Summary
Målet med denne protokollen er å beskrive en modifisert parallell plate Flow kammer for bruk i å undersøke sanntids aktivering av mechanosensitive ion kanaler ved skjær stress.
Abstract
Fluid skjær stress er godt kjent for å spille en viktig rolle i endothelial funksjon. I de fleste vaskulære senger, utløser forhøyet skjær stress fra akutte økninger i blodstrømmen en signalering Cascade resulterer i vasodilatasjon dermed lindre mekaniske påkjenninger på vaskulær veggen. Mønsteret av skjær stress er også godt kjent for å være en kritisk faktor i utviklingen av aterosklerose med laminær skjær stress blir atheroprotective og forstyrret skjær stress blir Pro-atherogenic. Mens vi har en detaljert forståelse av de ulike mellomliggende celle signalering trasé, reseptorene som først oversette den mekaniske stimulans i kjemiske meglere er ikke helt forstått. Mechanosensitive ion kanaler er avgjørende for responsen til skjær og regulere skjær-indusert celle signalering dermed kontrollere produksjonen av vasoactive meglere. Disse kanalene er blant de tidligste aktiverte signalering komponenter for å skjære og har vært knyttet til skjær-indusert vasodilatasjon gjennom fremme nitrogenoksid produksjon (f. eks innvendig rectifying K+ [KIR] og forbigående reseptor potensial [TRP] kanaler) og endotelet hyperpolarizing faktor (for eksempel Kir og kalsium-aktiverte K+ [KCa] kanaler) og skjær-indusert vasokonstriksjon gjennom en ubestemt mekanisme som involverer piezo kanaler. Forstå Biofysiske mekanismen som disse kanalene aktiveres av skjærkrefter (dvs. direkte eller gjennom en primær mechano-reseptor) kan gi potensielle nye mål å løse patofysiologi forbundet med endothelial dysfunksjon og atherogenesis. Det er fortsatt en stor utfordring å registrere Flow-indusert aktivering av ion-kanaler i sanntid ved hjelp av elektrofysiologi. Standardmetodene for å eksponere celler til veldefinerte skjær stress, slik som kjegle og plate rheometer og lukket parallell plate Flow kammer ikke tillater sanntids studie av ion kanal aktivering. Målet med denne protokollen er å beskrive en modifisert parallell plate Flow kammer som gjør at sanntid elektrofysiologisk innspillingen av mechanosensitive ion kanaler under veldefinerte skjær stress.
Introduction
Hemodynamisk tyrker generert av blodgjennomstrømningen er velkjent for å spille store roller i endothelial og vaskulær funksjon1,2. Det er også velkjent at flere typer ion-kanaler akutt svare på endringer i skjær stress3,4,5 fører til hypotesen om at ion-kanaler kan være primære skjær stress sensorer. Mer nylig, vi og andre viste at mechanosensitive ion kanaler spille kritiske roller i flere skjær-stress sensitive vaskulære funksjoner, inkludert vasoactive respons på skjær stress6,7,8 , og utviklingsmessige angiogenese9. Mekanismene for skjær-stress følsomhet for ion-kanaler, men er nesten helt ukjent. Dette gapet av kunnskap er sannsynlig å være på grunn av de tekniske vanskelighetene med å utføre elektrofysiologisk innspillinger under veldefinerte skjær stress. I denne artikkelen, derfor gir vi en trinnvis detaljert protokoll rutinemessig utført i laboratoriet vårt for å oppnå dette målet6,7,10,11.
Det overordnede målet med denne metoden er å la sanntids undersøkelse av ion Channel mechanoactivation under veldefinerte skjær stress i det fysiologiske området. Dette oppnås ved å endre en standard parallell plate Flow kammer å tillate en elektrofysiologisk pipette skal senkes ned i kammeret og få tilgang til celler dyrket på bunnplaten under sanntid eksponering for flyt, og gir en unik tilnærming for å oppnå dette målet6,7,11. I kontrast kan standard parallell plate strømnings kamre, beskrevet i tidligere publikasjoner, brukes til bildeanalyse i sanntid av celler som utsettes for skjærkraft12 eller andre ikke-invasive tilnærminger13,14 , men ikke for elektrofysiologi. Tilsvarende kjegle og plate apparat, en annen kraftfull tilnærming for å utsette celler for å skjære stress15,16 er heller ikke egnet for elektrofysiologisk innspillinger. Dermed gjør disse flyt enheter ikke tillater etterforskning av skjær stress følsomhet for ion-kanaler. Vanskeligheten med å utføre elektrofysiologisk opptak under Flow er hovedårsaken til mangelen av informasjon om mekanismene som er ansvarlige for disse avgjørende effektene.
I forhold til alternative tilnærminger for å oppnå samme mål, er det ingen som er så nøyaktig eller kontrollert. Noen tidligere studier forsøkte å registrere ion Channel aktivitet under Flow ved å utsette celler til en strøm av væske som kommer fra en annen pipette brakt til nærheten av en celle fra over17,18. Dette er svært ikke-fysiologiske, som mekaniske krefter generert under disse forholdene har lite til felles med de fysiologiske profiler av skjær stress i blodkarene. Lignende bekymringer gjelder for forsøk på å simulere fysiologiske skjær stress ved å rekke åpne kamre. Som beskrevet i detalj i vår tidligere studie10, en åpen væske-luft-grensesnitt skaper flere forstyrrelser og resirkulering, som er ikke-fysiologiske. For å løse alle disse bekymringene, har vi utviklet en modifisert parallell plate (MPP) Flow Chamber, også referert til som "minimalt invasiv Flow Device" i våre tidligere studier6,7,10,11, laget fra akryl og mye brukt i laboratoriet vårt. Men til tross for det faktum at den opprinnelige beskrivelsen av design har blitt publisert nesten 20 år siden, og er den eneste flyten enhet som gjør det mulig å utføre elektrofysiologisk innspillinger under veldefinerte skjær stress, har denne metodikken ikke vært vedtatt av andre laboratorier og det er bare svært få studier som forsøker å ta opp strømninger underflyt. Vi tror derfor at å gi en detaljert beskrivelse for bruk av MPP Flow kammeret vil være til stor hjelp for forskere som er interessert i mechanosensitive ion kanaler og vaskulær biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruken av dyr i våre studier er godkjent av University of Illinois i Chicago Animal Care Committee (#16-183).
1. montering av modifisert parallell plate Flow Chamber
Merk: Vennligst referer til tabell 1 og figur 1 for MPP Flow Chamber Piece-IDer. Vennligst referer til figur 1 for en skjematisk detaljering orienteringen av kammer stykker for montering.
- For å overholde det rektangulære dekkglasset, stykke D, til bunnen av arb C, først gjøre silikon elastomer løsningen ved å grundig blande 500 μL silikon elastomer herding agent i 5 mL silikon elastomer base.
- Påfør et tynt lag av silikon elastomer løsning rundt kantene av den rektangulære plassen i stykket C og forsiktig plassere rektangulære dekselet glass brikke D direkte på elastomer løsning slik at stykket D dekker helt den åpne rektangulære plassen av stykket C. Tørk forsiktig bort overflødig silikon elastomer løsning.
- Gjenta trinn 1,2 for å overholde det rektangulære dekkglasset, arb F, til bunnen av arb E og la silikon elastomer løsningen kurere over natten ved romtemperatur.
Merk: Når den er kurert, vil den rektangulære dekkglass forbli overholdt i opptil seks måneder før du trenger å bli erstattet. - Begynner med bunnen kammer stykke, stykke E, montere MPP Flow kammer ved sekvensielt plassere hver brikke på toppen av den forrige i følgende rekkefølge: stykke E (nederst), stykke C, stykke B, stykke A (øverst).
- Juster skruen hullene av hver brikke i hjørnene og tett skruen bitene sammen for å hindre lekkasjer oppstår mens administrere flyt til MPP Flow kammer.
2. Cell forberedelse og seeding i MPP Flow Chamber
Merk: Følg trinn 2.1 − 2.7 for kultivert endothelial celler. Følg metoden som er beskrevet i trinn 2.8 − 2.14 for å isolere endothelial celler fra musen chrezbryzheechno arteriell arkade og utarbeidelse av fersk isolerte endothelial celler.
- I en 6-brønn plate, sted fire til 5 12 mm deksel glass sirkler/brønn og frø celler mellom 10% og 30% confluency slik at enkeltceller kan nås for elektrofysiologisk innspillinger.
- Ruge celler under standard kultur forhold (5% CO2, 37 ° c) for ikke mindre enn 2 h å tillate celler til å følge og ikke mer enn 24 h som endothelial celler i forfatternes erfaring blitt veldig flatt og vanskelig å patch når seeded på sub-confluency for mer enn 24 H.
- Fjern et dekkglass som inneholder overholdt celler fra en brønn av 6-brønn plate, raskt skyll i fosfat-bufret saltvann (PBS), og overføre til en 35 mm Petri parabolen inneholder 2 mL elektrofysiologisk bad løsning (tabell 2) før overføring til MPP flyt Kammer.
- Overfør dekselet glass sirkelen til rektangulære dekselet glass, stykke D, som er levd opp til stykke C av MPP strømnings kammeret er sikker på at tilstrekkelig løsning forblir på dekselet glass slik at cellene ikke blir utsatt for luft. Tilsett ønsket bad løsning (~ 250 μL) til cellene slik at dekselet glass sirkelen og cellene er helt neddykket i løsningen.
- Plasser dekselet glass sirkelen slik at den hviler i halvparten nærmest vakuum reservoaret side slik at cellene vil være i tråd med slit åpninger av stykke B. Pass på at glass deksel sirkelen fester seg til arb D gjennom løsning-glass vedheft slik at påføring av flyt til kammeret ikke forstyrre plasseringen av dekselet glass sirkelen.
- Monter MPP strømnings kammer ved å skru bitene sammen i riktig rekkefølge, som beskrevet i trinn 1,4 og 1,5 og som vist i figur 1. Overfør kammeret til mikroskopet scenen og umiddelbart perfuse kammeret med bad løsning slik at løsningen når vakuum reservoaret for aspirasjon (~ 10 mL).
- Identifiser en sunn celle for eksperimentet ved å identifisere en celle med en mørk kantlinje og tydelig kjerne. Unngå celler som ser ut til å være blebbing eller celler som er i kontakt med andre celler.
Merk: I forfatternes laboratorium, menneskelige aorta endothelial celler og primær mus chrezbryzheechno endothelial celler i kulturen brukes. En hvilken som helst annen type tilhenger celle som er av interesse for spesifikke forskningsbehov, kan imidlertid brukes på samme måte. - Vask den isolerte arterie arkaden i dissosiasjon løsning (tabell 2). Overfør arkade til et 2 mL sentrifugerør inneholdende 2 mL pre-varmet (37 ° c) dissosiasjon oppløsning (oppskrift for dissosiasjon oppløsning vist i tabell 2) som inneholder nøytral protease (0,5 mg/ml) og elastase (0,5 mg/ml). Ruge for 1 t ved 37 ° c med mild risting hver 10 min.
- Fjern 1 mL av den nøytrale protease/elastase dissosiasjon løsningen og tilsett 1 mg/mL kollagenase type 1. Returner den kollagenase løsningen til løsningen som inneholder arteriene for en endelig kollagenase type 1 konsentrasjon på 0,5 mg/mL. Ruge for 2 − 3 min ved 37 ° c.
- Bruke 5 grade tang, raskt flytte arkade på en 35 mm diameter Petri parabolen inneholder en 750 μL dråpe frisk, kjølt dissosiasjon løsning. Videre distansere vevet ved å bruke 2 20 G sprøyte nåler til mekanisk frigjøre endothelial celler fra enzymatisk fordøyd arterier.
- Ved å bruke en 9 "Pipet i Pasteur, triturate celle løsningen 10x før du overfører cellene til en ny 1,5 mL sentrifuge slange ved hjelp av glass Pipet.
- Vask Petri parabolen med en annen 750 μL av dissosiasjon løsning og overføre til samme rør. Bruke glass pipette, ytterligere mekanisk spre cellene ved pipettering minst 10x å lage en enkelt celle suspensjon være forsiktig med å innføre bobler som kan skade endothelial celle integritet.
- Tilsett 750 μL av endothelial celle fjæring (~ 500 − 1000 celler) direkte til del D av MPP strømnings kammer på halvparten nærmest reservoaret vakuum side. La endothelial celler festes mellom 45 min og 1 time ved romtemperatur.
- Monter MPP strømnings kammer ved å skru bitene sammen i riktig rekkefølge som beskrevet i trinn 1,4 og 1,5 og som vist i figur 1. Overfør kammeret til mikroskopet scenen og umiddelbart perfuse kammeret med bad løsning slik at løsningen når vakuum aspirasjon (~ 10 mL). Identifiser tilgjengelige endothelial celler etter grov og rund fenotype19,20.
Merk: En rekke fordøyelsen metoder og enzym cocktails har blitt brukt til å isolere endothelial celler fra ulike arteriell senger. Se tabell 3 for detaljerte beskrivelser av protokoller som har blitt brukt av en rekke etterforskere for å isolere endothelial celler for patch Clamp elektrofysiologi av mechanosensitive ion kanaler. Disse metodene er sannsynligvis egnet for bruk i kombinasjon med MPP strømnings kammer.
3. kontrollere skjær stress til MPP Flow Chamber for elektrofysiologisk innspillinger av Shear-aktiverte Mechanosensitive ion Channels
- Sett opp et tyngdekraft system ved å koble en 30 mL gradert sprøyte sylinder til en 3-veis luer lås utstyrt med mirkodiameter slange (innvendig diameter: 0,05 tommer, ytre diameter: 0,09 tommer) egnet for innsetting i 3 mm diameter inntaks hullet av stykke A av MPP Kammer.
- Fest den graderte sylinderen til det ytre ansiktet til Faraday-buret som omgir elektrofysiologi riggen (figur 2) med dobbeltsidig tape. Før du setter inn slangen i MPP kammeret, pre-fylle sprøyten og slange med bad løsning (se tabell 2 for bad løsning brukes til å undersøke innvendig rectifying K+ kanaler i endothelial celler). Sett slangen inn i MPP strømnings kammer innløps hullet i stykke A.
- Pre-fylle MPP Flow kammer med løsning slik at løsningen blir fjernet i vakuum reservoaret. Stopp strømmen til kammeret og fyll på gradert sylinder til toppen merke. Beregn strømningsrater manuelt ved å la løsningen flyte gjennom kammeret og bruke en stopp-klokke til å beregne mL/s ved en gitt sprøyte sylinder høyde.
- Hev eller Senk sprøyten for å endre flyt, og dermed skjær i kammeret, og fortsette denne prosessen til et ønsket nivå av skjær stress er funnet.
- Beregn skjær stress i et parallelt kammer ved hjelp av følgende ligning21:
τ = 6μQ/h2w
der μ = væske viskositet (g/cm · s), Q = strømningshastighet (mL/s) og parallell plate kammer bredde (w = 2,2 cm) og høyde (h = 0,1 cm).
Merk: I det nåværende tyngdekraft systemet, ved en sprøyte sylinder høyde (målt fra toppen av sylinderen) på 57 cm over mikroskop trinnet, er strømningshastigheten 0,3 mL/s. Den skjær som beregnes i kammeret på denne sprøyten sylinder høyde og strømningshastighet er 0,7 Dyn/cm2. Det bør også bemerkes at andre systemer, for eksempel en peristaltisk pumpe, kan brukes til å kontrollere flyten til MPP strømnings kammer. Disse enhetene kan imidlertid legge til uønsket turbulens og påvirke stabiliteten til de elektrofysiologi målingene underflyt, derfor anbefales det å bruke tyngdekraft systemet som beskrives her. - Overfør et samlet kammer som inneholder overholdt celler til mikroskop fasen av elektrofysiologi riggen og sett slangen pre-fylt med bad løsning inn i hullet i stykke A. samtidig fylle kammeret og vask cellene med 10 mL bad løsning av snu 3-veis luer låsen slik at løsningen renner til kammeret.
- Når ønsket patch konfigurasjonen er vellykket innhentet tillate kanal strømninger å stabilisere i et statisk bad ved romtemperatur. Når strømmen har stabilisert, gjelder skjær i en steg-klok måte slik at økninger i strøm for å stabilisere før neste trinn økning i skjær stress.
Merk: Forfatterne finner mest suksess med den perforerte patch konfigurasjonen når du studerer mechanoactivated ion kanaler i endothelial celler. For å utføre perforerte hel celle patch konfigurasjoner, tilsett 5 μL av en 60 mg/mL lager amfotericin B i dimethyl sulfoxide (DMSO) til 1 mL 0,2 μm steril filtrert pipette løsning. Etter å ha generert en Giga-ohm forsegling i celle-vedlagte konfigurasjon, perforerte hele cellen patcher form innen 2 − 5 min. - Fjern skjær eksponering til cellene ved å stoppe flyten til kammeret slik at mechanosensitive kanal strømmene å gå tilbake til Baseline strømmer observert i statisk bad.
- Isolere mechanosensitive strømmer av interesse ved å endre løsningen Valence (f. eks, 60 mM K+ i badekaret løsning med 0 ca2 + i pipette løsning for å studere innvendig rectifying K + kanaler. Tabell 2 viser eksempel løsnings oppskrifter) og/eller farmakologisk hemming av potensielt forurensende strømkilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flere fotografier som viser ulike visninger av MPP Flow kammer på mikroskopet scenen (øvre panel) og en skjematisk fremstilling av MPP strømnings kammer (nederste panel) er vist i figur 1. Den Skjematisk detaljer dimensjonene av hele enheten og Flow kammer. Figur 2 viser et fotografi av tyngdekraft systemet til MPP strømnings kammer i vårt laboratorium (øvre panel). Også vist er en skjematisk representasjon av strømnings systemet (nederste panel) ment å markere trinnene som isolere cellene i strømnings kammeret fra rush av løsningen fra et system og fra kraft av vakuum fjerning av løsningen.
Et kjennetegn på mechanosensitive ion kanaler er en brå tilbake til Baseline nivåer ved opphør av mekanisk stimulans3,6,7. Figur 3 viser som et eksempel som fjerner skjær stress stimulans under elektrofysiologisk innspillinger av KIR strøm fra en fersk isolert endothelial celle resulterer i en tilbakevending til Baseline strømmer først registrert i et statisk bad. Tilbake til Baseline gjeldende nivåer etter avsluttet flyt til MPP kammeret skjedde innen ti sekunder av flyt opphør.
Hel celle (WC) elektrofysiologisk innspillinger, spesielt de som er Hentet fra ferske isolerte celler, har ofte åpenbare lekkasjer bakgrunn strømninger som kan maskere kanal aktivitet. Noen ion-kanaler, slik som de av innvendig rectifying K+ Channel familien, har Biofysiske egenskaper som tillater for å trekke lekkasjen bakgrunnen gjeldende for mer nøyaktig analyse. Figur 4 viser som et eksempel prosessen fra rådata (figur 4a) til beregnet og plottet lineær ytre lekkasje (figur 4b) til finalen, lekkasje trekkes representative spor (figur 4c). Se en detaljert forklaring for beregning og trekke lekkasje fra rå perforert WC patch innspillingen i den med følgende legenden til Figur 4.
Figur 1: MPP Flow kammer og detaljert skjematisk. Fotografier av den monterte MPP strømnings kammer (øvre panel) viser kammeret på mikroskopet scenen fra tre forskjellige visninger: siden som vises under eksperimenter (venstre), fra den (midten), og fra vakuum utløp (til høyre) som er ute av visningen i bildet. Flytretningen er merket i hver. Legg merke til at jordledningen lett kan passe inn i en av de 2 mm åpninger når bøyd i en 90 ° vinkel. En detaljert skjematisk (nederst) viser nøyaktige dimensjoner for replikering av apparatet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: tyngdekraft systemet. Et merket bilde av tyngdekraft systemet i laboratoriet vårt vises i det øvre panelet. Det to-trinns MPP strømnings kammeret og tyngdekraft-systemet er beskrevet i bunnpanelet. Separasjon av strømnings kammeret som inneholder celler og de to øvre og nedre reservoarer er uthevet. Trinn 1 gjør det mulig løsning å strømme fra den øvre reservoaret av stykket B til stykke D av kammeret der cellene er sådd. Trinn 2 gjør at løsningen kan flyte fra stykke D ned til nedre reservoar, stykke F. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representative spor av skjær-indusert nåværende aktivering av KIR kanaler og gå tilbake til Baseline gjeldende nivå ved fjerning av flyt. En god positiv kontroll for mechanoactivation av ion-kanaler er tilbake til Baseline gjeldende nivåer i utgangspunktet observert i et statisk bad ved opphør av den mekaniske stimulans. Innvendig rectifying K+ (KIR) kanal strømmer aktiveres i løpet av sekunder ved å skjære stress når tyngdekraften løsningen er tillatt å STRØMME til MPP strømnings kammeret. Ved opphør av strømmen til kammeret, vil KIR strøm raskt tilbake til Baseline statiske nivåer observert før Flow. En rampe på-140 mV til + 40 mV ble brukt på plasteret over 400 MS. badet løsningen inneholdt 60 mM K+ og reversering potensialet var ~-20 mv. Den representative spor ble generert fra en endothelial celle fersk isolert fra mus chrezbryzheechno arterier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: eksempel på lekkasje subtraksjon for nøyaktig analyse av Mechanoactivated KIR strøm. (A) representative rå innspilling av KIR strøm fra en primær mus chrezbryzheechno endothelial celle med bemerkelsesverdige lineær ytre lekkasjestrøm (jeglekkasje). En rampe på-140 mV til + 40 mV ble brukt på plasteret over 400 MS. badet løsningen inneholdt 60 mM K+ og reversering potensialet var ~-20 mv. (B) jeglekkasje hindrer analyse av ekte KIR kanal aktivitet. Å trekke jeglekkasje, først beregne den lineære skråningen konduktans avlekkasje jeg (GSlope = (ia-Ib)/(va-vb)). Multipliser GSlope av tilsvarende spenninger i hele rå spor til tomten jeglekke på rådata. Linjen skal overlappe de ytre lineære lekkasjen nøyaktig. (C) subtrahere den plottet jeglekker fra hele sporet, slik at den lineære utover strømmen er ~ 0 pa/PF og den virkelige KIR strømmen kan analyseres. Legg merke til i panel C at den indre KIR-strømmen er omtrent halvparten av den opprinnelige rå data sporet i panel A. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Høyde (mm) | Bredde (mm) | Lengde (mm) | Tilleggsinformasjon | ||
| Stykke A | 8 | 80 | 98 | Inneholder 3 mm diameter hull for Innløpsrør (se tabell over materialer) og 53 mm x 60 mm rektangulær plass for tilgang til midtre deler og celler | |
| Stykke B | 1 | 80 | 98 | Inneholder et mellomrom (20 mm diagonalt) under et hull av stykke A og tre 2 mm x 17 mm åpninger for tilgang til celler | |
| Stykke C | 1 | 80 | 98 | Inneholder en 22 mm x 50 mm plass hvor Piece D er levd ved hjelp av silikon elastomer løsning (se tabell over materialer) | |
| Stykke D | 0,16 | 24 | 40 | Rektangulær glass skyve bunnen av strømnings kammeret | |
| Stykke E | 5 | 80 | 120 | Inneholder en 45 mm x 50 mm plass for å tillate visualisering av celler på Piece D. En 20 mm x 45 mm plass er til stede for reservoaret vakuum utløp, Piece F, som skal overholdes | |
| Stykke F | 0,16 | 24 | 50 | Rektangulært glass Slide bunnen av vakuum utløp reservoaret | |
| Sammensatt MPP | 15 | 80 | 120 | Flow kammer er adskilt fra innløps-og utløps vakuum med to trinn for å unngå forstyrrelser i veldefinert laminær skjær | |
| Flow Chamber av monterte MPP | 1 | 22 | 42 | Piece D er glasset raset bunnen av strømnings kammeret | |
Tabell 1: dimensjonene til MPP (montert og demontert) og tilleggsinformasjon som er spesifikk for hver del av enheten.
| Løsning | Oppskrift (i mM) | Ph | ||
| Dissosiasjon | 55 NaCl, 80 na-glutamat, 6 KCl, 2 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 glukose, 10 HEPES | 7,3 | ||
| (Celle isolasjon) | ||||
| Bath (elektrofysiologi) | 80 NaCl, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 glukose, 10 HEPES | 7,4 | ||
| Pipette (elektrofysiologi) | 5 NaCl, 135 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl2, 5 glukose, 10 HEPES | 7,2 | ||
Tabell 2: eksempler på løsninger med oppskrifter brukt i eksperimentene.
| Endothelial celle isolasjons protokoll | Referanser | |
| Cocktail av nøytral protease og elastase (0,5 mg/mL hver; 1 h ved 37 ° c) etterfulgt av kollagenase type I (0,5 mg/mL; 2,5 min) | 6, 7 | |
| Lett mekanisk skraping av en 5-cm2 region som ligger på den indre veggen av den synkende bryst aorta | 11 | |
| Na | 17 | |
| Na | 3 | |
| Kollagenase type IA (1 mg/mL) i 14 min ved 37 ° c | 8 | |
Tabell 3: metodikk for å studere mechanosensitive-kanaler ved hjelp av elektrofysiologisk teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det vaskulære systemet er stadig utsatt for aktive hemodynamisk tyrker, som aktiverer mechanosensitive ion kanaler3,22 men fysiologiske roller av disse kanalene i skjær stress-indusert mechanotransduction er bare begynner å dukke opp4,6,8. Mekanismene ansvarlig for mechanosensitivity av skjær stress-aktiverte kanaler forblir ukjent. Protokollen detaljert her beskriver metoden for direkte gransking av mechanosensitive ion kanaler eksponert for laminær skjær stress i sanntid.
Den kritiske og essensielle trinn i denne protokollen er bruken av en modifisert parallell plate Flow kammer som har smale åpninger for å tillate en elektrofysiologisk pipette skal senkes ned i kammeret og få tilgang til cellene underflyt. Det generelle prinsippet for denne enheten er at hvis åpningene er smale nok, kan fysiologisk skjær stress (opp til 15 Dyn/cm2) oppnås uten løsning overløp på grunn av overflate spenningsstyrke10. For å utføre disse eksperimentene vellykket, er det avgjørende: (i) å frø celler i området av bunnplaten som er rett under åpningene; (II) etablere en Giga-ohm forsegling før oppstart av flyten eller under svært langsom (< 0,01 Dyn/cm2) bakgrunns flyt; (III) opprettholde en stabil forsegling mens trapper opp flyten. Dimensjoner av de fire-brikke akryl apparat som brukes i vårt laboratorium er levert sammen med detaljerte skjematisk (figur 1) slik at MPP Flow kammer og Flow system (figur 2) kan bli replikert for bruk i alle laboratorium gransker mechanosensitive ion kanaler. Disse dimensjonene kan også endres for å øke arealet seeded av celler og for å endre høyden på strømnings kanalen, noe som ville endre forholdet mellom strømningshastigheten og skjær stresset. En reduksjon i høyden av strømnings kammeret vil resultere i høyere skjær stress for samme strømningshastighet, noe som kan være fordelaktig for å oppnå høyere skjær spenninger. Kammeret kan også endres til å omfatte en Flow separasjon barriere som induserer en lokal region av resirkulering forstyrret Flow23.
De store fordelene ved å bruke MPP flyt kammer inkluderer (1) sanntid undersøkelse av skjær-aktiverte ion kanaler fra endothelial celler i kultur og celler fersk isolert fra vaskulær vev, (2) eksponering av celler og responsen av mechanosensitive ion kanaler for å fysiologisk relevante nivåer av skjær stress, og (3) enkel montering og demontering med tilleggsalternativer for eksperimentering. Med hensyn til andre eksisterende metoder, er den eneste andre metoden som gjør det mulig å utføre elektrofysiologisk innspillinger under veldefinert skjær stress seeding cellene i en kapillær slutten og sette inn opptaket pipette i kapillær åpningen, som ble gjort i de tidlige studiene3,22. Det er imidlertid flere ulemper i forhold til metoden som er beskrevet her, for eksempel vanskelighetene med seeding celler i blodkar, tilgang til et svært lite antall celler som er nær nok til kapillær slutten for pipette å kunne nå dem, og strømnings forstyrrelser på slutten av strømnings kanalen (kapillær i dette tilfellet). Hver av disse ulempene gjør det vanskelig å utføre elektrofysiologi underflyt i celler kultivert i kapillær åpningen og praktisk talt umulig å lappe eller til og med frø celler fersk isolert fra blodkar. Det er også umulig å innføre et skritt for å generere et område av forstyrret flyt. Alle andre eksisterende metoder som enten ansette åpne kamre24,25 eller damper løsninger direkte på en celle17,18 ikke etterligne hemodynamisk miljøet i blodkaret.
Den viktigste begrensningen av denne metoden, derimot, er en begrensning for å oppnå skjær stress på høyere nivåer av det fysiologiske området. Spesielt fysiologiske skjær stress nivåer er anslått å nå opp til 70 Dyn/cm2 i friske arterier26. I kontrast, den høyeste skjær stressnivå som vi kunne oppnå i den nåværende konfigurasjonen av kammeret var 15 Dyn/cm2, hvoretter overflaten spenn kreftene blir ikke tilstrekkelig til å hindre at løsningen å søle ut av åpningene10. Det er mulig at å redusere høyden på strømnings kanalen kan tillate å oppnå høyere skjær stress nivåer. Opprettholde en stabil Giga-ohm segl under høy skjær stress er en annen utfordring, men suksessraten er rimelig med praksis. Vi fant at bruk av perforert patch teknikk (inkludert antibiotika amfotericin B i pipette løsningen som beskrevet ovenfor) gir mer stabile innspillinger enn standard hele celle konfigurasjonen. I tillegg MPP flyt kammer og løsninger som brukes ikke nøyaktig gjenskape skjær av blodstrøm i arterier. Blod er en viskøs, ikke-newtonsk væske som vi ikke har kopiert i våre in vitro eksperimenter. I tillegg er kammeret som brukes her er et parallelt kammer mens skjær stress i arterier er best beregnes ved hjelp av formelen for skjær i en sylinder.
Det er viktige hensyn og begrensninger for å utføre enkeltkanals innspillinger underflyt. Denne metoden er egnet for en celle-vedlagt konfigurasjon (pipette festet til membranen av en intakt celle), som gir stabile tetninger. Det er kritisk om å være klar over at enkeltkanaler hvis aktivitet blir registrert ikke er direkte eksponert for skjær stress fordi de er skjermet av innspillingen pipette, spesielt i innsiden ut konfigurasjonen27. Vi mener at de excised patch konfigurasjonene ikke er de mest pålitelige når de brukes til å teste følsomheten til ion-kanaler for å flyte fordi excised membranen vanligvis trekkes inn i opptaks pipette og dermed ikke utsettes for en veldefinert flyt.
I forhold til den type celler som kan brukes i disse eksperimentene, vaskulær endothelial celler representerer den mest aktuelle celle type å studere skjær stress og mechanosensitive kanaler. Tidligere studier fokuserte primært på kulturperler endothelial celler3,28 som er lett tilgjengelig. Vi har testet og utvidet bruken av denne metoden til å endothelial celler nylig isolert fra musen motstand arterier6,7. Andre celletyper bør definitivt vurderes. Vaskulære glatte muskelceller, for eksempel, kan bli utsatt for skjær stress under sykdomstilstander der endotelet har blitt skadet og fjernet29,30. Dette representerer et spennende område av studien der mechanosensitive kanaler som bor i glatt muskulatur, som ellers ville være upåvirket av skjær stress, vil nå bidra til potensielt patofysiologiske sykdom mekanismer. Videre er transfeksjoner av kjøretøy cellelinjer som HEK eller CHO med genet koding kanalen av interesse en utmerket plattform for Biofysiske analyser av kanaler i kombinasjon med bruk av MPP flyt kammer.
Det er også viktig å merke seg at mens den opprinnelige intensjonen for MPP Flow kammeret var for sanntids undersøkelse av ion-kanalen mechanoactivation, anvendelsen av enheten kan strekke seg utover dette målet. Nærmere bestemt, kan den samme tilnærmingen brukes for studier som bruker elektrode sensorer, for eksempel en nitrogenoksid (NO) sensor for å fastslå utgivelsen av NO som svar på skjær stress. Derfor gir vi en generalisert metodikk for de med interesse i å undersøke mekanisk regulert biologiske prosesser i sanntid og fremme ytterligere modifisering av MPP kammeret for å møte spesifikke forskningsbehov for de som studerer mechanosensitive prosesser i en rekke felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Heart, Lung, og Blood Institute (R01 HL073965, IL) og (T32 HL007829-24, ISF). Forfatterne vil også erkjenne Scientific Machine Shop ved University of Illinois i Chicago for å generere vår nyeste MPP Flow kamre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 G syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| Elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| Neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
