Summary
El objetivo de este protocolo es describir una cámara de flujo de placa paralela modificada para su uso en la investigación de la activación en tiempo real de canales iónicos sensibles al mecano sensible por tensión de cizallamiento.
Abstract
Se sabe que la tensión de cizallamiento fluido desempeña un papel importante en la función endotelial. En la mayoría de los lechos vasculares, el estrés de cizallamiento elevado por aumentos agudos en el flujo sanguíneo desencadena una cascada de señalización que resulta en vasodilatación, aliviando así el estrés mecánico en la pared vascular. El patrón de estrés por cizallamiento también es bien conocido por ser un factor crítico en el desarrollo de la aterosclerosis con el estrés de cizallamiento laminar siendo ateroprotector y perturbado estrés de cizallamiento siendo pro-aterogénico. Si bien tenemos una comprensión detallada de las diversas vías de señalización de células intermedias, los receptores que primero traducen el estímulo mecánico en mediadores químicos no se entienden completamente. Los canales iónicos sensibles al mecano sensible son críticos para la respuesta a la cizalladura y regulan la señalización celular inducida por cizallamiento, controlando así la producción de mediadores vasoactivos. Estos canales se encuentran entre los primeros componentes de señalización activados para cortar y se han relacionado con vasodilatación inducida por cizallamiento mediante la promoción de la producción de óxido nítrico (por ejemplo, rectificación interna de K+ [Kir] y potencial de receptor transitorio [TRP] (p. ej., canales K+ [KCa] activados por Kir y calcio) y vasoconstricción inducida por cizallamiento a través de un mecanismo indeterminado que implica canales piezoeléctricos. Comprender el mecanismo biofísico por el cual estos canales son activados por fuerzas cortantes (es decir, directamente o a través de un receptor mecano primario) podría proporcionar posibles nuevos objetivos para resolver la fisiopatología asociada con la disfunción endotelial y la atrogénesis. Sigue siendo un desafío importante para registrar la activación inducida por el flujo de canales iónicos en tiempo real utilizando la electrofisiología. Los métodos estándar para exponer las células a tensión de cizallamiento bien definida, como el reómetro de cono y placa y la cámara de flujo de placa paralela cerrada no permiten el estudio en tiempo real de la activación del canal iónico. El objetivo de este protocolo es describir una cámara de flujo de placa paralela modificada que permite el registro electrofisiológico en tiempo real de canales iónicos sensibles a la tensión de cizallamiento bien definido.
Introduction
Las fuerzas hemodinámicas generadas por el flujo sanguíneo son bien conocidas por desempeñar un papel importante en la función endotelial y vascular1,2. También es bien sabido que varios tipos de canales iónicos responden agudamente a los cambios en la tensión de cizallamiento3,4,5 lo que lleva a la hipótesis de que los canales iónicos pueden ser sensores de tensión de cizallamiento primarios. Más recientemente, nosotros y otros mostramos que los canales iónicos mecanosensitive desempeñan un papel crítico en varias funciones vasculares sensibles al estrés de cizallamiento, incluyendo la respuesta vasoactiva a la tensión de cizallamiento6,7,8 , y la angiogénesis del desarrollo9. Los mecanismos de la sensibilidad de tensión de cizallamiento de los canales iónicos, sin embargo, son casi totalmente desconocidos. Es probable que esta brecha de conocimiento se deba a la dificultad técnica de realizar grabaciones electrofisiológicas bajo tensión cortante bien definida. En este artículo, por lo tanto, proporcionamos un protocolo detallado paso a paso realizado rutinariamente en nuestro laboratorio para lograr este objetivo6,7,10,11.
El objetivo general de este método es permitir la investigación en tiempo real de la mecanoactivación del canal iónico bajo tensión de cizallamiento bien definida en el rango fisiológico. Esto se logra modificando una cámara de flujo de placa paralela estándar para permitir que una pipeta electrofisiológica se baje en la cámara y las células de acceso cultivadas en la placa inferior durante la exposición en tiempo real al flujo, proporcionando un enfoque único para lograr esto meta6,7,11. Por el contrario, las cámaras de flujo de placas paralelas estándar, descritas en publicaciones anteriores, se pueden utilizar para el análisis de imágenes en tiempo real de células expuestas a fuerzas de cizallamiento12 u otros enfoques no invasivos13,14, pero no para Electrofisiología. Del mismo modo, el aparato de cono y placa, otro enfoque poderoso para exponer las células a la tensión de cizallamiento15,16 tampoco es adecuado para grabaciones electrofisiológicas. Por lo tanto, estos dispositivos de flujo no permiten la investigación de la sensibilidad de tensión de cizallamiento de los canales iónicos. La dificultad para realizar grabaciones electrofisiológicas bajo flujo es la razón principal de la escasez de información sobre los mecanismos responsables de estos efectos cruciales.
En cuanto a los enfoques alternativos para lograr el mismo objetivo, no hay ninguno que sea tan preciso o controlado. Algunos estudios anteriores intentaron registrar la actividad del canal iónico bajo flujo exponiendo las células a una corriente de líquido procedente de otra pipeta traída a las proximidades de una célula desde más de17,18. Esto es altamente no fisiológico, ya que las fuerzas mecánicas generadas en estas condiciones tienen poco en común con los perfiles fisiológicos de tensión cortante en los vasos sanguíneos. Preocupaciones similares se aplican a los intentos de simular la tensión de cizallamiento fisiológica por perfusión de cámaras abiertas. Como se discutió en detalle en nuestro estudio anterior10, una interfaz de aire líquido abierto crea múltiples perturbaciones y recirculación, que no son fisiológicas. Para abordar todas estas preocupaciones, hemos diseñado una cámara de flujo de placa paralela modificada (MPP), también conocida como el "dispositivo de flujo mínimamente invasivo" en nuestros estudios anteriores6,7,10,11, hecho de acrílico y ampliamente utilizado en nuestro laboratorio. Sin embargo, a pesar de que la descripción original del diseño se ha publicado hace casi 20 años y es el único dispositivo de flujo que permite realizar grabaciones electrofisiológicas bajo tensión de cizallamiento bien definida, esta metodología no ha sido adoptados por otros laboratorios y sólo hay muy pocos estudios que intenten registrar corrientes bajo flujo. Creemos, por lo tanto, que proporcionar una descripción detallada para el uso de la cámara de flujo MPP será de gran ayuda para las investigaciones que están interesadas en canales iónicos mecanosensitive y biología vascular.
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Protocol
El uso de animales en nuestros estudios está aprobado por el Comité de Cuidado animal de la Universidad de Illinois en Chicago (#16-183).
1. Montaje de la Cámara de Flujo de Placas Paralelas Modificadas
NOTA: Consulte la Tabla 1 y la Figura 1 para los iDE de piezas de cámara de flujo MPP. Consulte la Figura 1 para obtener un esquema que detalla la orientación de las piezas de la cámara para el montaje.
- Para adherir el vidrio de la cubierta rectangular, pieza D, a la parte inferior de la pieza C, primero haga la solución de elastómero de silicona mezclando a fondo el agente de curado de elastómero de silicona de 500 ol en 5 ml de base de elastómero de silicona.
- Aplique una fina capa de la solución de elastómero de silicona alrededor de los bordes del espacio rectangular de la pieza C y coloque suavemente la pieza de vidrio de cubierta rectangular D directamente sobre la solución de elastómero, de modo que la pieza D cubra completamente el espacio rectangular abierto de la pieza C. Limpie cuidadosamente el exceso de solución de elastómero de silicona.
- Repita el paso 1.2 para adherir el vidrio de la cubierta rectangular, pieza F, a la parte inferior de la pieza E y permita que la solución de elastómero de silicona se cure durante la noche a temperatura ambiente.
NOTA: Una vez curado, el vidrio de la cubierta rectangular permanecerá adherido hasta seis meses antes de necesitar ser reemplazado. - Comenzando con la pieza de la cámara inferior, la pieza E, ensamble la cámara de flujo MPP colocando secuencialmente cada pieza encima de la anterior en el siguiente orden: pieza E (abajo), pieza C, pieza B, pieza A (arriba).
- Alinee los orificios de tornillo de cada pieza en las esquinas y atornille firmemente las piezas para evitar que se produzcan fugas durante la administración del flujo a la cámara de flujo MPP.
2. Preparación celular y sembrado en la cámara de flujo MPP
NOTA: Siga los pasos 2.1-2.7 para las células endoteliales cultivadas. Siga el método detallado en los pasos 2.8 a 2.14 para aislar las células endoteliales de la arcada arterial mesentérica del ratón y la preparación de células endoteliales recién aisladas.
- En una placa de 6 pocillos, coloque de cuatro a cinco círculos de vidrio de 12 mm de cubierta/bien y células de semillas entre 10% y 30% de confluencia, de modo que se pueda acceder a células individuales para grabaciones electrofisiológicas.
- Incubar células bajo condiciones de cultivo estándar (5% CO2, 37 oC) durante no menos de 2 h para permitir que las células se adhieran y no más de 24 h como células endoteliales en la experiencia de los autores se vuelven muy planas y difíciles de parchear cuando se sembran en la subconfluencia durante más de 24 H.
- Retire un vaso de cubierta que contenga células adheridas de un pozo de la placa de 6 pocillos, enjuague rápidamente la solución salina con fosfato (PBS) y transfiera a una placa Petri de 35 mm que contenga una solución de baño electrofisiológico de 2 ml (Tabla2) antes de transferirla al flujo MPP Cámara.
- Transfiera el círculo de vidrio de la cubierta al vidrio de la cubierta rectangular, la pieza D, que se adhiere a la pieza C de la cámara de flujo MPP asegurándose de que la solución adecuada permanezca en el vidrio de la cubierta para que las células no se expongan al aire. Agregue la solución de baño deseada (250 l) a las células para que el círculo de vidrio de la cubierta y las celdas estén completamente sumergidos en la solución.
- Coloque el círculo de vidrio de la cubierta de tal manera que se apoye en la mitad más cercana al lado del depósito de vacío para que las células estén en línea con las aberturas de hendidura de la pieza B. Asegúrese de que el círculo de la cubierta de vidrio se adhiera a la pieza D a través de la adhesión de vidrio de solución para que la aplicación de flujo a la cámara no interrumpe la posición del círculo de vidrio de la cubierta.
- Ensamble la cámara de flujo MPP atornillando las piezas en el orden apropiado, como se describe en los pasos 1.4 y 1.5 y como se muestra en la Figura1. Transfiera la cámara a la etapa del microscopio y perfundie inmediatamente la cámara con solución de baño de tal forma que la solución llegue al depósito de vacío para la aspiración (10 ml).
- Identifique una célula sana para el experimento identificando una célula con un borde oscuro y un núcleo obvio. Evite las células que parecen estar manchando o las células que están en contacto con otras células.
NOTA: En el laboratorio de autores, se utilizan células endoteliales aórticas humanas y células endoteliales mesentéricas de ratón primario en el cultivo. Sin embargo, cualquier otro tipo de célula adherente que sea de interés para necesidades específicas de investigación se puede utilizar de la misma manera. - Lavar la arcada arterial aislada en solución de disociación (Tabla 2). Transfiera la arcada a un tubo centrífugo de 2 ml que contenga 2 ml de solución de disociación precalentada (37 oC) (receta para la solución de disociación que se muestra en la Tabla 2) que contiene proteasa neutra (0,5 mg/ml) y elastasa (0,5 mg/ml). Incubar durante 1 h a 37oC con suave agitación cada 10 min.
- Retire 1 ml de la solución de disociación de proteasa/elastasa neutra y añada 1 mg/ml de colagenasa tipo 1. Devolver la solución de colagenasa a la solución que contiene las arterias para una concentración final de colagenasa tipo 1 de 0,5 mg/ml. Incubar durante 2 x 3 min a 37oC.
- Usando 5 fórceps de grado, mueva rápidamente la arcada a una placa Petri de 35 mm de diámetro que contenga una gota de 750 ol de solución de disociación fresca y refrigerada. Disociar aún más el tejido mediante el uso de dos agujas de jeringa de 20 G para liberar mecánicamente las células endoteliales de las arterias digeridas enzimáticamente.
- Usando un pipeta de vidrio Pasteur desechable de 9", tritura la solución celular 10veces antes de transferir las células a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 ml usando el pipeta de vidrio.
- Lavar el plato de Petri con otros 750 ml de solución de disociación y transferirlo al mismo tubo. Usando la pipeta de vidrio, disperse mecánicamente las células pipeteando al menos 10 veces para crear una suspensión de una sola célula teniendo cuidado de no introducir burbujas que puedan dañar la integridad de las células endoteliales.
- Añadir 750 l de la suspensión de la célula endotelial (500 x 1.000 células) directamente a la pieza D de la cámara de flujo MPP en la mitad más cercana al lado de vacío del depósito. Deje que las células endoteliales se adhieran entre 45 min y 1 h a temperatura ambiente.
- Ensamble la cámara de flujo MPP atornillando las piezas en el orden apropiado como se describe en los pasos 1.4 y 1.5 y como se muestra en la Figura1. Transfiera la cámara a la etapa del microscopio y perfundie inmediatamente la cámara con solución de baño de tal forma que la solución alcance la aspiración al vacío (10 ml). Identificar células endoteliales accesibles por su fenotipo áspero y redondo19,20.
NOTA: Se han utilizado diversos métodos de digestión y cócteles enzimáticos para aislar las células endoteliales de diferentes lechos arteriales. Consulte la Tabla 3 para obtener descripciones detalladas de los protocolos que han sido utilizados por una variedad de investigadores para aislar las células endoteliales para la electrofisiología de abrazadera de parche de canales iónicos mecanosensitive. Estos métodos son probablemente adecuados para su uso en combinación con la cámara de flujo MPP.
3. Control del estrés de cizallamiento a la cámara de flujo MPP para grabaciones electrofisiológicas de canales de iones mecanosensibles activados por cizallamiento
- Configure un sistema de perfusión por gravedad conectando un cilindro de jeringa graduado de 30 ml a un bloqueo luer de 3 vías equipado con tubo de microbore (diámetro interno: 0,05 pulgadas, diámetro exterior: 0,09 pulgadas) adecuado para la inserción en el orificio de entrada de 3 mm de diámetro de la pieza A del MPP Cámara.
- Fije el cilindro graduado a la cara exterior de la jaula de Faraday que rodea la plataforma de electrofisiología (Figura2) utilizando cinta adhesiva de doble cara. Antes de insertar el tubo en la cámara MPP, rellene previamente la jeringa y el tubo con solución de baño (consulte la Tabla 2 para la solución de baño utilizada para investigar la rectificación interna de los canales K+ en células endoteliales). Inserte el tubo en el orificio de entrada de la cámara de flujo MPP de la pieza A.
- Rellene previamente la cámara de flujo MPP con una solución tal que se retire la solución en el depósito de vacío. Detenga el flujo a la cámara y rellene el cilindro graduado hasta la marca superior. Calcule los caudales manualmente permitiendo que la solución fluya a través de la cámara y utilizando un cronómetro para calcular ml/s a una altura de cilindro de jeringa dada.
- Levante o baje la jeringa para alterar el flujo, y así cortar en la cámara, y continuar este proceso hasta que se encuentre el nivel deseado de tensión de cizallamiento.
- Calcule la tensión de cizallamiento en una cámara paralela utilizando la siguiente ecuación21:
á 6oQ/h2w
donde - viscosidad del fluido (g/cm-s), Q - caudal (mL/s), y anchura de la cámara de la placa paralela (w a 2,2 cm) y altura (h a 0,1 cm).
NOTA: En el sistema de perfusión por gravedad actual, a una altura de cilindro de jeringa (medida desde la parte superior del cilindro) de 57 cm por encima de la etapa del microscopio, el caudal es de 0,3 ml/s. La cizalladura calculada en la cámara a la altura del cilindro de la jeringa y el caudal es de 0,7 dyn/cm2. También debe tenerse en cuenta que otros sistemas de perfusión, como una bomba peristáltica, se pueden utilizar para controlar el flujo a la cámara de flujo MPP. Sin embargo, estos dispositivos pueden añadir turbulencia no deseada e influir en la estabilidad de las mediciones de electrofisiología bajo flujo, por lo tanto, se recomienda el uso del sistema de perfusión de gravedad descrito aquí. - Transfiera una cámara montada que contenga células adheridas a la etapa del microscopio de la plataforma de electrofisiología e inserte el tubo precargado con solución de baño en el orificio de la pieza A. Llene simultáneamente la cámara y lave las células con 10 ml de solución de baño girando la cerradura luer de 3 vías de tal manera que la solución fluye a la cámara.
- Una vez que la configuración de parche deseada se obtiene con éxito permiten que las corrientes de canal se estabilicen en un baño estático a temperatura ambiente. Una vez que las corrientes se han estabilizado, aplique la cizalladera de manera escalonada, lo que permite que los aumentos de corriente se estabilicen antes del siguiente aumento del paso en la tensión de cizallamiento.
NOTA: Los autores encuentran el mayor éxito con la configuración de parches perforados al estudiar canales iónicos mecanoactivados en células endoteliales. Para realizar configuraciones de parches perforados de células enteras, añada 5 ml de una anfotericina B de material de 60 mg/ml en sulfóxido de dimetil (DMSO) a 1 ml de solución de pipeta filtrada estéril de 0,2 m. Después de generar un sello giga-ohm en la configuración de celda, los parches perforados de células enteras se forman dentro de 2 x 5 min. - Elimine la exposición al cizallamiento de las células deteniendo el flujo a la cámara permitiendo que las corrientes de canal sensibles al mecanosensible vuelvan a las corrientes de línea base observadas en el baño estático.
- Aísle las corrientes de canal iónico sensibles al mecano sensible de interés alterando la valencia de la solución (por ejemplo, 60 mM K+ en solución de baño con 0 Ca2+ en solución de pipeta para estudiar la rectificación interna de los canales K+. La Tabla 2 muestra ejemplos de recetas de solución) y/o inhibición farmacológica de fuentes de corriente potencialmente contaminantes.
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Representative Results
En la Figura 1se muestran varias fotografías que muestran diferentes vistas de la cámara de flujo MPP en la etapa del microscopio (panel superior) y una representación esquemática de la cámara de flujo MPP (panel inferior). El esquema detalla las dimensiones de todo el dispositivo y la cámara de flujo. La Figura 2 muestra una fotografía del sistema de perfusión por gravedad a la cámara de flujo MPP en nuestro laboratorio (panel superior). También se muestra una representación esquemática del sistema de flujo (panel inferior) destinado a resaltar los pasos que aíslan las celdas en la cámara de flujo de la fiebre de la solución del sistema de perfusión y de la fuerza de la eliminación de vacío de la solución.
Un sello distintivo de los canales ióniones mecanosensibles es un retorno abrupto a los niveles basales al cese del estímulo mecánico3,6,7. La Figura 3 muestra como ejemplo que la eliminación del estímulo de tensión cortante durante las grabaciones electrofisiológicas de corriente Kir de una célula endotelial recién aislada da como resultado un retorno a las corrientes basales registradas inicialmente en un baño estático. El retorno a los niveles de corriente basal después de detener el flujo a la cámara MPP se produjo dentro de los diez segundos posteriores al cese del flujo.
Las grabaciones electrofisiológicas de células enteras (WC), especialmente las tomadas de células recién aisladas, a menudo tienen corrientes de fondo de fuga obvias que pueden enmascarar la actividad del canal. Algunos canales iónicos, como los de la familia de canales K+ de rectificación interna, tienen propiedades biofísicas que permiten restar la corriente de fondo de fuga para un análisis más preciso. La Figura 4 muestra como ejemplo el proceso de datos sin procesar (Figura4A) a la fuga externa lineal calculada y trazada (Figura4B)a la traza representativa final y restada a la fuga (Figura4C). Vea una explicación detallada para calcular y restar fugas de la grabación de parches WC perforadas en bruto en la leyenda adjunta a la Figura4.
Figura 1: Cámara de flujo MPP y esquema detallado. Las fotografías de la cámara de flujo MPP montada (panel superior) muestran la cámara en el escenario del microscopio desde tres puntos de vista diferentes: el lado visto durante los experimentos (izquierda), desde la entrada de perfusión (medio) y desde la salida de vacío (derecha) que está fuera de la vista en la fotografía. La dirección del flujo se etiqueta en cada uno. Observe que el cable de tierra puede caber fácilmente en una de las aberturas de 2 mm cuando se dobla en un ángulo de 90o. Un esquema detallado (abajo) muestra las dimensiones exactas para la replicación del aparato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El sistema de perfusión por gravedad. En el panel superior se muestra una fotografía etiquetada del sistema de perfusión por gravedad en nuestro laboratorio. La cámara de flujo MPP de dos pasos y el sistema de perfusión por gravedad se detallan en el panel inferior. Se resalta la separación de la cámara de flujo que contiene las células y los dos depósitos superior e inferior. El paso 1 permite que la solución fluya desde el depósito superior de la pieza B a la pieza D de la cámara donde se sembran las células. Paso 2 permite que la solución fluya desde la pieza D hasta el depósito inferior, la pieza F. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Rastros representativos de la activación de corriente inducida por cizallamiento de los canales Kir y volver a los niveles de corriente de línea base al eliminar el flujo. Un buen control positivo para la mecanoactivación de los canales iónicos es el retorno a los niveles de corriente basal observados inicialmente en un baño estático al cese del estímulo mecánico. Las corrientes de canal K+ (Kir) que rectifican internamente se activan en cuestión de segundos mediante tensión de cizallamiento cuando se permite que la solución de gravedad fluya a la cámara de flujo MPP. Tras el cese del flujo a la cámara, las corrientes Kir regresan rápidamente a los niveles estáticos basales observados antes del flujo. Se aplicó una rampa de -140 mV a +40 mV al parche a lo largo de 400 ms. La solución de baño contenía 60 mM K+ y el potencial de inversión era de 20 mV. Los rastros representativos se generaron a partir de una célula endotelial recién aislada de las arterias mesentéricas del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplo de resta de fugas para un análisis preciso de la corriente Kir mecanoactivada. (A) Registro en bruto representativo de la corriente Kir desde una celda endotelial mesentérica de ratón primario con corriente de fuga externa lineal notable (ileak). Se aplicó una rampa de -140 mV a +40 mV al parche a lo largo de 400 ms. La solución de baño contenía 60 mM K+ y el potencial de inversión era de 20 mV. (B) Lafuga impide el análisis de la actividad real del canal Kir. Para restar mefuga, primero calcular la conductancia de pendiente lineal de ifuga (pendiente G á (Ia-Ib)/(Va-Vb)). Multiplique lapendiente G por los voltajes correspondientes de toda la traza sin procesar para trazar quefilqué en los datos sin procesar. La línea debe superponer exactamente la fuga lineal hacia afuera. (C) Restar lafuga trazada de toda la traza para que la corriente exterior lineal sea de 0 pA/pF y se pueda analizar la corriente Kir real. Observe en el panel C que la corriente de Kir interna es aproximadamente la mitad que la del rastreo de datos sin procesar original en el panel A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Altura (mm) | Ancho (mm) | Longitud (mm) | Información adicional | ||
| Pieza A | 8 | 80 | 98 | Contiene un orificio de 3 mm de diámetro para tubos de perfusión de entrada (ver Tabla de materiales)y un espacio rectangular de 53 mm x 60 mm para el acceso a piezas y celdas intermedias | |
| Pieza B | 1 | 80 | 98 | Contiene un espacio (20 mm diagonal) debajo del orificio de perfusión de la pieza A y tres aberturas de 2 mm x 17 mm para acceder a las celdas | |
| Pieza C | 1 | 80 | 98 | Contiene un espacio de 22 mm x 50 mm donde la pieza D se adhiere utilizando la solución de elastómero de silicona (ver Tabla de materiales) | |
| Pieza D | 0.16 | 24 | 40 | Parte inferior rectangular del deslizamiento de vidrio de la cámara de flujo | |
| Pieza E | 5 | 80 | 120 | Contiene un espacio de 45 mm x 50 mm para permitir la visualización de celdas en la pieza D. Un espacio de 20 mm x 45 mm está presente para que la salida de vacío del depósito, la pieza F, se adhiera | |
| Pieza F | 0.16 | 24 | 50 | Parte inferior de la corredera de vidrio rectangular del depósito de salida de vacío | |
| MPP ensamblado | 15 | 80 | 120 | La cámara de flujo se separa de la perfusión de entrada y el vacío de salida por dos pasos para evitar la interrupción de la cizalladura laminar bien definida | |
| Cámara de flujo de MPP montado | 1 | 22 | 42 | La pieza D es la parte inferior de la cámara de flujo de la corredera de vidrio | |
Tabla 1: Dimensiones del MPP (montado y desmontado) e información adicional específica para cada parte del dispositivo.
| Solución | Receta (en mM) | Ph | ||
| Disociación | 55 NaCl, 80 Na-glutamato, 6 KCl, 2 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 glucosa, 10 HEPES | 7.3 | ||
| (Aislamiento celular) | ||||
| Baño (Electrofisiología) | 80 NaCl, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 glucosa, 10 HEPES | 7.4 | ||
| Pipeta (Electrofisiología) | 5 NaCl, 135 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl2, 5 glucosa, 10 HEPES | 7.2 | ||
Tabla 2: Ejemplos de soluciones con recetas utilizadas en los experimentos.
| Protocolo de aislamiento de células endoteliales | Referencias | |
| Cóctel de proteasa neutra y elastasa (0,5 mg/ml cada uno; 1 h a 37oC) seguido de colagenasa tipo I (0,5 mg/ml; 2,5 min) | 6,7 | |
| Raspado mecánico suave de una región de 5 cmy 2 situado en la pared interior de la aorta torácica descendente | 11 | |
| Na | 17 | |
| Na | 3 | |
| Colagenasa tipo IA (1 mg/ml) durante 14 min a 37oC | 8 | |
Tabla 3: Metodología para estudiar canales ióniones mecanosensibles utilizando técnicas electrofisiológicas.
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Discussion
El sistema vascular está constantemente expuesto a fuerzas hemodinámicas activas, que activan los canales iónicos mecanosensibles3,22, pero las funciones fisiológicas de estos canales en la mecanotransducción inducida por el estrés de cizallamiento es sólo empezando a emerger4,6,8. Los mecanismos responsables de la mecanosensibilidad de los canales activados por tensión cortante siguen siendo desconocidos. El protocolo detallado aquí describe el método para la investigación directa de canales iónicos mecanosensitive expuestos a tensión de cizallamiento laminar en tiempo real.
El paso crítico y esencial de este protocolo es el uso de una cámara de flujo de placa paralela modificada que tiene aberturas estrechas para permitir que una pipeta electrofisiológica se baje en la cámara y las células de acceso bajo flujo. El principio general de este dispositivo es que si las aberturas son lo suficientemente estrechas, la tensión de cizallamiento fisiológica (hasta 15 dyn/cm2) se puede lograr sin desbordamiento de solución debido a las fuerzas de tensión superficiales10. Para realizar estos experimentos con éxito, es crítico: (i) a las células de semilla en el área de la placa inferior que está directamente debajo de las aberturas; (ii) establecer un sello giga-ohm antes del inicio del flujo o durante un flujo de fondo muy lento (<0.01 dyn/cm2); (iii) mantener un sello estable mientras se intensifica el flujo. Las dimensiones del aparato acrílico de cuatro piezas utilizado en nuestro laboratorio se proporcionan junto con esquemas detallados (Figura1) de tal manera que la cámara de flujo MPP y el sistema de flujo (Figura2)pueden replicarse para su uso en cualquier laboratorio que investigue canales de iones mecanosensibles. Estas dimensiones también se pueden modificar para aumentar el área sembrada por las celdas y para cambiar la altura del canal de flujo, lo que cambiaría la relación entre el caudal y la tensión de cizallamiento. Una disminución en la altura de la cámara de flujo resultaría en una mayor tensión de cizallamiento para el mismo caudal, lo que podría ser beneficioso para lograr tensiones de cizallamiento más altas. La cámara también se puede modificar para incluir una barrera de separación de flujo que induce una región local de flujo perturbado recirculante23.
Las principales ventajas de utilizar la cámara de flujo MPP incluyen (1) investigación en tiempo real de canales iónicos activados por cizallamiento de células endoteliales en cultivos y células recién aisladas del tejido vascular, (2) exposición de células y la respuesta de iones mecanosensibles canales a niveles fisiológicamente relevantes de tensión cortante, y (3) fácil montaje y desmontaje con opciones de perfusión para la experimentación. Con respecto a otros métodos existentes, el único otro método que permite realizar grabaciones electrofisiológicas bajo tensión de cizallamiento bien definida es sembrar las células dentro de un extremo capilar e insertar la pipeta de grabación en la abertura capilar, como se hizo en los primeros estudios3,22. Hay, sin embargo, múltiples desventajas en comparación con el método descrito aquí, como la dificultad de sembrar las células en capilares, el acceso a un número muy pequeño de células que están lo suficientemente cerca del extremo capilar para que la pipeta pueda alcanzarlas, y alteraciones del flujo al final del canal de flujo (capilar en este caso). Cada una de estas desventajas hace que sea difícil realizar electrofisiología bajo flujo en células cultivadas en la abertura capilar y prácticamente imposible parchear o incluso células de semillas recién aisladas de la vasculatura. También es imposible introducir un paso para generar un área de flujo perturbado. Todos los demás métodos existentes que emplean cámaras abiertas24,25 o soluciones de soplado directamente en una célula17,18 no imitan el ambiente hemodinámico en el vaso sanguíneo.
La principal limitación de este método, sin embargo, es una restricción para lograr la tensión de cizallamiento en niveles más altos del rango fisiológico. Específicamente, se ha estimado que los niveles fisiológicos de tensión de cizallamiento alcanzan hasta 70 dyn/cm2 en arterias sanas26. Por el contrario, el nivel de tensión de cizallamiento más alto que pudimos alcanzar en la configuración actual de la cámara fue de 15 dyn/cm2, después de lo cual las fuerzas de tensión superficial es no suficientes para evitar que la solución se derrame fuera de las aberturas10. Es posible que la disminución de la altura del canal de flujo podría permitir lograr mayores niveles de tensión de cizallamiento. Mantener un sello giga-ohm estable bajo alta tensión de cizallamiento es otro desafío, pero la tasa de éxito es razonable con la práctica. Encontramos que el uso de la técnica de parche perforado (incluyendo el antibiótico anfotericina B en la solución de pipeta como se describió anteriormente) produce grabaciones más estables que la configuración estándar de células enteras. Además, la cámara de flujo MPP y las soluciones utilizadas no replican exactamente la cizalladura del flujo sanguíneo en las arterias. La sangre es un fluido viscoso y no newtoniano que no hemos replicado en nuestros experimentos in vitro. Además, la cámara utilizada aquí es una cámara paralela, mientras que la tensión de cizallamiento en las arterias se calcula mejor utilizando la fórmula para la cizallamiento en un cilindro.
Hay consideraciones y limitaciones importantes para realizar grabaciones de un solo canal bajo flujo. Este método es apropiado para una configuración de conexión celular (pipeta unida a la membrana de una célula intacta), que produce sellos estables. Sin embargo, es fundamental tener en cuenta que los canales individuales cuya actividad se está grabando no están expuestos directamente a la tensión de cizallamiento porque están protegidos por la pipeta de grabación, especialmente en la configuración de adentro hacia afuera27. Creemos que las configuraciones de parches extirpados no son las más fiables cuando se utilizan para probar la sensibilidad de los canales iónicos para fluir porque la membrana extirpada normalmente se tira en la pipeta de registro y por lo tanto no está expuesta a un flujo bien definido.
En términos del tipo de células que se pueden utilizar en estos experimentos, las células endoteliales vasculares representan el tipo de célula más aplicable para estudiar el estrés por cizallamiento y los canales sensibles al mecanosensible. Estudios anteriores se centraron principalmente en células endoteliales cultivadas3,28 que están fácilmente disponibles. Hemos probado y ampliado el uso de este método a las células endoteliales recién aisladas de las arterias de resistencia del ratón6,7. Otros tipos de células definitivamente deben ser considerados. Las células musculares lisas vasculares, por ejemplo, pueden quedar expuestas al estrés por cizallamiento durante los estados de la enfermedad donde el endotelio ha sido dañado y eliminado29,30. Esto representa un área intrigante de estudio por la cual los canales mecanosensibles que residen en el músculo liso, que de otro modo no estarían influenciados por el estrés de cizallamiento, ahora contribuirían a mecanismos de enfermedad potencialmente fisiopatológica. Además, la transfección de líneas celulares de vehículos como HEK o CHO con el gen que codifica el canal de interés es una excelente plataforma para los análisis biofísicos de canales en combinación con el uso de la cámara de flujo MPP.
También es importante tener en cuenta que si bien la intención original de la cámara de flujo MPP era la investigación en tiempo real de la mecanoactivación del canal iónico, la aplicación del dispositivo puede extenderse más allá de este objetivo. Específicamente, el mismo enfoque se puede utilizar para estudios que utilizan sensores de electrodos, como un sensor de óxido nítrico (NO) para determinar la liberación de NO en respuesta a la tensión de cizallamiento. Por lo tanto, proporcionamos una metodología generalizada para aquellos con interés en investigar procesos biológicos regulados mecánicamente en tiempo real y promover una mayor modificación de la cámara MPP para satisfacer las necesidades específicas de investigación para aquellos que estudian procesos mecanosensitivees en una variedad de campos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre (R01 HL073965, IL) y (T32 HL007829-24, ISF). Los autores también quieren reconocer a la Tienda de Máquinas Científicas de la Universidad de Illinois en Chicago por generar nuestras últimas cámaras de flujo MPP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 G syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| Elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| Neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
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