Summary
L'imagerie optique transcrânienne permet l'imagerie à large champ du transport du liquide céphalo-rachidien dans le cortex des souris vivantes à travers un crâne intact.
Abstract
Le flux de fluide céphalo-rachidien (CSF) chez les rongeurs a été largement étudié à l'aide de la quantification ex vivo des traceurs. Des techniques telles que la microscopie à deux photons et l'imagerie par résonance magnétique (IRM) ont permis une quantification in vivo du flux de FSC, mais elles sont limitées par des volumes d'imagerie réduits et une faible résolution spatiale, respectivement. Des travaux récents ont constaté que CSF pénètre dans le parenchyme cérébral à travers un réseau d'espaces périvasculaires entourant les artères piales et pénétrantes du cortex des rongeurs. Cette entrée périvasculaire de CSF est un moteur primaire du système glymphatique, une voie impliquée dans le dégagement des solutés métaboliques toxiques (par exemple, amyloïde-MD). Ici, nous illustrons une nouvelle technique d'imagerie macroscopique qui permet l'imagerie en temps réel et mésoscopique des traceurs fluorescents de CSF par le crâne intact des souris vivantes. Cette méthode peu invasive facilite une multitude de conceptions expérimentales et permet des tests uniques ou répétés de la dynamique du FSC. Les macroscopes ont une résolution spatiale et temporelle élevée et leur grande distance de portique et de travail permet l'imagerie tout en effectuant des tâches sur des dispositifs comportementaux. Cette approche d'imagerie a été validée à l'aide de mesures d'imagerie à deux photons et de fluorescence obtenues à partir de cette technique fortement corrélées avec la fluorescence ex vivo et la quantification des traceurs radio-étiquetés. Dans ce protocole, nous décrivons comment l'imagerie macroscopique transcrânienne peut être utilisée pour évaluer le transport glymphatique chez les souris vivantes, offrant une alternative accessible aux modalités d'imagerie plus coûteuses.
Introduction
Le liquide céphalo-rachidien (CSF) baigne le cerveau et la moelle épinière et est impliqué dans le maintien de l'homéostasie, l'approvisionnement en nutriments, et la régulation de la pression intracrânienne1. CSF dans l'espace subarachnoïde pénètre dans le cerveau à travers un réseau d'espaces périvasculaires (PVS) entourant les artères corticales piales, puis coule vers le bas le long des artérioles pénétrantes2. Une fois dans le parenchyme, Le CSF échange avec le liquide interstitiel (ISF), transportant des métabolites nocifs tels que l'amyloïde et les agrégats de protéines tau hors du cerveau par des voies de matière blanche à faible résistance et des espaces pereux2,3 . Cette voie dépend des canaux astroglial d'aquaporine-4 (AQP4) et a donc été appeléele système glil-lymphatique (glymphatique) 4. Les déchets du neuropil sont finalement éliminés du CSF-ISF par des vaisseaux lymphatiques près des nerfs crâniens et dans les méninges vers les ganglions lymphatiques cervicaux5. L'échec de ce système a été impliqué dans plusieurs maladies neurologiques telles que la maladie d'Alzheimer6,7, traumatisme crânien3, et l'AVC ischémique et hémorragique8.
Le transport De CSF peut être visualisé en infusant des traceurs dans la magna de cisterna (CM)9,10 et les études glymphatiques dans le passé ont principalement utilisé la microscopie de deux photons4,11,12, 13, imagerie par résonance magnétique (IRM)14,15,16,17, et ex vivo imagerie3,6,11, 18 pour évaluer la cinétique des traceurs. La microscopie à deux photons est une méthode appropriée pour l'imagerie détaillée des traceurs de CSF dans les PVS et le parenchyme en raison de sa haute résolution spatiale, cependant, il a un champ de vision étroit et nécessite une fenêtre crânienne envahissante ou l'amincissement du crâne. L'imagerie ex vivo, en combinaison avec l'immunohistochimie, permet des analyses à plusieurs niveaux allant des cellules individuelles jusqu'à l'ensemble du cerveau19. Cependant, le processus de perfusion-fixation qui est nécessaire pour observer le tissu post-mortem produit des changements profonds dans la direction de flux de CSF et s'effondre le PVS, modifiant considérablement la distribution et l'emplacement des traceurs12. Enfin, tandis que MRI peut suivre le flux de CSF dans l'ensemble du cerveau murine et humain, il manque de résolution spatiale et temporelle du flux périvasculaire.
Une nouvelle technique, l'imagerie macroscopique transcrânienne, résout certaines de ces limitations en permettant l'imagerie à large champ du transport périvasculaire de CSF dans le cortex dorsal entier des souris vivantes. Ce type d'imagerie est fait avec un macroscope épifluorescent utilisant un cube de filtre multibande, source de lumière LED réglable, et caméra CMOS à haut rendement10. Ces configurations sont capables de résoudre pvS jusqu'à 1-2 mm sous la surface du crâne et peuvent détecter les fluorophores jusqu'à 5-6 mm sous la surface corticale tout en laissant le crâne entièrement intact10. Les filtres multibandes et les LED qui peuvent rapidement régler la longueur d'onde de l'excitation permettent l'utilisation de fluorophores multiples permettant à CSF d'être étiqueté avec des traceurs de différents poids moléculaires et propriétés chimiques dans la même expérience.
Cette procédure nécessite une chirurgie simple et mini-invasive pour exposer le crâne et placer une plaque de tête légère pour stabiliser la tête pendant la séance d'imagerie. Les traceurs peuvent être livrés dans le CM sans percer dans le crâne ou pénétrer le tissu cortical avec des pipettes ou des canules9,20. Les canules CM et les plaques de tête restent stables pendant plusieurs jours à plusieurs semaines et facilitent des conceptions expérimentales plus complexes par rapport à la visualisation classique de point final. Ce protocole décrit comment la formation image macroscopique transcrânienne est employée pour étudier la fonction glymphatique de système suivant l'injection aigue ou chronique du traceur fluorescent de CSF dans le CM des souris anesthésiées/dormantes ou éveillées.
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Protocol
Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité universitaire sur les ressources animales (UCAR, Protocole no 2011-023) de l'Université de Rochester et réalisées selon le Guide des NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Préparation de la canule cisterna magna, plaque de tête et support de tête
- Stériliser tous les instruments chirurgicaux et les plaques de tête avant la chirurgie.
REMARQUE : Les traceurs fluorescents sont livrés directement dans CSF par l'intermédiaire d'une cannulation de magna de cisterna. Pour des instructions détaillées sur cette procédure, veuillez consulter Xavier et coll.9. - En bref, à l'aide d'un conducteur d'aiguille, casser la pointe d'une aiguille de 30 G x 12,7 mm (1/2 po), 3/4 du chemin vers le bas, et placer l'extrémité émoussée de l'aiguille dans une extrémité du tube en polyéthylène 10 (PE10) (environ 45 cm de long). Assurez-vous que seul le bevel dépasse de la bordure de la tubulure PE10.
- Casser 1/4 de l'extrémité bevée d'une autre aiguille 30G et placer l'extrémité émoussée de l'aiguille restante dans l'autre extrémité de la tubulure PE10, avec le plastique Luer-lock encore attaché.
- Remplir une seringue en verre de 100 l avec du CSF stérile et artificiel (aCSF : 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 m NaH2PO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM de glucose, et 26 mM NaHCO3).
- Fixez la seringue à l'extrémité de la ligne et remplissez-la d'un FSC jusqu'à ce qu'elle atteigne la pointe de l'aiguille bevée. Il est important que la seringue soit remblayée avec un ACSF et non de l'air, car une colonne d'air est plus sujette à des volumes d'infusion variables.
- Pour les expériences chroniques, quittez la ligne remplie d'aCSF et sautez l'étape 1.7.
- Pour les expériences aigues, placez la seringue sur une pompe à perfusion et retirez environ 5 mm d'air, ce qui empêchera le mélange. Ensuite, retirez le volume total de traceurs (s) qui est souhaité pour l'expérience (20% de plus est recommandé en raison de pertes d'espace morts).
REMARQUE : Le tube PE10 doit être assez long pour que la bulle d'air n'entre pas dans le brassard en plastique de la seringue en verre lors du chargement du traceur. Pour une expérience typique, le protocole utilise 10 ll d'albumine de sérum bovin conjugué à Alexa Fluor 647 (BSA-647) dilué dans aCSF à 0,5%. - Confirmez que la plaque de tête s'insère dans le support de la tête et qu'elle est la bonne taille pour la souris utilisée. Marqueurs anatomiques pour s'assurer que c'est: la bordure supérieure de la fenêtre s'aligne avec la ligne interoculaire et la bordure postérieure tombe rostral à la crête occipitale.
REMARQUE : Les plaques de tête en acier inoxydable peuvent être stérilisées et réutilisées. La plupart des mélanges de cyanoacrylate peuvent être enlevés avec une solution d'acétone.
2. Procédure chirurgicale
- Peser et anesthésier la souris (p. ex. kétamine/xylazine; 100 mg/kg de kétamine, 10 mg/kg de xylazine; i.p.).
- Une fois que la souris ne répond plus à une pincée d'orteil, humidifiez le cou et la tête avec de l'eau stérile et rasez à l'aide de tondeuses. Une fois la zone rasée, essuyez la zone à l'abri d'un écouvillon d'alcool pour enlever les poils résiduels.
REMARQUE : L'humidifier la fourrure avant de couper réduit considérablement la quantité de cheveux dans la fenêtre d'imagerie après l'incision. - Placez la souris dans un cadre stéréotaxique sur un tampon à température contrôlée et appliquez un onduleur ophtalmique de pétrole sur les yeux de la souris pour s'assurer qu'elle ne se dessèche pas.
- Nettoyer la peau exposée à l'eau de chlorhexidine. Après 2 min, retirer la chlorhexidine avec une lingette à alcool. Enfin, appliquez une solution d'iode qui peut être laissée sécher.
- Injecter l'analgésie sous-cutanée (0,25% Bupivacaine HCl) au sommet du crâne et du cou.
- En commençant par la partie du cou qui recouvre la crête occipitale, faire une coupure de ligne médiane dans la peau sus-jacente et continuer vers la ligne interorbitale. Inciser latéralement à la frontière où le muscle temporel s'insère dans le crâne. Enlever toute la peau de l'incision fusiforme pour exposer les os frontaux et pariétaux.
CAUTION: Le sinus rétroorbital se trouve caudal aux yeux et de grandes branches de la veine faciale postérieure se trouvent rostral à la pinna. Soyez prudent lors de l'incision pour épargner ces structures. Si cela se produit, arrêter le saignement en maintenant l'hémostase avec un coton-tige stérile pendant plusieurs minutes et continuer. - Irriguer le crâne avec saline stérile et nettoyer la surface à l'aide d'écouvillons de coton afin qu'il soit exempt de débris et de cheveux car ceux-ci interfèrent avec la qualité de l'image. La transparence du crâne est mieux préservée en laissant intact le périosteume et le fascia sus-susant.
REMARQUE : Si ces structures sont enlevées accidentellement, le crâne peut devenir sec et opaque au fil du temps. Re-humidifiez-vous avec l'aCSF ou utilisez un mélange d'huile de paraffine et de glycérol pour réduire la réflectoflanisation du crâne dans les expériences aigues21. - Procéder à l'insertion de la canule cisterna magna - pour les détails chirurgicaux de cette procédure, se référer à Xavier et al9.
- Après l'insertion de la canule CM, appliquer un mélange de ciment dentaire avec de la colle cyanoacrylate sur le côté ventral de la plaque de tête autour de la bordure et le placer sur le crâne de sorte que la bordure antérieure de la plaque de tête s'aligne avec la pointe postérieure de l'os nasal et le po la bordure stérile s'aligne avec l'aspect antérieur de l'os interpariétal, en s'assurant que la suture sagittale (ligne médiane) est centrée et droite par rapport à la fenêtre (Figure 1B).
- Fixer la position de la plaque de la tête à l'aide de quelques gouttes d'accélérateur de colle. Remplissez les lacunes restantes avec le mélange de ciment et guérissez-le avec un accélérateur.
CAUTION: Assurez-vous que le cyanoacrylate n'entre pas en contact avec les yeux de la souris ou de bloquer la fenêtre d'imagerie. - Collez la canule CM à la plaque de tête pour s'assurer qu'elles ne se détachent pas pendant le transport ou lorsque la souris se réveille.
- Pour les expériences aigues, passez à l'étape 2.16.
- Pour les expériences chroniques, appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate à séchage clair sur le crâne exposé, en prenant soin de ne pas créer de bulles car celles-ci interfèrent avec l'imagerie. La colle assure une protection pour le crâne et n'interfère pas avec l'imagerie. Assurez-vous que la colle couvre le crâne exposé tout le chemin à la peau à la bordure d'incision.
- Utilisez une pince à hemostat pour tenir le tube PE10 rempli d'aCSF à 2-3 cm du CM et coupez la ligne avec une pointe de cautérisation à haute température. Une fois qu'il est séparé, aplatir le tube PE10 fondu pour sceller la canule.
CAUTION: Assurez-vous de ne pas relâcher la pince jusqu'à ce que la canule a été scellée et confirmer qu'il n'y a pas de fuites dans le tube pour empêcher une fistule CSF. - Administrer le carprofène (5 mg/kg toutes les 24 h pendant 3 jours; i.p. ou s.c.) et remettre la souris dans une cage à un seul foyer à température contrôlée et lui permettre de récupérer pendant au moins 24 h avant l'imagerie. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu'à ce qu'elle retrouve une conscience suffisante pour maintenir la charge sévère. Les fenêtres crâniennes intactes restent stables pendant plusieurs semaines.
REMARQUE: L'expérience chronique peut être interrompue ici.
CAUTION : Quelques complications postopératoires sont : céphalohematoma/hématomes subgaleal, fistule de CSF, et infection. - Pour les expériences aigues, placez la souris dans le support de tête en utilisant la plaque de tête de sorte que le crâne est dans une position fixe. Assurez-vous de vérifier le niveau d'anesthésie et de placer un coussin chauffant sous la souris. La souris est maintenant prête à être prise au macroscope.
CAUTION: Transportez soigneusement la souris avec la pompe à perfusion sur un chariot. Si le cannulation de CM devient délogé, il causera une baisse de la pression intracrânienne et toutes les fuites de CSF modifieront les résultats expérimentaux.
3. Préparation de la souris pour l'imagerie
REMARQUE : Le protocole varie selon que l'expérience d'imagerie sera effectuée sur une souris anesthésiée (à partir de l'étape 3.1) ou éveillée (à l'étape 3.2).
- Souris anesthésiées
- Placez le support de tête sur la scène du macroscope, en s'assurant qu'il n'y a pas de plis dans la ligne de la pompe à seringue à la canule CM et qu'il n'est pas tendu car cela pourrait affecter l'infusion traceur.
- Observez la fréquence respiratoire et la coloration rose des muqueuses, ce qui indique une bonne oxygénation. Injecter saline sous-cutanée pour sécuriser le niveau d'hydratation si nécessaire. Vérifiez que l'animal est suffisamment anesthésié et re-dose si nécessaire.
- Allumez la caméra macroscope et leLED et démarrez le mode LIVE.
- Confirmer le grossissement du champ d'imagerie de sorte que la suture nasofrontal au sommet du champ et la suture lambdoid au fond peut clairement être visualisée, avec la suture sagittale parallèle et centrée au milieu de l'image (Figure 1C). Une fois en place, fixer le support de tête à l'étape du macroscope avec du ruban adhésif.
- Concentrez le macroscope sur le crâne exposé. Malgré une profondeur de champ relativement importante, la courbure du crâne de la souris ne permet qu'une zone spécifique d'être mise au point. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque le plan focal est situé sur les côtés latéraux des os pariétals postérieurs aux sutures coronales.
REMARQUE: C'est l'emplacement des artères cérébrales moyennes (MCA), où la plupart des flux de FSC se produit (Figure 1D,E)10.
- Souris éveillées
- Avant la séance d'imagerie, laissez les animaux récupérer pendant au moins 24 h de la chirurgie de la plaque de la tête. Des périodes de récupération plus longues (5-7 jours) sont également recommandées. Pendant ce temps, entraînez la souris à être la tête fixée sur la scène dans le tube de retenue pendant 0,5-1 h par jour pendant la durée de la période de récupération.
REMARQUE : L'habitude permet à la souris d'être attachée au support de tête sans anesthésie et réduit le stress et l'anxiété pendant l'expérience réelle. Si cela n'est pas faisable et que l'anesthésie n'interfère pas avec l'expérience, une dose d'induction d'un anesthésique inhalé (p. ex., isoflurane 2 % à 1-2 L/min O2 taux d'écoulement) peut être utilisée pour attacher rapidement la souris au stade de la tête. - Une fois que la souris est fixée au support de la tête et dans le tube de retenue, suivre les étapes 3.1.1-3.1.5.
- Avant la séance d'imagerie, laissez les animaux récupérer pendant au moins 24 h de la chirurgie de la plaque de la tête. Des périodes de récupération plus longues (5-7 jours) sont également recommandées. Pendant ce temps, entraînez la souris à être la tête fixée sur la scène dans le tube de retenue pendant 0,5-1 h par jour pendant la durée de la période de récupération.
4. Infusion de traceurs CSF fluorescents
-
CM Cannulation aigu
- Étant donné que le traceur était déjà chargé dans la canule avant d'être placé dans la cisterna magna à l'étape 1.6, placer la pompe à perfusion à la vitesse et au volume désirés. Les paradigmes de perfusion couramment utilisés sont de 5 à 10 L à 1-2 l/min, mais ces paramètres peuvent être ajustés en fonction de l'expérience particulière, ou de la taille et de l'âge de l'animal.
-
Cm Chronique Cannulation
- Avant de commencer la séance d'imagerie, suivez les étapes 1.2-1.7 pour des expériences aigues pour préparer la ligne d'infusion pour délivrer les traceurs.
- Une fois la ligne préparée, à l'aide d'une pince à hemostat, couper l'extrémité scellée de la canule CM chronique. Prenez l'aiguille de la ligne préparée à l'étape 4.2.1 et insérez-la délicatement dans la canule. Relâchez la pince et utilisez la pompe à seringues, avancez le traceur CSF au taux d'infusion souhaité (p. ex., 2 l/min) pour l'expérience jusqu'à ce que le traceur atteigne l'aiguille implantée dans le CM.
CAUTION: Si l'aiguille perce à travers le tube lors de la connexion de la ligne, retirez l'aiguille, couper le segment percé et répéter cette étape. Toute déchirure dans le tube PE10 provoquera une fuite et affectera les résultats de l'expérience.
5. Mise en place de la session d'imagerie
- En fonction de l'infusement du traceur fluorescent, déterminez la longueur d'onde de l'excitation et le temps d'exposition de chaque canal. Choisissez le temps d'exposition le plus court nécessaire pour visualiser le traceur afin de maximiser la résolution temporelle de l'imagerie time-lapse. Ce temps d'exposition sera utilisé pour toutes les expériences ultérieures visant à comparer le transport De FSC entre différents animaux.
REMARQUE : Une astuce consiste à utiliser le traceur de la ligne CM pour ajuster le temps d'exposition. Bien qu'il s'agisse d'une première approche utile, elle devrait être optimisée au fil du temps. - Choisissez la durée de l'expérience et les intervalles auxquels les images seront acquises. Les expériences durent normalement entre 30 et 60 min selon la phase de transport glymphatique qui intéresse. Les taux de trame de 1 cadre/min et plus rapides sont suffisants pour la plupart des expériences.
- Définir le nom du fichier et l'annuaire d'enregistrement.
- Si l'imagerie est recueillie en plus de l'acquisition simultanée d'autres variables (par exemple, électrocardiogramme, tension artérielle, électrophysiologie), le macroscope et la pompe peuvent être programmés pour être déclenchés avec le logiciel d'acquisition de données. Vérifiez que la fonction de déclenchement sur le macroscope est correcte avant de passer à l'étape suivante.
6. Expérience d'imagerie optique transcrânienne
- Démarrer l'infusion de traceur et l'imagerie en même temps.
- Vérifiez régulièrement la canule CM et le tube PE10 pour tout signe de fuite. S'il y a une fuite de traceur au CM, les résultats de cette expérience doivent être exclus.
REMARQUE : Si le traceur commence à s'accumuler dans le cervelet et ne voyage pas la voie glymphatique du MCA, il est probable que la canule de CM ait été injectée dans le cervelet. Ces données ne doivent pas être incluses. - Pour les expériences aigues, après l'achèvement de l'expérience, retirez la souris du microscope et vérifiez qu'elle est encore correctement anesthésiée. Décapiter rapidement la souris et récolter le tissu cérébral. Fixez le cerveau dans 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant la nuit à 4 oC.
- Pour les expériences chroniques, une fois l'imagerie terminée, retirez la ligne CM de la canule, rincer avec un aCSF stérile et refermer la canule CM avec une pointe de cautérisation à haute température. Retirez la souris du support de la tête et retournez-la dans sa cage. Répétez ce processus jusqu'à ce qu'une imagerie plus poussée ne soit pas nécessaire, puis suivez l'étape 6.3.
7. Analyse des données
REMARQUE : Les analyses basées sur Matlab, telles que le suivi frontal du FSC, peuvent extraire de grandes quantités de données quantitatives à partir des fronts du traceur dans ces ensembles de données d'imagerie10,22. Cependant, ces types de fichiers peuvent également être facilement importés et analysés dans des logiciels d'analyse d'images open-source comme Fidji23.
- Importer les piles d'images dans les îles Fidji à l'aide de l'outil d'importation Bio-Formats. Cette fonction préservera les métadonnées de fichiers qui incluent le temps et la résolution des pixels. Enregistrer la pile d'image comme un fichier .tiff.
- Dessinez manuellement une région d'intérêt (ROI) autour du crâne ou de la zone d'intérêt à l'aide de l'outil de sélection du polygone. Par exemple, dans la figure 1G, un roi-roi a été établi séparément pour l'ipsilatéral et pour l'hémisphère contralatéral après une lésion cérébrale traumatique. Assurez-vous d'ajouter le roi-roi dans le gestionnaire de roi-roi (Analyze -gt;Tools 'gt;ROI Manager) et enregistrez-le.
REMARQUE : Le transport Du FSC peut être quantifié de deux façons principales : 1) l'intensité moyenne de fluorescence au fil du temps ou 2) la zone d'afflux exprimée en pourcentage du retour sur investissement ou de la superficie totale (mm2) après avoir appliqué un seuil. Cette dernière méthode (figure 1H) sera décrite dans les étapes suivantes. - Fixez le seuil sur le cadre avec la fluorescence maximale (Select Image 'gt;Adjust'gt;Threshold...). Les méthodes de seuil automatisées telles que Otsu sont normalement bonnes pour détecter le traceur de CSF. Appliquer le seuil.
- Avant d'aller de l'avant, assurez-vous que dans Analyze -gt;Set Measurements, les options Zone et Zone Fraction sont sélectionnés. Ensuite, dans le gestionnaire de retour sur investissement , sélectionnez Plus -gt;Multi Measure.
- Convertir la valeur %Area en mm2 en utilisant la valeur zone du retour sur investissement à partir de la sortie. Les valeurs de la zone %reflètent le pourcentage de la surface corticale dorsal avec le traceur DeF.
- Terrain CSF traceur afflux en mm2 en fonction du temps.
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Representative Results
L'afflux de CSF est représenté sur un macroscope épifluorescent (Figure 1A), qui permet l'imagerie mésoscopique du transport de traceurs CSF dans le cortex murine. La plaque de tête du crâne entier permet la visualisation des os nasaux rostral, les os frontaux et pariétaux au centre, et la partie rostrale de l'os interpariétal caudally (Figure 1B). Pendant l'imagerie, les sutures nasofrontales, sagittales, coronales et lambdoid peuvent être facilement identifiées (figure 1C). Une fois que l'infusion de traceur CSF dans le CM commence (Figure 1D), fluorescence traceur est d'abord vu dans de grands bassins de CSF sous-arachnoïdide à la citerne basale, la citerne olfactofrontal, et la citerne quadrigeminale près de la cavité pinéale (Figure 1E , à gauche). Les traceurs de CSF entrent alors dans le cerveau le long des espaces périvasculaires des branches piales corticales de l'artère cérébrale moyenne (MCA) (figure 1E,droite).
L'imagerie optique transcrânienne peut être utilisée pour étudier la fonction glymphatique après une lésion cérébrale traumatique (ITC)3. Les souris ont reçu un TBI modéré et immédiatement après un traceur fluorescent de CSF (BSA-647) a été injecté dans le CM24. Le transport CSF a été photographié pendant 60 min après TBI (Figure 1F). L'imagerie macroscopique montre que le traceur est d'abord vu à la citerne olfactofrontal, mais l'afflux glymphatique le long des PVS corticales est complètement aboli sur le côté de la TBI (Figure 1G, Supp. Movie 1). L'effet inhibiteur du TBI sur la fonction glymphatique a été montré en utilisant plusieurs autres méthodes de quantification de traceuret pourrait sous-tendre la relation entre TBI et l'accumulation de A et tau vu après des dommages 3. L'analyse quantitative des images in vivo montre que la zone d'afflux ipsilatéral diminue de près d'un tiers par rapport à l'hémisphère contralatéral (Figure 1H).
Figure 1. Imagerie macroscopique transcrânienne. (A) Schéma de l'imagerie macroscopique mise en place. (B) Vue dorsale de la position de la plaque de tête sur le crâne. L'os interpariétal et les os nasaux, frontaux et pariétaux sont tous visibles. (C) Un crâne de souris exposé pendant l'imagerie avant que le traceur de CSF soit apparu, montrant clairement toutes les sutures crâniennes du crâne intact. Barre d'échelle : 1 mm (D) Schéma d'une vue latérale du traceur de CSF entrant dans la magna de cisterna (CM) et voyageant de la citerne basale le long de la voie lymphatique. (E, panneau gauche) Imagerie macroscopique de l'afflux glymphatique dans une souris de type sauvage anesthésié de ketamine-xylazine à 20 minutes après injection de CM (BSA-647 ; 10 l à 2 'L/min). Le traceur de CSF est vu dans la citerne olfactofrontal autour de la veine rhinale rostrale au-dessous de la suture nasofrontal, le long de certaines parties du sinus sagittal supérieur au-dessous de la suture sagittale, et dans l'encastrement pinéal entourant le sinus transversal au-dessous du lambdoid suture. (E, panneau droit) Le grossissement numérique de l'image sur la gauche montre la haute résolution spatiale obtenue avec ces microscopes. Le traceur de CSF se déplace dans les espaces périvasculaires de l'artère cérébrale moyenne (MCA)10. Barre d'échelle : 0.5 mm (F) Chronologie expérimentale. Une souris de type sauvage anesthésié a reçu une lésion cérébrale traumatique modérée (ITT)24 et immédiatement après une injection de CM (BSA-647; 10 l à 2 l/min), suivie de 60 min d'imagerie macroscopique. (G) Images en accéléré du transport de traceurs CSF après TBI (ligne en pointillé). Barre d'échelle : 1 mm (H) Zone d'influx (mm2) au-dessus de chaque hémisphère pendant l'expérience de 60 min, quantifiée à partir des ROIs dans (G), l'hémisphère qui a reçu TBI (ipsilateral) et l'hémisphère qui n'a pas (contralatéral). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1. Plan de la plaque de tête faite sur commande. (A, B) Mesures exactes (en mm) de la plaque de tête personnalisée utilisée dans le protocole d'imagerie macroscopique transcrânienne. Schémas 3D d'une plaque de tête évidée (C) et d'une plaque de tête entière (D). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Film supplémentaire 1. Imagerie en accéléré du transport de CSF après des dommages traumatiques modérés de cerveau à l'os pariétal gauche. Durée: 60 min. Barre à l'échelle: 1 mm S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Nous avons décrit un protocole détaillé pour exécuter la formation image transcrânienne de CSF dans les souris vivantes utilisant les macroscopes et les traceurs fluorescents commercialement disponibles. Cette technique est simple et peu invasive, mais quantitative. L'imagerie in vivo est bien corrélée avec des méthodes sensibles telles que le comptage de la scintillation liquide des traceurs étiquetés par radio, y compris 3H-dextran et 14C-inuline après la livraison de CM, et avec la quantification de section coronale ex vivo10, 18. La validation par microscopie à deux photons démontre que les traceurs cSF vus le long des vaisseaux sanguins corticaux sous le macroscope sont principalement situés dans les espaces périvasculaires du MCA et de ses branches10. Ces voies d'entrée de CSF sont une composante critique du système glymphatique19. Bien qu'ils ne soient pas couverts par ce protocole, ces configurations peuvent également être utilisées pour l'image des voies de dégagement cSF telles que les lymphatiques méningéens et cervicaux25,26.
L'amélioration de la conception des plaques de tête permet l'imagerie chronique, stable et à large champ d'une même souris au fil du temps. La forme, la taille et le poids de la plaque de tête peuvent être adaptés pour chaque application spécifique. Avec les progrès de la découpe au laser et de l'impression 3D, il y a peu de limitations quant aux spécifications. Le plaquage de tête permet également l'imagerie longitudinale des animaux anesthésiés ou éveillés et la capacité d'imager à travers un crâne intact évite la neuroinflammation et l'oedème liés au placement des fenêtres crâniennes ou minces de crâne27, 28 Annonces , 29. C'est un avantage important puisque la livraison stéréotaxique des traceurs fluorescents par le cortex dans le striatum ou les ventricules latéraux utilisant un trou crânien de burr réduisent considérablement la fonction glymphatique20,26. Les grandes distances de portique et de travail de la plupart des macroscopes commerciaux permettent aux souris d'être fixées à la scène dans diverses configurations, y compris les roues de course ou les labyrinthes flottants. Les souris peuvent être formées et habituées à être la tête fixée à l'étape du microscope au cours de la période de récupération de 5-7 jours pour faciliter l'imagerie éveillée30.
L'une des principales limites de cette méthode est la faible profondeur de pénétration du macroscope par rapport à la microscopie à deux photons10. Ce dispositif est capable de résoudre seulement quelques millimètres de la surface corticale sous le crâne intact. Cependant, bien que cela limite la formation image des processus se produisant plus profondément vers le bas dans le tissu, il n'est généralement pas un problème pour les analyses glymphatiques puisque les principales voies d'entrée sont principalement situés autour des artères principales de la surface corticale dorsal. En dépit d'être incapables de résoudre des structures plus profondes, les macroscopes avec des caméras scientifiques de CMOS à haut rendement ont la détection de fluorescence grande ; bien que le traceur ne soit pas situé à la surface du cerveau, l'intensité totale de fluorescence est en corrélation avec la quantité de traceur trouvée dans le cerveau à chaque moment après le début de l'injection de CM10. Ces paramètres sont améliorés par l'utilisation de traceurs infrarouges lointains, proches infrarouges ou infrarouges puisque l'imagerie à ces longueurs d'onde plus longues réduit l'autofluorescence des tissus et la diffusion de la lumière, et ont un rapport signal-bruit supérieur à une émission plus faible. fluorophores de longueur d'onde. Le macroscope standard permet l'imagerie de plus d'un traceur dans la même expérience. Selon la configuration du macroscope, la tourelle filtrée doit tourner entre les acquisitions, réduisant considérablement la résolution temporelle qui peut être obtenue. Ceci peut être amélioré par l'utilisation des LED réglables et d'un cube de filtre multibande. Malgré cette amélioration, l'imagerie multicanal n'est pas vraiment simultanée, puisqu'il y a un retard dans l'acquisition tandis que la LED bascule entre les longueurs d'onde d'excitation. Il est possible d'obtenir l'imagerie simultanée à double canal en utilisant des optiques de fractionnement d'image qui sont compatibles avec la plupart des configurations macroscopiques; cependant, ceux-ci sacrifient la résolution spatiale en divisant la pleine résolution de la caméra CMOS (2048 x 2048 pixels) en deux champs de vision avec la moitié de la résolution (1024 x 1024 pixels). Bien que les caméras CMOS sont tout à fait adéquates pour cette utilisation, l'utilisation d'une caméra CCD peut être appliquée à cette application ainsi. Un facteur supplémentaire qui réduit la résolution temporelle est le temps d'exposition nécessaire pour une excitation adéquate du fluorophore choisi, qui varie normalement entre 50 et 1000 ms. Cela peut être encore optimisé en utilisant soit 2x2 ou 4x4 pixels binning, ce qui réduit le temps d'exposition et augmente le taux d'image, au détriment de la résolution spatiale. Malgré ces limitations, l'imagerie multicanal macroscopique transcrânienne est capable d'atteindre des taux de trame entre 10-20 Hz avec une haute résolution spatiale.
Des exemples récents dans l'imagerie macroscopique transcrânienne ont utilisé l'aquaporine-4 (AQP4) assommer les souris10,20 et le facteur de croissance dérivé plaquettaire B (PDGF-B) rétention des souris knock-out22 pour démontrer l'importance de l'AQP4 et PDGF-B dans le système glymphatique. Les études ont utilisé des souris de type sauvage C57Bl6 pour comparer les lignées de souris knock-out. Ils ont transcranially image d'une souris pour une durée de 30 min en utilisant des traceurs fluorescents et les résultats ont conclu que les lignes knock-out avait considérablement réduit l'afflux de CSF par rapport aux types sauvages.
Ces propriétés font de l'imagerie optique transcrânienne une technique idéale pour étudier le transport du FSC, en particulier entre 2 cohortes ou plus d'animaux. Il permet de mesurer la cinétique des traceurs intracistesrnal chez les souris vivantes à une résolution à l'échelle micron, à une fraction du coût d'autres modalités d'imagerie in vivo. Cette technique permet l'étude du système glymphatique d'une manière physiologique, non-invasive, et a été utile pour aider à élucider certains des facteurs qui régulent sa fonction dans la santé et la maladie10,20,25 . Cependant, son attribut le plus intéressant est son potentiel pour répondre aux questions futures sur l'hydrodynamique CSF.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ces travaux ont été financés par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke et le National Institute on Aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 et RF1AG057575 à MN), le Programme des réseaux transatlantiques d'excellence de la Fondation Leducq et le programme de recherche et d'innovation DE l'UE Horizon 2020 (subvention no 666881; SVDs-target). Nous tenons également à remercier Dan Xue pour son aide experte en illustrations graphiques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane - Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
References
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