Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine modifizierte parallele Plattendurchflusskammer für die Untersuchung der Echtzeitaktivierung von mechanosensitiven Ionenkanälen durch Scherspannung zu beschreiben.
Abstract
Flüssigkeitsscherspannung ist bekannt, eine wichtige Rolle in der endothelialen Funktion zu spielen. In den meisten Gefäßbetten löst ein erhöhter Scherstress durch akute Nukzesserhöhungen eine Signalkaskade aus, was zu vasodilatation führt und dadurch die mechanische Belastung der Gefäßwand lindert. Das Muster der Scherspannung ist auch bekannt als ein kritischer Faktor bei der Entwicklung von Arteriosklerose mit laminaren Scherstress atheroprotective und gestörtscher Stress pro-atherogen. Während wir ein detailliertes Verständnis der verschiedenen Zwischenzellsignalwege haben, werden die Rezeptoren, die zuerst den mechanischen Stimulus in chemische Mediatoren übersetzen, nicht vollständig verstanden. Mechanosensitive Ionenkanäle sind entscheidend für die Reaktion auf die Scherung und regulieren die scherinduzierte Zellsignalisierung und steuern so die Produktion von vasoaktiven Mediatoren. Diese Kanäle gehören zu den frühesten aktivierten Signalkomponenten zum Scheren und wurden durch Förderung der Stickstoffmonoxidproduktion mit der scherinduzierten Vasodilatation in Verbindung gebracht (z.B. nach innen korrigierende K+ [Kir] und transientes Rezeptorpotential [TRP] Kanäle) und Endothel-Hyperpolarisierungsfaktor (z. B. Kir- und Calcium-aktivierte K+ [KCa]-Kanäle) und scherinduzierte Vasokonstriktion durch einen unbestimmten Mechanismus, der Piezokanäle umfasst. Das Verständnis des biophysikalischen Mechanismus, durch den diese Kanäle durch Scherkräfte (d. h. direkt oder durch einen primären Mechano-Rezeptor) aktiviert werden, könnte potenzielle neue Ziele zur Lösung der pathophysiologie im Zusammenhang mit endotheliaaler Dysfunktion bieten. und Atherogenese. Es ist immer noch eine große Herausforderung, die strömungsinduzierte Aktivierung von Ionenkanälen in Echtzeit mittels Elektrophysiologie aufzuzeichnen. Die Standardmethoden zur Belichtung von Zellen gegenüber klar definierter Scherspannung, wie dem Kegel- und Plattenrheometer und der geschlossenen parallelen Plattendurchflusskammer, erlauben keine Echtzeituntersuchung der Ionenkanalaktivierung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine modifizierte parallele Plattendurchflusskammer zu beschreiben, die eine elektrophysiologische Echtzeitaufzeichnung mechanosensitiver Ionenkanäle unter genau definierter Scherspannung ermöglicht.
Introduction
Hämodynamische Kräfte, die durch den Blutfluss erzeugt werden, sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle in der endothelialen und vaskulären Funktion1,2zu spielen. Es ist auch bekannt, dass mehrere Arten von Ionenkanälen akut auf Veränderungen der Scherspannung3,4,5 reagieren, was zu der Hypothese führt, dass Ionenkanäle primäre Scherspannungssensoren sein können. In jüngerer Zeit haben wir und andere gezeigt, dass mechanosensitive Ionenkanäle in mehreren scher-stressempfindlichen Gefäßfunktionen eine entscheidende Rolle spielen, einschließlich der vasoaktiven Reaktion auf Scherstress6,7,8 und Entwicklungsangiogenese9. Die Mechanismen der Scher-Stress-Empfindlichkeit von Ionenkanälen sind jedoch fast völlig unbekannt. Diese Wissenslücke ist wahrscheinlich auf die technische Schwierigkeit zurückzuführen, elektrophysiologische Aufnahmen unter genau definierter Scherspannung durchzuführen. In diesem Artikel bieten wir daher ein Schritt für Schritt detailliertes Protokoll routinemäßig in unserem Labor durchgeführt, um dieses Ziel zu erreichen6,7,10,11.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Echtzeit-Untersuchung der Ionenkanal-Mechanoaktivierung unter genau definiertem Scherstress im physiologischen Bereich zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem eine Standard-Parallelplattendurchflusskammer so geändert wird, dass eine elektrophysiologische Pipette in die Kammer abgesenkt und Zugangszellen, die während der Echtzeit-Exposition zum Durchfluss auf der Bodenplatte angebaut werden, abgesenkt werden können, was einen einzigartigen Ansatz bietet, dies zu erreichen. Tor6,7,11. Im Gegensatz dazu können Standard-Parallelplattendurchflusskammern, die in früheren Veröffentlichungen beschrieben wurden, für die Echtzeit-Bildgebungsanalyse von Zellen verwendet werden, die Scherkräften12 oder anderen nicht-invasiven Ansätzen13,14 Elektrophysiologie. In ähnlicher Weise ist der Kegel- und Plattenapparat, ein weiterer starker Ansatz, um Zellen Scherspannung15,16 auszusetzen, auch nicht für elektrophysiologische Aufnahmen geeignet. Somit erlauben diese Durchflussgeräte keine Untersuchung der Scherspannungsempfindlichkeit von Ionenkanälen. Die Schwierigkeit bei der Durchführung elektrophysiologischer Aufnahmen unter Fließen ist der Hauptgrund für die Mangel an Informationen über die Mechanismen, die für diese entscheidenden Effekte verantwortlich sind.
In Bezug auf die alternativen Ansätze, um das gleiche Ziel zu erreichen, gibt es keine, die so genau oder kontrolliert sind. Einige frühere Studien versuchten, die Ionenkanalaktivität unter dem Durchfluss aufzuzeichnen, indem zellen einem Flüssigkeitsstrom aus einer anderen Pipette aus einer anderen Pipette aus der Nähe einer Zelle von oben17,18aussetzten. Dies ist sehr nicht-physiologisch, da die unter diesen Bedingungen erzeugten mechanischen Kräfte wenig mit den physiologischen Profilen von Scherstress in den Blutgefäßen gemein haben. Ähnliche Bedenken gelten für die Versuche, physiologische Scherspannung durch Durchblutung offener Kammern zu simulieren. Wie in unserer früheren Studie10ausführlich erläutert, erzeugt eine offene Flüssigkeits-Luft-Schnittstelle mehrere Störungen und Dierezirkulation, die nicht-physiologisch sind. Um all diese Bedenken auszuräumen, haben wir in unseren früheren Studien6,7,10,11, eine modifizierte Parallelplatte (MPP) Strömungskammer entworfen, die auch als "minimal-invasives Durchflussgerät" bezeichnet wird. aus Acryl und ausgiebig in unserem Labor verwendet. Trotz der Tatsache, dass die ursprüngliche Beschreibung des Designs vor fast 20 Jahren veröffentlicht wurde und das einzige Strömungsgerät ist, das die Durchführung elektrophysiologischer Aufnahmen unter genau definierter Scherspannung ermöglicht, wurde diese Methode nicht von anderen Labors angenommen und es gibt nur sehr wenige Studien, die versuchen, Ströme unter Fluss zu erfassen. Wir glauben daher, dass die Bereitstellung einer detaillierten Beschreibung für die Verwendung der MPP-Flusskammer eine große Hilfe für Forschungen sein wird, die sich für mechanosensitive Ionenkanäle und Gefäßbiologie interessieren.
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Protocol
Die Verwendung von Tieren in unseren Studien ist von der University of Illinois at Chicago Animal Care Committee (#16-183) zugelassen.
1. Montage der modifizierten Parallelplattendurchflusskammer
HINWEIS: Siehe Tabelle 1 und Abbildung 1 für MPP-Flusskammerstück-IDs. In Abbildung 1 finden Sie einen Schaltplan, in dem die Ausrichtung von Kammerstücken für die Montage detailliert beschrieben wird.
- Um das rechteckige Abdeckglas, Stück D, an der Unterseite des Stücks C zu befestigen, stellen Sie zunächst die Silikonelastomerlösung her, indem Sie 500 l Silikonelastomer-Härtungsmittel gründlich in 5 ml Silikonelastomerbasis mischen.
- Tragen Sie eine dünne Schicht der Silikonelastomerlösung um die Ränder des rechteckigen Raumes des Stücks C auf und legen Sie das rechteckige Abdeckglasstück D vorsichtig direkt auf die Elastomerlösung, so dass Stück D den offenen rechteckigen Raum des Stücks C vollständig abdeckt. Überschüssige Silikonelastomerlösung vorsichtig wegwischen.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2 zum Festhalten des rechteckigen Abdeckglases, Stück F, an der Unterseite des Stücks E und lassen Sie die Silikonelastomerlösung über Nacht bei Raumtemperatur aushärten.
HINWEIS: Nach dem Aushärten bleibt das rechteckige Abdeckglas bis zu sechs Monate haften, bevor es ausgetauscht werden muss. - Beginnend mit dem unteren Kammerstück, Stück E, montieren Sie die MPP-Durchflusskammer, indem Sie jedes Stück sequenziell auf das vorherige in der folgenden Reihenfolge platzieren: Stück E (unten), Stück C, Stück B, Stück A (oben).
- Richten Sie die Schraublöcher jedes Stücks an den Ecken aus und schrauben Sie die Teile fest zusammen, um Leckagen während der Verabreichung des Durchflusses an die MPP-Durchflusskammer zu verhindern.
2. Zellvorbereitung und Aussaat in die MPP-Durchflusskammer
HINWEIS: Befolgen Sie die Schritte 2.1-2.7 für kultivierte Endothelzellen. Befolgen Sie die in den Schritten 2.8-2.14 beschriebene Methode zur Isolierung von Endothelzellen aus der mesenterischen Arterienpassage der Maus und zur Herstellung frisch isolierter Endothelzellen.
- In einer 6-Well-Platte vier bis fünf 12 mm Abdeckung Glaskreise/Brunnen und Samenzellen zwischen 10% und 30% Konfluenz, so dass einzelne Zellen für elektrophysiologische Aufnahmen zugänglich sind.
- Inkubieren Sie Zellen unter Standardkulturbedingungen (5%CO2, 37 °C) für nicht weniger als 2 h, damit Zellen haften können, und nicht mehr als 24 h als Endothelzellen in der Erfahrung der Autoren werden sehr flach und schwer zu patchen, wenn sie bei Subkonfluenz für mehr als 24 h.
- Ein Deckglas mit aufhaftenden Zellen aus einem Brunnen der 6-Well-Platte entfernen, schnell in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) abspülen und vor der Übertragung in den MPP-Fluss in eine 35 mm Petrischale mit 2 ml elektrophysiologischer Badlösung (Tabelle2) übertragen kammer.
- Übertragen Sie den Abdeckungglaskreis auf das rechteckige Deckglas, Stück D, das auf Stück C der MPP-Durchflusskammer haftet, da sicher ist, dass eine ausreichende Lösung auf dem Deckglas bleibt, damit die Zellen nicht der Luft ausgesetzt werden. Fügen Sie den Zellen die gewünschte Badlösung (ca. 250 l) hinzu, so dass der Deckelglaskreis und die Zellen vollständig in Lösung eingetaucht sind.
- Positionieren Sie den Abdeckungsglaskreis so, dass er in der Hälfte am nächsten an der Vakuumbehälterseite liegt, so dass die Zellen mit den Schlitzöffnungen des Stücks B in Einklang stehen. Stellen Sie sicher, dass der Glasabdeckungskreis durch Lösungsglashaftung am Stück D haftet, so dass die durch fluss in die Kammer stört nicht die Position des Abdeckungglaskreises.
- Montieren Sie die MPP-Durchflusskammer, indem Sie die Teile in der entsprechenden Reihenfolge zusammenschrauben, wie in den Schritten 1.4 und 1.5 beschrieben und wie in Abbildung 1dargestellt. Übertragen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe und durchdringen Sie die Kammer sofort mit einer Badlösung, so dass die Lösung das Vakuumreservoir für die Aspiration erreicht (ca. 10 ml).
- Identifizieren Sie eine gesunde Zelle für das Experiment, indem Sie eine Zelle mit einem dunklen Rand und einem offensichtlichen Kern identifizieren. Vermeiden Sie Zellen, die zu bleichen scheinen, oder Zellen, die mit anderen Zellen in Kontakt stehen.
HINWEIS: Im Labor der Autoren werden menschliche Aorten-Endothelzellen und primäre mausmesenterische Endothelzellen in der Kultur verwendet. Jedoch, jede andere Art von AnhängerZelle, die für spezifische Forschungsbedürfnisse von Interesse ist, kann auf die gleiche Weise verwendet werden. - Waschen Sie die isolierte arterielle Arkade in Dissoziationslösung (Tabelle 2). Übertragen Sie die Arkade in ein 2 ml Zentrifugenrohr mit 2 ml vorgewärmter (37 °C) Dissoziationslösung (Rezept für Dissoziationslösung in Tabelle 2) mit neutraler Protease (0,5 mg/ml) und Elastase (0,5 mg/ml). 1 h bei 37 °C mit sanftem Schütteln alle 10 min inkubieren.
- Entfernen Sie 1 ml der neutralen Protease/Elastase-Dissoziationslösung und fügen Sie 1 mg/ml Kollagennase Typ 1 hinzu. Geben Sie die Kollagenaselösung für eine endgültige Kollagenase-Typ-1-Konzentration von 0,5 mg/ml an die Lösung zurück, die die Arterien enthält. Inkubieren Sie für 2 x 3 min bei 37 °C.
- Mit 5 Grad Zangen bewegen Sie die Arkade schnell auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 35 mm, die einen 750 L Tropfen frischer, gekühlter Dissoziationslösung enthält. Weitere Dissoziation des Gewebes durch die Verwendung von zwei 20 G Spritzennadeln, um endotheliale Zellen mechanisch aus enzymatisch verdauten Arterien zu befreien.
- Mit einer 9" Einweg-Pasteur-Glaspipette trituieren Sie die Zelllösung 10x, bevor Sie die Zellen mit der Glaspipette in ein neues 1,5 ml Zentrifugenrohr übertragen.
- Waschen Sie die Petrischale mit weiteren 750 L Dissoziationslösung und übertragen Sie sie in ein und dasselbe Rohr. Mit der Glaspipette, weiter mechanisch dispergieren die Zellen durch Pipettierung mindestens 10x, um eine einzellige Suspension zu schaffen, die darauf achtet, keine Blasen einzuführen, die die Integrität der Endothelzellen beschädigen können.
- Fügen Sie 750 l der Endothelzellsuspension (500 bis 1.000 Zellen) direkt in Stück D der MPP-Durchflusskammer auf der Hälfte, die der Vakuumseite des Reservoirs am nächsten ist, hinzu. Lassen Sie die Endothelzellen zwischen 45 min und 1 h bei Raumtemperatur haften.
- Montieren Sie die MPP-Durchflusskammer, indem Sie die Teile in der in den Schritten 1.4 und 1.5 beschriebenen Reihenfolge zusammenschrauben, wie in Abbildung 1dargestellt. Übertragen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe und durchdringen Sie die Kammer sofort mit einer Badlösung, so dass die Lösung die Vakuumaspiration erreicht (ca. 10 ml). Identifizieren Sie zugängliche Endothelzellen anhand ihres rauen und runden Phänotyps19,20.
HINWEIS: Eine Vielzahl von Verdauungsmethoden und Enzymcocktails wurden verwendet, um Endothelzellen aus verschiedenen arteriellen Betten zu isolieren. Siehe Tabelle 3 für detaillierte Beschreibungen von Protokollen, die von einer Vielzahl von Forschern verwendet wurden, um Endothelzellen für die Patchklemmenelektrophysiologie von mechanosensitiven Ionenkanälen zu isolieren. Diese Methoden sind wahrscheinlich für den Einsatz in Kombination mit der MPP-Durchflusskammer geeignet.
3. Steuerung der Scherspannung zur MPP-Durchflusskammer für elektrophysiologische Aufnahmen von scheraktivierten mechanosensitiven Ionenkanälen
- Einrichtung eines Schwerkraft-Perfusionssystems durch Anschluss eines 30 ml abgestuften Spritzenzylinders an ein 3-Wege-Luer-Schloss mit Mikrobohrrohr (Innendurchmesser: 0,05 Zoll, Außendurchmesser: 0,09 Zoll) zum Einsetzen in das 3 mm Durchmesser eingelassene Einlassloch des Stücks A des MPP kammer.
- Befestigen Sie den abgestuften Zylinder mit doppelseitigem Klebeband an der Außenseite des Faraday-Käfigs, der das Elektrophysiologie-Rig umgibt (Abbildung 2). Vor dem Einsetzen der Schläuche in die MPP-Kammer die Spritze und die Schläuche mit Badlösung vorfüllen (siehe Tabelle 2 für Badlösung zur Untersuchung der inneren Rektifikierung von K+ Kanälen in Endothelzellen). Setzen Sie die Schläuche in das MPP-Flusskammer-Einlassloch von Stück A ein.
- Füllen Sie die MPP-Durchflusskammer mit einer Lösung vor, so dass die Lösung im Vakuumbehälter entfernt wird. Stoppen Sie den Fluss in die Kammer und füllen Sie den abgestuften Zylinder bis zur Bestmarke auf. Berechnen Sie die Durchflussraten manuell, indem Sie die Lösung durch die Kammer fließen lassen und mit einer Stoppuhr ml/s bei einer bestimmten Spritzenzylinderhöhe berechnen.
- Heben oder senken Sie die Spritze, um den Durchfluss zu verändern, und scheren Sie so in der Kammer, und setzen Sie diesen Prozess fort, bis ein gewünschtes Maß an Scherspannung gefunden wird.
- Berechnen Sie die Scherspannung in einer parallelen Kammer mit der folgenden Gleichung21:
• = 6 x Q/h2w
wobei die Flüssigkeitsviskosität (g/cms), Q = Durchflussrate (ml/s) und die breite der parallelen Plattenkammer (b = 2,2 cm) und die Höhe (h = 0,1 cm)
HINWEIS: Im aktuellen Schwerkraft-Perfusionssystem beträgt der Durchfluss bei einer Spritzenzylinderhöhe (gemessen von der Oberseite des Zylinders) von 57 cm über der Mikroskopstufe 0,3 ml/s. Die in der Kammer berechnete Scherung bei dieser Spritzenzylinderhöhe und Durchflussrate beträgt 0,7 dyn/cm2. Es sollte auch beachtet werden, dass andere Perfusionssysteme, wie eine peristaltische Pumpe, verwendet werden können, um den Durchfluss zur MPP-Durchflusskammer zu steuern. Diese Geräte können jedoch unerwünschte Turbulenzen und Einflussstabilität der elektrophysiologischen Messungen unter Strömung hinzufügen, daher wird mit dem hier beschriebenen Schwerkraftperfusionssystem empfohlen. - Eine montierte Kammer mit haftenden Zellen auf die Mikroskopstufe des Elektrophysiologie-Rigs übertragen und die mit Badlösung vorgefüllten Schläuche in das Loch des Stücks A einlegen. Gleichzeitig die Kammer füllen und die Zellen mit 10 ml Badlösung durch Drehen des 3-Wege-Luerschlosses so, dass die Lösung in die Kammer fließt.
- Sobald die gewünschte Patch-Konfiguration erfolgreich erreicht ist, können kanalströmen in einem statischen Bad bei Raumtemperatur stabilisiert werden. Sobald sich die Ströme stabilisiert haben, tragen Sie die Scherung schrittweise auf, so dass sich die Erhöhung des Stroms vor dem nächsten Schritt der Erhöhung der Scherspannung stabilisiert.
HINWEIS: Die Autoren finden den größten Erfolg mit der perforierten Patch-Konfiguration beim Studium mechanoaktivierter Ionenkanäle in Endothelzellen. Um perforierte Ganzzell-Patchkonfigurationen durchzuführen, fügen Sie 5 l einer 60 mg/ml-Lageramphotericin B in Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 1 ml 0,2 m sterilgefilterte Pipettenlösung hinzu. Nach der Erzeugung einer Giga-Ohm-Dichtung in der zellgebundenen Konfiguration bilden sich perforierte Ganzzell-Patches innerhalb von 2 x 5 min. - Entfernen Sie die Scherexposition gegenüber den Zellen, indem Sie den Fluss in die Kammer stoppen, sodass mechanosensitive Kanalströme zu den im statischen Bad beobachteten Basisströmen zurückkehren können.
- Isolieren Sie mechanosensitive Ionenkanalströme von Interesse, indem Sie die Lösungsvalenz (z.B. 60 mM K+ in Badlösung mit 0 Ca2+ in Pipettenlösung zur inneren Korrektur von K+-Kanälen) verändern. Tabelle 2 zeigt Beispiellösungsrezepte) und/oder pharmakologische Hemmung potenziell kontaminierender Stromquellen.
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Representative Results
In Abbildung 1sind mehrere Fotografien mit unterschiedlichen Ansichten der MPP-Flusskammer auf der Mikroskopbühne (oberes Panel) und einer schematischen Darstellung der MPP-Durchflusskammer (untere Wandgruppe) dargestellt. Der Schaltplan beschreibt die Abmessungen des gesamten Gerätes und der Durchflusskammer. Abbildung 2 zeigt ein Foto des Schwerkraftperfusionssystems zur MPP-Durchflusskammer in unserem Labor (Obere Platte). Gezeigt wird auch eine schematische Darstellung des Strömungssystems (untere Platte), die die Schritte hervorheben soll, die die Zellen in der Strömungskammer vom Lösungsrausch aus dem Perfusionssystem und von der Kraft der Vakuumentfernung der Lösung isolieren.
Ein Markenzeichen mechanosensitiver Ionenkanäle ist eine abrupte Rückkehr zu Ausgangsniveaus nach Beendigung des mechanischen Stimulus3,6,7. Abbildung 3 zeigt als Beispiel, dass das Entfernen des Scherspannungsreizs während elektrophysiologischer Aufnahmen von Kirstrom aus einer frisch isolierten Endothelzelle zu einer Rückkehr zu den ursprünglich in einem statischen Bad aufgezeichneten Basisströmen führt. Die Rückkehr zu den Basisstrompegeln nach dem Stoppen des Durchflusses in die MPP-Kammer erfolgte innerhalb von zehn Sekunden nach Ablaufeinstellung.
Vollzellige (WC) elektrophysiologische Aufnahmen, insbesondere solche, die aus frisch isolierten Zellen stammen, haben oft offensichtliche Leck-Hintergrundströme, die die Kanalaktivität maskieren können. Einige Ionenkanäle, wie die der nach innen korrigierenden K+ Kanalfamilie, haben biophysikalische Eigenschaften, die es ermöglichen, den Leckhintergrundstrom für eine genauere Analyse zu subtrahieren. Abbildung 4 zeigt als Beispiel den Prozess von Rohdaten (Abbildung 4A) bis zum berechneten und geplotteten linearen äußeren Leck (Abbildung 4B) bis zum endgültigen, leckage subtrahierten repräsentativen Ablauf (Abbildung 4C). Eine detaillierte Erklärung für die Berechnung und Subtraktion von Lecks von der perforierten RAW-PATCHaufzeichnung finden Sie in der begleitenden Legende zu Abbildung 4.
Abbildung 1: MPP-Durchflusskammer und detaillierte Schaltplan. Fotos der montierten MPP-Durchflusskammer (obere Platte) zeigen die Kammer auf der Mikroskopbühne aus drei verschiedenen Ansichten: die Seite, wie sie bei Experimenten betrachtet wird (links), vom Perfusionseinlass (Mitte) und vom Vakuumauslass (rechts), der in das Foto. Die Strömungsrichtung ist in jedem beschriftet. Beachten Sie, dass der Erdungsdraht leicht in einen der 2 mm Schlitze passen kann, wenn er in einem 90°-Winkel gebogen wird. Ein detaillierter Schaltplan (unten) zeigt genaue Abmessungen für die Replikation des Geräts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Das Schwerkraft-Perfusionssystem. Ein beschriftetes Foto des Schwerkraftperfusionssystems in unserem Labor ist im oberen Bereich dargestellt. Die zweistufige MPP-Durchflusskammer und das Schwerkraft-Perfusionssystem sind in der unteren Platte detailliert. Hervorgehoben wird die Trennung der Zell- und Unteren wasserfreien Strömungskammer und der beiden oberen und unteren Reservoirs. Schritt 1 ermöglicht es, die Lösung vom oberen Reservoir des Stücks B zu Stück D der Kammer zu fließen, in der Zellen gesät werden. Schritt 2 ermöglicht es, die Lösung vom Stück D hinunter zum unteren Reservoir, Stück F, zu fließen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Spuren der scherinduzierten Stromaktivierung von Kir-Kanälen und Rückkehr zu Basisstromniveaus nach Entfernung des Durchflusses. Eine gute positive Kontrolle für die Mechanoaktivierung von Ionenkanälen ist die Rückkehr zu den Ausgangsstromwerten, die ursprünglich in einem statischen Bad nach Beendigung des mechanischen Stimulus beobachtet wurden. Nach innen korrigierende K+ (Kir) Kanalströme werden innerhalb von Sekunden durch Scherspannung aktiviert, wenn die Schwerkraftlösung in die MPP-Durchflusskammer fließen darf. Nach Beendigung des Flusses in die Kammer kehren Kir-Ströme schnell zu statischen Ausgangswerten zurück, die vor dem Fluss beobachtet wurden. Auf das Pflaster wurde eine Rampe von -140 mV bis +40 mV über 400 ms aufgebracht. Die Badlösung enthielt 60 mM K+ und das Umkehrpotential betrug -20 mV. Die repräsentativen Spuren wurden aus einer Endothelzelle erzeugt, die frisch aus mausmesenterischen Arterien isoliert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Beispiel für Lecksubtraktion zur genauen Analyse des mechanoaktivierten Kirstroms. (A) Repräsentative Rohaufzeichnung des Kirstroms aus einer primären mausmesenterischen Endothelzelle mit bemerkenswertem linearen austrittsichströmenStrom (Ileak). Auf das Pflaster wurde eine Rampe von -140 mV bis +40 mV über 400 ms aufgebracht. Die Badlösung enthielt 60 mM K+ und das Umkehrpotential betrug -20 mV. (B) ILeck verhindert die Analyse der realen Kir-Kanal-Aktivität. Um dasLeckzu subtrahieren, berechnen Sie zunächst die lineare Neigungsleitfähigkeit von ILeak (G-Neigung = (Ia-Ib)/(Va-Vb)). Multiplizieren SieG-Neigung mit entsprechenden Spannungen der gesamten Rohspur, um Diagramm ILeck auf den Rohdaten. Die Linie sollte das nach außen gerichtete lineare Leck genau überlagern. (C) Subtrahieren Sie das geplotteteI-Leck von der gesamten Spur, so dass der lineare Außenstrom 0 pA/pF beträgt und der reale Kir-Strom analysiert werden kann. Beachten Sie in Panel C, dass der nach innen gerichtete Kirstrom etwa halb so hoch ist wie der der ursprünglichen Rohdatenspur im Panel A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Höhe (mm) | Breite (mm) | Länge (mm) | Zusätzliche Informationen | ||
| Stück A | 8 | 80 | 98 | Enthält ein Loch mit 3 mm Durchmesser für Einlass-Perfusionsrohre (siehe Materialtabelle)und einen rechteckigen Raum von 53 mm x 60 mm für den Zugang zu mittleren Teilen und Zellen | |
| Stück B | 1 | 80 | 98 | Enthält einen Raum (20 mm diagonal) unter der Perfusionsbohrung von Stück A und drei 2 mm x 17 mm Schlitze für den Zugang zu Zellen | |
| Stück C | 1 | 80 | 98 | Enthält einen Abstand von 22 mm x 50 mm, in dem Stück D mit der Silikonelastomerlösung haftet (siehe Materialtabelle) | |
| Stück D | 0,16 | 24 | 40 | Rechteckiger Glasschieberboden der Strömungskammer | |
| Stück E | 5 | 80 | 120 | Enthält einen Abstand von 45 mm x 50 mm, um die Visualisierung von Zellen auf Stück D zu ermöglichen. Für den Behälter-Vakuumauslass Stück F ist ein Abstand von 20 mm x 45 mm vorhanden, der | |
| Stück F | 0,16 | 24 | 50 | Rechteckiger Glasschieberboden des Vakuumaustrittsbehälters | |
| Montierte MPP | 15 | 80 | 120 | Die Durchflusskammer wird durch zwei Schritte vom Einlassperfusion und Auslassvakuum getrennt, um Störungen einer klar definierten Laminarscherung zu vermeiden | |
| Strömungskammer von montierten MPP | 1 | 22 | 42 | Stück D ist der Glasschieberboden der Strömungskammer | |
Tabelle 1: Abmessungen des MPP (montiert und demontiert) und zusätzliche Informationen, die für jeden Teil des Geräts spezifisch sind.
| lösung | Rezept (in mM) | Ph | ||
| Dissoziation | 55 NaCl, 80 Na-Glutamat, 6 KCl, 2 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 Glukose, 10 HEPES | 7,3 | ||
| (Zellisolation) | ||||
| Bad (Elektrophysiologie) | 80 NaCl, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 Glukose, 10 HEPES | 7,4 | ||
| Pipette (Elektrophysiologie) | 5 NaCl, 135 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl2, 5 Glukose, 10 HEPES | 7,2 | ||
Tabelle 2: Beispiele für Lösungen mit Rezepturen, die in den Experimenten verwendet werden.
| Endothelzellisolationsprotokoll | Verweise | |
| Cocktail aus neutraler Protease und Elastase (je 0,5 mg/ml; 1 h bei 37 °C) gefolgt von Kollagenase Typ I (0,5 mg/ml; 2,5 min) | 6,7 | |
| Sanftes mechanisches Abkratzen eines 5-cm 2-Bereichs an der Innenwand der absteigenden Thoraxaorta | 11 | |
| Na | 17 | |
| Na | 3 | |
| Kollagenase Typ IA (1 mg/ml) für 14 min bei 37 °C | 8 | |
Tabelle 3: Methodik zur Untersuchung mechanosensitiver Ionenkanäle mit elektrophysiologischen Techniken.
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Discussion
Das Gefäßsystem ist ständig aktiven hämodynamischen Kräften ausgesetzt, die mechanosensitive Ionenkanäle3,22 aktivieren, aber die physiologischen Rollen dieser Kanäle in der Scherstress-induzierten Mechanotransduktion sind nur 4,6,8. Die Mechanismen, die für die Mechanosensitivität von scherenspannungsaktivierten Kanälen verantwortlich sind, bleiben unbekannt. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Methode zur direkten Untersuchung von mechanosensitiven Ionenkanälen, die laminaren Scherspannungen in Echtzeit ausgesetzt sind.
Der entscheidende und wesentliche Schritt dieses Protokolls ist die Verwendung einer modifizierten parallelen Plattendurchflusskammer mit schmalen Öffnungen, um eine elektrophysiologische Pipette in die Kammer absenken zu können und unter Strömung auf Zellen zuzugreifen. Das allgemeine Prinzip dieses Gerätes ist, dass, wenn die Öffnungen schmal genug sind, physiologische Scherspannung (bis zu 15 dyn/cm2) ohne Lösungsüberlauf aufgrund von Oberflächenspannungskräften10erreicht werden kann. Um diese Experimente erfolgreich durchführen zu können, ist es entscheidend: (i) zu Samenzellen im Bereich der Bodenplatte, die sich direkt unter den Öffnungen befindet; ii) vor beginnem Beginn oder bei sehr langsamem (<0,01 dyn/cm2) Hintergrundstrom eine Giga-Ohm-Dichtung zu etablieren; iii) eine stabile Abdichtung zu halten und gleichzeitig den Durchfluss zu beschleunigen. Die Abmessungen des in unserem Labor verwendeten vierteiligen Acrylapparates sind zusammen mit detaillierten Schaltplänen (Abbildung1) vorgesehen, so dass das MPP-Durchflusskammer- und Durchflusssystem (Abbildung 2) für den Einsatz in jedem Labor, das untersucht wird, repliziert werden kann. mechanosensitiveIonenkanäle. Diese Dimensionen können auch geändert werden, um die von Zellen gesäte Fläche zu vergrößern und die Höhe des Strömungskanals zu ändern, was die Beziehung zwischen der Durchflussrate und der Scherspannung ändern würde. Eine Abnahme der Höhe der Durchflusskammer würde zu einer höheren Scherspannung bei gleicher Durchflussrate führen, was für die Erreichung höherer Scherspannungen von Vorteil sein könnte. Die Kammer kann auch so modifiziert werden, dass sie eine Strömungstrennwand enthält, die eine lokale Region mit rezirkulierendem gestörtem Fluss23induziert.
Die Hauptvorteile der MPP-Durchflusskammer sind (1) Die Echtzeituntersuchung von scheraktivierten Ionenkanälen aus Endothelzellen in Kultur und Zellen, die frisch aus Gefäßgewebe isoliert sind, (2) die Exposition von Zellen und die Reaktion von mechanosensitivem Ionen Kanäle zu physiologisch relevanten Niveaus der Scherspannung und (3) einfache Montage und Demontage mit Perfusionsoptionen für Experimente. Im Vergleich zu anderen bestehenden Methoden ist die einzige andere Methode, die die Durchführung elektrophysiologischer Aufnahmen unter genau definierter Scherspannung ermöglicht, das Säen der Zellen innerhalb eines Kapillarenendes und das Einsetzen der Aufnahmepipette in die Kapillaröffnung, da wurde in den frühen Studien3,22durchgeführt. Es gibt jedoch mehrere Nachteile im Vergleich zu der hier beschriebenen Methode, wie die Schwierigkeit, Zellen in Kapillaren auszusäen, Zugang zu einer sehr kleinen Anzahl von Zellen, die nahe genug am Kapillarende sind, damit die Pipette sie erreichen kann, und Strömungsstörungen am Ende des Strömungskanals (in diesem Fall Kapillare). Jeder dieser Nachteile macht es schwierig, Elektrophysiologie unter Strömung in Zellen in der Kapillaröffnung kultiviert und praktisch unmöglich zu flicken oder sogar Samenzellen frisch aus der Vaskulatur isoliert. Es ist auch unmöglich, einen Schritt einzuführen, um einen Bereich des gestörten Flusses zu erzeugen. Alle anderen existierenden Methoden, die entweder offene Kammern24,25 oder Puffing-Lösungen direkt auf einer Zelle17,18 verwenden, imitieren nicht die hämodynamische Umgebung im Blutgefäß.
Die Hauptbeschränkung dieser Methode ist jedoch eine Einschränkung, um Scherspannung auf höheren Ebenen des physiologischen Bereichs zu erreichen. Insbesondere wurden physiologische Scherstresswerte auf bis zu 70 Dyn/cm2 in gesunden Arterien26geschätzt. Im Gegensatz dazu betrug der höchste Scherspannungspegel, den wir in der aktuellenKammerkonfiguration erreichen konnten, 15 dyn/cm2 , woraufhin die Oberflächenspannungskräfte nicht ausreichen, um zu verhindern, dass die Lösung aus den Öffnungen ausläuft10. Es ist möglich, dass die Verringerung der Höhe des Strömungskanals es ermöglichen könnte, höhere Scherspannungen zu erreichen. Die Aufrechterhaltung einer stabilen Giga-Ohm-Dichtung unter hohem Scherstress ist eine weitere Herausforderung, aber die Erfolgsquote ist mit der Praxis angemessen. Wir fanden heraus, dass die Verwendung perforierter Patch-Techniken (einschließlich des Antibiotikums Amphotericin B in der Oben beschriebenen Pipettenlösung) stabilere Aufnahmen liefert als die Standardkonfiguration der ganzen Zelle. Darüber hinaus replizieren die MPP-Durchflusskammer und die verwendeten Lösungen nicht genau die Scherung des Blutflusses in den Arterien. Blut ist eine zähflüssige, nicht-Newtonsche Flüssigkeit, die wir in unseren In-vitro-Experimenten nicht repliziert haben. Zusätzlich ist die hier verwendete Kammer eine parallele Kammer, während die Scherspannung in den Arterien am besten mit der Formel für die Scherung in einem Zylinder berechnet wird.
Es gibt wichtige Überlegungen und Einschränkungen für die Durchführung von Single-Channel-Aufnahmen unter Flow. Dieses Verfahren eignet sich für eine zellgebundene Konfiguration (Pipette, die an der Membran einer intakten Zelle befestigt ist), die stabile Dichtungen ergibt. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass einzelne Kanäle, deren Aktivität aufgezeichnet wird, nicht direkt Scherspannung ausgesetzt sind, da sie durch die Aufnahmepipette abgeschirmt werden, insbesondere in der Inside-Out-Konfiguration27. Wir glauben, dass die ausgeschnittenen Patch-Konfigurationen nicht die zuverlässigsten sind, wenn sie verwendet werden, um die Empfindlichkeit von Ionenkanälen zu testen, da die ausgeschnittene Membran in der Regel in die Aufzeichnungspipette gezogen wird und somit keinem genau definierten Fluss ausgesetzt ist.
In Bezug auf die Art der Zellen, die in diesen Experimenten verwendet werden können, stellen vaskuläre Endothelzellen den am besten anwendbaren Zelltyp dar, um Scherspannung und die mechanosensitiven Kanäle zu untersuchen. Frühere Studien konzentrierten sich in erster Linie auf kultivierte Endothelzellen3,28, die leicht verfügbar sind. Wir haben die Verwendung dieser Methode getestet und erweitert, um Endothelzellen frisch isoliert von Mauswiderstandsarterien6,7. Andere Zelltypen sollten auf jeden Fall in Betracht gezogen werden. Vaskuläre glatte Muskelzellen, zum Beispiel, können Scherstress während Krankheitszuständen ausgesetzt werden, wo das Endothel beschädigt wurde undentfernt wurde 29,30. Dies stellt ein faszinierendes Studiengebiet dar, in dem mechanosensitive Kanäle, die sich in glatten Muskeln befinden, die sonst nicht durch Scherstress beeinflusst würden, nun zu potenziell pathophysiologischen Krankheitsmechanismen beitragen würden. Darüber hinaus ist die Transfektion von Fahrzeugzelllinien wie HEK oder CHO mit dem Gen, das den Interessenkanal kodiert, eine hervorragende Plattform für die biophysikalische Analyse von Kanälen in Kombination mit der MPP-Durchflusskammer.
Es ist auch wichtig zu beachten, dass, während die ursprüngliche Absicht für die MPP-Flusskammer für die Echtzeit-Untersuchung der Ionenkanal-Mechanoaktivierung war, kann die Anwendung des Geräts über dieses Ziel hinausgehen. Insbesondere kann derselbe Ansatz für Studien verwendet werden, die Elektrodensensoren verwenden, wie z. B. einen Stickstoffmonoxid-Sensor (NO), um die Freisetzung von NO als Reaktion auf Scherspannung zu bestimmen. Daher bieten wir eine verallgemeinerte Methodik für diejenigen, die daran interessiert sind, mechanisch regulierte biologische Prozesse in Echtzeit zu untersuchen, und fördern weitere Modifikationen der MPP-Kammer, um den spezifischen Forschungsbedarf für diejenigen zu decken, die mechanosensitive Prozesse in einer Vielzahl von Bereichen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL073965, IL) und (T32 HL007829-24, ISF) finanziert. Die Autoren möchten auch den Scientific Machine Shop an der University of Illinois in Chicago für die Generierung unserer neuesten MPP-Flusskammern würdigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 G syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| Elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| Neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
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