Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य कतरनी तनाव से mechanosensitive आयन चैनलों की वास्तविक समय सक्रियण की जांच में उपयोग के लिए एक संशोधित समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष का वर्णन है.
Abstract
द्रव कतरनी तनाव endothelial समारोह में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है. सबसे संवहनी बिस्तरों में, रक्त प्रवाह में तीव्र वृद्धि से ऊंचा कतरनी तनाव एक संकेत झरना ट्रिगर करता है जिसके परिणामस्वरूप वासोडिलेशन होता है जिससे संवहनी दीवार पर यांत्रिक तनाव को समाप्त किया जाता है। कतरनी तनाव के पैटर्न भी अच्छी तरह से लेमिनर कतरनी तनाव के साथ atherosclerosis के विकास में एक महत्वपूर्ण कारक होने के लिए जाना जाता है atheroprotective जा रहा है और परेशान कतरनी तनाव समर्थक atherogenic जा रहा है. जबकि हम विभिन्न मध्यवर्ती सेल संकेतन रास्ते की एक विस्तृत समझ है, रिसेप्टर्स कि पहले रासायनिक मध्यस्थों में यांत्रिक उत्तेजना अनुवाद पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं. मेकेनोसेन्सेटिव आयन चैनल कतरनी की प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण होते हैं और कतरनी-प्रेरित सेल संकेतन को विनियमित करते हैं जिससे वासोएक्टिव मध्यस्थों के उत्पादन को नियंत्रित किया जा सकता है। इन चैनलों जल्द से जल्द सक्रिय संकेत घटककतरा के बीच में हैं और नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन को बढ़ावा देने के माध्यम से कतरनी प्रेरित vasodilation से जोड़ा गया है (जैसे, अंदर से सुधार K+ [कीर] और क्षणिक रिसेप्टर क्षमता [टीआरपी] चैनल) और endothelium hyperpolarizing कारक (जैसे, किर और कैल्शियम सक्रिय कश्मीर+ [KCa] चैनल) और एक अनिर्धारित तंत्र है कि piezo चैनल शामिल है के माध्यम से कतरनी प्रेरित वाहिकासंकीर्णन. जैवभौतिक तंत्र को समझना जिसके द्वारा इन चैनलों कतरनी बलों द्वारा सक्रिय कर रहे हैं (यानी, सीधे या एक प्राथमिक mechano-रिसेप्टर के माध्यम से) संभावित नए लक्ष्य प्रदान करने के लिए endothelial रोग के साथ जुड़े pathophysiology को हल कर सकता है और अतींद्रजनन। यह अभी भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग कर वास्तविक समय में आयन चैनलों के प्रवाह प्रेरित सक्रियण रिकॉर्ड करने के लिए एक बड़ी चुनौती है। अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी तनाव के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए मानक तरीके, इस तरह के शंकु और प्लेट rheometer और बंद समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष आयन चैनल सक्रियण के वास्तविक समय अध्ययन की अनुमति नहीं है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक संशोधित समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष है कि अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी तनाव के तहत mechanosensitive आयन चैनलों की वास्तविक समय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है का वर्णन करने के लिए है.
Introduction
रक्त प्रवाह से उत्पन्न हीमोडायनामिक बल एंडोथेलियल और संवहनी फलन1,2में प्रमुख भूमिका निभाने के लिए जाने जाते हैं . यह भी अच्छी तरह से जाना जाता है कि आयन चैनलों के कई प्रकार तीव्रता कतरनी तनाव में परिवर्तन का जवाब3,4,5 परिकल्पना है कि आयन चैनल ों प्राथमिक कतरनी तनाव सेंसर हो सकता है के लिए अग्रणी. हाल ही में, हम और अन्य लोगों से पता चला है कि mechanosensitive आयन चैनलकई कतरनी तनाव के लिए vasoactive प्रतिक्रिया सहित कई कतरनी तनाव संवेदनशील संवहनी कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभातेहैं 6,7,8 , और विकासात्मक एंजियोजेनेसिस9. आयन चैनलों के कतरनी तनाव संवेदनशीलता के तंत्र, तथापि, लगभग पूरी तरह से अज्ञात हैं. ज्ञान का यह अंतर सुपरिभाषित कतरनी तनाव के तहत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग करने की तकनीकी कठिनाई के कारण होने की संभावना है। इस लेख में, इसलिए, हम इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया विस्तृत प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम प्रदान करते हैं6,7,10,11.
इस विधि के समग्र लक्ष्य शारीरिक रेंज में अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी तनाव के तहत आयन चैनल mechanoactivation की वास्तविक समय जांच की अनुमति है. यह एक मानक समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष को संशोधित करने के द्वारा हासिल की है एक electrophysiological pippette कक्ष में कम किया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए और प्रवाह के लिए वास्तविक समय जोखिम के दौरान नीचे की थाली पर हो कोशिकाओं का उपयोग, इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए एक अद्वितीय दृष्टिकोण प्रदान लक्ष्य6,7,11. इसके विपरीत, मानक समानांतर प्लेट प्रवाह कक्षों, पूर्व प्रकाशनों में वर्णित कतरनी बलों को उजागर कोशिकाओं की वास्तविक समय इमेजिंग विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता12 या अन्य गैर इनवेसिव दृष्टिकोण13,14 लेकिन के लिए नहीं वैद्युत शरीर विज्ञान। इसी प्रकार, शंकु और प्लेट उपकरण, कोशिकाओं को अपस्मार करने के लिए एक और शक्तिशाली दृष्टिकोण तनाव15,16 भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त नहीं है। इस प्रकार, इन प्रवाह उपकरणों आयन चैनलों की कतरनी तनाव संवेदनशीलता की जांच की अनुमति नहीं है. प्रवाह के तहत electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रदर्शन में कठिनाई इन महत्वपूर्ण प्रभाव के लिए जिम्मेदार तंत्र के बारे में जानकारी की कमी के लिए मुख्य कारण है.
वैकल्पिक दृष्टिकोण के संदर्भ में एक ही लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, वहाँ कोई नहीं है कि के रूप में सही या नियंत्रित कर रहे हैं. कुछ पहले के अध्ययनों में 17,18से ऊपर के सेल के आस - पासके क्षेत्र में लाए गए अन्य पिपेट से आने वाले तरल की धारा को कोशिकाओं को उजागर करके आयन चैनल गतिविधि को प्रवाह के अधीन रिकॉर्ड करने का प्रयास किया गया . यह अत्यधिक गैर-भौतिक है, क्योंकि इन स्थितियों में उत्पन्न यांत्रिक बलों में रक्त वाहिकाओं में कतरनी तनाव की शारीरिक प्रोफाइल के साथ कम है। इसी तरह की चिंताओं को खुले कक्षों के भ्रम द्वारा शारीरिक कतरनी तनाव अनुकरण करने के प्रयास करने के लिए लागू होते हैं. जैसा कि हमारे पहले के अध्ययन में विस्तार से चर्चा10, एक खुला तरल हवा इंटरफ़ेस कई गड़बड़ी और recirculation, जो गैर भौतिक हैं बनाता है. इन सभी चिंताओं को संबोधित करने के लिए, हम एक संशोधित समानांतर प्लेट (एमपीपी) प्रवाह कक्ष तैयार किया है, यह भी हमारे पहले के अध्ययन में "न्यूनतम इनवेसिव प्रवाह डिवाइस" के रूप में संदर्भित6,7,10,11, बनाया एक्रिलिक से और बड़े पैमाने पर हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया. हालांकि, इस तथ्य के बावजूद कि डिजाइन का मूल विवरण लगभग 20 साल पहले प्रकाशित किया गया है और केवल प्रवाह उपकरण है जो अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी तनाव के तहत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने की अनुमति देता है, इस पद्धति को नहीं किया गया है अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाया और वहाँ केवल बहुत कुछ अध्ययन है कि प्रवाह के तहत धाराओं रिकॉर्ड करने का प्रयास कर रहे हैं. इसलिए, हम मानते हैं, कि एमपीपी प्रवाह कक्ष का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करने के लिए जो mechanosensitive आयन चैनलों और संवहनी जीव विज्ञान में रुचि रखते हैं शोध करने के लिए बहुत मदद की होगी.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
हमारे अध्ययन में जानवरों का उपयोग शिकागो पशु देखभाल समिति (#16-183) में इलिनोइस विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित है.
1. संशोधित समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर की विधानसभा
नोट: कृपया MPP प्रवाह कक्ष भाग IDs के लिए तालिका 1 और चित्र 1 देखें. विधानसभा के लिए कक्ष टुकड़े के अभिविन्यास का विवरण एक योजनाबद्ध विवरण के लिए चित्र 1 को देखें.
- आयताकार कवर ग्लास, टुकड़ा डी, टुकड़ा सी के नीचे करने के लिए पालन करने के लिए, पहले अच्छी तरह से सिलिकॉन elastomer समाधान मिश्रण द्वारा सिलिकॉन elastomer समाधान बनाने के लिए 5 एमएल सिलिकॉन elastomer आधार के 5 एमएल में.
- टुकड़ा सी के आयताकार अंतरिक्ष के किनारों के आसपास सिलिकॉन इलोस्टोमर समाधान की एक पतली परत लागू करें और धीरे से आयताकार कवर ग्लास टुकड़ा डी सीधे elastomer समाधान पर जगह है कि टुकड़ा डी पूरी तरह से टुकड़ा सी के खुले आयताकार अंतरिक्ष को शामिल किया गया। ध्यान से अतिरिक्त सिलिकॉन elastomer समाधान मिटा.
- आयताकार कवर ग्लास, टुकड़ा एफ, टुकड़ा ई के नीचे का उपयोग करने के लिए कदम 1.2 दोहराएँ और कमरे के तापमान पर रात में इलाज करने के लिए सिलिकॉन elastomer समाधान की अनुमति देते हैं।
नोट: एक बार ठीक हो जाने पर, आयताकार कवर ग्लास को बदलने की आवश्यकता से पहले छह महीने तक पालन किया जाएगा। - नीचे कक्ष टुकड़ा, टुकड़ा ई के साथ शुरुआत, क्रमिक रूप से निम्नलिखित क्रम में पिछले के शीर्ष पर प्रत्येक टुकड़ा रखने से एमपीपी प्रवाह कक्ष इकट्ठा: टुकड़ा ई (नीचे), टुकड़ा सी, टुकड़ा बी, टुकड़ा एक (ऊपर).
- कोनों पर प्रत्येक टुकड़ा के पेंच छेद संरेखित करें और कसकर टुकड़े एक साथ पेंच करने के लिए होने वाली से लीक को रोकने के लिए, जबकि एमपीपी प्रवाह कक्ष के लिए प्रवाह प्रशासन.
2. सेल तैयारी और एमपीपी फ्लो चैंबर में सीडिंग
नोट: सुसंस्कृत अंत:स्वृणोली कोशिकाओं के लिए चरणों का पालन करें 2.1$2.7. माउस mesenteric धमनी आर्केड और ताजा अलग endothelial कोशिकाओं की तैयारी से endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए चरण 2.8 $2.14 में विस्तृत विधि का पालन करें।
- एक 6-वेल प्लेट में, चार से पांच मिमी कवर ग्लास सर्कल/वेल और बीज कोशिकाओं को 10% और 30% संगम के बीच रखें ताकि एकल कोशिकाओं को इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए एक्सेस किया जा सके।
- मानक संस्कृति की स्थिति के तहत इनक्यूबेट कोशिकाओं (5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस) से कम नहीं के लिए कोशिकाओं का पालन करने की अनुमति देने के लिए और कोई अधिक से अधिक 24 एच लेखकों के अनुभव में endothelial कोशिकाओं के रूप में बहुत फ्लैट और पैच करने के लिए मुश्किल हो जब 24 से अधिक के लिए उप संगम पर बीज एच.
- 6 अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं से पालन की कोशिकाओं युक्त एक कवर ग्लास निकालें, जल्दी से फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में कुल्ला, और एक 35 मिमी पेट्री डिश जिसमें 2 एमएल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल बाथ समाधान (तालिका 2) एमपीपी प्रवाह में स्थानांतरित करने से पहले स्थानांतरित करें कक्ष.
- आयताकार कवर ग्लास, पीस डी, जो एमपीपी फ्लो चैम्बर के पीस सी का पालन किया जाता है, को कवर ग्लास में स्थानांतरित करें ताकि कोशिकाओं को हवा के संपर्क में न बनाया जा सके। कोशिकाओं में वांछित स्नान समाधान ($250 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें ताकि कवर कांच वृत्त और कोशिकाएं समाधान में पूरी तरह से जलमग्न हो सकें।
- कवर ग्लास सर्कल को इस तरह रखें कि यह वैक्यूम जलाशय की ओर के आधे निकटतम में स्थित हो ताकि कोशिकाएं पीस B के भट्ठा उद्घाटनों के अनुरूप हों, यह सुनिश्चित करें कि कांच का आवरण वृत्त समाधान-ग्लास आसंजन के माध्यम से पीस डी का पालन करता है ताकि आवेदन करें कक्ष में प्रवाह कवर ग्लास सर्कल की स्थिति को बाधित नहीं करता है।
- एमपीपी प्रवाह कक्ष को उचित क्रम में एक साथ पेंच करके इकट्ठा करें, जैसा कि चरण 1-4 और 1.5 में वर्णित है और जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है। कक्ष को सूक्ष्मदर्शी अवस्था में स्थानांतरित करें और कक्ष को स्नान समाधान के साथ तुरंत इस प्रकार व्याप्त करें कि समाधान आकांक्षा के लिए निर्वात जलाशय तक पहुँच जाए( $10 एमएल)।
- एक अंधेरे सीमा और स्पष्ट नाभिक के साथ एक सेल की पहचान करके प्रयोग के लिए एक स्वस्थ कोशिका की पहचान. उन कक्षों से बचें जो ब्लिंग या अन्य कक्षों के संपर्क में हैं.
नोट: लेखकों की प्रयोगशाला में, मानव महाधमनी endothelial कोशिकाओं और संस्कृति में प्राथमिक माउस mesenteric endothelial कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है. हालांकि, किसी भी अन्य प्रकार के अनुलग्न सेल जो विशिष्ट अनुसंधान आवश्यकताओं के लिए रुचि रखते हैं, उसी तरह इस्तेमाल किया जा सकता है। - वियोजन विलयन में पृथक धमनी आर्केड को धोइये (सारणी 2)। आर्केड को 2 एमएल अपकेंद्रण ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 2 एमएल पूर्व-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) वियोजन विलयन (तालिका 2 में दिखाया गया वियोजन विलयन के लिए नुस्खा )जिसमें तटस्थ प्रोटीज़ (0.5 मिलीग्राम/एमएल) और इलैस्टेस (0.5 मिलीग्राम/एमएल) शामिल हैं। कोमल मिलाते हुए हर 10 मिनट के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
- तटस्थ protease /elastase वियोजन समाधान के 1 एमएल निकालें और 1 mg/mL collagenase प्रकार 1 जोड़ें। एक अंतिम कोलैजानेस प्रकार के लिए धमनियों युक्त समाधान के लिए कोलैजाज़ समाधान वापस 1 0.5 मिलीग्राम / 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 $3 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- 5 ग्रेड forceps का उपयोग करना, जल्दी से ताजा, ठंडा वियोजन समाधान के एक 750 डिग्री एल ड्रॉप युक्त एक 35 मिमी व्यास पेट्री पकवान पर आर्केड ले जाएँ. इसके अलावा दो 20 जी सिरिंज सुइयों का उपयोग करके ऊतक को यांत्रिक रूप से एंजाइमी रूप से पचाने वाली धमनियों से एंडोथेलियल कोशिकाओं को मुक्त करने के लिए अलग करें।
- एक 9" डिस्पोजेबल पाश्चर ग्लास पाइप का उपयोग करना, कांच पाइप्ट का उपयोग कर एक नया 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करने से पहले सेल समाधान 10x triturate।
- पेट्री डिश को एक और 750 डिग्री सेल्सियस के वियोजन समाधान के साथ धो लें और एक ही ट्यूब में स्थानांतरित करें। ग्लास पिपेट का उपयोग करना, आगे यंत्रवत् कम से कम 10x पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को फैलाने के लिए एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए सावधान किया जा रहा बुलबुले कि endothelial सेल अखंडता को नुकसान पहुंचा सकता है परिचय नहीं किया जा रहा है.
- अंत:स्वएली सेल निलंबन ($500$1,000 कोशिकाओं) के 750 $L जोड़ें सीधे जलाशय वैक्यूम पक्ष के आधे निकटतम पर एमपीपी प्रवाह कक्ष के टुकड़े डी करने के लिए। एंडोथेलियल कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 45 मिनट और 1 एच के बीच पालन करने की अनुमति दें।
- एमपीपी प्रवाह कक्ष को उचित क्रम में एक साथ पेंच करके इकट्ठा करें जैसा कि चरण 1-4 और 1.5 में वर्णित है और जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है। कक्ष को सूक्ष्मदर्शी अवस्था में स्थानांतरित करें और कक्ष को स्नान समाधान के साथ तुरंत इस प्रकार व्याप्त करें कि समाधान निर्वात आकांक्षा ($ 10 एमएल) तक पहुँच जाए। उनके खुरदरे और गोल फीनोटाइप19,20द्वारा सुलभ एंडोथेलियल कोशिकाओं की पहचान करें .
नोट: पाचन विधियों और एंजाइम कॉकटेल की एक किस्म के विभिन्न धमनी बेड से endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यंत्रसंवेदी आयन चैनलों के पैच क्लैम्प इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए जांचकर्ताओं की एक किस्म द्वारा इस्तेमाल किया गया है कि प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण के लिए तालिका 3 देखें. इन विधियों की संभावना एमपीपी प्रवाह कक्ष के साथ संयोजन में उपयोग के लिए उपयुक्त हैं.
3. शीर-सक्रिय Mechanosensitive आयन चैनलों के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए एमपीपी फ्लो चैंबर को शीर तनाव को नियंत्रित करना
- एक 30 एमएल स्नातक सिरिंज सिलेंडर को माइक्रोबोर ट्यूबिंग (आंतरिक व्यास: 0.05 इंच, बाहरी व्यास: 0.09 इंच) में सम्मिलित करने के लिए अनुकूल 30 एमएल ग्रेजुएट सिरिंज सिलेंडर को जोड़ने के द्वारा एक गुरुत्वाकर्षण perfusion प्रणाली सेट अप एमपीपी के टुकड़े ए के 3 मिमी व्यास इनलेट छेद में डालने के लिए अनुकूल कक्ष.
- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग के आस-पास के फराडे पिंजरे के बाहरी चेहरे पर स्नातक सिलेंडर को दो तरफा टेप का उपयोग करके संलग्न करें (चित्र2)। एमपीपी कक्ष में ट्यूबिंग डालने से पहले, सिरिंज को प्री-फिल करें और स्नान समाधान के साथ ट्यूबिंग करें (एंडोथेलियल कोशिकाओं में अंदर से सुधारी कश्मीर+ चैनलों की जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले स्नान समाधान के लिए तालिका 2 देखें)। टुकड़े ए के एमपीपी प्रवाह कक्ष इनलेट छेद में ट्यूबिंग डालें।
- समाधान के साथ एमपीपी प्रवाह कक्ष को प्री-फिल करें ताकि वैक्यूम जलाशय में समाधान निकाला जा सके। कक्ष के लिए प्रवाह बंद करो और शीर्ष निशान करने के लिए स्नातक सिलेंडर फिर से भरना। प्रवाह दरों की मैन्युअल रूप से गणना करें, जिससे समाधान को चैम्बर के माध्यम से प्रवाहित किया जा सके और किसी दिए गए सिरिंज सिलेंडर ऊंचाई पर एमएल/एस की गणना करने के लिए स्टॉप-वॉच का उपयोग किया जा सके।
- उठाएँ या प्रवाह को बदलने के लिए सिरिंज कम है, और इस प्रकार कक्ष में कतरनी, और कतरनी तनाव का एक वांछित स्तर पाया जाता है जब तक इस प्रक्रिया को जारी रखने.
- निम्नलिखित समीकरण21का उपयोग करके समानांतर कक्ष में कतरनी प्रतिबल परिकलित कीजिए।
[ ] 6 ]Q/h2w
जहाँ र् द्रव श्यानता (छ/सेमी), ु र् प्रवाह दर (एमएल/स) तथा समांतर प्लेट कक्ष चौड़ाई (प़22 बउ) तथा ऊँचाई (ज र् 0ण्1 बउ)।
नोट: वर्तमान गुरुत्वाकर्षण परफ्यूजन प्रणाली में, एक सिरिंज सिलेंडर ऊंचाई पर (जैसा कि सिलेंडर के ऊपर से मापा जाता है) माइक्रोस्कोप चरण से ऊपर 57 सेमी, प्रवाह दर 0.3 एमएल/ इस सिरिंज सिलेंडर ऊंचाई और प्रवाह दर पर कक्ष मेंपरिकलित कतरनी 0.7 dyn/ यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य perfusion प्रणाली, इस तरह के एक peristaltic पंप के रूप में, एमपीपी प्रवाह कक्ष के लिए प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, इन उपकरणों अवांछित अशांति जोड़ सकते हैं और प्रवाह के तहत electrophysiology माप की स्थिरता को प्रभावित, इसलिए, यहाँ वर्णित गुरुत्वाकर्षण भ्रम प्रणाली का उपयोग करने की सिफारिश की है. - इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग के माइक्रोस्कोप चरण में पालन की गई कोशिकाओं वाले एक इकट्ठे कक्ष को स्थानांतरित करें और ट्यूबिंग को स्नान समाधान के साथ पहले से भरे हुए टुकड़ों के छेद में डालें ए साथ-साथ कक्ष को भरें और कोशिकाओं को 10 एमएल से स्नान समाधान के साथ धोएं 3-तरफा लुअर लॉक को इस तरह मोड़ना कि समाधान कक्ष में प्रवाहित होता है।
- वांछित पैच विन्यास सफलतापूर्वक प्राप्त है एक बार चैनल धाराओं कमरे के तापमान पर एक स्थिर स्नान में स्थिर करने के लिए अनुमति देते हैं. एक बार धाराओं स्थिर हो गया है, एक कदम के लिहाज से फैशन में कतरनी लागू कतरनी तनाव में अगले कदम वृद्धि से पहले स्थिर करने के लिए वर्तमान में बढ़ जाती है की अनुमति.
नोट: एंडोथेलियल कोशिकाओं में mechanoactivated आयन चैनलों का अध्ययन करते समय लेखकों छिद्रित पैच विन्यास के साथ सबसे अधिक सफलता पाते हैं। छिद्रित पूरे सेल पैच विन्यास करने के लिए, डाइमेथिल सल्फोक्सेक्साइड (डीएमएसओ) में 60 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक एम्फोटोटेरिन बी के 5 डिग्री एल को 0.2 मीटर बाँझ फ़िल्टर्ड पिपेट समाधान के 1 एमएल में जोड़ें। सेल संलग्न विन्यास में एक गीगा-ओम सील पैदा करने के बाद, 2 "5 मिनट के भीतर छिद्रित पूरे सेल पैच फार्म. - कक्ष के प्रवाह को रोककर कोशिकाओं के लिए कतरनी जोखिम निकालें mechanosensitive चैनल धाराओं स्थिर स्नान में मनाया आधारभूत धाराओं पर लौटने के लिए अनुमति देता है.
- समाधान संयोजकता में परिवर्तन करके ब्याज की mechanosensitive आयन चैनल धाराओं को अलग करें (उदा., 60 mM K+ स्नान समाधान में 0 Ca2 + के साथ पिपेट समाधान में inwardly सुधार K + चैनलों का अध्ययन करने के लिए। तालिका 2 उदाहरण समाधान व्यंजनों से पता चलता है) और /
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
माइक्रोस्कोप मंच (ऊपरी पैनल) पर एमपीपी प्रवाह कक्ष के विभिन्न विचारों को दर्शाने वाली एकाधिक तस्वीरें और एमपीपी प्रवाह कक्ष (नीचे फलक) का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्र 1में दर्शाया गया है। योजनाबद्ध विवरण पूरे डिवाइस और प्रवाह कक्ष के आयाम. चित्र 2 हमारी प्रयोगशाला (ऊपरी पैनल) में एमपीपी प्रवाह कक्ष के लिए गुरुत्वाकर्षण भ्रम प्रणाली की एक तस्वीर से पता चलता है। इसके अलावा दिखाया गया है प्रवाह प्रणाली (नीचे पैनल) के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के लिए कदम है जो प्रवाह प्रणाली से और समाधान के वैक्यूम हटाने के बल से समाधान की भीड़ से प्रवाह कक्ष में कोशिकाओं को अलग को उजागर करने का इरादा है.
यांत्रिक उद्दीपक3,6,7के समापन पर यांत्रिक स्तर पर अचानक लौटने की बात है . चित्र 3 एक उदाहरण के रूप में दर्शाता है कि एक ताजा पृथक अंत:स्थीय सेल से किर धारा के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के दौरान कतरनी तनाव उत्तेजना को हटाने के परिणामस्वरूप आधारभूत धाराओं के लिए एक वापसी में शुरू में एक स्थिर स्नान में दर्ज की गई. एमपीपी चैम्बर में प्रवाह को रोकने के बाद आधार रेखा वर्तमान स्तर ों के लिए वापसी प्रवाह समाप्ति के दस सेकंड के भीतर हुई।
पूरे सेल (WC) electrophysiological रिकॉर्डिंग, विशेष रूप से ताजा अलग कोशिकाओं से लिया उन, अक्सर स्पष्ट रिसाव पृष्ठभूमि धाराओं है कि चैनल गतिविधि मुखौटा कर सकते हैं. कुछ आयन चैनलों, जैसे कि अंदर की ओर सुधार K+ चैनल परिवार के उन लोगों के रूप में, biophysical गुण है कि अधिक सटीक विश्लेषण के लिए रिसाव पृष्ठभूमि वर्तमान subtracting के लिए अनुमति देते हैं. चित्र 4 एक उदाहरण के रूप में दर्शाता है कि कच्चे डेटा से प्रक्रिया (चित्र 4क) से परिकलित और आलेखित रैखिक जावक रिसाव (चित्र 4ख) से अंतिम, रिसाव घटाए गए प्रतिनिधि ट्रेस (चित्र 4ब्) तक । साथ में कथा चित्र 4में कच्चे छिद्रित WC पैच रिकॉर्डिंग से रिसाव की गणना और घटाने के लिए एक विस्तृत विवरण देखें .
चित्र 1: एमपीपी प्रवाह कक्ष और विस्तृत योजनाबद्ध. इकट्ठे एमपीपी प्रवाह कक्ष (ऊपरी पैनल) की तस्वीरें तीन अलग अलग विचारों से माइक्रोस्कोप मंच पर कक्ष दिखाने: पक्ष के रूप में प्रयोगों के दौरान देखा (बाएं), perfusion प्रवेश से (मध्य), और वैक्यूम आउटलेट से (दाएं) जो देखने से बाहर है तस्वीर. प्रवाह की दिशा प्रत्येक में लेबल है. ध्यान दें कि 90 डिग्री कोण पर मुड़ते समय जमीन का तार आसानी से 2 मिमी slits में से एक में फिट हो सकता है। एक विस्तृत योजनाबद्ध (नीचे) उपकरण की प्रतिकृति के लिए सटीक आयाम से पता चलता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: गुरुत्व परफ्यूजन प्रणाली। हमारी प्रयोगशाला में गुरुत्वाकर्षण भ्रम प्रणाली की एक लेबल तस्वीर ऊपरी पैनल में दिखाया गया है. दो कदम एमपीपी प्रवाह कक्ष और गुरुत्वाकर्षण perfusion प्रणाली नीचे पैनल में विस्तृत रहे हैं. कोशिकाओं और दो ऊपरी और निचले जलाशयों वाले प्रवाह कक्ष के पृथक्करण पर प्रकाश डाला गया है। चरण 1 समाधान को टुकड़ा बी के ऊपरी जलाशय से चैम्बर के टुकड़े डी तक प्रवाह करने की अनुमति देता है जहां कोशिकाओं को बीज दिया जाता है। चरण 2 समाधान टुकड़ा डी से नीचे कम जलाशय के लिए प्रवाह करने के लिए अनुमति देता है, टुकड़ा एफ कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
चित्र 3: किर चैनलों के कतरनी प्रेरित वर्तमान सक्रियण के प्रतिनिधि निशान और प्रवाह को हटाने पर आधारभूत वर्तमान स्तर पर वापस. आयन चैनलों के mechanoactivation के लिए एक अच्छा सकारात्मक नियंत्रण शुरू में यांत्रिक उत्तेजना की समाप्ति पर एक स्थिर स्नान में मनाया आधारभूत वर्तमान स्तरों के लिए वापसी है. अंदर की ओर सुधार K+ (Kir) चैनल धाराओं कतरनी तनाव द्वारा सेकंड के भीतर सक्रिय कर रहे हैं जब गुरुत्वाकर्षण समाधान एमपीपी प्रवाह कक्ष में प्रवाह करने की अनुमति दी है. कक्ष के लिए प्रवाह की समाप्ति पर, Kir धाराओं जल्दी से प्रवाह से पहले मनाया आधारभूत स्थिर स्तर पर लौटने. -140 एमवी से +40 एमवी का एक रैंप 400 एमएस से अधिक पैच पर लागू किया गया था स्नान समाधान 60 एम एम K+ निहित है और उत्क्रमण क्षमता था $-20 mV. प्रतिनिधि निशान एक endothelial सेल से उत्पन्न किए गए थे ताजा माउस mesenteric धमनियों से अलग. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: mechanoactivated किर धारा का सही विश्लेषण के लिए रिसाव घटाव का उदाहरण. (क) प्राथमिक माउस मध्यअंतीय अंत:स्थकक्ष ीय कोशिका से किर धारा की प्रतिनिधि कच्ची रिकॉर्डिंग जिसमें उल्लेखनीय रैखिक जावक रिसाव धारा (मैंलीक) है . -140 एमवी से +40 एमवी का एक रैंप 400 एमएस से अधिक पैच पर लागू किया गया था स्नान समाधान 60 एम एम K+ निहित है और उत्क्रमण क्षमता था $-20 mV. (बी) मैंरिसाव असली किर चैनल गतिविधि के विश्लेषण को रोकता है. मैंरिसावघटाना करने के लिए, पहले मैंरिसाव के रैखिक ढलान चालकता की गणना(जीढलान ] (मैंएक-Iख) / गुणा जीढलान पूरे कच्चे ट्रेस के इसी voltages द्वारा साजिश मैं कच्चे डेटा पररिसाव. रेखा को बाह्य रैखिक रिसाव को बिल्कुल ओवरले करना चाहिए. (ग) प्लॉट किए गए मैं पूरे ट्रेस सेरिसाव को कम करें ताकि रैखिक जावक धारा $0 pA/pF हो और वास्तविक किर धारा का विश्लेषण किया जा सके। पैनल सी में सूचना है कि आवक Kir वर्तमान लगभग आधा है कि पैनल में मूल कच्चे डेटा ट्रेस A. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
| ऊँचाई (मिमी) | चौड़ाई (मिमी) | लंबाई (मिमी) | अतिरिक्त जानकारी | ||
| टुकड़ा एक | 8 | 80 | 98 | इनलेट परफ्यूजन ट्यूबिंग के लिए एक 3 मिमी व्यास छेद शामिल हैं (सामग्री की तालिकादेखें ) और 53 मिमी x 60 मध्य टुकड़े और कोशिकाओं के लिए उपयोग के लिए आयताकार अंतरिक्ष | |
| टुकड़ा बी | 1 | 80 | 98 | कोशिकाओं के उपयोग के लिए पीस ए और तीन 2 मिमी x 17 मिमी slits के perfusion छेद के नीचे एक अंतरिक्ष (20 मिमी विकर्ण) शामिल | |
| टुकड़ा सी | 1 | 80 | 98 | एक 22 मिमी x 50 मिमी अंतरिक्ष जहां टुकड़ा डी सिलिकॉन elastomer समाधान का उपयोग किया जाता है शामिल हैं (सामग्री की तालिकादेखें) | |
| टुकड़ा डी | 0.16 | 24 | 40 | प्रवाह कक्ष के आयताकार कांच स्लाइड नीचे | |
| टुकड़ा ई | 5 | 80 | १२० | टुकड़ा डी पर कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देने के लिए एक 45 मिमी x 50 मिमी अंतरिक्ष शामिल हैं। एक 20 मिमी x 45 मिमी अंतरिक्ष जलाशय वैक्यूम आउटलेट, टुकड़ा एफ, पालन किया जा करने के लिए के लिए मौजूद है | |
| टुकड़ा एफ | 0.16 | 24 | 50 | वैक्यूम आउटलेट जलाशय के आयताकार कांच स्लाइड नीचे | |
| इकट्ठे एमपीपी | 15 | 80 | १२० | प्रवाह कक्ष अच्छी तरह से परिभाषित laminar कतरनी के विघटन से बचने के लिए दो चरणों से इनलेट perfusion और आउटलेट वैक्यूम से अलग है | |
| इकट्ठा एमपीपी के फ्लो चैंबर | 1 | 22 | 42 | टुकड़ा डी प्रवाह कक्ष के कांच स्लाइड नीचे है | |
तालिका 1: MPP के आयाम (संयोजित और disassembled) और अतिरिक्त जानकारी डिवाइस के प्रत्येक भाग के लिए विशिष्ट.
| समाधान | पकाने की विधि (एम एम में) | फोन | ||
| वियोजन | 55 NaCl, 80 Na-glutamate, 6 KCl, 2 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 ग्लूकोज, 10 HEPES | 7.3 | ||
| (सेल अलगाव) | ||||
| स्नान (इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) | 80 NaCl, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 ग्लूकोज, 10 HEPES | 7.4 | ||
| पिपेट (इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) | 5 NaCl, 135 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl2, 5 ग्लूकोज, 10 HEPES | 7.2 | ||
तालिका 2: प्रयोगों में प्रयुक्त व्यंजनों के साथ समाधान के उदाहरण.
| एंडोथेलियल सेल आइसोलेशन प्रोटोकॉल | संदर्भ | |
| तटस्थ प्रोटीज़ और इलैस्टेज का कॉकटेल (0.5 mg/mL प्रत्येक; 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 h) उसके बाद कोलैजानाज प्रकार I (0.5 mg/mL; 2.5 मिनट) | 6,7 | |
| अवरोही वक्ष आरोटा की भीतरी दीवार पर स्थित 5-सेमी2 क्षेत्र की कोमल यांत्रिक खुरचनी | 11 | |
| ना | 17 | |
| ना | 3 | |
| कोलैडेनेज प्रकार IA (1 mg/mL) 14 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर | 8 | |
तालिका 3: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीकों का उपयोग करके मशीनसंवेदी आयन चैनलों का अध्ययन करने की पद्धति।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
संवहनी प्रणाली लगातार सक्रिय हीमोडायनामिक बलों के संपर्क में है, जो मशीन संवेदी आयन चैनलोंकोसक्रिय3 ,22 लेकिन कतरनी तनाव प्रेरित mechanotransduction में इन चैनलों की शारीरिक भूमिकाओं ही है 4,6,8उभरने के लिए शुरू . कतरनी तनाव-सक्रिय चैनलों के यंत्र संवेदनशीलता के लिए जिम्मेदार तंत्र अज्ञात रहते हैं। यहाँ विस्तृत प्रोटोकॉल वास्तविक समय में लेमिनर कतरनी तनाव के संपर्क में mechanosensitive आयन चैनलों की प्रत्यक्ष जांच के लिए विधि का वर्णन करता है.
इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण और आवश्यक कदम एक संशोधित समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष है कि संकीर्ण उद्घाटन के लिए एक electrophysiological pipette कक्ष में कम किया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए और प्रवाह के तहत कोशिकाओं का उपयोग किया है का उपयोग है. इस उपकरण का सामान्य सिद्धांत यह है कि यदि द्वार काफी संकीर्ण हैं , तो शारीरिक अपरूपण तनाव (15 डाइन/सेमी2तक ) सतह तनाव बलों10के कारण बिना समाधान के प्राप्त किया जा सकता है . इन प्रयोगों को सफलतापूर्वक करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है: (i) नीचे प्लेट के क्षेत्र में बीज कोशिकाओं के लिए जो सीधे उद्घाटन के नीचे है; (ii) प्रवाह की शुरुआत से पहले या बहुत धीमी गति से (0.01 डाइन/सेमी2)पृष्ठभूमि प्रवाह से पहले एक गीगा-ओम सील स्थापित करना; (iii) प्रवाह को आगे बढ़ाते हुए एक स्थिर मुहर बनाए रखें। हमारी प्रयोगशाला में प्रयुक्त चार-टुकड़े एक्रिलिक तंत्र के आयाम विस्तृत योजनाबद्ध के साथ प्रदान किए जाते हैं (चित्र 1) इस प्रकार है कि एमपीपी प्रवाह कक्ष और प्रवाह प्रणाली (चित्र 2) को किसी भी प्रयोगशाला जांच में उपयोग के लिए दोहराया जा सकता है mechanosensitive आयन चैनलों. इन आयामों को कोशिकाओं द्वारा वरीयता प्राप्त क्षेत्र को बढ़ाने के लिए और प्रवाह चैनल की ऊँचाई बदलने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है, जो प्रवाह दर और कतरनी तनाव के बीच संबंध को बदल देगा. प्रवाह कक्ष की ऊंचाई में कमी एक ही प्रवाह दर है, जो उच्च कतरनी तनाव प्राप्त करने के लिए फायदेमंद हो सकता है के लिए उच्च कतरनी तनाव में परिणाम होगा. कक्ष को प्रवाह पृथक्करण अवरोध को शामिल करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है जो अशांत प्रवाह23के एक स्थानीय क्षेत्र को प्रेरित करता है .
एमपीपी प्रवाह कक्ष का उपयोग करने के प्रमुख लाभ में शामिल हैं (1) संस्कृति में endothelial कोशिकाओं से कतरनी सक्रिय आयन चैनलों की वास्तविक समय जांच और कोशिकाओं को ताजा संवहनी ऊतक से अलग, (2) कोशिकाओं के जोखिम और mechanosensitive आयन की प्रतिक्रिया कतरनी तनाव के शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्तर के लिए चैनलों, और (3) प्रयोग के लिए भ्रम विकल्पों के साथ आसान विधानसभा और disassembly. अन्य मौजूदा तरीकों के संबंध में, केवल अन्य विधि है कि अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी तनाव के तहत electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रदर्शन की अनुमति देता है एक केशिका अंत के अंदर कोशिकाओं बोने और केशिका खोलने में रिकॉर्डिंग pipette डालने, के रूप में प्रारंभिक अध्ययन 3,22में किया गया था . वहाँ रहे हैं, तथापि, विधि की तुलना में कई नुकसान यहाँ वर्णित, इस तरह के केशिकाओं में कोशिकाओं बोने की कठिनाई के रूप में, कोशिकाओं की एक बहुत छोटी संख्या है कि Pippette के लिए केशिका अंत करने के लिए काफी करीब हैं करने के लिए उपयोग उन तक पहुँचने में सक्षम हो, और प्रवाह चैनल के अंत में प्रवाह गड़बड़ी (इस मामले में कैपिलरी). इन नुकसान के प्रत्येक यह मुश्किल केशिका खोलने में सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रवाह के तहत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रदर्शन करने के लिए बनाता है और पैच या यहां तक कि बीज कोशिकाओं को ताजा vascuature से अलग करने के लिए लगभग असंभव. यह भी परेशान प्रवाह का एक क्षेत्र उत्पन्न करने के लिए एक कदम शुरू करने के लिए असंभव है. अन्य सभी मौजूदा विधियां जो या तो खुले कक्षों को24,25 या सीधे कक्ष17,18 पर पफिंग समाधान ों का उपयोग करती हैं, रक्त वाहिका में हीमोडायनामिक वातावरण की नकल नहीं करती हैं।
इस विधि की मुख्य सीमा, तथापि, शारीरिक रेंज के उच्च स्तर पर कतरनी तनाव को प्राप्त करने के लिए एक बाधा है. विशेष रूप से, शारीरिक कतरनी तनाव का स्तर स्वस्थ धमनियों26में 70 dyn/cm2 तक पहुंचने का अनुमान लगाया गया है। इसके विपरीत, उच्चतम कतरनी तनाव स्तर जो हम कक्ष के वर्तमान विन्यास में प्राप्त कर सकते थे वह 15 डाइन/सेमी2था, जिसके बाद सतह तनाव बल 10 के उद्घाटन से बाहर निकलने के समाधान को रोकने के लिए पर्याप्त नहीं हो जाते हैं। यह संभव है कि प्रवाह चैनल की ऊंचाई को कम उच्च कतरनी तनाव के स्तर को प्राप्त करने की अनुमति हो सकती है. उच्च कतरनी तनाव के तहत एक स्थिर गीगा-ओम सील बनाए रखना एक और चुनौती है, लेकिन सफलता की दर अभ्यास के साथ उचित है। हमने पाया है कि perforated पैच तकनीक का उपयोग कर (ऊपर वर्णित के रूप में पिपेट समाधान में एंटीबायोटिक एम्फोटेरिकिन बी सहित) मानक पूरे सेल विन्यास की तुलना में अधिक स्थिर रिकॉर्डिंग पैदावार. इसके अतिरिक्त, एमपीपी प्रवाह कक्ष और उपयोग किए गए समाधान धमनियों में रक्त प्रवाह की कतरनी को ठीक से प्रतिकृति नहीं करते हैं। रक्त एक चिपचिपा, गैर-न्यूटोनियन तरल पदार्थ है जिसे हमने अपने इन विट्रो प्रयोगों में दोहराया नहीं है। इसके अतिरिक्त, यहाँ इस्तेमाल कक्ष एक समानांतर कक्ष है, जबकि धमनियों में कतरनी तनाव सबसे अच्छा एक सिलेंडर में कतरनी के लिए सूत्र का उपयोग कर गणना की है.
प्रवाह के तहत एकल चैनल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण विचार और सीमाएं हैं. यह विधि एक सेल संलग्न विन्यास (एक बरकरार सेल की झिल्ली से जुड़ी पिपेट) के लिए उपयुक्त है, जो स्थिर जवानों की पैदावार करती है। यह हालांकि पता होना महत्वपूर्ण है कि एकल चैनल जिनकी गतिविधि दर्ज की जा रही है सीधे कतरनी तनाव को उजागर नहीं कर रहे हैं क्योंकि वे रिकॉर्डिंग pipette द्वारा परिरक्षित कर रहे हैं, विशेष रूप से अंदर से बाहर विन्यास27में. हम मानते हैं कि excised पैच विन्यास सबसे विश्वसनीय नहीं हैं जब excised झिल्ली आम तौर पर रिकॉर्डिंग पिपेट में खींच लिया है और इस तरह एक अच्छी तरह से परिभाषित प्रवाह के संपर्क में नहीं है, क्योंकि प्रवाह के लिए आयन चैनलों की संवेदनशीलता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया।
कोशिकाओं है कि इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है के प्रकार के संदर्भ में, संवहनी endothelial कोशिकाओं कतरनी तनाव और mechanosensitive चैनलों का अध्ययन करने के लिए सबसे लागू सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं. इससे पहले के अध्ययन ों में मुख्य रूप से सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित3,28 कि आसानी से उपलब्ध हैं. हमने इस विधि का परीक्षण किया है और इस विधि का उपयोग करने के लिए endothelial कोशिकाओं को ताजा- माउस प्रतिरोध धमनियों6,7से अलग कर दिया है. अन्य सेल प्रकार निश्चित रूप से विचार किया जाना चाहिए. संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, उदाहरण के लिए, रोग राज्यों जहां endothelium क्षतिग्रस्त हो गया है और हटा दिया गया है के दौरान कतरनी तनाव के संपर्क में हो सकता है29,30. यह अध्ययन के एक पेचीदा क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है जिससे mechanosensitive चैनल है कि चिकनी मांसपेशियों में रहते हैं, जो अन्यथा कतरनी तनाव से प्रभावित हो जाएगा, अब संभावित pathophysiological रोग तंत्र के लिए योगदान देगा. इसके अलावा, ब्याज के चैनल एन्कोडिंग जीन के साथ HEK या CHO की तरह वाहन सेल लाइनों के transfection एमपीपी प्रवाह कक्ष के उपयोग के साथ संयोजन में चैनलों के biophysical विश्लेषण के लिए एक उत्कृष्ट मंच है.
यह भी ध्यान दें कि जबकि एमपीपी प्रवाह कक्ष के लिए मूल इरादा आयन चैनल mechanoactivation की वास्तविक समय जांच के लिए किया गया था महत्वपूर्ण है, डिवाइस के आवेदन इस लक्ष्य से परे का विस्तार कर सकते हैं. विशेष रूप से, एक ही दृष्टिकोण इलेक्ट्रोड सेंसर का उपयोग करें कि अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, जैसे एक नाइट्रिक ऑक्साइड (नहीं) सेंसर कतरनी तनाव के जवाब में नहीं की रिहाई निर्धारित करने के लिए. इसलिए, हम वास्तविक समय में यांत्रिक रूप से विनियमित जैविक प्रक्रियाओं की जांच में रुचि रखने वालों के लिए एक सामान्यीकृत पद्धति प्रदान करते हैं और अध्ययन करने वालों के लिए विशिष्ट अनुसंधान आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए एमपीपी चैम्बर के आगे संशोधन को बढ़ावा देते हैं क्षेत्रों की एक किस्म में mechanosensitive प्रक्रियाओं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय दिल, फेफड़े, और रक्त संस्थान (R01 HL073965, आईएल) और (T32 HL007829-24, ISF) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. लेखकों को भी हमारे नवीनतम एमपीपी प्रवाह कक्षों पैदा करने के लिए शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय में वैज्ञानिक मशीन की दुकान स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 G syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| Elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| Neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
