasplantada. Es importante destacar que el microbioma trasplantado similar al humano se mantuvo estable en los ratones de doble hu-BLT durante la duración del estudio hasta 14,5 semanas después del trasplante.

Introduction

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Los ratones humanizados (hu-mice) han transformado el estudio de muchos aspectos de la salud humana y la enfermedad, incluyendo hematopoyesis, inmunidad, cáncer, enfermedad autoinmune y enfermedad infecciosa1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Estos hu-mice tienen la clara ventaja sobre otros modelos de ratón en que tienen un sistema inmunológico humano funcional y pueden ser infectados con patógenos específicos humanos. Sin embargo, la importancia del microbioma intestinal ha quedado demostrada por su papel en muchas enfermedades humanas como la obesidad, el síndrome metabólico, las enfermedades inflamatorias y el cáncer10,11,12, 13. El sistema inmunitario mucoso y el microbioma intestinal están regulados recíprocamente para mantener la homeostasis intestinal y sistémica. El sistema inmunitario está formado por antígenos presentados por el microbioma intestinal y recíprocamente el sistema inmunitario desempeña un importante papel regulador en la promoción de bacterias intestinales comensales y la eliminación de patógenos14,15, 16. Sin embargo, el microbioma intestinal de hu-mice no se ha caracterizado bien y el microbioma intestinal murino difiere sustancialmente en composición y función de los seres humanos17. Esto se debe a diferencias evolutivas, fisiológicas y anatómicas entre el intestino murino y humano, así como otros factores importantes como la dieta, que pueden influir en los resultados experimentales de los modelos18de la enfermedad de hu-mice. Por lo tanto, más allá de la clasificación del microbioma intestinal murino de hu-mice, se necesita un modelo animal con un sistema inmune humano y microbioma intestinal humano para estudiar las complejas interacciones de la enfermedad humana in vivo.

El estudio de las enfermedades humanas directamente en seres humanos es a menudo poco práctico o poco ético. Muchos modelos animales no se pueden utilizar para estudiar patógenos humanos como el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Los modelos de primates no humanos son genéticamente endogámicos, muy caros y no son susceptibles a muchos patógenos humanos. Los ratones que se han derivado como libres de gérmenes (GF) y reconstituidos con microbiomas intestinales similares al humano se han utilizado ampliamente para estudiar la salud humana y la enfermedad19,20. Sin embargo, estos animales no tienen un sistema inmunológico humano y trabajar con animales GF requiere instalaciones especializadas, procedimientos y experiencia. Por lo tanto, hay una necesidad de modelos preclínicos mejorados para estudiar la compleja relación del microbioma intestinal y el sistema inmunitario humano. Muchas cepas de ratones, como NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), no están disponibles comercialmente como GF. Los animales GF también pueden sufrir de deficiencias inmunitarias duraderas que no se invierten completamente por el injerto de microbios21. Por lo tanto, creamos un doble hu-mice con un sistema inmune humano funcional y microbioma intestinal estable similar al humano bajo condiciones específicas libres de patógenos (SPF). Para generar doble hu-mice, se realizó una cirugía en ratones NSG para crear ratones de médula ósea, hígado, timo humanizados (hu-BLT). Los ratones hu-BLT fueron tratados con antibióticos de amplio espectro y luego se les administraron trasplantes fecales con una muestra de donante humano saludable. Caracterizamos el microbioma intestinal bacteriano de 173 muestras fecales de 45 ratones dobles hu-BLT y 4 muestras de donantes fecales humanos. Los ratones de doble hu-BLT tienen perfiles únicos del gen rRNA 16S basados en la muestra de donante humano individual que se trasplanta. Es importante destacar que el microbioma trasplantado similar al humano se mantuvo estable en ratones durante la duración del estudio hasta 14,5 semanas después del trasplante. Además, los metagenomas pronosticados mostraron que los ratones de doble hu-BLT tienen diferente capacidad funcional pronosticada que los ratones de hu que es más similar a las muestras de donantes humanos.

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Protocol

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Todos los métodos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado e Investigación de Animales (IACUC) en la Universidad de Nebraska-Lincoln (UNL). La IACUC de la UNL ha aprobado dos protocolos relacionados con la generación y el uso de ratones hu-BLT, incluyendo doble hu-mice. Además, el Comité de Supervisión de la Investigación Científica (SROC) de la UNL también ha aprobado el uso de células madre embrionarias humanas y tejidos fetales, que se obtienen de los Recursos Avanzados de Biociencia para estudios de ratones humanizados (SROC-2016-1-002).

1. Alojamiento y mantenimiento de ratones

  1. Comprar ratones NSG de 6-8 semanas de edad (NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
  2. Auna los ratones en condiciones de SPF con intercambio de aire, prefiltros y filtros HEPA (0,22 m) en una habitación con temperatura, humedad y presión controladas.
    1. Casa y mantiene los ratones en jaulas de microisolator individuales autoclavedas en un sistema de rack capaz de gestionar el intercambio de aire con prefiltros y filtros HEPA (0,22 m).
  3. Realizar todos los procedimientos y manipulaciones de los ratones en una campana de humo de seguridad biológica Tipo A2 de Clase II que ha sido pretratada con 70% de etanol. Antes de trabajar en la sala de animales, ducharse y cambiarse a exfoliantes limpios, traje de tyvek, fundas de botas, gorra para el cabello, máscara facial y guantes. Use una bata de cirugía sobre el traje de tyvek durante los procedimientos quirúrgicos.
    NOTA: La descontaminación de la luz ultravioleta (UV) también se prefiere antes de los procedimientos.
    1. Autoclave todos los instrumentos y reactivos si es posible y luego desinfectar antes de transferir a la campana de humos.
    2. Durante los procedimientos, retire las jaulas ventiladas individualmente de los animales del estante y desinfecte antes de transferirlas a la campana de humos.
  4. Alimentar a los ratones con una dieta irradiada y proporcionar agua autoclave. Proporcione alimentos irradiados ab libitum y complemente con alimentos irradiados adicionales según sea necesario. Cambie el agua autoclave semanalmente o según sea necesario.
    NOTA: También se puede utilizar agua acidificada autoclave. La dieta irradiada proporcionada tuvo una vida útil de 6 meses después de la fabricación.

2. Generación de ratones BLT humanizados

NOTA: La generación de ratones hu-BLT se ha descrito anteriormente22,23,24.

  1. El día de la cirugía, dar a los ratones irradiación de todo el cuerpo a una dosis de 12 cGy/g de peso corporal.
  2. Prepare a los ratones para la cirugía.
    1. Dar a cada ratón irradiado una mezcla de ketamina a la concentración de trabajo de 100 mg/kg y xilazina a la concentración de 12 mg/kg, que osciló entre 130-170 l por ratón en función del peso corporal mediante inyección intraperitoneal (IP) para anestesia. Para preparar 3 ml de la mezcla de ketamina y xilazina, añadir 0,27 ml de ketamina a la concentración de stock de 100 mg/ml y 0,03 ml de xilazina a la concentración de 100 mg/ml a 2,7 ml de solución salina estéril y mezclar bien. Desinfectar la piel con 70% isopropanol antes de la inyección.
    2. Dar a cada ratón irradiado Buprenorfina 1 mg/kg de peso corporal (media vida 72 h, SR-LAB) mediante inyección subcutánea para el manejo del dolor de larga duración.
    3. Entregar a cada ratón irradiado 100 l (858 g) de Cefazolin mediante inyección de IP para la profilaxis antibiótica preoperatoria.
    4. Afeitar el cabello de los ratones usando cortapelos eléctricos alrededor del lado lateral izquierdo y medial del ratón en el sitio quirúrgico posterior utilizado para exponer el riñón izquierdo.
    5. Verifique el nivel adecuado de anestesia por reflejo de pedal (pellizco firme del dedo del pecho).
    6. Dar gas isoflurano al 3-5% si se necesita anestesia adicional en cualquier momento durante la cirugía.
    7. Aplique pomada oftálmica en ambos ojos para prevenir la desecación corneal. Aplique la etiqueta de la oreja si es necesario.
  3. Realice una cirugía para implantar los tejidos hepáticos y del timo en la cápsula renal izquierda.
    1. Desinfectar la piel en el sitio quirúrgico mediante la aplicación de exfoliación de yodo a partir del centro del sitio quirúrgico y moverse hacia el exterior de una manera circular. Repita este proceso con 70% isopropanol y una tercera vez con yodo.
    2. Usando fórceps, primero cargue un fragmento de tejido hepático fetal humano en un trocar. Luego, usando fórceps, cargue un fragmento de tejido del timo fetal humano en el trocar. Luego, usando fórceps, cargue otro fragmento de tejido hepático fetal humano en el trocar. Los tejidos deben cortarse a 1-1,6 mm3 para adaptarse a las dimensiones internas del trocar.
    3. Usa fórceps para levantar la piel y tijeras para hacer un corte pequeño longitudinalmente. Extienda el corte a 1,5-2 cm en el lado izquierdo del ratón.
    4. Usa fórceps para levantar la capa muscular y tijeras para hacer un pequeño corte longitudinalmente. Extienda el corte según sea necesario para exponer el riñón.
    5. Exponga el riñón agarrando suavemente el tejido graso que rodea el riñón. No toque directamente el parénquima renal.
    6. Haga una incisión de 1-2 mm en el extremo posterior de la cápsula renal usando un bisturí.
    7. Inserte lentamente el trocar precargado a través de la incisión paralela al eje largo del riñón y libere los tejidos entre la cápsula renal y el riñón.
    8. Devuelva cuidadosamente el riñón y el intestino a su posición normal. Utilice suturas absorbibles 5/0 P-3 (P-13) con aguja circular de 13 mm 3/8 para cerrar la capa muscular y grapas quirúrgicas para cerrar la piel.
  4. Después de la cirugía, coloque el ratón en una jaula de microisolator autoclave limpia para su recuperación.
    1. Para minimizar la pérdida de calor durante la recuperación postquirúrgica, coloque la jaula que contiene los ratones en una almohadilla de calentamiento que esté conectada a una bomba de agua que caliente y circule el agua.
    2. Monitoree a los ratones hasta que hayan recuperado suficiente conciencia para mantener la recumbencia esternal.
  5. Dentro de las 6 h de la finalización de la cirugía, a través de la vena de cola, inyectar CD34+ células madre hematopoyéticas aisladas del tejido hepático fetal humano.
    1. Calienta a los ratones con una lámpara de calor. Desinfectar la cola con 70% de isopropanol y luego inyectar de 1,5 a 5 x 105 células madre/200 l en la vena de la cola.
    2. Detenga cualquier sangrado de la inyección y devuelva los ratones a la jaula del microisolator y a la jaula del microisolator al estante de la jaula.
      NOTA: Los ratones post-cirugía suelen estar alojados juntos, cinco por jaula de microisolator, durante y después de la recuperación. Sin embargo, los ratones solo se alojan juntos si todos recibieron cirugía el mismo día.
  6. Revisa los ratones todos los días. Supervise cuidadosamente las grapas quirúrgicas y reemplácelas según sea necesario. Controle de cerca a los ratones en busca de cualquier signo de infección o malestar. Suministre alimentos autoclavedos en el suelo de la jaula del microisolator durante unos días después de la cirugía.
  7. Retire las grapas quirúrgicas 7-10 días después de la cirugía. Dar gas isoflurano al 3-5% para anestesiar a los ratones. Retire cuidadosamente las grapas y luego aplique antibióticos y pomada para aliviar el dolor en el sitio.
  8. Permita 9-12 semanas para la reconstitución de las células inmunitarias humanas, luego recoja sangre periférica de la vena safenosa medial de cada uno de los ratones humanizados.
    1. Sujete a los ratones conscientes usando un sistema de cono de plástico de tamaño adecuado con una abertura cerca de la cabeza del ratón para respirar y una abertura cerca de la parte posterior del ratón para aislar una pierna. Coloque primero los ratones en la cabeza del cono de sujeción y luego tire suavemente de una pierna a través de la abertura de la pierna.
    2. Rocíe el lado medial de la pierna aislada con 70% de isopropanol, luego propague antibióticos y pomada para aliviar el dolor en el mismo sitio.
      NOTA: La pomada ayuda a revelar la ubicación de la vena sin necesidad de depilación y también ayuda en la formación de gotas de sangre.
    3. Usando una aguja de calibre 25 en un ángulo de 90o, perforar la vena y recoger 50-100 l de sangre usando un tubo de recolección de sangre recubierto con EDTA. Detenga el sangrado aplicando presión en el sitio con gasa estéril. Una vez que el sangrado se haya detenido, devuelva a los ratones a su jaula.
      NOTA: Los volúmenes máximos de sangre recogidos suelen ser de 50 ml por semana o de 100 litros cada dos semanas.
    4. Utilice la sangre periférica recogida para analizar el nivel de reconstitución de células inmunitarias humanas utilizando citometría de flujo con anticuerpos para hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.

3. Tratamiento antibiótico

  1. Antes del tratamiento con antibióticos, recoja muestras fecales previas al tratamiento. Mueva los ratones a una nueva jaula de microisolator autoclave.
  2. Prepare un cóctel fresco de antibióticos de amplio espectro todos los días.
    1. Preparar 250 ml de agua que contenga Metronidazol recién preparado (1 g/L), Neomicina (1 g/L), Vancomicina (0,5 g/L) y Ampicilina (1 g/L) para cada jaula de microisolator de ratones.
      NOTA: Utilice agua autoclave o estéril para el agua potable suplementada con antibióticos.
    2. Añadir 9,2 g de mezcla de bebida endulzada con azúcar de uva a 250 ml de agua suplementada con antibióticos.
      NOTA: El uso de la mezcla de bebidas edulcoradas de azúcar de uva enmascara el sabor amargo de los antibióticos y ayuda a prevenir la deshidratación en ratones.
    3. Cambiar el antibiótico y azúcar de uva mezcla de bebida endulzada agua suplementada y colocar los ratones en una nueva jaula autoclaved todos los días.
      NOTA: Los ratones son coprofágicos y cambiar las jaulas diariamente evita que los ratones se vuelvan a inocular con bacterias intestinales.
    4. Para el injerto máximo del microbioma intestinal similar al humano, proporcione antibióticos durante 14 días. Durante el tratamiento con antibióticos, monitoriza a los ratones para ver si hay pérdida de peso y deshidratación. Se espera pérdida de peso durante los primeros 3-4 días y mesetas después de eso durante la duración del tratamiento. Si se produce deshidratación, administrar a los ratones solución salina o ringers a través de inyección intraperitoneal.
      NOTA: Otros protocolos de humanización del microbioma intestinal requieren gavage oral de antibióticos. Si bien es eficaz para agotar las bacterias intestinales murinas, encontramos que el método menos invasivo de agregar antibióticos al agua potable puso menos estrés en nuestros ratones humanizados y condujo a mejores resultados.

4. Muestras de donantes y trasplante fecal

  1. Preparar muestras fecales de donantes humanos.
    1. Utilizar fuentes adecuadamente preparadas de material de trasplante de microbiota fecal (FMT) para el trasplante fecal en ratones humanizados.
    2. Descongelar las preparaciones de FMT y alícuotas en condiciones anaeróbicas en una cámara anaeróbica.
    3. Si se desea, en este paso mezcle partes iguales de las muestras fecales para crear una muestra "humana" imparcial.
    4. Mantenga la congelación y descongelación del material FMT al mínimo, si no es necesario alícuota o mezcla de muestras, sólo descongelar inmediatamente antes del procedimiento.
  2. Trasplante fecal humano
    1. Después de completar 14 días de tratamiento antibiótico, cambie el agua potable a agua autoclave y mueva a los ratones a una nueva jaula autoclave. Detenga los cambios diarios de jaula e implemente un horario de cambio de jaula una vez cada 1-2 semanas.
    2. Dar dos trasplantes fecales a 24 y 48 h después del cese de antibióticos.
    3. 24 h después del tratamiento con antibióticos, descongelar la cantidad necesaria de material FMT, dar a cada ratón 200 l de material FMT a través de gavage oral. Repita el procedimiento de nuevo a las 48 h después de los antibióticos.
    4. Extienda cualquier material FMT descongelar restante o sobrante en el pelaje de los ratones humanizados o en la ropa de cama de la jaula.

5. Recogida de muestras fecales frescas

  1. Autoclave bolsas de papel individuales antes de transferir a la campana de humos.
  2. En la campana de humos, coloque un ratón en cada bolsa de papel individual y permita que el ratón defeque.
  3. Con fórceps estériles, recoja la muestra fecal en tubos de plástico de 1,5 ml y congele a -80 oC. Devuelva a los ratones a las jaulas de microisolator.
    NOTA: Este método de recolección de muestras fecales permite la recolección de muestras fecales frescas de ratones individuales sin manipulaciones que induzcan estrés.

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Representative Results

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La Figura 1 muestra un esquema de los métodos utilizados para crear ratones de doble hu-BLT y describe brevemente el proceso de agregar un sistema inmune humano funcional y un microbioma intestinal estable similar al humano a los ratones NSG. La Figura 2 muestra un ejemplo de análisis de citometría de flujo de sangre periférica de un ratón BLT humanizado 10 semanas después de la cirugía. La Figura 3 muestra la abundancia relativa de las muestras de donantes fecales humanos utilizadas para transferir un microbioma intestinal para crear doble hu-mice. La Figura 4 muestra los cambios fenotípicos inducidos por el tratamiento antibiótico al bazo y al cecum, similar a lo que se observa en animales libres de gérmenes. La Figura 5 muestra una gráfica de análisis de componentes principales (PCA) de los datos de secuenciación de rRNA 16S que revelan que los ratones de doble hu tienen microbiomas intestinales similares al ser humano que son exclusivos de la muestra de donante humano.

Figure 1
Figura 1 : Creación de ratones BLT dobles humanizados. La creación de ratones de doble hu-BLT es un proceso de dos pasos. El primer paso es injertar el sistema inmunitario humano a los ratones NSG. El día de la cirugía, los ratones NSG reciben irradiación para crear un nicho para las células madre. Los ratones se implantan con hígado fetal humano y tejidos de timo e inyectan células madre hematopoyéticas humanas. La reconstitución de células inmunitarias humanas se controla alrededor de las 10 semanas después de la cirugía.  El segundo paso es injertar el microbioma intestinal humano. Los ratones son tratados con antibióticos para reducir las bacterias intestinales murinas preexistentes. A continuación, se les administran trasplantes fecales para proporcionar el microbioma intestinal humano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Prueba de la reconstitución de células inmunitarias humanas en ratones BLT dobles humanizados. Un ejemplo de análisis de citometría de flujo de una sangre periférica humanizada de ratón BLT 10 semanas después de la cirugía. La figura muestra la estrategia de gating utilizada para identificar la población de linfocitos, células mCD45- hCD45+, células CD19+ B, células T CD3+, células T CD4+ y células T CD8+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Perfiles de muestrafecales de donantes humanos. Abundancia relativa de las 3 muestras de donantes humanos y mixtas (todos los donantes) mostradas a nivel familiar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Los ratones tratados con antibióticos se asemejan a fenotipos libres de gérmenes. Los hu-ratones fueron sacrificados después de 9 días de tratamiento antibiótico (antibióticos) o ningún tratamiento antibiótico (Control). Después del tratamiento con antibióticos, el fenotipo de los ratones humanizados comienza a parecerse a los observados en animales libres de gérmenes. Como resultado del tratamiento con antibióticos hay una reducción en el tamaño del bazo (izquierda) y el cecum se agranda (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Los ratones BLT dobles humanizados cuentan con microbiomas intestinales específicos de donantes fecales. La gráfica PCA de datos de secuenciación de rRNA 16S muestra después del trasplante fecal humano los ratones de doble hu-BLT cuentan con microbiomas intestinales que son únicos para el donante fecal humano individual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El protocolo descrito aquí es para la creación de ratones de doble hu-BLT que cuentan con un sistema inmune humano funcional y un microbioma intestinal humano estable. Este protocolo se puede adaptar a otros modelos de ratones humanizados o no humanizados sin necesidad de animales GF e instalaciones gnotobióticas. Si bien los métodos descritos aquí son relativamente simples, hay varios detalles críticos que son importantes para la creación exitosa de ratones de doble hu-BLT. Los ratones NSG son extremadamente inmunodeficientes y la prevención de infecciones es clave para la supervivencia a largo plazo de los ratones. Tomamos las siguientes medidas para prevenir la infección. En primer lugar, los animales fueron alojados en jaulas de microisolator individuales con filtros HEPA (0,22 m) en un sistema de rack con gestión del tipo de cambio de aire en una suite dedicada. El controlador de aire para el bastidor contenía prefiltros junto con hePA filtrada (0,22 m) de suministro y aire de escape, así como monitoreo en tiempo real en línea de la temperatura del aire de escape de la jaula y la humedad relativa. En segundo lugar, todos los que entraron en la sala de animales tenían que ducharse y usar exfoliaciones y zapatos limpios, así como ponerse guantes, traje de tyvek desechable, botines, sombrero de pelo y máscara facial. En tercer lugar, todos los procedimientos, incluidos los cambios en las jaulas y la adición de alimentos y agua, se realizaron dentro de una campana de humodes de seguridad biológica Tipo A2 de Clase II que fue esterilizada previamente con 70% de etanol y luz UV. En cuarto lugar, se utilizó una técnica quirúrgica aséptica durante la cirugía de supervivencia, que incluyó al cirujano y asistentes que llevaban una capa adicional de protección, incluyendo una bata de cirugía y guantes. La cirugía se llevó a cabo en la campana de humo desinfectada, utilizando sólo instrumentos estériles, gasas y materiales de cierre de heridas, manteniendo la esterilidad de guantes e instrumentos durante toda la cirugía. Por último, para prevenir la infección y garantizar la estabilidad del microbioma intestinal similar al humano injertado, todos los alimentos y agua administrados a los ratones eran estériles. Todos los alimentos deben ser irradiados y toda el agua debe ser autoclaveda. Para minimizar el dolor y la angustia, administramos buprenorfina de acción prolongada por vía subcutánea a ratones antes de la cirugía. La combinación de ketamina y xilazina para la anestesia quirúrgica de ratón es muy confiable y puede durar unos 30 minutos. Si eso no es suficiente, le damos gas isoflurano para anestesiar aún más a los ratones. También es muy importante mantener la temperatura corporal del ratón después de la cirugía. Ponemos la jaula en la almohadilla de calentamiento calentada hasta la inyección de células madre hematopoyéticas a través de la vena de la cola. En ese momento, los ratones se recuperan de la anestesia y se devuelven al estante.

Para agotar el microbioma intestinal murino y prepararse para el trasplante fecal humano, es importante utilizar siempre antibióticos recién preparados y cambiar el agua suplementada con antibióticos y jaulas todos los días. Esto utilizará muchas jaulas de microisolator a lo largo del tratamiento antibiótico de 14 días, pero garantiza que los ratones no están siendo re-inoculados a través de la coprofagia. Durante el tratamiento con antibióticos, también es fundamental controlar el peso corporal y la salud de los ratones. Después del trasplante fecal, los ratones recuperan rápidamente cualquier pérdida de peso. Es importante minimizar cualquier ciclos de congelación-descongelación para el material de trasplante fecal y asegurarse de utilizar una cámara anaeróbica si se necesitan muestras de alícuota. Al mismo tiempo que se crean ratones de doble hu-BLT es importante minimizar el manejo y el estrés inducido en los ratones. Esto ayuda a prevenir la infección y mejora la supervivencia a largo plazo.

Inicialmente tratamos de pre-tratar ratones con anfotericina antifúngica B, pero encontramos que los ratones no toleraron muy bien el tratamiento y ya no se utiliza. También experimentamos con diferentes duraciones de tratamiento antibiótico. Encontramos que mientras que la mayoría de las bacterias del intestino murino parecen agotarse después de 7 días de antibióticos, el nivel de injerto de donante es mucho mayor después de 14 días de tratamiento. También intentamos administrar antibióticos a través de gavage oral dos veces al día. Sin embargo, encontramos que este método era demasiado invasivo para nuestros hu-mice. Cambiamos a un solo horario diario de gavage, pero los ratones todavía parecían estar estresados e insalubres. Encontramos que proporcionar antibióticos en el agua potable era el mejor método. Redujo la cantidad de manejo y el estrés a los ratones mientras que todavía reduce adecuadamente las bacterias del intestino murino. Proporcionamos mezcla de bebida sendulzada de azúcar de uva en el agua potable para asegurar que los ratones recibieron una dosis adecuada de antibiótico y para prevenir la deshidratación. Los ratones experimentan una reducción en el peso corporal durante los primeros 3-4 días de tratamiento antibiótico, pero proporcionar líquidos adicionales a través de inyección intraperitoneal no aumenta el peso corporal. Después del trasplante fecal, los ratones recuperan rápidamente el peso perdido.

Si bien este método es capaz de generar reproducir ratones de doble hu-BLT, hay algunas limitaciones en el modelo. Lo primero que hay que tener en cuenta es que los hu-mice tienen una estructura linfoide menos organizada, incluido el centro germinal, lo que conduce a un cambio de clase de anticuerpos reducido y una maduración de afinidad limitada. Sin embargo, los ratones NSG hu-BLT tienen reconstitución inmune sistémica y respuestas de células T traducibles y se pueden utilizar para modelar muchas enfermedades humanas. Otro problema es el desarrollo potencial de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) en algunos hu-mice después de varios meses de reconstitución inmune humana excesiva. Nosotros y otros hemos observado manifestaciones de la EICH como blefaritis, alopecia, pérdida de peso y maloclusión que deben ser cuidadosamente monitoreadas25.

Existen varios regímenes documentados para agotar las bacterias intestinales en ratones con antibióticos26,27,28,29,30,31. Elegimos nuestro cóctel de antibióticos debido a su capacidad conocida para apuntar a una amplia gama de bacterias en el intestino y porque encontramos varios ejemplos de agotamiento bacteriano exitoso en la literatura. Muchos casos publicados utilizan un curso mucho menos riguroso de antibióticos, pero en nuestro estudio, encontramos que se necesitan 14 días para el injerto óptimo de un microbioma intestinal similar al humano. Si bien inicialmente probamos un protocolo basado en Hintze et al., encontramos que el gavage oral era demasiado invasivo y que el tratamiento antifúngico era perjudicial para los ratones26. Creemos que los ratones NSG hu-BLT son únicos y se prefieren procedimientos menos invasivos en comparación con otros ratones más robustos. No usamos animales GF en nuestro estudio. El uso de ratones GF para estudiar los efectos del microbioma intestinal han sido bien documentados, sin embargo, estos animales no tienen un sistema inmunológico humano19,32. Además, admitimos que trabajar con un modelo de ratones GF NSG hu-BLT crearía oportunidades interesantes para la investigación. Por un lado, el estudio de la reconstitución de células inmunitarias humanas y la patogénesis de patógenos específicos humanos como el VIH-1 sin la presencia del microbioma intestinal podría proporcionar resultados interesantes. Además, los modelos GF pueden permitir una reconstitución más completa de un microbioma intestinal similar al humano después del trasplante fecal. Sin embargo, los ratones GF tienen deficiencias inmunitarias de larga duración, incluso después de la reconstitución del microbioma intestinal21. Nuestro modelo tiene la ventaja de utilizar las condiciones de la carcasa SPF, que son ampliamente disponibles y menos costosas en comparación con las instalaciones de GF. Nuestro modelo también tiene la ventaja de no perturbar los procedimientos normales de los ratones hu-BLT que generan quirúrgicamente porque no hay necesidad de un entorno completamente GF.

Creemos que este modelo de ratón doble hu-BLT es único en el que no sólo se puede utilizar para estudiar la función inmune humana y las enfermedades humanas, sino también determinar el impacto del microbioma intestinal en la patogénesis de la enfermedad y el tratamiento in vivo. Con este protocolo, podemos crear ratones de doble hu-BLT con perfiles de microbioma intestinal específicos de donantes humanos. Por lo tanto, creemos que el uso de ratones de doble hu-BLT será beneficioso para futuras aplicaciones de medicina personalizada diseñadas para probar el impacto del microbioma intestinal en tratamientos para diversas enfermedades humanas como el VIH-1 y el cáncer. En resumen, nuestro modelo de ratones doble hu-BLT es un modelo preclínico importante y novedoso que cuenta con un sistema inmunitario humano funcional y un microbioma intestinal estable similar al humano para estudiar la salud humana y la enfermedad.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Yanmin Wan, Guobin Kang y Pallabi Kundu por su ayuda en la generación de ratones humanizados BLT. Nos gustaría reconocer el Fondo de Genómica de la UNMC que recibe apoyo parcial de la Red de Investigación de Nebraska en Genómica Funcional NE-INBRE P20GM103427-14, La Biología Molecular de Sistemas Neurosensoriales CoBRE P30GM110768, The Fred & Pamela Buffett Cancer Center - P30CA036727, The Center for Root and Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, y la Iniciativa de Investigación de Nebraska. Nos gustaría agradecer a la Universidad de Nebraska - Lincoln Life Sciences Annex y a su personal por su asistencia. Este estudio es apoyado en parte por el InstitutoNacional de Salud (NIH) Becas R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Chronic HIV Infection and Aging in NeuroAIDS (CHAIN) Center, 1R01AI111862 to Q Li.  Los funderos no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la preparación del manuscrito o la decisión de publicación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal Feeding Needles 18G Cadence Science 9928B
Clidox-s Activator Pharmacal Research Laboratories 95120F
Clidox-s Base Pharmacal Research Laboratories 96125F
DGM 108 cage rack Techniplast
Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L  Grainger 12R063
FMT Upper Delivery Microbiota Preparations  OpenBiome FMP30
Grape Kool-Aid Kraft Foods Inc.
hCD19-PE/Cy5 Biolegend 302209
hCD3-PE Biolegend 300408
hCD4-Alexa 700 Biolegend 300526
hCD45-FITC Biolegend 304006
hCD8-APC/Cy7 Biolegend 301016
Lactate Buffered Ringer's Solution Boston BioProducts Inc  PY-906-500 
mCD45-APC Biolegend 103111
Microvette 100 K3E Microvette 20.1278.100
Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment Neosporin
NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) The Jackson Laboratory 005557
PrecisionGlide 25 G Needle BD 305127
RS200 X-ray irradiator RAD Source Technologies
Sealsafe Plus GM500 microisolator cages Techniplast
Sterile Non-woven Gauze Fisherbrand 22-028-558
Teklad global 16% protein irradiated mouse chow Teklad 2916

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References

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Un modelo de dos colores BLT humanizados con un microbioma intestinal humano estable y un sistema inmune humano
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Daharsh, L., Zhang, J., Ramer-Tait, A., Li, Q. A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System. J. Vis. Exp. (150), e59773, doi:10.3791/59773 (2019).More

Daharsh, L., Zhang, J., Ramer-Tait, A., Li, Q. A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System. J. Vis. Exp. (150), e59773, doi:10.3791/59773 (2019).

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