Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את חדר הזרימה המקביל של לוח הצלחת לשימוש בחקירת הפעלה בזמן אמת של ערוצי יונים מכניטיים הרגישים על ידי הטיית מתח.
Abstract
מתח הטיית נוזלים ידוע לשחק תפקיד מרכזי בפונקציה אנדותל. ברוב מיטות כלי הדם, מתח הטיה מוגבר מגדילה חריפה בזרימת הדם מעורר אשד איתות וכתוצאה מכך ובכך מקלה על לחץ מכני על הקיר כלי הדם. הדפוס של מתח הטיה ידוע גם להיות גורם קריטי בפיתוח טרשת עורקים עם מלבינו להטות את הלחץ להיות atherop, מופרע להטות מתח להיות pro-atherגנטית. בעוד יש לנו הבנה מפורטת של מסלולים שונים של תא ביניים איתות, הקולטנים הראשונים לתרגם את הגירוי המכני לתוך מגשרים כימיים לא מובנים לחלוטין. ערוצי יונים מכניתרגישים באופן קריטי לתגובה להטיה ולוויסות איתות התא המושרה להטיה ובכך שליטה בייצור מגשרים של vasoactive. ערוצים אלה הם בין הרכיבים המוקדמים ביותר המופעל איתות כדי להטות וקושרו המושרה להטות הנגרמת באמצעות קידום הייצור תחמוצת החנקן (g., מבפנים לתקן K+ [קיר] פוטנציאל קולטן ארעי [trp] ערוצים) ו מקדם היפרפרזת היתר (למשל, קיר והפעלת סידן K+ [kca] ערוצים) ו להטות המושרה באמצעות מנגנון לא נקבע המערבת ערוצי piezo. הבנת המנגנון הביופיזיקלי שדרכו ערוצים אלה מופעלים על-ידי כוחות הטיה (כלומר, ישירות או באמצעות קולטן מכונאי ראשי) יכול לספק מטרות חדשות פוטנציאליות כדי לפתור את הפתופסולוגיה הקשורים בתפקוד האנדותל ו atherogenesis. זה עדיין האתגר העיקרי להקליט הפעלת זרימה המושרה של ערוצי יון בזמן אמת באמצעות אלקטרופיזיולוגיה. השיטות הסטנדרטיות לחשוף תאים למתח הטיה מוגדר היטב, כגון חרוט ולוחית הצלחת ומתח מקביל לוחית הלוח לא מאפשרים מחקר בזמן אמת של הפעלת ערוץ יונים. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר תא זרימה שונה של הלוח המקביל המאפשר הקלטה בזמן אמת אלקטרופיסיולוגית של ערוצי יון מכונאי מוגדר תחת לחץ הטיה מוגדרים היטב.
Introduction
כוחות הומודינמיים המופקים על ידי זרימת הדם ידועים לשחק תפקידים מרכזיים בפונקציה אנדותל ובתפקוד כלי דם1,2. כמו כן ידוע גם כי מספר סוגים של ערוצי יונים בחריפות להגיב לשינויים בלחץ הטיה3,4,5 המוביל ההשערה כי ערוצי יון יכול להיות ראשי מתח להטות חיישנים. לאחרונה, אנו ואחרים הראו כי ערוצי היונים הרגישים מאוד לשחק תפקידים קריטיים בכמה פונקציות המתח להטות-לחץ רגיש, כולל התגובה vasoactive כדי להטות את הלחץ6,7,8 ואנגיוגנזה התפתחותי9. לעומת זאת, המנגנונים של רגישות ההטיה של ערוצי היונים אינם ידועים כמעט לחלוטין. פער הידע הזה עשוי להיות בשל הקושי הטכני של ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תחת לחץ גזירה מוגדר היטב. במאמר זה, לכן, אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול מפורט באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי להשיג את המטרה הזאת6,7,10,11.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לאפשר חקירה בזמן אמת של ערוץ יון מכונאי תחת מוגדר להדגיש הטיה בטווח הפיזיולוגי. זה מושגת על ידי שינוי תא מקביל לוחית הלוח המקביל כדי לאפשר לצינורות אלקטרופיזיולוגיה להיות מופחת לתוך התאים לתאי הגישה גדל על הלוח התחתון בזמן חשיפה ממשית לזרום, מתן גישה ייחודית כדי להשיג את זה . מטרה6,7,11 לעומת זאת, תאים סטנדרטיים מקבילים לוחות הלוח, המתואר בפרסומים קודמים ניתן להשתמש עבור ניתוח הדמיה בזמן אמת של תאים חשופים כוחות הטיה12 או אחרים שאינם פולשנית גישות13,14 אבל לא עבור אלקטרופיזיולוגיה. באופן דומה, חרוט ומכשיר צלחת, עוד גישה רבת עוצמה כדי לחשוף את התאים כדי להטות את הלחץ15,16 הוא גם לא מתאים הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לפיכך, מתקני זרימה אלה אינם מאפשרים את החקירה של הטיית הרגישות של ערוצי יונים. הקושי בביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מתחת לזרימה הוא הסיבה העיקרית לפאולעיר המידע על המנגנונים האחראים להשפעות הקריטיות הללו.
מבחינת הגישות החלופיות להשגת אותה מטרה, אין כאלה מדויקים או מבוקרים. כמה מחקרים קודמים ניסו להקליט את הפעילות ערוץ יון תחת הזרימה על ידי חשיפת תאים לזרם של נוזל המגיע מצינורות אחרים הביא לקרבת תא מ17,18. זה מאוד לא פיזיולוגי, כמו כוחות מכניים שנוצרו בתנאים אלה יש מעט משותף עם פרופילים פיזיולוגיים של מתח הטיה בכלי הדם. חששות דומים חלים על ניסיונות לדמות לחץ הטיה פיסיולוגיים על ידי הפרזיה של התאים הפתוחים. כפי שנדונו בפירוט במחקר המוקדם שלנו10, ממשק פתוח באוויר הנוזלי יוצר הפרעות מרובות, שאינן פיזיולוגיות. כדי לטפל בכל החששות האלה, עיצבנו לוחית מקבילית שונה (MPP) תא זרימה, המכונה גם "מכשיר הזרמת מינימלית פולשנית" במחקרים המוקדמים שלנו6,7,10,11, עשה מאקריליק ושימוש נרחב במעבדה שלנו. עם זאת, למרות העובדה כי התיאור המקורי של העיצוב פורסם כמעט לפני 20 שנה והוא מכשיר הזרימה היחיד המאפשר ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תחת מוגדרים היטב להדגיש הטיה, מתודולוגיה זו לא היתה שאומצה על-ידי מעבדות אחרות ויש רק מעט מחקרים שמנסים להקליט זרמים בזרם. אנו מאמינים, אפוא, כי מתן תיאור מפורט עבור שימוש בחדר הזרימה MPP יהיה לעזר רב למחקרים המעוניינים בערוצי יון ומכנירגישים וביולוגיה כלי דם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש בבעלי חיים בלימודים שלנו מאושר על ידי אוניברסיטת אילינוי בוועדת הטיפול בבעלי חיים בשיקגו (16-183).
1. הרכבת לשכת הזרם של הלוח המקביל המתוקן
הערה: נא עיין בטבלה 1 ובאיור 1 עבור מזהי החלקים הקאמריים של זרימת MPP. אנא התייחס לאיור 1 עבור סכמטי המפרט את כיוון הכלים הקאמריים להרכבה.
- כדי לדבוק זכוכית כיסוי מלבני, פיסת D, לחלק התחתון של פיסת C, תחילה להפוך את הפתרון אלסטורר סיליקון על-ידי ערבוב ביסודיות 500 μL סיליקון אלסטוייר לריפוי סוכן לתוך 5 מ ל של בסיס אלסטומר סיליקון.
- להחיל שכבה דקה של הפתרון elastomer סיליקון סביב הקצוות של החלל המלבני של פיסת C ובעדינות למקם את העטיפה מלבני זכוכית פיסת D ישירות על הפתרון elastomer כגון זה חתיכת D מכסה לחלוטין את החלל מלבני פתוח של פיסת C. נגב בזהירות את התמיסה העודפת של אלסטומר סיליקון.
- חזור על שלב 1.2 עבור שמירה על זכוכית העטיפה המלבנית, פיסת F, לחלק התחתון של פיסת E ולאפשר פתרון אלסטונר סיליקון לריפוי בלילה בטמפרטורת החדר.
הערה: לאחר שנרפא, הזכוכית המכסה מלבני יישאר במשך עד שישה חודשים לפני הצורך להיות מוחלף. - החל עם פיסת החדר התחתון, חתיכת E, להרכיב את החדר לזרום MPP ידי ברציפות הצבת כל פיסת על גבי הקודם בסדר הבא: פיסה E (למטה), חתיכה C, חתיכת B, piece A (למעלה).
- יישר את חורי הברגים של כל חתיכה בפינות והברג בחוזקה את החלקים ביחד כדי למנוע התרחשות של דליפות בעת ניהול הזרימה אל תא זרימת MPP.
2. תא הכנה וזריעה לתוך תא הזרמת MPP
הערה: בצע את שלבים 2.1-2.7 על תאי האנדותל התרבותי. בצע את השיטה המפורטת בשלבים 2.8-2.14 לבידוד תאי האנדותל מתוך ארקייד עורקי העכבר והכנת תאי האנדותל הבודדים הטריים.
- בצלחת 6-הבאר, במקום 4 כדי 5 12 מ"מ לכסות עיגולים זכוכית/גם תאים זרע בין 10% ו 30% שטף כזה תאים בודדים ניתן לגשת עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
- התאים מודניים תחת תנאי תרבות סטנדרטיים (5% CO2, 37 ° c) עבור לא פחות מ 2 h כדי לאפשר לתאים לדבוק ולא יותר 24 שעות כמו תאים אנדותל בניסיון המחברים להיות שטוח מאוד וקשה תיקון כאשר הזרע בתוך משנה שליטה עבור יותר מ -24 h.
- הסרת זכוכית כיסוי המכילה תאים דבק מבאר של 6-היטב צלחת, לשטוף במהירות מלוחים באגירה פוספט (PBS), ולהעביר לצלחת פטרי 35 מ"מ המכיל 2 מוצרי אמבטיה אלקטרולוגיים (שולחן 2) לפני העברה לזרימת MPP קאמרית.
- העבר את העיגול זכוכית המכסה את הזכוכית לכסות מלבני, פיסת D, אשר דבקה של פיסת C של תא הזרימה MPP להיות בטוח כי פתרון הולם נשאר על הזכוכית לכסות כך תאים לא להיות חשופים לאוויר. הוסף את פתרון האמבטיה הרצוי (~ 250 μL) אל התאים כך שמעגל הזכוכית והתאים המכסה שקועים לחלוטין בתמיסה.
- מקמו את מעגל זכוכית המכסה כך שהוא נח במחצית הקרובה בצד של מאגר הוואקום, כך תאים יהיו בקנה אחד עם פתחי החריץ של פיסת B. ודא כי מעגל כיסוי הזכוכית דבק D דרך הפתרון-הדבקה זכוכית כך יישום של הזרימה אל החדר אינה משבש את מיקומו של מעגל הזכוכית המכסה.
- הכנס את תא זרימת MPP על-ידי התעסקות בחלקים בסדר המתאים, כמתואר בשלבים 1.4 ו-1.5 וכמוצג באיור 1. להעביר את החדר לשלב המיקרוסקופ ומיד מיד בחדר עם פתרון אמבטיה כזה הפתרון מגיע למאגר הוואקום לשאיפה (~ 10 mL).
- זיהוי תא בריא לניסוי על-ידי זיהוי תא באמצעות גבול כהה וגרעין ברור. הימנע מתאים הנראים כבלתרים או תאים הנמצאים בקשר עם תאים אחרים.
הערה: במעבדת המחברים, משתמשים בתאי אבי העורקים האנושיים ובתאים הראשוניים של העכבר הראשי בתרבות. עם זאת, כל סוג אחר של תא חסיד שהוא עניין צרכי מחקר ספציפיים ניתן להשתמש באותו אופן. - שטוף ארקייד עורקים מבודדים בתמיסה הדיסוציאציה (שולחן 2). העבר את הארקייד לצינורית צנטריפוגה של 2 מ ל המכילה 2 מ ל של פתרון דיסוציאציה מחומם (37 ° c) (מתכון לפתרון הדיסוציאציה המוצג בטבלה 2) המכיל פרוטאז נייטרלי (0.5 Mg/ml) ו elastase (0.5 Mg/ml). דגירה של 1 h ב 37 ° צ' עם טלטול עדין כל 10 דקות.
- הסר 1 mL של הפתרון הניטרלי פרוטאז/elastase דיסוציאציה ולהוסיף 1 מ"ג/mL קולגן סוג 1. החזר את הפתרון הקולגן לפתרון המכיל את העורקים עבור כקולגן הסופי סוג 1 ריכוז של 0.5 mg/mL. מודקון עבור 2 עד 3 דקות ב 37 ° c.
- שימוש 5 מלקחיים כיתה, במהירות להעביר את הארקייד אל הצלחת פטרי 35 מ"מ המכילים ירידה של 750 μL של פתרון הדיסוציאציה רענן, מקורר. עוד לנתק את הרקמה באמצעות 2 20 G מזרק מחטים לשחרור מכני תאים אנדותל מעורקים מתעכל אנזימטי.
- באמצעות 9 "חד פעמי מזכוכית פסטר, קצוצות פתרון התא 10x לפני העברת התאים שפופרת חדש 1.5 mL צנטריפוגה באמצעות הזכוכית pipet.
- שטוף את צלחת פטרי עם עוד 750 μL של פתרון הדיסוציאציה והעבר לאותה צינורית. באמצעות הצינורות זכוכית, עוד לפזר מכנית את התאים על ידי ליטוף לפחות 10x כדי ליצור תא הבולם היחיד נזהר לא להציג בועות שעלולות לגרום נזק לשלמות התא של האנדותל.
- הוסף 750 μL של השעיית התא האנדותל (~ 500-1000) ישירות כדי לחלק D של תא הזרימה MPP על החצי הקרוב ביותר של ואקום בצד המאגר. אפשר לתאי האנדותל לדבוק בין 45 דקות ו-1 h בטמפרטורת החדר.
- הכנס את תא זרימת MPP על-ידי התעסקות בחלקים בסדר המתאים כמתואר בשלבים 1.4 ו-1.5 וכמוצג באיור 1. העבר את החדר לשלב המיקרוסקופ והוא מיד מבצע את החדר עם פתרון האמבטיה כך הפתרון מגיע שאיפה ואקום (~ 10 mL). זיהוי תאי האנדותל הנגישים באמצעות הפנוטיפ הגולמי והעגול שלהם19,20.
הערה: מגוון שיטות עיכול וקוקטיילים אנזימים שימשו לבידוד תאי האנדותל ממיטות עורקים שונות. ראה שולחן 3 לתיאורים מפורטים של פרוטוקולים ששימשו מגוון חוקרים לבידוד תאי האנדותל לצורך הדבקת מהדק של שימוש בערוצי יון מכניקלים. שיטות אלה עשויות להתאים לשימוש בשילוב עם תא הזרימה MPP.
3. שליטה במתח הטיה לחדר הזרמת MPP עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של הטיה-ערוצי יון-מכניתרגישים מופעלים
- הגדרת מערכת הכבידה זלוף על ידי חיבור 30 mL בוגר גליל מזרק למנעול 3-way לנעול מצויד צינורות microbore (בקוטר פנימי: 0.05 אינץ ', קוטר החיצוני: 0.09 אינץ ') מתאים הכניסה לתוך החור בקוטר 3 מ"מ של פיסת a של MPP קאמרית.
- חברו את גליל הסיום לפנים החיצוניות של כלוב פאראדיי שמסביב למעטה האלקטרופיזיולוגיה (איור 2) תוך שימוש בטייפ דו-צידי. לפני החדרת אבובים בחדר MPP, למלא מראש את המזרק ואבובים עם פתרון אמבטיה (ראה שולחן 2 עבור הפתרון אמבטיה המשמש לחקירת מבפנים K+ ערוצים בתאי האנדותל). הכנס את הצינורות לתוך חור הזרימה של הזרם MPP של חתיכה A.
- טרום למלא את תא הזרימה MPP עם פתרון כזה הפתרון הוא הוסר במאגר ואקום. להפסיק לזרום לחדר ולמלא את גליל הסיום לסמן העליון. לחשב את קצב הזרימה באופן ידני על ידי מתן הפתרון לזרום דרך החדר ובאמצעות לעצור-שעון כדי לחשב mL/s בגובה מזרק שניתנו צילינדר.
- הרימו או הורידו את המזרק כדי לשנות את הזרימה, ובכך להטות את החדר, ולהמשיך בתהליך זה עד שתימצא רמה רצויה של מתח הטיה.
- חישוב לחץ הטיה בתא מקביל באמצעות המשוואה הבאה21:
τ = 6μQ/h2w
כאשר μ = צמיגות של נוזלים (גר'/cm · s), Q = קצב הזרימה (mL/s), ורוחב חדר הצלחת המקביל (w = 2.2 ס מ) וגובה (h = 0.1 ס מ).
הערה: במערכת הכבידה הנוכחית מערכת, בגובה גליל מזרק (כפי שנמדד מראש גליל) של 57 ס מ מעל לשלב המיקרוסקופ, קצב הזרימה הוא 0.3 mL/s. ההטיה מחושבת בחדר בגובה גליל זה מזרק ושיעור הזרימה הוא 0.7 דינמיקה/cm2. כמו כן יש לציין כי מערכות פרסטזיה אחרות, כגון משאבה פריסטלטית, יכולות לשמש לשליטה בזרימה לחדר הזרימה של MPP. עם זאת, התקנים אלה עשויים להוסיף מערבולות לא רצויות ויציבות השפעה של מדידות אלקטרופיזיולוגיה בזרימה, ולכן, באמצעות מערכת הכבידה שתוארה כאן מומלץ. - העבר חדר מורכב המכיל תאים הדבקה לשלב המיקרוסקופ של המתקן אלקטרופיזיולוגיה ולהכניס את האבובים מתמלא מראש עם פתרון אמבטיה לתוך החור של פיסת A. במקביל למלא את התא ולשטוף את התאים עם 10 מ ל של פתרון אמבטיה על ידי הפיכת המנעול התלת-ממדי לנעול כגון הפתרון זורם אל החדר.
- לאחר קביעת תצורת התיקון הרצויה מושגת בהצלחה לאפשר זרמי הערוץ לייצב באמבט סטטי בטמפרטורת החדר. פעם הזרמים התייצב, להחיל את ההטיה באופן צעד נבון המאפשר עליות בזרם לייצב לפני להגדיל את השלב הבא במתח הטיה.
הערה: המחברים מוצאים את ההצלחה הגדולה ביותר עם תצורת טלאי מחורר בעת לימוד ערוצי יון מכניתפעילים בתאי האנדותל. כדי לבצע מחורר התיקון השלם בתאים, להוסיף 5 μl של 60 mg/mL מלאי אמפוריטיצין B ב diמתיל סולפוקסיד (dmso) ל 1 מ ל של 0.2 יקרומטר מסוננים ניקוי הפתרון צנרת. לאחר יצירת חותמת giga-אוהם בתצורה המצורפת לתא, מחורר את הצורה של תיקוני תאים שלמים בתוך 2 עד 5 דקות. - להסיר את החשיפה הטיה לתאים על ידי עצירת זרימת לחדר לאפשר זרמים מכנימים רגישים לחזור זרמים בסיסיים נצפתה באמבט סטטי.
- בידוד זרמים מכונאי ערוץ יון של עניין על ידי שינוי הערכיות הפתרון (למשל, 60 mM K+ בפתרון אמבטיה עם 0 Ca2 + בתמיסה הפיפטה כדי ללמוד מבפנים K + ערוצים. Table 2 מציג מתכוני פתרון לדוגמה) ו/או עיכוב תרופתי של מקורות נוכחיים העלולים לזהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תצלומים מרובים המציגים תצוגות שונות של תא הזרימה MPP על הבמה המיקרוסקופ (הפאנל העליון) וייצוג סכמטי של תא הזרימה MPP (הפאנל התחתון) מוצגים באיור 1. הסכמטי מפרט את הממדים של המתקן כולו ותאי הזרימה. איור 2 מראה תצלום של מערכת הכבידה של המערכת לחדר הזרמת MPP במעבדה שלנו (הפאנל העליון). המוצג גם הוא ייצוג סכמטי של מערכת הזרימה (הפאנל התחתון) נועד להדגיש את השלבים אשר לבודד את התאים בחדר הזרימה מן העומס של הפתרון מן המערכת זלוף ואת הכוח של הסרת ואקום של פתרון.
סימן ההיכר של ערוצי יונים מכניים רגישים הוא חזרה פתאומית לרמות הבסיסית עם הפסקת גירוי מכני3,6,7. איור 3 מראה כדוגמה להסרת גירוי מתח ההטיה במהלך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של קיר הזרם מן התוצאות של תא אנדותל מבודד טרי בחזרה לזרמים בסיסיים שנרשמו בתחילה באמבט סטטי. החזרה לרמות הנוכחיות של הבסיס לאחר הפסקת הזרימה לתאי MPP התרחשה בתוך עשר שניות של הפסקת זרימה.
הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של התאים (WC), במיוחד אלה שנלקחו מתאים מבודדים טריים, לעתים קרובות יש זרמים ברורים הרקע דליפה שיכולים להסוות פעילות הערוץ. מספר ערוצי יונים, כגון אלה של משפחת K+ ערוץ מבפנים, יש מאפיינים ביופיזיים המאפשרים הפחתה של רקע הדליפה הנוכחי לניתוח מדויק יותר. איור 4 מראה כדוגמה את התהליך מתוך נתונים גולמיים (איור 4a) לחישוב והתווה ליניארי החוצה דליפה (איור 4a) לסוף, דליפה החיסור הנציג מעקב (איור 4a). ראה הסבר מפורט לחישוב וחיסור דליפה מן raw מחורר שירותים הקלטה תיקון במקרא הנלווה לדמות 4.
איור 1: תא תזרים MPP ותרשים מפורט. תמונות של התא המורכב של זרימת MPP (הפאנל העליון) להראות את התא על הבמה המיקרוסקופ מתוך שלוש תצוגות שונות: הצד כפי שהוצג במהלך ניסויים (משמאל), מן האוויר השולי (האמצע), ומשקע ואקום (מימין) אשר מחוץ לתצוגה ב התמונה כיוון הזרימה מסומן בכל אחד מהם. שים לב כי חוט הקרקע יכול בקלות להתאים לתוך אחד 2 מילימטר חריצים כפוף בזווית 90 °. סכמטית מפורט (למטה) מראה מידות מדויקות לשכפול המנגנון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מערכת הכבידה כבידה. תצלום בתווית של מערכת הכבידה של המערכת במעבדה שלנו מוצג בפאנל העליון. המערכת מפורטת בפאנל התחתון, ומערכת מערכות הכבידה של שני השלבים מפורטים בלוח הבקרה. הפרדת תא הזרימה המכיל תאים ושני המאגרים העליונים והתחתונים מודגשים. שלב 1 מאפשר פתרון לזרום מן המאגר העליון של פיסת B כדי פיסת D של התא שבו התאים נזרע. שלב 2 מאפשר לפתרון לזרום מפיסת D מטה אל המאגר התחתון, חתיכת F. לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שאריות הנציגים של ההפעלה הנוכחית המושרה של קיר ולחזור רמות הנוכחי בסיסית בעת הסרת הזרימה. שליטה חיובית טובה עבור מכניההפעלה של ערוצי יונים היא חזרה לרמות הנוכחי בסיסית נצפתה בתחילה באמבט סטטי עם הפסקת גירוי מכני. זרם מבפנים של K+ (קיר) זרמי ערוץ מופעלים בתוך שניות על ידי הטיית הלחץ כאשר פתרון כוח הכבידה מותר לזרום אל תא הזרימה MPP. עם הפסקת הזרימה לחדר, זרמי הקיר יחזרו במהירות לרמות סטטיות בסיסיות שנצפו לפני הזרימה. כבש של-140 mV כדי + 40 mV הוחל על התיקון מעל 400 ms. פתרון אמבטיה הכיל 60 mM K+ ואת הפוטנציאל היפוך היה ~-20 mV. העקבות הנציגים נוצרו מתאי אנדותל. מבודדים מעורקי העכברים אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דוגמת חיסור הנזילות לניתוח מדויק של המכונה קיר זרם. (א) מייצג הקלטה גולמית של קיר הזרם מתוך תא ראשי של מצע העכבר עם הזרם הבולט ליניארי החיצוני דליפה (אנידליפה). כבש של-140 mV כדי + 40 mV הוחל על התיקון מעל 400 ms. פתרון אמבטיה הכיל 60 mM K+ ואת הפוטנציאל היפוך היה ~-20 mV. (ב) אנידליפה מונע ניתוח של האמיתי קיר הערוץ פעילות. כדי להפחיתאת הדליפה, הראשון לחשב את הכיוון מוליכות ליניארית של השיפוע אנידליפה (G מדרון = (אניא-ib)/(va-vb)). הכפל G מדרון על ידי המתח המקביל של כל מעקב raw כדי להתוות שאני לדלוף על הנתונים הגולמיים. השורה צריכה להיות כיסוי הדליפה לינארית כלפי חוץ בדיוק. (ג) הפחת את ההתוויה שאנימדליף מכל העקבות כך שהזרם החיצוני ליניארי הוא ~ 0 pA/pF וניתן לנתח את הזרם האמיתי של קיר. הודעה בלוח C שזרם הקיר הפנימי הוא כמחצית ממעקב הנתונים המקורי בלוח א. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| גובה (ממ) | רוחב (mm) | אורך (ממ) | פרטים נוספים | ||
| חתיכה A | 8 | 80 | 98 | מכיל חור בקוטר 3 מ"מ עבור צינורות היתוך מפרץ (ראה טבלת חומרים) ו 53 mm x 60 מ"מ שטח מלבני עבור גישה לחלקים ותאים בינוניים | |
| מחלק ב' | 1 | 80 | 98 | מכיל רווח (20 מ"מ באלכסון) מתחת לחור הפרפיוז של Piece A ושלושה חריצים בעובי 2 מ"מ x 17 מ"מ עבור גישה לתאים | |
| חתיכה ג | 1 | 80 | 98 | מכיל שטח של 22 מ"מ x 50 מ"מ כאשר Piece D דבקה באמצעות פתרון אלסטורר סיליקון (ראה טבלת חומרים) | |
| מחלק ד' | 0.16 | 24 | 40 | שקופית זכוכית מלבנית בתחתית תא הזרימה | |
| חתיכה E | מיכל 5 | 80 | 120 | מכיל שטח 45 mm x 50 מ"מ כדי לאפשר ויזואליזציה של תאים ב-Piece D. שטח של 20 מ"מ x 45 מ"מ מופיע עבור שקע ואקום המאגר, פיסת F, להיות מדבקה | |
| חתיכת מטוס | 0.16 | 24 | 50 | שקופית זכוכית מלבנית תחתית של מאגר שקע ואקום | |
| מורכב MPP | 15 | 80 | 120 | לשכת הזרימה מופרד משקע האוורור ואקום הפורקן על ידי שני צעדים כדי למנוע שיבוש של גזירה מוגדרת היטב למינארי | |
| לשכת הזרימה של MPP מורכב | 1 | 22 | 42 | חתיכה D היא החלק התחתון של הזכוכית של תא הזרם | |
טבלה 1: מידות MPP (מורכבות ומפורקים) ומידע נוסף הספציפי לכל חלק של ההתקן.
| פתרון | מתכון (ב ממ) | pH | ||
| דיסוציאציה | 55 היום, 80 Na-גלוטמט, 6 KCl, 2 MgCl2, 0.1 cacl2, 10 גלוקוז, 10 hepes | 7.3 | ||
| (בידוד תאים) | ||||
| אמבט (אלקטרופיזיולוגיה) | 80 היום, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 cacl2, 10 גלוקוז, 10 hepes | 7.4 | ||
| פיפטה (אלקטרופיזיולוגיה) | 5 הנאגל, 135 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl2, 5 גלוקוז, 10 הפסי | 7.2 | ||
שולחן 2: דוגמאות של פתרונות עם מתכונים המשמשים בניסויים.
| פרוטוקול בידוד תאים אנדותל | פניות | |
| קוקטייל של פרוטאז נייטרלי ו elastase (0.5 mg/mL כל אחד; 1 h ב 37 ° צ') ואחריו הקלד אגנאז סוג I (0.5 mg/mL; 2.5 דקות) | מיכל בן-שבע, 6 | |
| גירוד מכני עדין של 5 ס מ2 אזור ממוקם בקיר הפנימי של בית העורקים היורד בבית החזה | 11 | |
| נה | 17 | |
| נה | 3 | |
| קולגן סוג IA (1 מ"ג/mL) עבור 14 דקות ב 37 ° צ' | 8 | |
שולחן 3: מתודולוגיה ללימוד תעלות יון מכנינויות באמצעות טכניקות אלקטרופיזיולוגיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת כלי הדם נחשפת כל הזמן לכוחות המטדינאמיים הפעילים, המפעילים את ערוצי היון המכניים3,22 אך התפקידים הפיזיולוגיים של הערוצים הללו בהטיה הנגרמת רק . מתחילים להופיע4,6,8 המנגנונים האחראים לרגישות המנגנון של התעלות המופעלות במתחים, נותרים בלתי ידועים. הפרוטוקול המפורט כאן מתאר את השיטה לחקירה ישירה של ערוצי יונים מכניביים החשופים למתח מאוזן בזמן אמת.
הצעד הקריטי והחיוני של פרוטוקול זה הוא השימוש בחדר זרימה מקביל לצלחת ששונתה, הכולל פתחים צרים כדי לאפשר הורדה של צינורות אלקטרולוגיים לחדר התאים ולתאי הגישה שמתחת לזרם. העיקרון הכללי של המכשיר הזה הוא שאם הפתחים הם צרים מספיק, מתח הטיה פיזיולוגי (עד 15 דינמיקה/cm2) ניתן להשיג ללא הצפת הפתרון בשל כוחות מתח פני השטח10. על מנת לבצע ניסויים אלה בהצלחה, זה קריטי: (i) לתאי זרע באזור הלוחית התחתונה הנמצאת ישירות מתחת לפתחים; (ii) להקים חותם giga-אוהם לפני החניכה של הזרימה או במהלך איטי מאוד (< 0.01 דינמיקה/ס"מ2) זרימת הרקע; (iii) לשמור על חותם יציב תוך כדי הזרם. מידות של מכשיר אקרילי ארבעת החלקים המשמשים במעבדה שלנו מסופקים יחד עם שרטוטים מפורטים (איור 1) כך ניתן לשכפל את מערכת זרימת הזרימה של MPP (איור 2) לשימוש בכל מעבדה חוקרת ערוצי יון רגישים למכונה. ממדים אלה יכולים גם להיות שונה כדי להגדיל את האזור שנזרע על ידי תאים לשנות את הגובה של ערוץ הזרימה, אשר ישנה את הקשר בין קצב הזרימה לבין מתח ההטיה. ירידה בגובה תא הזרימה תגרום למתח הטיה גבוה יותר עבור אותו קצב זרימה, שיכול להועיל להשגת מתחים גבוהים יותר. ניתן לשנות את החדר גם כדי לכלול מכשול הפרדת הזרימה הגורם לאזור מקומי של זרימה מופרעת של הזרם23.
היתרונות העיקריים של שימוש בתאי הזרימה של MPP כוללים (1) בזמן אמת בחקירת ערוצי יונים המופעלות באמצעות גזירה מתאי האנדותל בתרבות ובתאים טריים מבודדים מרקמת כלי הדם, (2) חשיפת תאים והתגובה של יון מכניבי רגיש ערוצים לרמות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית של מתח הטיה, ו (3) קל הרכבה ופירוק עם אפשרויות זלוף עבור ניסויים. ביחס לשיטות קיימות אחרות, השיטה האחרת היחידה המאפשרת ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות מתח הטיה מוגדר היטב היא זריעת התאים בתוך קצה נימי והכנסת הפיפטה ההקלטה לפתח הקפילר, כ נעשה בתחילת הלימודים3,22. עם זאת, ישנם חסרונות רבים בהשוואה לשיטה המתוארת כאן, כגון הקושי של זריעת תאים לנימים, גישה למספר קטן מאוד של תאים הקרובים מספיק לקצה הנימי של הפיפטה כדי שיוכלו להגיע אליהם, ו הפרעות זרימה בסוף ערוץ הזרימה (נימי במקרה זה). כל אחד מהחסרונות הללו מקשה על ביצוע האלקטרופיזיולוגיה מתחת לזרימה בתאים המתורבתות בפתח הקפילר וכמעט בלתי אפשרי לתיקון ואפילו תאי זרעים מבודדים מהvasקולטורה. כמו כן, אי אפשר להציג צעד ליצירת שטח של זרימה מופרעת. כל השיטות הקיימות האחרות המעסיקים את צ'יימברס הפתוח24,25 או מפיקות פתרונות ישירות על תא17,18 אינם מחקים את הסביבה הדינמית בכלי הדם.
עם זאת, המגבלה העיקרית של שיטה זו היא אילוץ להשגת מתח הטיה ברמות גבוהות יותר של הטווח הפיזיולוגי. במיוחד, מתחים פיסיולוגיים רמות המשוער להגיע עד 70 דינמיקה/cm2 בעורקים בריאים26. לעומת זאת, רמת הסטרס הגבוהה ביותר שיכולנו להשיג בקביעת התצורה הנוכחית של החדר הייתה 15 דינמיקה/cm2, לאחר שכוחות המתח של פני השטח לא מספיקים כדי למנוע מהפתרון לשפוך את הפתחים10. ניתן להקטין את גובה ערוץ הזרימה עשוי לאפשר השגת רמות גבוהות יותר של מתחים בהטיה. שמירה על חותם giga-אוהם יציב תחת מתח הטיה גבוה הוא אתגר אחר, אבל שיעור ההצלחה הוא סביר עם תרגול. מצאנו כי באמצעות טכניקת טלאי מחורר (כולל אנטיביוטיקה אמפוריטיצין B בפתרון הפיפטה כפי שמתואר לעיל) תשואות הקלטות יציבה יותר מאשר התצורה הסטנדרטית של התא כולו. בנוסף, תא זרימת MPP ופתרונות בשימוש אינם משכפלים בדיוק את ההטיה של זרימת הדם בעורקים. דם הוא נוזל בלתי-ניוטוני, שאינו משוכפל בניסויים שלנו במבחנה. בנוסף, החדר המשמש כאן הוא חדר מקביל תוך הטיית מתח בעורקים מחושב בדרך הטובה ביותר באמצעות הנוסחה להטיה בצילינדר.
קיימים שיקולים ומגבלות חשובות לביצוע הקלטות של ערוץ יחיד תחת זרימה. שיטה זו מתאימה לתצורה המצורפת לתא (הפיפטה המחובר לקרום של תא שלם), אשר מניב את החותמות היציבות. זה קריטי אם להיות מודע לכך שערוצים בודדים שפעילותם מוקלטת אינם חשופים ישירות למתח ההטיה משום שהם מוגנים על ידי הפיפטה המוקלט, במיוחד בתצורת הפנים-out27. אנו מאמינים כי תצורות תיקון מגורש הם לא האמינים ביותר כאשר משתמשים כדי לבדוק את הרגישות של ערוצי יונים לזרום כי הקרום מגורש הוא בדרך כלל לתוך פיפטה ההקלטה ולכן הוא לא נחשף לזרימה מוגדרת היטב.
במונחים של סוג התאים שניתן להשתמש בהם בניסויים אלה, תאי כלי הדם מייצגים את סוג התא הישים ביותר ללימוד מתח הטיה והערוצים המכניים. מחקרים קודמים התמקדו בעיקר בתאי האנדותל התרבותי3,28 הזמינים בקלות. בדקנו והרחבנו את השימוש בשיטה זו לתאי האנדותל טרי מבודדים מעורקי ההתנגדות של העכבר6,7. סוגי תאים אחרים בהחלט צריכים להיחשב. תאי שריר וסקולריים חלקים, למשל, יכולים להיחשף למתח הטיה במהלך מצבי מחלה שבהם האנדותל ניזוק והוסר29,30. זה מייצג אזור מרתק של מחקר לפיו ערוצים מכניניים רגישים השוכנים שריר חלק, אשר אחרת יהיה בלתי מושפע מלחץ הטיה, כעת יתרום למנגנון מחלה הפתופסולוגית פוטנציאלי. יתר על כן, השילוב של קווי תא רכב כמו HEK או צ'ו עם הקידוד הגן ערוץ העניין הוא פלטפורמה מצוינת עבור ניתוחים ביופיזיים של ערוצים בשילוב עם השימוש של תא הזרימה MPP.
חשוב גם לציין כי בעוד הכוונה המקורית של תא הזרימה MPP היה לחקירה בזמן אמת של הפעלת ערוץ יונים, היישום של המכשיר עשוי להאריך מעבר למטרה זו. באופן ספציפי, את הגישה אותה ניתן להשתמש למחקרים המשתמשים חיישני אלקטרודה, כגון תחמוצת החנקן (NO) חיישן כדי לקבוע את שחרורו של NO בתגובה להטות את הלחץ. לכן, אנו מספקים מתודולוגיה כללית לבעלי עניין בחקירת תהליכים ביולוגיים מוסדרים מכנית בזמן אמת ולקדם שינוי נוסף של תא MPP כדי לענות על צורכי מחקר ספציפיים עבור אלה הלומדים תהליכים מכניתיים רגישים במגוון תחומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי הלב הלאומי, ריאות, ובדם המכון (R01 HL073965, IL) ו (T32 HL007829-24, קרן הלאומית). המחברים גם רוצה להכיר את המכונה המדעית חנות באוניברסיטת אילינוי בשיקגו להפקת שלנו האחרונים שלנו לתאי זרימה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 G syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| Elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| Neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
