Summary
Het doel van dit protocol is om een gemodificeerde parallelle plaat stroom kamer te beschrijven voor gebruik bij het onderzoeken van real-time activering van mechanosensitieve ionenkanalen door shear stress.
Abstract
Vloeibare shear stress is bekend om een belangrijke rol in de endotheliale functie te spelen. In de meeste vasculaire bedden, verhoogde shear stress van acute stijgingen van de bloedtoevoer activeert een signalering Cascade resulterend in vasodilatatie daardoor verlichten mechanische belasting op de vaatwand. Het patroon van shear stress is ook bekend als een kritische factor in de ontwikkeling van atherosclerose met laminaire shear stress wordt atheroprotective en verstoorde shear stress Pro-atherogenic. Terwijl we een gedetailleerd begrip van de verschillende tussenliggende cel signalering trajecten, de receptoren die eerst de mechanische stimulans vertalen in chemische bemiddel kers zijn niet volledig begrepen. Mechanosensitive ionenkanalen zijn van cruciaal belang voor de respons op afschuiving en regelen shear-geïnduceerde cel signalering waardoor de productie van vasoactieve mediatoren. Deze kanalen behoren tot de vroegste geactiveerde signalering componenten te scheren en zijn gekoppeld aan shear-geïnduceerde vasodilatatie door het bevorderen van stikstofmonoxide productie (bv, naar binnen rectificeren K+ [Kir] en voorbijgaande receptor potentieel [TRP] kanalen) en endotheel hyperpolarisatie factor (bijv. Kir en calcium-geactiveerde K+ [KCA] kanalen) en door afschuiving veroorzaakte vasoconstrictie door een onbepaald mechanisme dat piëzo-kanalen omvat. Het begrijpen van het biopfysische mechanisme waarmee deze kanalen worden geactiveerd door afschuifkrachten (d.w.z. direct of via een primaire mechano-receptor) kan potentiële nieuwe doelen bieden om de pathofysiologie te verhelpen die gepaard gaat met endotheliale disfunctie en atherogenese. Het is nog steeds een grote uitdaging om doorstroming geïnduceerde activering van ionenkanalen in real-time te registreren met behulp van elektrofysiologie. De standaardmethoden om cellen bloot te stellen aan goed gedefinieerde shear stress, zoals de kegel-en plaat rheometer en de gesloten parallelle plaat stroom kamer staan geen real-time studie toe van de activering van ionenkanalen. Het doel van dit protocol is om een gemodificeerde parallelle plaat stroom kamer te beschrijven die real-time elektrofysiologische opname van mechanosensitieve ionenkanalen onder welomschreven shear stress mogelijk maakt.
Introduction
Hemodynamische krachten gegenereerd door de bloedstroom zijn bekend om te spelen belangrijke rollen in endotheel en vasculaire functie1,2. Het is ook bekend dat verschillende soorten ionenkanalen acuut reageren op veranderingen in shear stress3,4,5 wat leidt tot de hypothese dat ionenkanalen primaire shear stress sensoren kunnen zijn. Meer recentelijk toonden wij en anderen aan dat mechanogevoelige ionenkanalen kritische rollen spelen in verschillende afschuiving gevoelige vasculaire functies, waaronder de vasoactieve respons op shear stress6,7,8 en ontwikkelings-angiogenese9. De mechanismen van de shear-stress gevoeligheid van ionenkanalen zijn echter bijna volledig onbekend. Deze kloof van kennis is waarschijnlijk te wijten aan de technische moeilijkheid van het uitvoeren van elektrofysiologische opnames onder goed gedefinieerde shear stress. In dit artikel bieden we daarom een stap voor stap gedetailleerd protocol dat routinematig wordt uitgevoerd in ons lab om dit doel te bereiken6,7,10,11.
Het algemene doel van deze methode is om het real-time onderzoek van Ion Channel mechanoactivation onder goed gedefinieerde shear stress in het fysiologische bereik mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door een standaard parallelle plaat stroom kamer te wijzigen, zodat een elektrofysiologische pipet in de kamer kan worden verlaagd en toegang wordt verkregen tot cellen die op de bodemplaat zijn geteeld tijdens de real-time blootstelling aan stroming, wat een unieke aanpak biedt om dit te bereiken doel6,7,11. Standaard parallelle plaat stroomkamers, beschreven in voorgaande publicaties, kunnen worden gebruikt voor de real-time beeldvormings analyse van cellen die zijn blootgesteld aan afschuifkrachten12 of andere niet-invasieve benaderingen13,14 maar niet voor Elektrofysiologie. Evenzo is de kegel-en plaat apparatuur, een andere krachtige benadering om cellen bloot te stellen aan shear stress15,16 ook niet geschikt voor elektrofysiologische opnames. Dus, deze stroom apparaten niet toestaan dat het onderzoek van shear stress gevoeligheid van ionenkanalen. De moeilijkheid bij het uitvoeren van elektrofysiologische opnames onder stroom is de belangrijkste reden voor de schaarste van informatie over de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze cruciale effecten.
In termen van de alternatieve benaderingen om hetzelfde doel te bereiken, zijn er geen die zo nauwkeurig of gecontroleerd zijn. Sommige eerdere studies probeerden de activiteit van het ion-kanaal onder stroom op te nemen door cellen bloot te stellen aan een stroom vloeistof afkomstig van een andere pipet die in de nabijheid van een cel van boven de17,18werd gebracht. Dit is zeer niet-fysiologische, als de mechanische krachten gegenereerd onder deze omstandigheden hebben weinig gemeen met de fysiologische profielen van shear stress in de bloedvaten. Vergelijkbare bezorgdheid is van toepassing op de pogingen om fysiologische afschuif stress te simuleren door een perfusie van open kamers. Zoals uitvoerig besproken in onze eerdere studie10, creëert een open Liquid-Air-interface meerdere storingen en recirculatie, die niet-fysiologisch zijn. Om al deze zorgen aan te pakken, hebben we een gemodificeerde parallelle plaat (MPP)-stroom kamer ontworpen, ook wel de "minimaal invasieve stroomvoorziening" genoemd in onze eerdere studies6,7,10,11, gemaakt van acryl en uitgebreid gebruikt in ons lab. Ondanks het feit dat de oorspronkelijke beschrijving van het ontwerp bijna twintig jaar geleden is gepubliceerd en het enige stroom apparaat is dat het mogelijk maakt elektrofysiologische opnames onder welomschreven afschuif spanning uit te voeren, is deze methodologie echter niet goedgekeurd door andere laboratoria en er zijn slechts zeer weinig studies die proberen om stromen onder stroom op te nemen. Wij zijn daarom van mening dat het verstrekken van een gedetailleerde beschrijving voor het gebruik van de MPP flow Chamber een grote hulp zal zijn voor onderzoeken die geïnteresseerd zijn in mechanosensitieve ionenkanalen en vasculaire biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van dieren in onze studies is goedgekeurd door de Universiteit van Illinois in het Dierenzorg Comité van Chicago (#16-183).
1. montage van de gemodificeerde parallelle plaat stroom kamer
Opmerking: Raadpleeg tabel 1 en Figuur 1 voor de MPP-stroom kamer stuk-id's. Zie afbeelding 1 voor een schematische voorstelling van de oriëntatie van de kamer stukken voor de assemblage.
- Om het rechthoekige afdekglas, deel D, aan de onderkant van het stuk C te hechten, maakt u eerst de siliconen elastomeer oplossing door het mengen van 500 μL silicone elastomeer Uithardings middel grondig in 5 mL siliconen elastomeer basis.
- Breng een dun laagje van de siliconen elastomeer oplossing aan de randen van de rechthoekige ruimte van stuk C en plaats het rechthoekige afdekglas stuk D direct op de elastomeer oplossing zodanig dat stuk D de open rechthoekige ruimte van stuk C volledig bedekt. Veeg voorzichtig overtollige siliconen elastomeer oplossing weg.
- Herhaal stap 1,2 voor het vasthouden van het rechthoekige afdekglas, stuk F, aan de onderkant van het stuk E en laat de siliconen elastomeer oplossing gedurende de nacht bij kamertemperatuur genezen.
Opmerking: Eenmaal genezen, blijft het rechthoekige afdekglas tot zes maanden vastgehouden voordat het vervangen moet worden. - Begin met het onderste kamer stuk, deel E, Monteer de MPP-stroom kamer door achtereenvolgens elk stuk boven op de vorige in de volgende volgorde te plaatsen: stuk E (onderkant), stuk C, stuk B, stuk A (boven).
- Lijn de schroefgaten van elk stuk op de hoeken uit en schroef de stukken stevig samen om te voorkomen dat er lekkages optreden tijdens het toedienen van de stroom naar de MPP-stroom kamer.
2. celvoorbereiding en zaaien in de MPP-stroom kamer
Opmerking: Volg de stappen 2.1 − 2.7 voor gekweekte endotheliale cellen. Volg de methode die is beschreven in stappen 2.8 − 2.14 voor het isoleren van endotheel cellen van de mesenterische arteriële Arcade muis en de bereiding van vers geïsoleerde endotheel cellen.
- Plaats in een 6-put plaat vier tot 5 12 mm afdekglas cirkels/put en zaadcellen tussen 10% en 30% confluentie zodanig dat enkele cellen kunnen worden benaderd voor elektrofysiologische opnames.
- Inbroed cellen onder de standaard kweek condities (5% CO2, 37 °c) voor niet minder dan 2 uur, zodat cellen zich kunnen hechten en niet meer dan 24 uur als endotheelcellen in de ervaring van de auteurs worden zeer plat en moeilijk te patchen wanneer ze op subconfluentie voor meer dan 24 H.
- Verwijder een afdekglas met vastgehouden cellen uit een put van de 6-well plaat, spoel snel in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en breng over in een 35 mm Petri schaaltje met 2 mL elektrofysiologische badoplossing (tabel 2) voorafgaand aan overdracht naar de MPP-stroom Kamer.
- Breng de afdekglas cirkel over naar het rechthoekige afdekglas, deel D, dat is gehecht aan stuk C van de MPP-stroom kamer, dat ervoor zorgt dat de juiste oplossing op het afdekglas blijft, zodat cellen niet aan de lucht worden blootgesteld. Voeg de gewenste badoplossing (~ 250 μL) toe aan de cellen, zodat de afdekglas cirkel en de cellen volledig in de oplossing worden ondergedompeld.
- Plaats de afdekglas cirkel zodanig dat deze in de helft ligt die zich het dichtst bij het vacuüm reservoir bevindt, zodat de cellen in overeenstemming zijn met de spleet openingen van het stuk B. Zorg ervoor dat de glazen afdek cirkel hecht aan het deel D door middel van een oplossing-glas hechting, zodat de toepassing van stroom naar de kamer niet verstoren de positie van de afdekglas cirkel.
- Monteer de MPP-stroom kamer door de onderdelen samen in de juiste volgorde te schroeven, zoals beschreven in de stappen 1,4 en 1,5 en zoals weergegeven in Figuur 1. Breng de kamer over in de Microscoop fase en parfumeer onmiddellijk de kamer met badoplossing, zodat de oplossing het vacuüm reservoir voor aspiratie bereikt (~ 10 mL).
- Identificeer een gezonde cel voor het experiment door een cel te identificeren met een donkere rand en een duidelijke Nucleus. Vermijd cellen die lijken te worden blebbing of cellen die in contact komen met andere cellen.
Opmerking: In het laboratorium van de auteurs worden menselijke aorta endotheel cellen en primaire muizen mesenterische endotheel cellen in de cultuur gebruikt. Echter, elk ander type hecht cel dat van belang is voor specifieke onderzoeksbehoeften kan op dezelfde manier worden gebruikt. - Was de geïsoleerde arteriële arcade in dissociatie oplossing (tabel 2). Breng de arcade in een 2 mL centrifugebuis met 2 mL voorverwarmde (37 °C) dissociatie oplossing (recept voor dissociatie oplossing weergegeven in tabel 2) met neutrale protease (0,5 mg/ml) en elastase (0,5 mg/ml). Inbroed voor 1 uur bij 37 °C met voorzichtig schudden om de 10 minuten.
- Verwijder 1 mL van de neutrale protease/elastase dissociatie oplossing en voeg 1 mg/mL Collagenase type 1 toe. Retourneer de Collagenase-oplossing naar de oplossing die de slagaders bevat voor een uiteindelijke Collagenase-type 1-concentratie van 0,5 mg/mL. Inbroed voor 2 − 3 min bij 37 °C.
- Met behulp van 5-grade Tang, verplaats de Arcade snel op een 35 mm diameter Petri schaal met een druppel van 750 μL van verse, gekoelde dissociatie oplossing. Verder dissociëren van het weefsel met behulp van 2 20 G spuit naalden om mechanisch bevrijden endotheliale cellen van enzymatisch verteerde slagaders.
- Met behulp van een 9 "wegwerp Pasteur glas Pipet, wrijf de cel oplossing 10x voordat de cellen overbrengen naar een nieuwe 1,5 ml centrifugebuis met behulp van de glazen pipet.
- Was de Petri schaal met nog eens 750 μL dissociatie oplossing en breng deze over naar dezelfde buis. Gebruik de glazen pipet om de cellen verder mechanisch te dispergeren door ten minste 10x te pipetteren om een enkele celsuspensie te maken die ervoor moet zorgen dat er geen bubbels worden geïntroduceerd die de integriteit van de endotheel cellen kunnen beschadigen.
- Voeg 750 μL van de suspensie van de endotheelcel (~ 500 − 1000 cellen) rechtstreeks toe aan het deel D van de MPP-stroom kamer op de helft die het dichtst bij de vacuüm zijde van het reservoir zit. Laat de endotheliale cellen tussen 45 min en 1 uur bij kamertemperatuur plakken.
- Monteer de MPP-stroom kamer door de delen samen te schroeven in de juiste volgorde zoals beschreven in de stappen 1,4 en 1,5 en zoals weergegeven in Figuur 1. Breng de kamer over in de Microscoop fase en parfumeer onmiddellijk de kamer met badoplossing, zodat de oplossing de vacuüm aspiratie bereikt (~ 10 mL). Identificeer toegankelijke endotheel cellen door hun ruw en rond fenotype19,20.
Opmerking: Een verscheidenheid van spijsvertering methoden en enzym cocktails zijn gebruikt om te isoleren van endotheel cellen uit verschillende arteriële bedden. Zie tabel 3 voor gedetailleerde beschrijvingen van de protocollen die door verschillende onderzoekers zijn gebruikt om endotheliale cellen voor patch klem elektrofysiologie van mechanosensitieve ionenkanalen te isoleren. Deze methoden zijn waarschijnlijk geschikt voor gebruik in combinatie met de MPP-stroom kamer.
3. het regelen van afschuif spanning naar de MPP-stroom kamer voor elektrofysiologische opnames van Afschuifgeactiveerde Mechanosensitieve ionenkanalen
- Set-up een zwaartekracht perfusie systeem door een 30 ml gegradueerde spuitcilinder aan te sluiten op een 3-weg Luer slot uitgerust met een mcirobore buis (inwendige diameter: 0,05 inch, buitendiameter: 0,09 inch) geschikt voor het inbrengen in de 3 mm diameter inlaat gat van de MPP Kamer.
- Bevestig de gegradueerde cilinder aan de buitenzijde van de kooi van Faraday rondom de elektrofysiologie rig (Figuur 2) met behulp van dubbelzijdige tape. Voorafgaand aan het inbrengen van de slang in de MPP-kamer, pre-Vul de spuit en slang met bad oplossing (Zie tabel 2 voor Bad oplossing gebruikt voor het onderzoeken van de inwarm rectificeren K+ kanalen in endotheel cellen). Plaats de slang in het inlaat gaatje van de MPP-stroom kamer van stuk A.
- Pre-Vul de MPP-stroom kamer met oplossing zodat de oplossing wordt verwijderd in het vacuüm reservoir. Stop de stroom naar de kamer en vul de gegradueerde cilinder op de bovenste markering. Bereken de stroomsnelheid handmatig door de oplossing door de kamer te laten stromen en een stop horloge te gebruiken om mL/s te berekenen bij een bepaalde cilinder hoogte van de spuit.
- Verhoog of verlaag de spuit om de stroming te veranderen, en dus schuin in de kamer, en ga door met dit proces totdat een gewenst niveau van afschuif spanning wordt gevonden.
- Bereken de afschuif spanning in een parallelle kamer met behulp van de volgende vergelijking21:
τ = 6μQ/h2w
waarbij μ = viscositeit van vloeistof (g/cm · s), Q = debiet (mL/s), en parallelle plaat kamer breedte (b = 2,2 cm) en hoogte (h = 0,1 cm).
Opmerking: In het huidige zwaartekracht perfusie systeem, bij een cilinder hoogte van de spuit (gemeten vanaf de bovenkant van de cilinder) van 57 cm boven de Microscoop, is het debiet 0,3 mL/s. De afschuiving berekend in de kamer op deze spuitcilinder hoogte en debiet is 0,7 dyn/cm2. Ook moet worden opgemerkt dat andere perfusie systemen, zoals een peristaltische pomp, kunnen worden gebruikt om de stroom naar de MPP-stroom kamer te regelen. Echter, deze apparaten kunnen ongewenste turbulentie en invloed stabiliteit van de elektrofysiologie metingen onder stroming toe te voegen, daarom, met behulp van de zwaartekracht perfusie systeem beschreven hier wordt aanbevolen. - Breng een geassembleerde kamer met vastgehouden cellen naar de Microscoop fase van de elektrofysiologie Rig en steek de slang voorgevulde met badoplossing in het gat van stuk A. Vul de kamer gelijktijdig en was de cellen met 10 mL badoplossing door het draaien van de 3-weg Luer Lock zodat de oplossing stroomt naar de kamer.
- Zodra de gewenste patch configuratie succesvol is verkregen, kunnen kanaal stromen in een statisch bad bij kamertemperatuur stabiliseren. Zodra de stromingen zijn gestabiliseerd, breng shear in een stap-Wise mode waardoor stijgingen van de stroom te stabiliseren voordat de volgende stap verhoging van de shear stress.
Opmerking: De auteurs vinden het meest succes met de geperforeerde patch configuratie bij het bestuderen van mechanoactivated ion-kanalen in endotheliale cellen. Om geperforeerde whole-Cell patch configuraties uit te voeren, voeg 5 μL van een 60 mg/mL voorraad amfotericine B in Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) toe aan 1 mL 0,2 μm steriele gefilterde pipet oplossing. Na het genereren van een Giga-Ohm zegel in de cel-aangesloten configuratie, vormen geperforeerde hele celpatches binnen 2 − 5 min. - Verwijder de afschuif blootstelling aan de cellen door de stroom naar de kamer te stoppen, waardoor mechanosensitieve kanaal stromen terugkeren naar Baseline stromingen die in het statische bad zijn waargenomen.
- Isoleer mechanisch gevoelige ionen kanaal stromen van belang door het veranderen van de oplossing Valence (bijv. 60 mm K+ in badoplossing met 0 CA2 + in pipet oplossing voor het bestuderen van naar binnen rectificeren K + kanalen. Tabel 2 toont voorbeelden van oplossings recepten) en/of farmacologische remming van mogelijk vervuinende stroombronnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Meerdere Foto's met verschillende weergaven van de MPP-stroom kamer op de Microscoop (bovenste paneel) en een schematische weergave van de MPP-stroom kamer (onderste paneel) worden weergegeven in Figuur 1. De schematische Details van de afmetingen van het gehele apparaat en de stroom kamer. Figuur 2 toont een foto van het zwaartekracht perfusie systeem aan de MPP-stroom kamer in ons laboratorium (bovenste paneel). Ook is een schematische weergave van het stromings systeem (onderste paneel) bedoeld om de stappen te markeren die de cellen in de stroom kamer isoleren van de Rush van oplossing uit het perfusie systeem en van de kracht van het vacuüm verwijderen van de oplossing.
Een kenmerk van mechanosensitieve ionenkanalen is een abrupte terugkeer naar Baseline niveaus na stopzetting van mechanische stimulus3,6,7. Figuur 3 toont als een voorbeeld dat het verwijderen van de shear stress stimulus tijdens elektrofysiologische opnames van Kir stroom uit een vers geïsoleerde endotheliale cel resulteert in een terugkeer naar Baseline stromingen aanvankelijk opgenomen in een statisch bad. De terugkeer naar Baseline huidige niveaus na het stoppen van de stroom naar de MPP-kamer vond plaats binnen tien seconden na beëindiging van de stroom.
Whole-Cell (WC) elektrofysiologische opnames, vooral die uit vers geïsoleerde cellen, hebben vaak duidelijke lekkage achtergrond stromingen die kanaal activiteit kunnen maskeren. Sommige ionenkanalen, zoals die van de juist rechtlijkende K+ Channel-familie, hebben biofysische eigenschappen die het mogelijk maken de lekachtergrond stroom af te trekken voor een nauwkeurigere analyse. Figuur 4 toont als voorbeeld het proces van onbewerkte gegevens (figuur 4a) naar berekend en uitgezet lineair Uitlek (figuur 4b) naar definitief, lek afgetrokken representatief spoor (figuur 4c). Zie een gedetailleerde uitleg voor het berekenen en aftrekken van lekkage van de RAW geperforeerd WC patch opname in de bijbehorende legende naar Figuur 4.
Figuur 1: MPP-stroom kamer en gedetailleerd schematisch. Foto's van de gemonteerde MPP-stroom kamer (bovenste paneel) tonen de kamer op de Microscoop-fase van drie verschillende weergaven: de zijkant zoals bekeken tijdens experimenten (links), van de perfusie inlaat (midden), en van de vacuüm uitlaat (rechts) die buiten het zicht is in de foto. De richting van de stroom wordt in elk gelabeld. Merk op dat de grond draad gemakkelijk in een van de 2 mm spleten kan passen wanneer gebogen in een hoek van 90 °. Een gedetailleerd schematisch (onderaan) toont de exacte afmetingen voor de replicatie van het apparaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: het zwaartekracht perfusie systeem. Een gelabelde foto van het zwaartekracht perfusie systeem in ons laboratorium wordt weergegeven in het bovenste paneel. De twee-stappen MPP flow Chamber en Gravity perfusie systeem zijn gedetailleerd in het onderste paneel. De scheiding van de stroom kamer met cellen en de twee bovenste en onderste reservoirs wordt gemarkeerd. Stap 1 zorgt ervoor dat de oplossing stroomt van het bovenste reservoir van stuk B naar het deel D van de kamer waar cellen worden geseeid. Stap 2 staat de oplossing toe om van het deel D naar het onderste reservoir te stromen, stuk F. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve sporen van shear-geïnduceerde huidige activering van Kir-kanalen en terugkeren naar de uitgangswaarde huidige niveaus bij het verwijderen van de stroom. Een goede positieve controle voor mechanoactivatie van ionenkanalen is de terugkeer naar Baseline huidige niveaus in eerste instantie waargenomen in een statisch bad na stopzetting van de mechanische prikkel. Invloeiend gelijkrichter K+ (KIR) kanaal stromen worden binnen enkele seconden geactiveerd door afschuif spanning wanneer de zwaartekracht oplossing naar de MPP-stroom kamer mag stromen. Bij stopzetting van de stroming naar de kamer keren de Kir-stromen snel terug naar de uitgangswaarden die vóór de stroming werden waargenomen. Een helling van-140 mV tot + 40 mV werd aangebracht op de pleister over 400 MS. de badoplossing bevatte 60 mM K+ en het omkeer potentieel was ~-20 mv. De representatieve sporen werden gegenereerd uit een endotheliale cel vers geïsoleerd van muis mesenteriale slagaders. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: voorbeeld van lekkage aftrekken voor nauwkeurige analyse van mechanogeactiveerde Kir current. A) representatieve RAW-registratie van Kir-stroom van een primaire mesenterische endotheelcel van de muis met een opmerkelijke lineaire uitgaande lekstroom (iklek). Een helling van-140 mV tot + 40 mV werd aangebracht op de pleister over 400 MS. de badoplossing bevatte 60 mM K+ en het omkeer potentieel was ~-20 mv. (B) iklek voorkomt analyse van echte Kir Channel activiteit. Om af te trekken Ilek, bereken eerst de lineaire helling geleiding van ilek (Ghelling = (ia-ib)/(va-vb)). Vermenigvuldig Ghelling door overeenkomstige spanningen van de gehele onbewerkte trace om te plot iklek op de onbewerkte gegevens. De lijn moet het uitgaande lineaire lek precies bedekken. (C) Trek het uitgezette I-lek van het hele spoor af, zodat de lineaire passieve stroom ~ 0 pa/PF is en de echte Kir-stroom kan worden geanalyseerd. Opmerking in panel C dat de inkomende Kir-stroom ongeveer de helft is van de oorspronkelijke trace van ruwe gegevens in panel A. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Hoogte (mm) | Breedte (mm) | Lengte (mm) | Aanvullende informatie | ||
| Stuk A | 8 | 80 | 98 | Bevat een 3 mm diameter gat voor inlaat perfusie slang (Zie tabel van materialen) en 53 mm x 60 mm rechthoekige ruimte voor toegang tot middelste stukken en cellen | |
| Stuk B | 1 | 80 | 98 | Bevat een spatie (20 mm diagonaal) onder perfusie gat van stuk A en drie 2 mm x 17 mm spleten voor toegang tot cellen | |
| Stuk C | 1 | 80 | 98 | Bevat een ruimte van 22 mm x 50 mm waar het deel D wordt vastgehouden met behulp van de siliconen elastomeer oplossing (Zie tabel met materialen) | |
| Stuk D | 0,16 | 24 | 40 | Rechthoekige glazen schuif bodem van de stroom kamer | |
| Stuk E | 5 | 80 | 120 | Bevat een 45 mm x 50 mm ruimte om visualisatie van cellen op het stuk D mogelijk te maken. Een 20 mm x 45 mm ruimte is aanwezig voor de vacuüm uitlaat van het reservoir, stuk F, om te worden nageleefd | |
| Stuk F | 0,16 | 24 | 50 | Rechthoekige glazen schuif bodem van vacuüm uitlaat reservoir | |
| Geassembleerde MPP | 15 | 80 | 120 | Stroom kamer wordt gescheiden van inlaat perfusie en uitlaat vacuüm door twee stappen om verstoring van welomschreven laminaire shear te voorkomen | |
| Stroom kamer van geassembleerde MPP | 1 | 22 | 42 | Stuk D is de glazen schuif bodem van de stroom kamer | |
Tabel 1: afmetingen van het MPP (geassembleerd en gedemonteerd) en aanvullende informatie die specifiek is voor elk onderdeel van het apparaat.
| Oplossing | Recept (in mM) | Ph | ||
| Dissociatie | 55 NaCl, 80 na-glutamaat, 6 KCl, 2 MgCl2, 0,1 CACL2, 10 GLUCOSE, 10 Hepes | 7,3 | ||
| (Celisolatie) | ||||
| Bad (elektrofysiologie) | 80 NaCl, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 CACL2, 10 GLUCOSE, 10 Hepes | 7,4 | ||
| Pipet (elektrofysiologie) | 5 NaCl, 135 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl2,5glucose, 10 Hepes | 7,2 | ||
Tabel 2: voorbeelden van oplossingen met recepten die in de experimenten worden gebruikt.
| Endotheliale cel isolatie Protocol | Verwijzingen | |
| Cocktail van neutrale protease en elastase (0,5 mg/mL elk; 1 uur bij 37 °C) gevolgd door Collagenase type I (0,5 mg/mL; 2,5 min) | 6, 7 | |
| Zachte mechanische schrapen van een 5-cm2 regio gelegen aan de binnenwand van de dalende thoracale aorta | 11 | |
| NA | 17 | |
| NA | 3 | |
| Collagenase type IA (1 mg/mL) gedurende 14 min bij 37 °C | 8 | |
Tabel 3: methodologie voor het bestuderen van mechanosensitieve ionenkanalen met behulp van elektrofysiologische technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het vasculaire systeem wordt voortdurend blootgesteld aan actieve hemodynamische krachten, die mechanosensitieve ionkanalen3,22 activeren, maar de fysiologische rollen van deze kanalen in shear stress-geïnduceerde mechanotransductie is alleen beginnen te ontstaan4,6,8. De mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de mechanosensitiviteit van shear stress-geactiveerde kanalen blijven onbekend. Het hier beschreven protocol beschrijft de methode voor direct onderzoek naar mechanische gevoelige ionenkanalen die in real-time worden blootgesteld aan laminaire afschuif spanning.
De kritieke en essentiële stap van dit protocol is het gebruik van een gemodificeerde parallelle plaat stroom kamer met smalle openingen, zodat een elektrofysiologische pipet in de kamer kan worden verlaagd en de cellen onder stroom kunnen worden aangesloten. Het algemene principe van dit apparaat is dat als de openingen smal genoeg zijn, fysiologische afschuif spanning (tot 15 dyn/cm2) kan worden bereikt zonder oplossing overloop als gevolg van oppervlakte spanningkrachten10. Om deze experimenten met succes uit te voeren, is het van cruciaal belang: (i) naar zaadcellen in het gebied van de bodemplaat die direct onder de openingen ligt; II) een dichting van Giga-Ohm tot stand brengen vóór de opening van de stroom of gedurende zeer langzame (< 0,01 dyn/cm2) achtergrond stroom; (III) behoud van een stabiele afdichting tijdens het opvoeren van de stroom. De afmetingen van het in ons laboratorium gebruikte vierdelige acryl apparaat worden samen met gedetailleerde schema's (Figuur 1) verstrekt, zodat de MPP-stroom kamer en het stroomsysteem (Figuur 2) kunnen worden gerepliceerd voor gebruik in een laboratoriumonderzoek mechanosensitieve ionenkanalen. Deze afmetingen kunnen ook worden aangepast om het door cellen geseede gebied te vergroten en om de hoogte van het stroom kanaal te wijzigen, waardoor de relatie tussen de stroomsnelheid en de shear stress verandert. Een afname van de hoogte van de stroom kamer zou resulteren in hogere shear stress voor hetzelfde debiet, wat gunstig zou kunnen zijn voor het bereiken van hogere schuif spanningen. De kamer kan ook worden aangepast om een stroom scheidings barrière te bevatten die een lokale regio van Recirculerende verstoorde stroom23induceert.
De belangrijkste voordelen van het gebruik van de MPP-stroom kamer zijn (1) real-time onderzoek naar afschuifgeactiveerde ionenkanalen van endotheliale cellen in cultuur en cellen die vers geïsoleerd zijn van vasculaire weefsels, (2) blootstelling van cellen en de respons van mechanosensitief Ion kanalen naar fysiologisch relevante niveaus van shear stress, en (3) eenvoudige montage en demontage met perfusie-opties voor experimenten. Met betrekking tot andere bestaande methoden, de enige andere methode die het mogelijk maakt elektrofysiologische opnames onder welomschreven shear stress uit te voeren, is de cellen in een capillair uiteinde te zaaien en de opname pipet in de capillaire opening te plaatsen, zoals werd gedaan in de vroege studies3,22. Er zijn echter meerdere nadelen in vergelijking met de hier beschreven methode, zoals de moeilijkheid van het zaaien van cellen in capillairen, toegang tot een zeer klein aantal cellen die dicht genoeg bij het capillaire uiteinde zijn voor de pipet om ze te kunnen bereiken, en stroomstoringen aan het uiteinde van het stromingskanaal (capillair in dit geval). Elk van deze nadelen maakt het moeilijk om het uitvoeren van elektrofysiologie onder stroom in cellen gekweekt in de capillaire opening en vrijwel onmogelijk te patchen of zelfs zaadcellen vers geïsoleerd uit de vasculatuur. Het is ook onmogelijk om een stap te introduceren om een gebied van verstoorde stroming te genereren. Alle andere bestaande methoden die ofwel open Chambers24,25 of puffing oplossingen rechtstreeks op een cel17,18 nabootsen de hemodynamische omgeving in het bloedvat niet.
De belangrijkste beperking van deze methode, echter, is een beperking voor het bereiken van shear stress op hogere niveaus van het fysiologische bereik. Specifiek, fysiologische shear stress niveaus zijn geschat om te bereiken tot 70 dyn/cm2 in gezonde slagaders26. In tegenstelling, het hoogste shear stressniveau dat we konden bereiken in de huidige configuratie van de kamer was 15 dyn/cm2, waarna de oppervlakte spanningkrachten niet voldoende zijn om te voorkomen dat de oplossing uit de openingen10wordt gemorst. Het is mogelijk dat het verminderen van de hoogte van het stroom kanaal kan leiden tot hogere shear stress niveaus. Het handhaven van een stabiele Giga-Ohm afdichting onder hoge shear stress is een andere uitdaging, maar het succespercentage is redelijk met de praktijk. We constateerden dat het gebruik van geperforeerde patch techniek (waaronder het antibioticum amfotericine B in de pipet oplossing zoals hierboven beschreven) stabielere opnames oplevert dan de standaard volledige celconfiguratie. Bovendien repliceren de MPP-stroom kamer en de gebruikte oplossingen niet exact de afschuiving van de bloedstroom in de slagaders. Bloed is een viskeuze, niet-Newtonian vloeistof die we niet hebben gerepliceerd in onze in vitro experimenten. Bovendien, de kamer hier gebruikt is een parallelle kamer terwijl shear stress in de slagaders is het best berekend met behulp van de formule voor shear in een cilinder.
Er zijn belangrijke overwegingen en beperkingen voor het uitvoeren van Single-Channel opnames onder flow. Deze methode is geschikt voor een cel-aangesloten configuratie (pipet bevestigd aan het membraan van een intacte cel), die stabiele afdichtingen oplevert. Het is echter van cruciaal belang om te beseffen dat enkele kanalen waarvan de activiteit wordt geregistreerd, niet direct worden blootgesteld aan afschuiving, omdat ze worden afgeschermd door de opname Pipet, vooral in de interne configuratie27. Wij zijn van mening dat de uitgelichte patch configuraties niet het meest betrouwbaar zijn wanneer ze worden gebruikt om de gevoeligheid van ionenkanalen te testen, omdat het bekraste membraan meestal in de opname pipet wordt getrokken en dus niet wordt blootgesteld aan een goed gedefinieerde stroming.
In termen van het type cellen dat kan worden gebruikt in deze experimenten, vasculaire endotheliale cellen vertegenwoordigen de meest toepasselijke celtype voor het bestuderen van shear stress en de mechanosensitive kanalen. Eerdere studies concentreerden zich voornamelijk op gekweekte endotheliale cellen3,28 die gemakkelijk beschikbaar zijn. We hebben het gebruik van deze methode getest en uitgebreid naar endotheliale cellen die vers geïsoleerd zijn van de muis weerstand slagaders6,7. Andere celtypen moeten zeker worden overwogen. Vasculaire gladde spiercellen, bijvoorbeeld, kan worden blootgesteld aan shear stress tijdens ziektetoestanden waar het endotheel is beschadigd en verwijderd29,30. Dit is een intrigerend studiegebied waarbij mechanische gevoelige kanalen die zich in een gladde spier bevinden, die anders niet beïnvloed zouden worden door afschuif stress, nu zouden bijdragen aan potentieel pathofysiologische ziekte mechanismen. Bovendien is de transfectie van voertuig cellijnen zoals HEK of CHO met het gen coderen van het kanaal van belang is een uitstekend platform voor de biofysische analyse van kanalen in combinatie met het gebruik van de MPP-stroom kamer.
Het is ook belangrijk op te merken dat, terwijl de oorspronkelijke intentie voor de MPP-stroom kamer was voor het real-time onderzoek van Ion Channel mechanoactivation, de toepassing van het apparaat kan reiken dan dit doel. In het bijzonder kan dezelfde aanpak worden gebruikt voor studies die elektrode sensoren gebruiken, zoals een stikstofoxide (NO)-sensor om het vrijkomen van NO in reactie op afschuiving te bepalen. Daarom bieden we een algemene methodologie voor mensen met belangstelling voor het onderzoeken van mechanisch gereguleerde biologische processen in real time en het bevorderen van verdere modificatie van de MPP-kamer om te voldoen aan specifieke onderzoeksbehoeften voor diegenen die studeren mechanosensitieve processen op verschillende gebieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het National Heart, Lung en Blood Institute (R01 HL073965, IL) en (T32 HL007829-24, ISF). De auteurs willen ook de wetenschappelijke machine winkel van de Universiteit van Illinois in Chicago erkennen voor het genereren van onze nieuwste MPP flow Chambers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 G syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| Elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| Neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
