Summary
Bu protokolün amacı, kayma stresi ile mekanik duyarlı iyon kanallarının gerçek zamanlı aktivasyonunu araştırırken kullanılmak üzere değiştirilmiş bir paralel plaka akış odasını tarif etmektir.
Abstract
Sıvı kesme stres iyi endotel fonksiyonunda önemli bir rol oynamak için bilinmektedir. Çoğu vasküler yataklarda, kan akışındaki akut artışlardan kaynaklanan yüksek kesme gerilimi, damar duvarındaki mekanik stresin azaltılması için vazodilasyona neden olan sinyalizasyon basamaklarını tetikler. Kesme stres deseni de iyi bir ateroskleroz gelişiminde önemli bir faktör olarak bilinen laminar kesme stres atherokoruyucu ve rahatsız kesme stres Pro-atojik olmak. Biz çeşitli ara hücre sinyalizasyon yolları ayrıntılı bir anlayış var iken, ilk kimyasal mediatörlere mekanik uyarıcı tercüme reseptörleri tamamen anlaşılır değildir. Mekanik duyarlı iyon kanalları, böylece vazoaktif mediatörlerin üretimini kontrol etmek için kesme ve kesme kaynaklı hücre sinyalleme düzenleyen yanıt için önemlidir. Bu kanallar, kesme için en erken aktif sinyal bileşenleri arasındadır ve nitrik oksit üretimini teşvik ederek kesme kaynaklı vazodilasyona bağlanmıştır (örn., K+ [kır] ve geçici reseptör potansiyeli [TRP] kanallar) ve endotelyum hiperpolarizasyon faktörü (örn., kir ve kalsiyum aktive K+ [KCA] kanallar) ve piezo kanalları içeren belirlenmemiş bir mekanizma aracılığıyla kesme kaynaklı vazokonstriksiyon. Bu kanalların kesme kuvvetleri tarafından aktive edildiği Biyofizik mekanizmayı anlamak (örneğin, doğrudan veya birincil mekanik reseptör yoluyla), endotel disfonksiyon ile ilişkili patofisyolojisi çözmek için potansiyel yeni hedefler sağlayabilir ve Atherogenesis. Elektrofizyoloji kullanarak gerçek zamanlı iyon kanallarının akış kaynaklı aktivasyonunu kaydetmek için hala önemli bir sorundur. Hücreleri iyi tanımlanmış kesme stresine maruz bırakmak için standart yöntemler, örneğin koni ve plaka reometresi ve kapalı paralel plaka akış odası iyon kanalı aktivasyonunun gerçek zamanlı çalışmasına izin vermez. Bu protokolün amacı, iyi tanımlanmış kayma stres altında mekanik duyarlı iyon kanallarının gerçek zamanlı elektrofizyolojik kayıt sağlayan değiştirilmiş bir paralel plaka akış odası açıklamak için.
Introduction
Kan akışının oluşturduğu hemodinamik kuvvetler, endotel ve vasküler fonksiyonların1,2' de önemli roller çalmaktadır. Aynı zamanda iyon kanallarının çeşitli türleri akut kayma stres değişiklikleri yanıt bilinmektedir3,4,5 hipotezi için iyon kanalları primer kesme stres sensörleri olabilir lider. Daha yakın zamanda, biz ve diğerleri mekanik duyarlı iyon kanalları çeşitli kesme stres duyarlı damar fonksiyonları kritik roller oynamak gösterdi, kırma stres vazoaktif yanıt dahil olmak üzere6,7,8 ve gelişimsel anjiyogenez9. Ancak, iyon kanallarının kesme-stres hassasiyeti mekanizmaları neredeyse tamamen bilinmiyor. Bu bilgi boşluğu, iyi tanımlanmış kayma stres altında elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesi teknik zorluk nedeniyle muhtemeldir. Bu makalede, bu nedenle, bu hedefe ulaşmak için laboratuvarımızda rutin olarak gerçekleştirilen bir adım adım ayrıntılı protokol sunuyoruz6,7,10,11.
Bu yöntemin genel amacı, fizyolojik aralıkta iyi tanımlanmış kesme stres altında iyon kanal mechanoactivation gerçek zamanlı soruşturma sağlamak için. Bu, standart bir paralel plaka akış odası değiştirerek elde edilir bir elektrofizyolojik pipet odasına indirilerek ve erişim hücreleri alt plaka üzerinde gerçek zamanlı akımına maruz kalma sırasında yetiştirilen, bu elde etmek için benzersiz bir yaklaşım sağlar hedef6,7,11. Buna karşılık, önceki yayınlarda açıklanan standart paralel plaka akış odaları, kesme kuvvetlerine maruz kalan hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleme analizi için kullanılabilir12 veya diğer non-invaziv yaklaşımlar13,14 ama değil Elektrofizyoloji. Benzer şekilde, koni ve plaka aparatı, hücreleri açığa çıkarmak için başka bir güçlü yaklaşım15,16 kesme stres de elektrofizyolojik kayıtlar için uygun değildir. Böylece, bu akış cihazları iyon kanallarının kesme stres hassasiyeti araştırılması izin vermez. Akış altında elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesinde zorluk, bu önemli etkilerden sorumlu mekanizmalar hakkında bilgi sağlamlığı için ana nedenidir.
Aynı hedefe ulaşmak için alternatif yaklaşımlar açısından, doğru veya kontrollü olan hiçbiri vardır. Bazı önceki çalışmalar,17,18yukarıdakinden bir hücrenin yakınında getirilen başka bir pipet gelen sıvı akışına hücreleri göstererek akış altında iyon kanal etkinliğini kaydetmeye çalıştı. Bu son derece fizyolojik olmayan, bu koşullarda oluşturulan mekanik kuvvetler kan damarlarında kesme stres fizyolojik profilleri ile ortak az olduğu gibi. Benzer endişeler açık odaların perfüzyon fizyolojik kesme stres simüle girişimleri için geçerlidir. Daha önceki çalışma10' da ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi, açık bir sıvı hava arayüzü, fizyolojik olmayan, birden fazla bozulma ve devridaim oluşturur. Tüm bu endişeleri gidermek için, daha önceki çalışmalarımız6,7,10,11, yapılan "minimal invazif akış cihazı" olarak da adlandırılan değiştirilmiş bir paralel plaka (MPP) akış odası tasarladık Akrilik ve yaygın laboratuvarımızda kullanılır. Ancak, tasarımın orijinal tanımı neredeyse 20 yıl önce yayınlandı olmasına rağmen ve iyi tanımlanmış kesme stres altında elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesi sağlayan tek akış cihazdır, Bu metodoloji değil diğer laboratuvarlar tarafından benimsenmiştir ve akış altında akımları kaydetmek için girişim sadece çok az sayıda çalışmalar vardır. Bu nedenle, MPP akış odasını kullanmak için ayrıntılı bir açıklama sağlayan, mekanik duyarlı iyon kanalları ve vasküler biyoloji ile ilgilenen araştırmalar için büyük yardımcı olacaktır inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışmalarda hayvanların kullanımı Chicago hayvan bakım Komitesi Illinois Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (#16-183).
1. modifiye paralel plaka akış odasının montajı
Not: Lütfen Tablo 1 ve ŞEKIL 1 için MPP akış odası parça kimlikleri bakın. Montaj için oda parçalarının oryantasyonunu ayrıntılarıyla açıklayan bir şematik için lütfen Şekil 1 ' e bakın.
- Dikdörtgen kapak camına, D parçasına, C parçasının altına sığması için, ilk olarak 500 μL silikon elastomer kür ajanını 5 mL silikon elastomer tabanına karıştırarak silikon elastomer solüsyonu yapın.
- C parçasının dikdörtgen boşluklarının kenarları etrafında silikon elastomer çözeltisinin ince bir katmanını uygulayın ve dikdörtgen kapak cam parçası D 'yi doğrudan elastomer çözümüne yerleştirin, böylece D parçası C 'nin açık dikdörtgen alanını tamamen kapsar. Aşırı silikon elastomer solüsyonu dikkatlice silin.
- Dikdörtgen kapak cam, parça F, parça E altına yapışmasına için adım 1,2 tekrarlayın ve silikon elastomer çözüm oda sıcaklığında gece boyunca tedavi izin.
Not: Tedavi edildikten sonra, dikdörtgen kapak camı, değiştirilmesi gerekmeden önce altı aya kadar yapışacak şekilde kalacaktır. - Alt oda parçası ile başlayarak, parça E, sıralı olarak aşağıdaki sırada önceki her parça yerleştirerek MPP akış odası birleştirmek: parça E (alt), parça C, parça B, parça A (üst).
- Her parçanın vida delikleri köşelerinde hizalayın ve MPP akış odasına akış yönetirken meydana gelen sızıntıları önlemek için sıkıca birlikte parçaları vidalayın.
2. hücre hazırlama ve MPP akış odasına tohumlama
Not: Kültürlü endotel hücreler için 2.1 − 2.7 adımları izleyin. Endotel hücrelerini fare mezenterik arteriyel Arcade 'den izole etmek ve taze izole endotel hücrelerin hazırlanması için 2.8 − 2.14 adımda ayrıntılı yöntemi izleyin.
- 6-kuyu plakasında, dört ila 5 12 mm kapak cam daire/kuyu ve tohum hücrelerini% 10 ile% 30 arasındaki konflukans gibi tek hücrelere electrofizyoloji kayıtları için erişilebilir.
- Standart kültür koşullarında (% 5 Co2, 37 °c) hücrelerde inküyenin en az 2 h için hücrelerin uymasına izin vermek ve hiçbir daha fazla 24 yazarlar ' deneyim endotel hücreleri olarak h çok düz ve yama için zor zaman alt-confluency daha fazla 24 için seribaşı hale H.
- 6-kuyu plakasının bir kuyunun içine yapışan hücreleri içeren bir kapak camı çıkarın, fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile hızlı bir şekilde durulayın ve MPP akışına aktarmadan önce 2 mL elektrofizyolojik banyo çözeltisi (Tablo 2) içeren bir 35 mm Petri tabağı aktarın Odası.
- Kapak cam daire dikdörtgen kapak cam transfer, parça D, hangi MPP akış odasının C parçası için yapışmış olduğu emin olmak yeterli çözüm kapak cam üzerinde kalır böylece hücreler havaya maruz olmayacaktır. İstenilen banyo çözümünü (~ 250 μL) hücrelere ekleyin, böylece kapak camı çemberi ve hücreleri tamamen çözüme sahiptir.
- Böylece hücrelerin parça B yarık açıklıkları ile birlikte olacak şekilde kapak cam daire, vakum rezervuar tarafına en yakın yarısında kalır şekilde konumlandırın. cam kapak daire çözüm-cam yapışma ile D parça yapışır emin olun böylece uygulama kapak cam daire konumunu bozmaz Oda akışı.
- 1,4 ve 1,5 adımlarında ve Şekil 1' de gösterildiği gibi, parçaları birlikte uygun düzende VIDALAYARAK MPP akış odasını birleştirin. Oda mikroskop aşamasına aktarın ve hemen banyo çözeltisi ile Oda serpmek bu çözüm aspirasyon için vakum rezervuar ulaşır (~ 10 ml).
- Karanlık kenarlık ve bariz çekirdeği olan bir hücreyi belirleyerek deneme için sağlıklı bir hücreyi tanımlayın. Diğer hücrelerle temas eden hücreler veya hücre karartılması olarak görünen hücrelerden kaçının.
Not: Yazarların laboratuvarında, kültürde insan aort endotel hücreleri ve primer fare mezenterik endotel hücreleri kullanılmaktadır. Bununla birlikte, belirli araştırma ihtiyaçlarına ilgi gösteren diğer herhangi bir tür yapışkar hücre aynı şekilde kullanılabilir. - Yalıtılmış arteriyel Arcade ayrışma solüsyonu yıkayın (Tablo 2). Bu çarşı, 2 ml ön ısıtılmış (37 °C) kesilme çözeltisi ( Tablo 2' de gösterilen dissosyasyon çözeltisi tarifi) ile nötr proteaz (0,5 mg/ml) ve elastaz (0,5 mg/ml) Içeren 2 ml santrifüj tüpüne aktarın. 37 °C ' de her 10 dakikada bir hafifçe sallama ile 1 h için inkübe.
- Nötr proteaz/elastaz ayrışma çözeltisi 1 ml çıkarın ve 1 mg/ml kolajenaz tip 1 ekleyin. Son kolajenaz türü 1 konsantrasyonu 0,5 mg/ml için arterlerin içeren çözüme kolajenaz çözüm dönün. 37 °C ' de 2 − 3 dak.
- 5 sınıf forseps kullanarak, hızlı bir 35 mm çapı Petri çanak üzerinde bir 750 μL taze, soğutulmuş ayrışma çözeltisi içeren üzerine Arcade taşıyın. Daha fazla 2 20 G şırınga iğneler kullanarak doku DISSOCIATE endotel hücreleri enzimsel olarak sindirilmiş arterlerin mekanik olarak özgürleşmesi.
- 9 "tek kullanımlık Pasteur cam pipet kullanarak, hücre çözeltisi 10X cam pipet kullanarak yeni bir 1,5 mL santrifüj tüp için hücreleri aktarmadan önce triturate.
- Petri tabağı başka bir 750 μL ayrışma solüsyonu ile yıkayın ve aynı tüpe aktarın. Cam Pipet kullanarak, daha mekanik tek bir hücre süspansiyon endotel hücre bütünlüğünü zarar verebilecek kabarcıklar tanıtmak için dikkatli olmak için en az 10X pipetleme hücreleri dağıtır.
- 750, endotel hücresi süspansiyonunun (~ 500 − 1000 hücre) μL değerini, rezervuar vakum tarafına en yakın olan yarı MPP akış odasının D parçasına doğrudan ekleyin. Endotel hücrelerin oda sıcaklığında 45 dk ve 1 saat arasında uymasına izin verin.
- 1,4 ve 1,5 adımlarında ve Şekil 1' de gösterildiği gibi, parçaları birlikte uygun düzende VIDALAYARAK MPP akış odasını birleştirin. Oda mikroskop aşamasına aktarın ve hemen banyo çözeltisi ile Oda serpmek Bu çözelti vakum aspirasyonu ulaşır (~ 10 ml). Onların kaba ve yuvarlak fenotip tarafından erişilebilir endotel hücreleri tanımlamak19,20.
Not: Farklı arteriyel yataklardan endotel hücrelerini izole etmek için çeşitli sindirim yöntemleri ve enzim kokteylleri kullanılmıştır. Tablo 3 , mekanik duyarlı iyon kanallarının yama kelepçe elektrofizyolojisi için endotel hücrelerini yalıtmak için araştırmacılar çeşitli tarafından kullanılan protokoller ayrıntılı açıklamaları için bkz. Bu yöntemler büyük olasılıkla MPP akış odası ile birlikte kullanılmak üzere uygundur.
3. kesme stresini MPP akış odasına kontrol ederek, kayma-aktif mekanik duyarlı Iyon kanallarının elektrofizyolojik kayıtları
- 30 ml 'lik bir şırınga silindirini, mikrobor boru (iç çapı: 0,05 inç, dış çap: 0,09 inç) ile donatılmış 3 yönlü Luer kilitlere bağlayarak bir yerçekimi perfüzyon sistemi kurma, MPP 'nin 3 mm çapında giriş deliğine yerleştirilmesi için uygundur Odası.
- Dereceli silindiri, Çift taraflı bant kullanarak Elektrofizyoloji makinesinin çevresindeki Faraday kafesi 'nin dış yüzüne takın (Şekil 2). Önce MPP odasına tüp takmak için, önceden doldurmak şırınga ve küvet çözeltisi ile boru ( Tablo 2 için bkz: banyo çözeltisi ınwardly önleyici önleyici K+ kanallar endotel hücrelerde araştırmak için kullanılır). Borusu A parçasının MPP akış odası giriş deliğine takın.
- MPP akış odasını, çözelti vakum rezervuarında kaldırılmakta olan çözeltiyle önceden doldurun. Odaya akış durdurun ve üst işareti için dereceli silindir doldurmak. Çözeltinin Oda üzerinden akmasına ve belirli bir şırınga silindir yüksekliğindeki mL/s 'yi hesaplamak için bir durdurma-saat kullanarak akış oranlarını el ile hesaplayın.
- Akışı değiştirmek için şırıngayı yükseltin veya alçaltın ve böylece odada kesme yapın ve istenilen seviyede kesme stresi buluncaya kadar bu işleme devam edin.
- Aşağıdaki denklem21kullanarak paralel bir odada kesme gerilimi hesaplayın:
τ = 6μQ/h2w
Burada μ = sıvı viskozitesi (g/cm · s), Q = akış hızı (mL/s) ve paralel plaka odası genişliği (w = 2,2 cm) ve yüksekliği (h = 0,1 cm).
Not: Mevcut yerçekimi perfüzyon sistemi, bir şırınga silindir yüksekliği (gibi silindir üst ölçülen) içinde 57 cm mikroskop aşamasında, akış oranı 0,3 mL/s. Bu şırınga silindir yüksekliği ve akış hızında odasında hesaplanan kesme 0,7 dyn/cm2' dir. Ayrıca, peristaltik pompa gibi diğer perfüzyon sistemlerinin MPP akış odasına akışını kontrol etmek için kullanılabilirler. Ancak, bu cihazlar istenmeyen türbülans ekleyebilir ve akış altında Elektrofizyoloji ölçümlerinin istikrarı etkileyebilir, bu nedenle, burada açıklanan yerçekimi perfüzyon sistemi kullanılarak tavsiye edilir. - Monte edilen bir odası Elektrofizyoloji donanımının mikroskop aşamasına yapışan hücreler içeren transferi ve tüp ön-banyo çözeltisi ile parça A. aynı anda doldurmak ve hücreleri yıkayın 10 mL banyo çözeltisi ile 3-yönlü luer kilidi gibi çözüm odasına akar tornalama.
- İstenilen yama konfigürasyonu başarıyla elde edildikten sonra kanal akımlarının oda sıcaklığında statik bir banyoda stabilizasyonu sağlar. Akımlar stabilize edildikten sonra, kesme stresinde bir sonraki adımdan önce stabilize etmek için mevcut artışlara izin veren bir step-Wise moda kesme uygulayın.
Not: Yazarlar, endotel hücrelerinde mechanoactivated iyon kanalları okurken delikli yama konfigürasyonu ile en başarılı bulmak. Delikli tüm hücreli yama konfigürasyonları gerçekleştirmek için, dimetil sülfoxide (DMSO) 1 ml 0,2 μm steril filtreli pipet çözeltisi için 5 μL 60 mg/ml stok Amfoterisin B ekleyin. Hücreye bağlı konfigürasyonda bir giga-ohm mührü oluşturduktan sonra, 2 − 5 dk içinde perforasyonlu tüm hücreli yamalar oluşturur. - Mekanik duyarlı kanal akımlarının statik banyoda gözlenen temel akımına geri dönmesini sağlayan odacık akışını durdurarak hücrelere kesme pozlamasını kaldırın.
- Çözüm valresinin değiştirilmesi (örn. 60 mM K+ banyo çözeltisi, 0 CA2 + ' da pipet çözeltisi ile k + kanallarını iç alarak incelemek için, mekanik duyarlı iyon kanalı akımları ile ilgi alanı yalıtın. Tablo 2 örnek çözüm tarifleri gösterir) ve/veya potansiyel kontamine mevcut kaynakların farmakolojik inhibisyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroskop aşamasında MPP akış odasının farklı görünümlerini gösteren birden fazla fotoğraf (üst panel) ve MPP akış odasının şematik gösterimi (alt panel) Şekil 1' de gösterilir. Şematik detaylar tüm cihaz ve akış odası boyutları. Şekil 2 , laboratuvarımızda (üst panel) MPP akış odasına yerçekimi perfüzyon sisteminin bir fotoğrafını gösterir. Ayrıca gösterilen akış sisteminin bir şematik temsili (alt panel) perfüzyon sisteminden çözüm acele ve çözeltinin vakum çıkarılması kuvvetinden akış odasında hücreleri izole adımları vurgulamak için tasarlanmıştır.
Mechanosensitive iyon kanallarının bir damgasını mekanik uyarıcı3,6,7durdurulması üzerine temel seviyelere ani bir dönüş olduğunu. Şekil 3 ' te, yeni izole endotel hücreden gelen kir akımı elektrofizyolojik kayıtlar sırasında kesme gerilimi uyarısının kaldırılması, başlangıçta statik bir banyoda kaydedilen temel akımların dönüşüne neden olan bir örnek olarak gösterilmektedir. MPP odasına akış durdurulduktan sonra temel akım düzeylerine dönüş akış durdurulması on saniye içinde oluştu.
Tüm hücre (WC) elektrofizyolojik kayıtlar, özellikle taze izole hücrelerden alınan, genellikle kanal etkinliğini maskeleyebilir bariz sızıntı arka plan akımları var. Bazı iyon kanalları, gibi içten retifying K+ kanal Aile, daha doğru analiz için sızıntı arka plan akımı çıkararak izin Biyofizik özelliklere sahip. Şekil 4 , ham verilerden (Şekil 4A) hesaplanan ve çizilmiş doğrusal dışa sızıntı (Şekil 4b) ile son, sızıntı çıkarma temsili izlemede (şekil4c) bir örnek olarak gösterilmektedir. Eşlik eden efsanede ham delikli WC yama kayıtlarından, Şekil 4' e kadar sızıntı hesaplanması ve çıkarılmasıyla ilgili ayrıntılı bir açıklama bakın.
Şekil 1: MPP akış odası ve ayrıntılı şematik. Birleştirilmiş MPP akış odasının fotoğrafları (üst panel), üç farklı görünümden mikroskop aşamasındaki odayı gösterir: deneyler sırasında (solda), perfüzyon girişinde (orta) ve görüş alanı dışında olan vakum prizinden (sağda) fotoğraf. Akış yönü her etiketli. 90 ° açıyla bükülmüş olduğunda, zemin kablolarının 2 mm 'lik yırtdan birine kolayca sığması gerektiğini unutmayın. Ayrıntılı şematik (altta) cihazın çoğaltılması için tam boyutları gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: yerçekimi perfüzyon sistemi. Laboratuvarımızda yerçekimi perfüzyon sisteminin etiketli bir fotoğrafı üst panelde gösterilir. İki adımlı MPP akış odası ve yerçekimi perfüzyon sistemi alt panelde ayrıntılı olarak görülmektedir. Hücreler ve iki üst ve alt rezervuarlar içeren akış odasının ayrılması vurgulanır. Adım 1, parça B 'nin üst rezervuarından hücrelerin seeded olduğu odanın D parçasına akışa çözüm sağlar. Adım 2 parça D aşağı alt rezervuar, parça F. lütfen buraya tıklayın Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için akış çözüm sağlar.
Şekil 3: kir kanallarının kesme kaynaklı akım aktivasyonunun temsili izleri ve akış kaldırıldıktan sonra temel akım düzeylerine geri dönün. İyon kanallarının mechanoactivation için iyi bir olumlu kontrol başlangıçta mekanik Stimulus durdurulması üzerine statik bir banyoda gözlenen temel akım seviyeleri geri dönüş olduğunu. Yerçekimi çözeltisi MPP akış odasına akmasına izin verildiğinde, inwardly K+ (kır) Kanal akımları kesme gerilimi ile Saniyeler içinde etkinleştirilir. Oda akışının durdurulması üzerine, kir akımları hızla akış öncesinde gözlenen temel statik seviyelere döner. Bir rampa-140 MV için + 40 mV üzerinde yama için uygulanan 400 MS. banyo solüsyonu bulunan 60 mm K+ ve ters potansiyeli ~-20 mV oldu. Temsilci izleri, fare mezenterik arterlerden taze izole edilmiş endotel hücreden üretilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: mekanik aktif kir akımı doğru analizi için sızıntı çıkarma örneği. (A) önemli doğrusal dışa sızıntı akımı (ısızıntı) ile primer fare mezenterik endotel hücresinden kir akımı temsilcisi ham kaydı. Bir rampa-140 MV için + 40 mV üzerinde yama için uygulanan 400 MS. banyo solüsyonu bulunan 60 mm K+ ve ters potansiyeli ~-20 mV oldu. (B) bensızıntı gerçek kir kanal aktivite Analizi önler. Bensızıntıçıkarmak için, ilk bensızıntı doğrusal eğim iletkenlik hesaplayın (GSlope = (ia-ıb)/(va-vb)). Ham veri üzerindesızıntı çizmek için tüm ham iz karşılık gelen voltajları ile Geğim çarpın. Satır, dışa doğru doğrusal sızıntısı tam olarak bindirmelidir. (C) Eğer doğrusal dışa akım ~ 0 PA/PF ve gerçek kir akımı analiz edilebilir böylece tüm izsızıntı çizilen çıkarın. Panel C içinde dikkat et iç kir akımı yaklaşık yarısı bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın panelde orijinal ham veri izleme.
| Yükseklik (mm) | Genişlik (mm) | Uzunluk (mm) | Ek bilgi | ||
| Parça A | 8 | 80 | 98 | Giriş perfüzyon borusu için 3 mm çap delik içerir (bkz . malzeme tablosu) ve 53 mm x 60 mm dikdörtgen alan orta parçalar ve hücrelere erişim için | |
| Parça B | 1 | 80 | 98 | Piece A 'nın perfüzyon deliği altında bir boşluk (20 mm diyagonal) ve hücrelere erişim için üç adet 2 mm x 17 mm kızak içerir | |
| Parça C | 1 | 80 | 98 | Adet D 'nin silikon elastomer çözeltisi kullanılarak yapışmış olduğu 22 mm x 50 mm 'lik bir alan içerir (bkz . malzeme tablosu) | |
| Parça D | 0,16 | 24 | 40 | Akış odasının dikdörtgen cam slayt alt | |
| Parça E | 5 | 80 | 120 | Piece D 'de hücrelerin görselleştirilmesine izin vermek için 45 mm x 50 mm 'lik bir alan içerir. Rezervuar vakum çıkışı, Piece F için 20 mm x 45 mm alan var | |
| Parça F | 0,16 | 24 | 50 | Vakum çıkış rezervuar dikdörtgen cam slayt alt | |
| Birleştirilmiş MPP | 15 | 80 | 120 | Akış odası, iyi tanımlanmış laminar kesme kesintisi önlemek için iki adım ile giriş perfüzyon ve çıkış vakum ayrılır | |
| Birleştirilmiş MPP akış odası | 1 | 22 | 42 | Piece D akış odasının cam slayt alt | |
Tablo 1: MPP 'nin boyutları (montajlı ve sökülebilir) ve aygıtın her bir kısmına özgü ek bilgiler.
| Çözüm | Tarif (mM cinsinden) | Ph | ||
| Ayrılma | 55 NaCl, 80 na-glutamat, 6 KCl, 2 MgCl2, 0,1 CAcl2, 10 GLIKOZ, 10 HEPES | 7,3 | ||
| (Hücre yalıtımı) | ||||
| Banyo (Elektrofizyoloji) | 80 NaCl, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 CAcl2, 10 GLIKOZ, 10 HEPES | 7,4 | ||
| Pipet (Elektrofizyoloji) | 5 NaCl, 135 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl2, 5 glikoz, 10 HEPES | 7,2 | ||
Tablo 2: deneylerde kullanılan tarifler ile çözüm örnekleri.
| Endotel hücre yalıtım Protokolü | Başvuru | |
| Nötr proteaz ve elastaz kokteyli (0,5 mg/ml her biri; 37 °c ' de 1 saat) ve ardından kolajenaz tipi ı (0,5 mg/ml; 2,5 min) | 6, 7 | |
| İnen torasik aort iç duvarında bulunan 5 cm2 bölgenin nazik mekanik kazınma | 11 | |
| Na | 17 | |
| Na | 3 | |
| 37 °C ' de 14 dakika için collagenase tipi IA (1 mg/mL) | 8 | |
Tablo 3: elektrofizyolojik teknikler kullanarak mekanik duyarlı iyon kanallarını incelemek için metodoloji.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vasküler sistem sürekli aktif hemodinamik kuvvetlere maruz kalmaktadır, hangi mekanik duyarlı iyon kanalları etkinleştirmek,3,22 ama bu kanallar kesme stres kaynaklı mechanotransdution içinde fizyolojik rolleri sadece 4,6,8ortaya çıkmaya başlıyor. Kesme stres aktif kanalların mekanik sensitivitesi sorumlu mekanizmalar bilinmeyen kalır. Burada ayrıntılı protokol, gerçek zamanlı olarak laminar kesme stresi maruz mekanik duyarlı iyon kanalları doğrudan soruşturma yöntemi açıklanmaktadır.
Bu protokolün kritik ve önemli basamağı, elektrofizyolojik bir pipetin odanın içine indirmesi ve akış altındaki hücrelere erişim sağlamak için dar açıklıklara sahip değiştirilmiş bir paralel plaka akış odasının kullanımı. Bu cihazın genel prensibi, açıklıkların yeterince dar olması durumunda, yüzey gerginlik güçleri10nedeniyle çözelti taşması olmaksızın fizyolojik kesme stres (15 dyn/cm2' ye kadar) elde edilebilir. Bu denemeleri başarıyla gerçekleştirmek için kritik öneme sahiptir: (i) doğrudan açıklıkların altında bulunan alt plaka alanında tohum hücrelere; (ii) akış başlamadan önce veya çok yavaş (< 0.01 dyn/cm2) arka plan akışı sırasında bir giga-ohm mührü kurun; (iii) akımı hızlandırırken istikrarlı bir mührü koruyun. Laboratuvarımızda kullanılan dört parçalı akrilik cihazın boyutları, ayrıntılı şemalar (Şekil 1) ile birlikte sağlanır, böylece MPP akış odası ve akış sistemi (Şekil 2) herhangi bir laboratuvarda kullanılmak üzere çoğaltılabilir Mekanik duyarlı iyon kanalları. Bu boyutlar, hücreler tarafından ayrılmış alanı artırmak ve akış hızı ile kesme gerilimi arasındaki ilişkiyi değiştiren akış kanalının yüksekliğini değiştirmek için de değiştirilebilir. Akış odasının yüksekliğindeki bir azalma, daha yüksek kesme gerilimleri elde etmek için yararlı olabilecek aynı akış hızı için daha yüksek kesme stresine neden olur. Oda aynı zamanda bir yerel bölge indükler bir akış ayırma bariyeri içerecek şekilde değiştirilebilir geri sirkülasyon rahatsız akışı23.
MPP akış odası kullanmanın önemli avantajları arasında (1), vasküler dokudan taze izole edilen kültür ve hücrelerdeki endotel hücrelerden kesme aktive iyon kanallarının gerçek zamanlı incelenmesi, (2) hücrelerin maruz kalması ve mekanik hassas iyon tepkisi ve (3) deney için perfüzyon seçenekleriyle kolay montaj ve demontaj. Mevcut diğer yöntemlerle ilgili olarak, iyi tanımlanmış kesme stresi altında elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesine izin veren tek yöntem, hücreleri bir kapiller ucunda tohumlama ve kayıt pipetini kapiller açılışına takarak, erken çalışmalarda3,22yapıldı. Ancak, burada açıklanan yönteme kıyasla birden fazla dezavantaj vardır, örneğin kılcal hücrelerde tohumlama zorluğu, pipet için kapiller ucuna yeterince yakın olan çok az sayıda hücreye erişim, onlara ulaşabilmek ve akış kanalının sonunda (Bu durumda kapiller) Akış bozuklukları. Bu dezavantajlara her biri, kapiller açılışında Kültürlenmiş hücrelerde akış altında Elektrofizyoloji yapmak ve neredeyse imkansız yama ya da tohum hücreleri taze damarından izole etmek için yapar. Ayrıca, rahatsız edici bir akış alanı oluşturmak için bir adım tanıtmak imkansız. Açık odaları24,25 veya şişirme çözümleri doğrudan bir hücrede17,18 kullanan diğer tüm mevcut yöntemler kan damarındaki hemodinamik ortamı taklit etmez.
Bu yöntemin ana sınırlama, ancak, fizyolojik aralığın daha yüksek seviyelerde kesme stres elde etmek için bir kısıtlamayı olduğunu. Özellikle, fizyolojik kesme stres seviyeleri kadar ulaşmak için tahmin edilmiştir 70 dyn/cm2 sağlıklı arterlerde26. Bunun aksine, odanın mevcut konfigürasyonuna ulaşabildiği en yüksek kesme stres seviyesi 15 dyn/cm2' dir, sonra yüzey gerilimi güçleri çözümün açıklıkların10' dan dökülmesini önlemek için yeterli değildir. Akış kanalının yüksekliğini azaltmak, daha yüksek kesme stres düzeylerine ulaşmasına izin verebilir. Yüksek kesme stres altında istikrarlı bir giga-ohm mühür bakımı başka bir zorluk ama başarı oranı pratik ile makul. Biz (yukarıda açıklandığı gibi pipet çözeltisi içinde antibiyotik Amfoterisin B dahil) delikli yama tekniği kullanarak standart tüm hücre konfigürasyonuna göre daha istikrarlı kayıtlar verir bulundu. Ayrıca, MPP akış odası ve kullanılan çözümler tam olarak arterlerde kan akışının kesme çoğaltmak değil. Kan, bizim in vitro deneylerinde çoğaltılmayan, viskoz olmayan, Newton 'a özgü bir sıvıdır. Ayrıca, burada kullanılan oda paralel bir odacık iken arterlerde kesme stres en iyi bir silindir içinde kesme formülü kullanılarak hesaplanır.
Akış altında tek kanallı kayıtlar gerçekleştirmek için önemli hususlar ve sınırlamalar vardır. Bu yöntem, bir hücreye bağlı yapılandırma için uygundur (sağlam bir hücrenin membranına bağlı pipet), istikrarlı mühürler verir. Etkinlik kaydedilmekte olan tek kanalların, özellikle iç-çıkış yapılandırması27' de kayıt pipeti tarafından korunduğundan, kesme stresi için doğrudan maruz kalmadığından haberdar olması önemlidir. Eksize edilen membran genellikle kayıt pipetine çekilir ve böylece iyi tanımlanmış bir akışa maruz kalmadığından, iyon kanallarının akımının hassasiyetini test etmek için kullanıldığında eksiz yama konfigürasyonlarının en güvenilir olmadığını düşünüyoruz.
Bu deneylerde kullanılabilecek hücrelerin türü açısından, vasküler endotel hücreler, kayma stresi ve mekanik duyarlı kanalları incelemek için en uygun hücre tipini temsil eder. Daha önce yapılan çalışmalar öncelikle kültürlü endotel hücrelerine odaklanmıştır3,28 bu kolayca kullanılabilir. Biz test ve endotel hücreleri taze-fare direnci arterleri6,7izole bu yöntemin kullanımını genişletti. Diğer hücre türleri kesinlikle dikkate alınmalıdır. Vasküler pürüzsüz Kas hücreleri, örneğin, endotelyum hasar gördü ve kaldırılan hastalık durumları sırasında kesme stres maruz olabilir29,30. Bu, düzgün kas içinde ikamet eden mekanik duyarlı kanallar, aksi takdirde kesme stres tarafından etkilenmez olacak, şimdi potansiyel patofizyolojik hastalık mekanizmalarına katkı sağlayacak çalışma ilginç bir alanı temsil eder. Dahası, HEK veya CHO gibi araç hücresi hatlarının, ilgi kanalını kodlayarak gen ile transfeksiyon, MPP akış odasının kullanımı ile birlikte kanalların Biyofizik analizleri için mükemmel bir platformdur.
Ayrıca MPP akış odası için orijinal niyet iyon kanal mechanoactivation gerçek zamanlı soruşturma için iken, cihazın uygulama bu hedefin ötesine uzatabilir dikkat etmek önemlidir. Özellikle, aynı yaklaşım, kesme stres yanıt olarak NO salınımını belirlemek için bir nitrik oksit (NO) sensörü gibi elektrot sensörleri kullanan çalışmalar için kullanılabilir. Bu nedenle, gerçek zamanlı olarak mekanik olarak düzenlenmiş biyolojik süreçleri araştırmaya ve MPP odasının daha fazla değiştirilmesini teşvik edenler için belirli araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için genelleştirilmiş bir metodoloji sağlıyoruz çeşitli alanlarda mekanik duyarlı süreçler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (R01 HL073965, IL) ve (T32 HL007829-24, ıSF) tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar da en son MPP akış odaları oluşturmak için Chicago Illinois Üniversitesi 'nde bilimsel makine dükkanı kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 G syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| Elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| Neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
