Summary
Transkraniell optisk tenkelig innrømmer bred-åker tenkelig av spinal Fluid transport inne det cortex av bo mus igjennom en Behold Skull.
Abstract
Spinalvæske (CSF) flyt i gnagere har i stor grad blitt studert ved hjelp av ex vivo kvantifisering av Bevegelsesuskarphet. Teknikker som to-Foton mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MRI) har aktivert in vivo kvantifisering av CSF flyt, men de er begrenset av redusert bildebehandling volumer og lav romlig oppløsning, henholdsvis. Nyere arbeid har funnet at CSF kommer inn i hjernen parenchyma gjennom et nettverk av inflammasjon mellomrom rundt saify og gjennomtrengende arterier av gnager cortex. Denne inflammasjon oppføring av CSF er en primær driver av glymphatic systemet, en sti innblandet i clearance av giftige metabolske oppløsninger (f. eks, amyloid-β). Her illustrerer vi en ny makroskopisk Imaging teknikk som gjør at sanntid, Mesoskopisk Imaging av fluorescerende CSF Bevegelsesuskarphet gjennom intakt skallen av levende mus. Denne minimalt-invasiv metode forenkler en rekke eksperimentelle design og muliggjør enkel eller gjentatt testing av CSF dynamikk. Macroscopes har høy romlig og tidsmessig oppløsning og deres store Portal og arbeidsavstand tillater bildebehandling mens du utfører oppgaver på atferds enheter. Denne Imaging tilnærmingen har blitt validert ved hjelp av to-Foton Imaging og fluorescens målinger innhentet fra denne teknikken sterkt relatere med ex vivo fluorescens og kvantifisering av radio-merket Bevegelsesuskarphet. I denne protokollen beskriver vi hvordan Transkraniell makroskopisk Imaging kan brukes til å evaluere glymphatic transport i levende mus, og tilbyr et tilgjengelig alternativ til mer kostbare bildebehandlings metoder.
Introduction
Spinalvæske (CSF) bader hjernen og ryggmargen og er involvert i å opprettholde homeostase, forsyne næringsstoffer, og regulere intrakraniell trykk1. CSF i subarachnoid plass inn i hjernen gjennom et nettverk av inflammasjon mellomrom (PVS) rundt kortikale saify arterier og deretter renner ned langs gjennomtrengende arterioler2. En gang i parenchyma, CSF utveksling med interstitiell væske (ISF), bærer skadelige metabolitter som amyloid-β (Aβ) og tau protein aggregater ut av hjernen gjennom lav motstand hvite materie traktater og perivenous mellomrom2,3 . Denne veien er avhengig av astroglial aquaporin-4 (AQP4) kanaler og har derfor blitt kalt gliacellene-lymfatisk (glymphatic) system4. Avfallsprodukter av neuropil er til slutt ryddet fra CSF-ISF gjennom lymfatisk fartøy nær skallen nerver og i hjernehinnene ut mot cervical lymfeknuter5. Svikt i dette systemet har vært innblandet i flere nevrologiske sykdommer som Alzheimers sykdom6,7, traumatisk hjerneskade3, og iskemiske og hemoragisk hjerneslag8.
CSF transport kan bli visualisere av infusjonen Bevegelsesuskarphet inn i Cisterna magna (cm)9,10 og glymphatic studier i det siste har i hovedsak benyttet to-Foton mikroskopi4,11,12, 13, magnetisk resonans imaging (MRI)14,15,16,17og ex vivo Imaging3,6,11, 18 for å evaluere Tracer Kinetics. To-Foton mikroskopi er en egnet metode for detaljert bildebehandling av CSF Bevegelsesuskarphet i PVSs og parenchyma på grunn av sin høye romlig oppløsning, men den har et smalt synsfelt og krever en invasiv skallen vindu eller tynning av skallen. Ex vivo Imaging, i kombinasjon med immunhistokjemi, gir flere nivåer analyser som spenner fra enkeltceller opp til hele hjernen19. Men prosessen med å ta av-fiksering som er nødvendig for å observere post-obduksjon vev produserer dyptgripende endringer i CSF Flow retning og kollapser i PVS, betydelig endre fordelingen og plasseringen av Bevegelsesuskarphet12. Til slutt, mens Mr kan spore CSF flyt gjennom hele murine og menneskelige hjerne, mangler det romlig og timelig oppløsning av inflammasjon flyt.
En ny teknikk, Transkraniell makroskopisk Imaging, løser noen av disse begrensningene ved å muliggjøre bred-feltet Imaging av inflammasjon CSF transport i hele rygg cortex av levende mus. Denne type av tenkelig er gjort med en epifluorescent macroscope benytter en Multiband filterene terningen, tunable smal avsats lyset kilde, og høy-effektiv CMOS kameraet10. Disse set-ups er i stand til å løse PVSs opp til 1-2 mm under hodeskallen overflaten og kan oppdage fluorophores opp til 5-6 mm under kortikale overflaten mens du forlater skallen helt intakt10. Multiband filtre og lysdioder som raskt kan tune eksitasjon bølgelengde aktivere bruk av flere fluorophores slik at CSF å bli merket med Bevegelsesuskarphet av ulike molekylære vekter og kjemiske egenskaper i samme eksperiment.
Denne prosedyren krever en enkel, minimalt invasiv kirurgi for å eksponere skallen og plassere en lett hode plate å stabilisere hodet under bildebehandling økten. Bevegelsesuskarphet kan leveres inn i cm uten å bore inn i skallen eller trenge gjennom kortikale vevet med Pipetter eller kanyler9,20. Begge CM kanyler og hode platene forblir stabile i flere dager til uker og tilrettelegge for mer komplekse eksperimentelle design i forhold til den klassiske end-punkt visualisering. Denne protokollen beskriver hvordan Transkraniell makroskopisk Imaging brukes til å studere glymphatic systemfunksjon etter akutt eller kronisk injeksjon av fluorescerende CSF Tracer i CM av anesthetized/sovende eller våken mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble godkjent av universitets komitéen på Animal Resources (UCAR, Protocol no. 2011-023) ved University of Rochester og utført i henhold til NIH guide for omsorg og bruk av Laboratory Animals.
1. forberede Cisterna magna kanyle, hode plate, og hode holder
- Sterilisere alle kirurgiske instrumenter og hode plater før operasjonen.
Merk: fluorescerende Bevegelsesuskarphet leveres direkte inn i CSF via en Cisterna magna kanyleringen. For detaljerte instruksjoner om denne prosedyren, kan du se Xavier et al9. - Kort, ved hjelp av en nål sjåfør, bryte spissen av en 30G x 12,7 mm (1/2 tommer) nål, 3/4 av veien ned, og plasser den butte enden av nålen i den ene enden av polyetylen 10 (PE10) slange (ca 45 cm lang). Pass på at bare skråkant stikker ut av grensen til PE10 slangen.
- Break off 1/4 av skrå enden av en annen 30G nål og plasser den butte enden av den gjenværende nålen i den andre enden av PE10 slangen, med plast Luer-lock fortsatt festet.
- Fyll en 100 μL glass sprøyte med steril, kunstig CSF (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mm MgSO4, 2 mm CaCl2, 10 mm glukose og 26 mm NaHCO3).
- Fest sprøyten til enden av linjen og fyll den med aCSF til den når tuppen av skrå nålen. Det er viktig at sprøyten er fylt med aCSF og ikke luft, da en luftspalte er mer utsatt for variable infusjons volumer.
- For kroniske eksperimenter lar du linjen være fylt med aCSF og hopper over trinn 1,7.
- For akutte eksperimenter plasserer du sprøyten på en infusjons pumpe og trekker ut ca. 5 mm luft, noe som vil hindre miksing. Etterpå, trekke det totale volumet av Tracer (s) som er ønsket for eksperimentet (20% ekstra anbefales på grunn av døde plass tap).
Merk: PE10-slangen bør være lang nok slik at luftboblen ikke kommer inn i plast mansjetten på glass sprøyten når du legger i sporings apparatet. For en typisk eksperiment, bruker protokollen 10 μL av storfe serum albumin bøyd til Alexa fluor 647 (BSA-647) fortynnet i aCSF på 0,5%. - Kontroller at hode platen passer inn i hode holde ren og at den har riktig størrelse for musen som brukes. Anatomiske markører for å sikre dette er: den øverste grensen av vinduet justeres med interocular linjen og den bakre grensen faller rostral til occipital Crest.
Merk: hode platene i rustfritt stål kan steriliseres og gjenbrukes. De fleste Cyanoacrylate blandinger kan fjernes med en aceton løsning.
2. kirurgisk prosedyre
- Veie og bedøve musa (f. eks ketamin/xylazine; 100 mg/kg Ketamin, 10 mg/kg xylazine; IP).
- Når musen ikke lenger reagerer på en tå knipe, fukte nakken og hodet med sterilt vann og barbering med Clippers. Når området er barbert, tørk av området med en alkoholserviett igjen for å fjerne eventuelle rester av hår.
Merk: fukte pelsen før klipping dramatisk reduserer mengden av hår i bildebehandlings vinduet etter snittet. - Plasser musen i en stereotactic ramme på toppen av en temperatur-kontrollerte pad og påfør Petroleum øye salve til musen øyne for å sikre at de ikke tørker ut.
- Rengjør den eksponerte huden med en klorheksidin serviett. Etter 2 min., Fjern klorheksidin med en alkoholserviett. Til slutt, Påfør en jod løsning som kan bli etterlatt for å tørke.
- Injiser subkutan analgesi (0,25% Bupivakain HCl) til toppen av skallen og nakken.
- Starter på den delen av nakken som dekker occipital Crest, lage en midtlinjen kutt i overliggende hud og fortsette rostrally mot interorbital linjen. Incise sideveis til grensen der Tinning muskelen setter inn i skallen. Fjern alle hud av fusiform snitt for å avdekke både frontal og parietal bein.
FORSIKTIG: den retroorbital sinus ligger caudal til øynene og store grener av bakre ansikts vene ligger rostral til høydepunkt. Vær forsiktig når du gjør snittet til overs disse strukturene. Hvis dette skjer, stopp blødningen ved å opprettholde hemostase med en steril bomullsdott i flere minutter og fortsette. - Skyll skallen med sterilt saltvann og rengjør overflaten med bomullspinner slik at den er fri for rusk og hår siden disse vil forstyrre bildekvaliteten. Skull åpenhet er best bevarte ved å forlate periosteum og overliggende konseptkjedene intakt.
Merk: Hvis disse strukturene er tilfeldigvis fjernet, skallen kan bli tørr og ugjennomsiktig over tid. Re-fukte med aCSF eller bruke en blanding av parafin olje og glyserol for å redusere skallen refleksjon i akutte eksperimenter21. - Fortsett å sette inn Cisterna magna kanyle-for kirurgiske detaljer om denne prosedyren, se Xavier et al9.
- Etter innsetting av CM kanyle, Påfør en blanding av Dental sement med Cyanoacrylate lim til den ventrale siden av hodet plate rundt grensen og plassere den på skallen slik at den fremre grensen av hodet platen justeres med bakre spissen av nese benet og PO sterior grensen justeres med fremre aspekt av interparietal bein, og pass på at sagittal Sutur (midtlinjen) er sentrert og rett i forhold til vinduet (figur 1B).
- Fastsette posisjonen til hoved platen ved hjelp av et par dråper lim akselerator. Fyll eventuelle gjenværende hullene med sementblandingen og kurere den med akselerator.
FORSIKTIG: Pass på at Cyanoacrylate ikke kommer i kontakt med øynene til musen eller blokkerer bildevinduet. - Lim CM-kanyle på hode platen for å sikre at disse ikke løsner under transporten eller når musen våkner.
- For akutte eksperimenter, hopp til trinn 2,16.
- For kroniske eksperimenter, Påfør et tynt lag med klar tørking Cyanoacrylate lim til den eksponerte skallen, være forsiktig med å lage bobler da disse vil forstyrre bildebehandling. Limet gir beskyttelse for skallen og vil ikke forstyrre bildebehandling. Sørg for at limet dekker den eksponerte skallen hele veien til huden ved snitt grensen.
- Bruk en hemostat klemme til å holde den aCSF-fylte PE10 slangen 2-3 cm fra CM og skjær linjen med en høy temperatur cauterization spissen. Når den er separert, flat den smeltet PE10 slangen for å forsegle kanyle.
FORSIKTIG: Pass på at du ikke slipper klemmen før etter at kanyle er lukket, og Bekreft at det ikke er lekkasjer i slangen for å forhindre en CSF-fistel. - Administrer karprofen (5 mg/kg hver 24 h for 3 dager, IP eller SC) og returner musen til en temperaturstyrt, enkelt plassert bur og la den komme i minst 24 timer før bildebehandling. Ikke la musen uten tilsyn før den gjenvinner tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Intakt skallen Vinduer forblir stabile i flere uker.
Merk: det kroniske eksperimentet kan stanses midlertidig her.
FORSIKTIG: noen postoperative komplikasjoner er: cephalohematoma/subgaleal hematomer, CSF fistel, og infeksjon. - For akutte eksperimenter, Plasser musen inn i hode holde ren ved hjelp av hoved platen slik at skallen er i en fast posisjon. Sørg for å sjekke anestesi nivå og plassere en oppvarming pad under musen. Musen er nå klar til å bli tatt til macroscope.
FORSIKTIG: transporter musen forsiktig sammen med infusjons pumpen i en vogn. Hvis CM kanyleringen blir forskyves, vil det føre til et fall i intrakraniell trykk og eventuelle CSF lekkasjer vil endre de eksperimentelle resultatene.
3. klargjøre musen for bildebehandling
Merk: protokollen varierer avhengig av om bilde eksperimentet skal utføres på en anesthetized (Start på trinn 3,1) eller våken (Start på trinn 3,2).
- Anesthetized mus
- Sett hode holde ren på macroscope trinn, og pass på at det ikke er noen knekk i linjen fra sprøyte pumpen til CM-kanyle, og at den ikke er stram siden dette kan påvirke sporings infusjonen.
- Observere respirasjonsfrekvens og rosa farge av slimhinner, indikerer god oksygenering. Injiser saltvann subkutant for å sikre væskenivået om nødvendig. Kontroller at dyret er tilstrekkelig anesthetized og re-dose hvis nødvendig.
- Slå på macroscope kamera og LED og start LIVE modus.
- Bekreft forstørrelsen av bildefeltet slik at nasofrontal Sutur på toppen av feltet og lambdoid Sutur på bunnen kan tydelig bli avbildet, med sagittal Sutur parallelt og sentrert til midten av bildet (figur 1C). Når du er på plass, fester du hode holde ren til den macroscope scenen med tape.
- Fokuser macroscope på den eksponerte skallen. Til tross for macroscopes å ha en relativt stor dybdeskarphet, kan krumning av musen skallen bare for et bestemt område å være i fokus. Best resultater oppnås når fokalplanet er plassert på den laterale sidene av parietal bein bakre til koronale sting.
Merk: Dette er plasseringen av midt cerebral arterier (MCA), der de fleste CSF tilsig oppstår (figur 1d, E)10.
- Våkne mus
- Før bildebehandlings økten, la dyrene komme seg i minst 24 h fra hodet plate kirurgi. Lengre utvinning perioder (5-7 dager) er også anbefalt. I løpet av denne tiden, trene musen til å være hodet festet på scenen i tilbakeholdenhet røret for 0,5-1 t per dag for varigheten av utvinningen perioden.
Merk: tilvenning gjør at musen kan festes til hode holde ren uten anestesi og reduserer stress og angst under selve eksperimentet. Hvis dette ikke er gjennomførbart og anestesi ikke forstyrrer eksperimentet, en induksjon dose av en inhalert bedøvelse (f. eks, isoflurane 2% ved 1-2 L/min O2 flow rate) kan brukes til å raskt feste musen til hodet scenen. - Når musen er festet til hodet holderen og i tilbakeholdenhet røret, Følg trinn 3.1.1-3.1.5.
- Før bildebehandlings økten, la dyrene komme seg i minst 24 h fra hodet plate kirurgi. Lengre utvinning perioder (5-7 dager) er også anbefalt. I løpet av denne tiden, trene musen til å være hodet festet på scenen i tilbakeholdenhet røret for 0,5-1 t per dag for varigheten av utvinningen perioden.
4. infusjon av fluorescerende CSF Bevegelsesuskarphet
-
Akutt CM Kanyleringen
- Siden Tracer var allerede lastet inn i kanyle før de ble plassert i Cisterna magna i trinn 1,6, sette infusjon pumpen til ønsket hastighet og volum. Infusjons paradigmer som rutinemessig brukes er 5-10 μL ved 1-2 μL/min, men disse parametrene kan justeres avhengig av det bestemte eksperimentet, eller størrelsen og alderen på dyret.
-
Kronisk CM Kanyleringen
- Før du starter bildebehandlings økten, følger du trinn 1.2-1.7 for akutte eksperimenter for å klargjøre infusjons linjen for å levere Bevegelsesuskarphet.
- Når linjen er utarbeidet, ved hjelp av en hemostat klemme kuttet den forseglede enden av den kroniske CM kanyle. Ta nålen fra linjen forberedt i trinn 4.2.1 og sett den forsiktig inn i kanyle. Løsne klemmen og bruk sprøyte pumpen og før CSF-Tracer-en til ønsket infusjonshastighet (f.eks. 2 μL/min) for eksperimentet, til den når en implantert nål i CM.
FORSIKTIG: Hvis nålen gjennomborer gjennom slangen når du kobler linjen, Fjern nålen, kutt gjennomboret segmentet og gjenta dette trinnet. Enhver tåre i PE10-slangen vil forårsake en lekkasje og påvirke resultatene av eksperimentet.
5. sette opp Imaging Session
- Basert på fluorescerende Tracer som blir tilført, bestemme eksitasjon bølgelengde og eksponeringstid for hver kanal. Velg den korteste eksponeringstiden som er nødvendig for å visualisere Tracer for å maksimere Temporal oppløsning av tidsforløp Imaging. Denne eksponeringstiden vil bli brukt for alle etterfølgende eksperimenter med sikte på å sammenligne CSF transport mellom forskjellige dyr.
Merk: ett tips er å bruke Tracer i CM-linjen for å justere eksponeringstiden. Selv om dette er en nyttig første tilnærming, bør dette være optimalisert over tid. - Velg varigheten på eksperimentet og intervallene for når bildene skal anskaffes. Eksperimenter normalt vare mellom 30-60 min avhengig av hvilken fase av glymphatic transport er av interesse. Bildefrekvenser på 1 ramme/min og raskere er tilstrekkelig for de fleste eksperimenter.
- Angi filnavnet og lagringsmappen.
- Hvis bildebehandling vil bli samlet i tillegg til samtidig anskaffelse av andre variabler (for eksempel elektro, arteriell blodtrykk, elektrofysiologi), kan macroscope og pumpen programmeres til å utløses med datainnsamlingsprogram varen. Kontroller at utløsnings funksjonen på macroscope er riktig før du går til neste trinn.
6. Transkraniell optisk tenkelig eksperiment
- Start Tracer infusjon og bildebehandling på samme tid.
- Sjekk rutinemessig CM-kanyle og PE10-slangen for tegn på en lekkasje. Hvis det er noen Tracer lekker på CM, resultatene fra dette eksperimentet må utelukkes.
Merk: Hvis Tracer begynner å akkumulere i lillehjernen og ikke reise glymphatic veien av MCA, er det sannsynlig at CM kanyle ble injisert i lillehjernen. Disse dataene bør ikke inkluderes. - For akutte eksperimenter, etter fullføring av eksperimentet, Fjern musen fra mikroskopet og kontroller at det fortsatt er tilstrekkelig anesthetized. Raskt halshugge musen og høste hjernevevet. Immersion-fest hjernen i 4% paraformaldehyde (PFA) over natten ved 4 ° c.
- For kroniske eksperimenter, når bildebehandling er fullført, fjerne CM linje fra kanyle, flush med sterile aCSF og forsegle CM kanyle med en høy temperatur cauterization spissen. Fjern musen fra hodet stå og returnere den til buret sitt. Gjenta denne prosessen til videre avbildning ikke er nødvendig, og følg deretter trinn 6,3.
7. data analyse
Merk: MATLAB-baserte analyser, som for eksempel CSF front-tracking, kan trekke ut store mengder kvantitative data fra Tracer fronter i disse bildedata settene10,22. Imidlertid kan disse filtypene også enkelt importeres og analyseres i åpen kildekode bildeanalyse programvare som Fiji23.
- Importer bilde bunkene til Fiji ved hjelp av import verktøyet for bio-formater. Denne funksjonen vil bevare fil metadataene som inkluderer tids-og piksel oppløsningen. Lagre bilde stabelen som en TIFF-fil.
- Tegn manuelt en region av interesse (ROI) rundt skallen eller interesseområdet ved hjelp av polygon markeringsverktøyet. For eksempel, i figur 1g en ROI ble trukket separat for ipsilateral og for den kontralateral halvkule etter en traumatisk hjerneskade. Sørg for å legge til AVKASTNINGEN i ROI manager (analyser > Verktøy > ROI Manager) og lagre den.
Merk: CSF transport kan kvantifisert på to måter: 1) bety fluorescens intensitet over tid eller 2) tilstrømningen området uttrykt som en prosentandel av AVKASTNINGEN eller totalt areal (mm2) etter å ha brukt en terskel. Den sistnevnte metoden (figur 1h) vil bli beskrevet i de neste trinnene. - Angi terskelen på rammen med maksimal fluorescens (Velg bilde ≫ juster ≫ terskel...). Automatiserte terskel metoder som Otsu er normalt flinke til å oppdage CSF Tracer. Bruk terskelen.
- Før du går videre, må du kontrollere at alternativer- området og område brøk er valgt i analyser > angitte mål . Så i ROI Manager, velg mer > multi mål.
- Konverter %-område verdien til mm2 ved hjelp av område verdien for avkastningen fra utdataene. % Area verdiene reflekterer prosent av rygg kortikale overflate med CSF Tracer.
- Plot CSF Tracer tilstrømningen i mm2 som en funksjon av tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CSF tilstrømningen er avbildet på en epifluorescent macroscope (figur 1a), som gjør det mulig for Mesoskopisk AVBILDNING av CSF Tracer Transport i murine cortex. Hele-skallen hodet plate tillater visualisering av rostral nese bein, både frontal og parietal bein i sentrum, og den rostral delen av interparietal bein caudally (figur 1B). Under bildebehandling kan nasofrontal, sagittal, koronale og lambdoid sting lett identifiseres (figur 1C). Når infusjon av CSF Tracer i CM begynner (figur 1d), Tracer fluorescens er først sett i store bassenger av subarachnoid CSF på basal beholder, olfactofrontal, og quadrigeminal i nærheten av Peneal fordypningen (figur 1e , venstre). CSF Bevegelsesuskarphet deretter inn i hjernen langs inflammasjon områder av kortikale saify grener av midten cerebral arterien (MCA) (figur 1e, høyre).
Transkraniell optisk tenkelig kan brukes å studere glymphatic funksjonen etter traumatisk hjerne skaden (TBI)3. Mus fikk en moderat TBI og umiddelbart etterpå en fluorescerende CSF Tracer (BSA-647) ble injisert i CM24. CSF transport ble avbildet for 60 min etter TBI (figur 1F). Makroskopisk Imaging viser at Tracer er først sett på olfactofrontal beholder, men glymphatic tilstrømningen langs kortikale PVSs er fullstendig avskaffet på siden av TBI (figur 1g, SUPP. film 1). Den hemmende effekten av TBI på glymphatic funksjon har blitt vist ved hjelp av flere andre Tracer kvantifisering metoder og kunne ligger til grunn forholdet mellom TBI og akkumulering av Aβ og tau sett etter skade3. Kvantitativ analyse av in vivo bilder viser at ipsilateral tilstrømningen området er redusert nesten en tredjedel i forhold til den kontralateral halvkule (figur 1h).
Figur 1. Transkraniell makroskopisk Imaging. (A) skjematisk av makroskopisk Imaging satt opp. (B) rygg utsikt over posisjonen til hode platen på skallen. Den interparietal bein og nese, frontal, og parietal bein er alle synlige. (C) en eksponert mus skallen under IMAGING før CSF Tracer har dukket opp, tydelig viser alle skallen sting av intakt skallen. Scale bar: 1 mm (D) skjematisk av en lateral visning av CSF Tracer inn i Cisterna magna (cm) og reise fra basal beholder langs glymphatic veien. (E, venstre panel) Makroskopisk avbildning av glymphatic tilstrømningen i en ketamin-xylazine anesthetized wildtype mus ved 20 minutter post CM injeksjon (BSA-647; 10 μL ved 2 μL/min). CSF Tracer er sett i olfactofrontal beholder rundt rostral rhinal vene under nasofrontal Sutur, langs noen deler av overlegen sagittal sinus under sagittal Sutur, og i Peneal fordypningen rundt tverrgående sinus under lambdoid Sutur. (E, høyre panel) Digital forstørrelse av bildet til venstre viser høy romlig oppløsning oppnådd med disse mikroskop. CSF Tracer reiser innenfor inflammasjon områder av midten cerebral arterien (MCA)10. Skala bar: 0,5 mm (F) eksperimentell tidslinje. En anesthetized wildtype mus mottok en moderat traumatisk hjerneskade (TBI)24 og umiddelbart etter en cm-INJEKSJON (BSA-647; 10 μL ved 2 μL/min), etterfulgt av 60 min. makroskopisk bilde. (G) tidsforløpbilder av CSF Tracer Transport etter TBI (stiplet linje). Scale bar: 1 mm (H) tilstrømning området (mm2) over hver halvkule i 60-min eksperiment, kvantifisert fra ROIs i (G), den halvkule som fikk TBI (ipsilateral) og halvkule som ikke (kontralateral). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1. Blueprint av tilpasset hode plate. (A, B) nøyaktige mål (i mm) på den egendefinerte hode platen som brukes i Transkraniell makroskopisk bilde protokoll. 3D-skjemaer av en uthult ut hode plate (C) og en hel hode plate (D). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggs film 1. Time-lapse Imaging av CSF transport etter moderat traumatisk hjerneskade på venstre parietal bein. Varighet: 60 min. Scale bar: 1 mm Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en detaljert protokoll for å utføre Transkraniell CSF Imaging i levende mus ved hjelp av kommersielt tilgjengelige fluorescerende macroscopes og Bevegelsesuskarphet. Denne teknikken er enkel og minimalt-invasiv, men kvantitativ. In vivo Imaging samsvarer godt med følsomme metoder som flytende scintillation telling av radio-merket Bevegelsesuskarphet inkludert 3H-dextran og 14C-inulin etter cm levering, og med ex vivo koronale delen kvantifisering10, 18 i år. Godkjenningen med to-Foton mikroskopi demonstrerer at CSF Bevegelsesuskarphet sett langs kortikale blodkar under macroscope er primært plassert innenfor inflammasjon områder av MCA og dens grener10. Disse CSF tilsig trasé er en kritisk komponent i glymphatic systemet19. Selv om det ikke dekkes i denne protokollen, kan disse set-ups også brukes til bilde CSF klaring trasé som meningeal og cervical lymphatics25,26.
Forbedringer i hodet plate design muliggjør kroniske, stabile, Wide-feltet Imaging av samme mus over tid. Hode plateform, størrelse og vekt kan skreddersys for hvert enkelt program. Med fremskritt innen laserskjæring og 3D-utskrift er det få begrensninger på spesifikasjonene. Head plating gir også for langsgående Imaging av enten anesthetized eller våken dyr og evnen til bildet gjennom en intakt skallen unngår nevroinflammasjon og ødem forbundet med plassering av skallen eller tynne skallen Vinduer27, 28 flere , 29. Dette er en viktig fordel siden stereotaxic levering av fluorescerende Bevegelsesuskarphet gjennom cortex i striatum eller lateral ventriklene ved hjelp av en skallen Burr hullet sterkt redusere glymphatic funksjon20,26. De store Portal-og arbeids avstandene til de fleste kommersielle macroscopes gjør det mulig for mus å festes til scenen i ulike konfigurasjoner, inkludert løpe hjul eller flytende labyrinter. Mus kan trenes og habituated til å være hodet festet til mikroskopet scenen i løpet av 5-7-dagers utvinning periode for å lette våken Imaging30.
En av de viktigste begrensningene for denne metoden er den lave gjennomtrenging dybden av macroscope sammenlignet med to-Foton mikroskopi10. Denne enheten er i stand til å løse bare noen få millimeter av kortikale overflaten under intakt skallen. Men mens dette begrenser Imaging av prosesser som forekommer dypere ned i vevet, er det vanligvis ikke et problem for glymphatic analyser siden de store rutene for oppføring er primært plassert rundt de viktigste arteriene i rygg kortikale overflaten. Til tross for tilværelse ute av stand til å løse dypere strukturer, macroscopes med høy effektiv naturvitenskapelig CMOS kamera ha stor fluorescens oppdagelsen; til tross for Tracer ikke ligger på hjernen overflaten, totalt fluorescens intensitet samsvarer med mengden av Tracer funnet i hjernen på hvert tidspunkt etter starten av CM injeksjon10. Disse parametrene er forbedret ved bruk av langt-rødt, nær-infrarød, eller infrarød Bevegelsesuskarphet siden Imaging på disse lengre bølgelengder reduserer vev Auto-fluorescens og spredning av lys, og har en overlegen signal-til-støy-forhold enn lavere utslipp bølgelengde fluorophores. Standard macroscope gjør det mulig å avbilde mer enn én Tracer i samme eksperiment. Avhengig av konfigurasjonen av macroscope, har filter turret å rotere mellom oppkjøp, drastisk redusere Temporal oppløsning som kan skaffes. Dette kan forbedres ved bruk av tunable lysdioder og en Multiband filter kube. Til tross for denne forbedringen, er flerkanals bilde ikke helt samtidige, siden det er en forsinkelse i oppkjøpet mens LED veksler mellom eksitasjon bølgelengder. Det er mulig å oppnå samtidig tokanals Imaging ved hjelp av bilde splitting optikk som er kompatible med de fleste makroskopisk set-ups; Imidlertid, disse ofring romlig resolution av deler det i sin helhet resolution av det CMOS kameraet (2048 x 2048 pixel) i to felter av utsikt med halv oppløsningen (1024 x 1024 pixel). Stund CMOS kamera er helt adekvat for denne utnyttelse, bruken av en CCD kameraet kan henvendte til denne søknad likeledes. En ekstra faktor som reduserer Temporal oppløsning er eksponeringstiden som kreves for tilstrekkelig eksitasjon av den valgte fluoroforen, som normalt spenner mellom 50-1000 MS. Dette kan optimaliseres ytterligere ved å bruke enten 2x2 eller 4x4 piksel binning, noe som reduserer eksponeringstiden og øker bildefrekvensen, på bekostning av romlig oppløsning. Til tross for disse begrensningene, Transkraniell makroskopisk flerkanals Imaging er i stand til å oppnå bildefrekvenser mellom 10-20 Hz med høy romlig oppløsning.
Nylige eksempler i Transkraniell makroskopisk Imaging har brukt aquaporin-4 (AQP4) Knock Out mus10,20 og plate-avledet vekstfaktor B (PDGF-B) bevaring motiv knockout mus22 for å demonstrere viktigheten av AQP4 og PDGF-B i glymphatic-systemet. Studiene brukte C57Bl6 wildtype mus for å sammenligne med knockout muse linjene. De transcranially avbildet musene for en varighet på 30 min ved hjelp av fluorescerende bevegelsesuskarphet og resultatene konkluderte med at knockout linjene hadde dramatisk redusert CSF tilstrømningen sammenlignet med wildtypes.
Disse egenskapene gjør Transkraniell optiske Imaging til en ideell teknikk for å studere CSF transport, spesielt mellom 2 eller flere kohorter av dyr. Den tillater målinger av intracisternal Tracer Kinetics i levende mus på en mikron skala oppløsning, til en brøkdel av kostnaden for andre in vivo Imaging modaliteter. Denne teknikken gjør at studiet av glymphatic systemet i en fysiologisk, ikke-invasiv måte, og har vært nyttig i å hjelpe belyse noen av faktorene som regulerer sin funksjon i helse og sykdom10,20,25 . Men den mest spennende egenskap er dens potensial for å besvare fremtidige spørsmål om CSF hydrodynamikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of nevrologiske lidelser og Stroke og National Institute on aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 og RF1AG057575 til MN), Fondation Leducq transatlantiske Networks of Excellence program, og EUs Horizon 2020 forsknings-og innovasjonsprogram (Grant no. 666881; SVDs @ Target). Vi vil også gjerne takke Dan Xue for eksperthjelp med grafiske illustrasjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane - Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
References
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
- Da Mesquita,, S,, et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
- Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
- Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ren, Z., et al. Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).
