Summary
Målet med detta protokoll är att beskriva en modifierad parallell platta flödes kammare för användning vid utredning av realtids aktivering av mechanosensitive jonkanaler genom skjuvning stress.
Abstract
Fluid skjuvning stress är väl känt att spela en viktig roll i endotelfunktion. I de flesta vaskulära sängar, förhöjda skjuvning stress från akuta ökningar i blodflödet utlöser en signalering kaskad resulterar i vasodilatation därigenom lindra mekanisk stress på kärlväggen. Mönstret av skjuvning stress är också väl känd för att vara en kritisk faktor i utvecklingen av åderförkalkning med laminär skjuvning stress är atheroprotective och störd skjuvning stress är Pro-aterogena. Medan vi har en detaljerad förståelse av de olika mellanliggande cell signalering vägar, de receptorer som först översätta mekanisk stimulans till kemiska medlare är inte helt klarlagda. Mechanosensitive jonkanaler är avgörande för svaret på skjuvning och reglera skjuvning-inducerad cellsignalering därmed kontrollera produktionen av vasoaktiva medlare. Dessa kanaler är bland de tidigaste aktiverade signalering komponenter till skjuvning och har kopplats till skjuvning-inducerad vasodilatation genom att främja kväveoxid produktion (t. ex., invärl rättelse K+ [Kir] och övergående receptor potential [TRP] kanaler) och endotel hyperpolariserande faktor (t. ex., Kir och kalcium-aktiverade K+ [KCA] kanaler) och skjuvning-inducerad vasokonstriktion genom en obestämd mekanism som involverar piezo kanaler. Att förstå den biofysiska mekanismen genom vilken dessa kanaler aktiveras av skjuvkrafter (dvs. direkt eller genom en primär Mechano-receptor) kan ge potentiella nya mål för att lösa patofysiologin i samband med endoteldysfunktion och aterogenes. Det är fortfarande en stor utmaning att spela in flödesinducerad aktivering av jonkanaler i realtid med hjälp av elektrofysiologi. De standardmetoder för att exponera celler till väldefinierad skjuvning stress, såsom konen och plattan skjuvreometer och slutna parallella plattan flöde kammare tillåter inte realtid studie av Jon kanal aktivering. Målet med detta protokoll är att beskriva en modifierad parallell plattans flödes kammare som möjliggör Elektrofysiologisk inspelning i realtid av mekankänsliga jonkanaler under väldefinierad skjuvbelastning.
Introduction
Hemodynamiska krafter som genereras av blodflödet är väl kända för att spela stora roller i endotelial och vaskulär funktion1,2. Det är också välkänt att flera typer av jonkanaler akut reagerar på förändringar i skjuvning stress3,4,5 som leder till hypotesen att jonkanaler kan vara primära skjuvning stress sensorer. Mer nyligen visade vi och andra att mechanosensitive jonkanaler spelar kritiska roller i flera skjuvning-stresskänsliga vaskulära funktioner, inklusive vasoaktiva svar på skjuvning stress6,7,8 , och utvecklingsmässig angiogenes9. Mekanismerna för skjuvning-stress känslighet jonkanaler, dock, är nästan helt okända. Detta kunskapsgap kommer sannolikt att bero på den tekniska svårigheten att utföra elektrofysiologiska inspelningar under väldefinierad skjuvning stress. I den här artikeln, därför ger vi ett steg för steg detaljerat protokoll rutinmässigt utförs i vårt labb för att uppnå detta mål6,7,10,11.
Det övergripande målet med denna metod är att möjliggöra realtids undersökning av Jon kanals mechanoactivation under väldefinierad skjuvning stress i det fysiologiska området. Detta åstadkoms genom att en standard flödes kammare för parallell plattan ändras så att en Elektrofysiologisk pipett kan sänkas ner i kammaren och få tillgång till celler som odlas på bottenplattan under realtids exponeringen för flöde, vilket ger en unik metod för att uppnå detta mål6,7,11. Standard flödes kammare med parallella plattor, beskrivna i tidigare publikationer, kan däremot användas för analys av realtidsbilder av celler som utsätts för skjuvkrafter12 eller andra icke-invasiva metoder13,14 men inte för Elektrofysiologi. Likaså konen och plattan apparat, en annan kraftfull metod för att exponera celler för skjuvning stress15,16 är inte heller lämplig för elektrofysiologiska inspelningar. Sålunda, dessa flödes anordningar tillåter inte utredning av skjuvning stress känslighet jonkanaler. Svårigheten att utföra elektrofysiologiska inspelningar under Flow är den främsta orsaken till bristen på information om de mekanismer som ansvarar för dessa avgörande effekter.
När det gäller de alternativa metoder för att uppnå samma mål, det finns ingen som är så noggrann eller kontrollerad. Vissa tidigare studier försökte registrera Jon kanalens aktivitet underflöde genom att exponera celler för en ström av vätska som kommer från en annan pipett som förs till närheten av en cell från ovan17,18. Detta är mycket icke-fysiologisk, eftersom de mekaniska krafterna som genereras under dessa förhållanden har lite gemensamt med de fysiologiska profilerna för skjuvning stress i blodkärlen. Liknande farhågor gäller försök att simulera fysiologiska skjuvning stress genom perfusion av öppna kammare. Som diskuterats i detalj i vår tidigare studie10, en öppen vätske-luftgränssnitt skapar flera störningar och återcirkulation, som är icke-fysiologiska. För att ta itu med alla dessa frågor har vi utformat en modifierad parallell platta (MPP) Flow Chamber, även kallad "minimalinvasiv Flow Device" i våra tidigare studier6,7,10,11, Made från akryl och används flitigt i vårt labb. Trots det faktum att den ursprungliga beskrivningen av konstruktionen har publicerats för nästan 20 år sedan och är den enda flödes anordning som gör det möjligt att utföra elektrofysiologiska inspelningar under väldefinierad skjuvning stress, har denna metod inte varit antagen av andra laboratorier och det finns bara mycket få studier som försöker spela in strömmar underflöde. Vi tror därför att ge en detaljerad beskrivning för att använda MPP Flow kammaren kommer att vara till stor hjälp för forskare som är intresserade av mechanosensitive jonkanaler och vaskulär biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av djur i våra studier är godkänd av University of Illinois på Chicago Animal Care kommittén (#16-183).
1. montering av den modifierade parallell plattans flödes kammare
Anmärkning: Se tabell 1 och figur 1 för MPP Flow kammarstycke IDS. Se figur 1 för en Schematisk beskrivning av kammar bitarna för montering.
- För att fästa det rektangulära täckglaset, stycke D, till botten av stycke C, gör först silikonelastomerlösningen genom att blanda 500 μL silikon elastomerhärdnings medel i 5 mL silikonelastomerbas.
- Applicera ett tunt lager av silikonelastomerlösningen runt kanterna på det rektangulära utrymmet i stycke C och placera försiktigt det rektangulära täckglasstycket D direkt på elastomerlösningen så att stycke D helt täcker det öppna rektangulära utrymmet i stycke C. Torka försiktigt bort överflödig silikonelastomerlösning.
- Upprepa steg 1,2 för att följa det rektangulära täckglaset, stycke F, till botten av stycke E och låt silikonelastomerlösningen härda över natten vid rumstemperatur.
Anmärkning: Efter att ha härdat kommer det rektangulära täckglaset att förbli kvar i upp till sex månader innan det behöver bytas ut. - Börjar med botten kammaren pjäs, bit E, montera MPP Flow Chamber genom att sekventiellt placera varje bit ovanpå den tidigare i följande ordning: Piece E (botten), bit C, bit B, Piece A (överst).
- Rikta skruvhålen på varje bit i hörnen och tätt skruva ihop bitarna för att förhindra läckage uppstår när du administrerar flödet till MPP Flow kammaren.
2. cell beredning och seedning i MPP-Flödeskammaren
Anmärkning: Följ steg 2.1 − 2.7 för odlade endotelceller. Följ den metod som beskrivs i steg 2.8 − 2.14 för att isolera endotelceller från musen mesenterisk arteriell arkad och beredning av nyligen isolerade endotelceller.
- I en 6-brunn tallrik, placera fyra till 5 12 mm täcka glas cirklar/brunn och frö celler mellan 10% och 30% confluency så att enstaka celler kan nås för elektrofysiologiska inspelningar.
- Inkubera celler under standard odlingsförhållanden (5% CO2, 37 ° c) för inte mindre än 2 h för att tillåta celler att klibba och inte mer än 24 h som endotelceller i författarnas erfarenhet blir mycket platt och svår att lappa när seedade vid sub-confluency för mer än 24 H.
- Ta bort ett täckglas som innehåller vidhäftade celler från en brunn på 6-brunnen plattan, skölj snabbt i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och överför till en 35 mm petriskål som innehåller 2 mL Elektrofysiologisk bad lösning (tabell 2) innan överföring till MPP-flödet Kammare.
- Överför locket glas cirkeln till den rektangulära locket glas, stycke D, som följs bit C i MPP Flow kammaren är säker på att lämplig lösning stannar på täckglaset så att cellerna inte blir utsatta för luft. Tillsätt önskad bad lösning (~ 250 μL) till cellerna så att täckglasets cirkel och celler är helt nedsänkt i lösningen.
- Placera locket glas cirkeln så att den vilar i den halva närmast vakuum reservoaren sidan så att cellerna kommer att vara i linje med slits öppningar av bit B. se till att glas täckets cirkel fastnar i stycke D genom lösningens glas, så att applicering av flödet till kammaren stör inte placeringen av locket glas cirkeln.
- Montera MPP-flödeskammaren genom att skruva ihop bitarna i lämplig ordning, enligt beskrivningen i steg 1,4 och 1,5 och som visas i figur 1. Överför kammaren till mikroskopet skede och omedelbart parfymera kammaren med bad lösning så att lösningen når vakuum reservoaren för aspiration (~ 10 mL).
- Identifiera en hälsosam cell för experimentet genom att identifiera en cell med en mörk gräns och en uppenbar kärna. Undvik celler som verkar vara blebbing eller celler som är i kontakt med andra celler.
Anmärkning: I författarnas laboratorium, mänskliga aorta endotelceller och primära mus mesenterica endotelceller i kulturen används. Men alla andra typer av anhängare cell som är av intresse för specifika forskningsbehov kan användas på samma sätt. - Tvätta den isolerade arteriell arkad i dissociation lösning (tabell 2). Överför arkaden till ett 2 mL centrifugeringsrör som innehåller 2 mL förvärmning (37 ° c) dissociationslösning (recept för dissociationslösning som visas i tabell 2) som innehåller neutralproteas (0,5 mg/ml) och elastas (0,5 mg/ml). Inkubera i 1 h vid 37 ° c med skonsam skakning var 10: de minut.
- Avlägsna 1 mL av den neutrala proteaslösningen/elastasdissociationslösningen och tillsätt 1 mg/mL kollagenastyp 1. Returnera kollagenaslösningen till den lösning som innehåller artärerna för en slutlig kollagenas typ 1-koncentration på 0,5 mg/mL. Inkubera i 2 − 3 minuter vid 37 ° c.
- Med hjälp av 5 grade forceps, snabbt flytta arkaden på en 35 mm diameter petriskål som innehåller en 750 μL droppe färsk, kyld dissociation lösning. Ytterligare separera vävnaden med hjälp av 2 20 G spruta nålar för att mekaniskt befria endotelceller från enzymatiskt smälta artärer.
- Med hjälp av en 9 "disponibel Pasteur glas pipet, hackad cellen lösning 10X innan du överför cellerna till en ny 1,5 ml Centrifugera röret med hjälp av glaset pipet.
- Tvätta petriskål med en annan 750 μL dissociation lösning och överföring till samma rör. Använda glaspipetten, ytterligare mekaniskt sprida cellerna genom Pipettera minst 10X för att skapa en enda cellsuspension är noga med att inte införa bubblor som kan skada endotelceller integritet.
- Tillsätt 750 μL av endotelcellernas suspension (~ 500 − 1000 celler) direkt till stycke D i MPP-flödeskammaren på den halva som ligger närmast reservoarens vakuum sida. Låt endotelcellerna att hålla sig mellan 45 min och 1 h vid rumstemperatur.
- Montera MPP-flödeskammaren genom att skruva ihop bitarna i lämplig ordning enligt beskrivningen i steg 1,4 och 1,5 och som visas i figur 1. Överför kammaren till mikroskopet scenen och omedelbart parfymera kammaren med bad lösning så att lösningen når vakuum aspiration (~ 10 mL). Identifiera tillgängliga endotelceller genom deras grova och runda fenotyp19,20.
Anmärkning: En mängd olika matsmältning metoder och enzym cocktails har använts för att isolera endotelceller från olika arteriell sängar. Se tabell 3 för detaljerade beskrivningar av protokoll som har använts av en mängd olika utredare för att isolera endotelceller för patch Clamp elektrofysiologi av mechanosensitive jonkanaler. Dessa metoder är sannolikt lämpliga för användning i kombination med MPP-flödeskammaren.
3. Kontrollera skjuvspänningen till MPP-Flödeskammaren för elektrofysiologiska inspelningar av skjuvaktiverade Mechanokänsliga jonkanaler
- Ställ in en gravitation perfusion system genom att ansluta en 30 ml graderad spruta cylinder till en 3-vägs luer lock Lås försedd med diameter slangar (innerdiameter: 0,05 tum, yttre diameter: 0,09 tum) lämpad för insättning i 3 mm diameter inlopps hålet i Piece a av MPP Kammare.
- Fäst den graderade cylindern till den yttre ytan av Faraday buren som omger elektrofysiologi rigg (figur 2) med dubbelhäftande tejp. Innan du sätter i slangen i MPP-kammaren, förfyll sprutan och slangen med bad lösning (se tabell 2 för bad lösning som används för att undersöka inombords rätande av K+ kanaler i endotelceller). Sätt i slangen i MPP Flow Chamber inlopps hålet i Piece A.
- Förfyll MPP-flödeskammaren med lösning så att lösningen avlägsnas i vakuum behållaren. Stoppa flödet till kammaren och fyll på graderad cylinder till toppen märket. Beräkna flödeshastigheter manuellt genom att låta lösningen flöda genom kammaren och med hjälp av en stoppur för att beräkna mL/s vid en given sprutcylinder höjd.
- Höj eller Sänk sprutan för att ändra flödet, och därmed skeva i kammaren, och fortsätt denna process tills önskad nivå av skjuvning stress hittas.
- Beräkna skjuvning stress i en parallell kammare med hjälp av följande ekvation21:
τ = 6μQ/h2w
där μ = vätskans viskositet (g/cm · s), Q = flödeshastighet (mL/s), och parallell plåt kammarens bredd (w = 2,2 cm) och höjd (h = 0,1 cm).
Anmärkning: I den nuvarande gravitationen perfusion systemet, vid en spruta cylinder höjd (mätt från toppen av cylindern) av 57 cm över mikroskopet skede, är flödet 0,3 mL/s. Skjuvning beräknas i kammaren på denna spruta cylinder höjd och flödeshastighet är 0,7 dyn/cm2. Det bör också noteras att andra per fusions system, såsom en Peristaltisk pump, kan användas för att kontrollera flödet till MPP-flödeskammaren. Emellertid, dessa enheter kan lägga oönskade turbulens och påverka stabiliteten i elektrofysiologi mätningar underflöde, därför, med hjälp av gravitationen perfusion system som beskrivs här rekommenderas. - Överför en monterad kammare som innehåller anslutit celler till mikroskopet skede av elektrofysiologi rigg och sätt slangen förfylld med bad lösning i hålet i pjäs A. Fyll samtidigt kammaren och tvätta cellerna med 10 mL bad lösning genom att vrida 3-vägs luer lock Lås så att lösningen strömmar till kammaren.
- När den önskade patchkonfigurationen har erhållits kan kanal strömmar stabiliseras i ett statiskt bad vid rumstemperatur. När strömmar har stabiliserats, tillämpa skjuvning i ett steg-vis sätt gör att ökningar i ström för att stabilisera före nästa steg ökning av skjuvning stress.
Anmärkning: Författarna finner mest framgång med perforerad patch konfiguration när man studerar mechanoactivated jonkanaler i endotelceller. För att utföra perforering av hela celler, tillsätt 5 μL av en 60 mg/mL av lageramfotericin B i dimetylsulfoxid (DMSO) till 1 mL 0,2 μm steril filtrerad pipettlösning. Efter att ha genererat en Giga-ohms tätning i den cellanslutna konfigurationen, bildas perforerade hel cells fläckar inom 2 − 5 minuter. - Ta bort skjuvning exponering för cellerna genom att stoppa flödet till kammaren så att mechanosensitive kanal strömmar att återvända till baslinje strömmar observerats i det statiska badet.
- Isolera mechanosensitive Jon kanal strömmar av intresse genom att ändra lösning Valence (t. ex., 60 mM K+ i Bad lösning med 0 ca2 + i pipett lösning för att studera inåt rätande K + kanaler. Tabell 2 visar exempel på lösnings recept) och/eller farmakologisk hämning av potentiellt kontaminerande strömkällor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flera fotografier som visar olika vyer av MPP-flödeskammaren på Mikroskop stadiet (övre panelen) och en schematisk representation av MPP-flödeskammaren (nedre panelen) visas i figur 1. Den schematiska Detaljer dimensionerna av hela enheten och flödes kammaren. Figur 2 visar ett fotografi av gravitationens per fusions system till MPP-flödeskammaren i vårt laboratorium (övre panelen). Också visat är en schematisk representation av flödes systemet (botten panel) avsedd att belysa de åtgärder som isolerar cellerna i flödet kammaren från rusa av lösningen från per fusions systemet och från kraften i vakuum avlägsnande av lösningen.
Ett kännetecken för mechanosensitive jonkanaler är en abrupt återgång till baslinjenivåer vid upphörande av mekanisk stimulans3,6,7. Figur 3 visar som ett exempel på att ta bort skjuvning stress stimulans under elektrofysiologiska inspelningar av Kir ström från en nyligen isolerad endotelial cell resulterar i en återgång till baslinje strömmar initialt registreras i ett statiskt bad. Den återgång till baslinjen nuvarande nivåer efter avslutad flöde till MPP kammaren inträffade inom tio sekunder av flödet upphörande.
Hela-cell (WC) elektrofysiologiska inspelningar, särskilt de som tas från nyligen isolerade celler, har ofta uppenbara läcka bakgrund strömmar som kan maskera kanal aktivitet. Vissa jonkanaler, såsom de i den inombords rätande K+ Channel-familjen, har biofysiska egenskaper som gör det möjligt att subtrahera läckan bakgrunds ström för mer exakt analys. Figur 4 visar som exempel processen från rådata (figur 4a) till Beräknad och plottad linjär Utläckan (figur 4b) till slutlig, läckagesubtrarerade representativa spår (figur 4c). Se en detaljerad förklaring för beräkning och subtrahera läcka från RAW perforerade WC patch inspelning i den medföljande legenden till figur 4.
Figur 1: MPP-flödeskammare och detaljerat schematiskt. Fotografier av den monterade MPP Flow Chamber (övre panelen) visar kammaren på mikroskopet scenen från tre olika vyer: den sida som visas under experiment (vänster), från perfusion inloppet (mitten), och från vakuum utlopp (höger) som är ur syn i fotografiet. Flödesriktningen är märkt i varje. Observera att jordledaren lätt kan passa in i en av de 2 mm slitsar när böjda i en 90 ° vinkel. En detaljerad Schematisk (nederst) visar exakta dimensioner för replikering av apparaten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: gravitationens per fusions system. En märkt fotografi av gravitationens per fusions system i vårt laboratorium visas i den övre panelen. Den två-steg MPP Flow Chamber och Gravity perfusion system beskrivs i bottenpanelen. Separationen av flödes kammaren som innehåller celler och de två övre och nedre reservoarerna belyses. Steg 1 tillåter lösning att flöda från den övre reservoaren av bit B till stycke D i kammaren där celler är seedade. Steg 2 tillåter lösning att flöda från stycke D ner till den nedre reservoaren, bit F. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa spår av skjuvinducerad strömaktivering av Kir-kanaler och återgång till baslinje nuvarande nivåer vid avlägsnande av flödet. En god positiv kontroll för mechanoactivation av jonkanaler är återgång till baslinjen nuvarande nivåer initialt observerats i ett statiskt bad vid upphörande av mekanisk stimulans. Invärdets rätande K+ (KIR) kanal strömmar aktiveras inom några sekunder genom skjuvning stress när gravitation lösning får flöda till MPP-flödeskammaren. Vid upphörande av flödet till kammaren, Kir strömmar snabbt tillbaka till baseline statiska nivåer observerats före flödet. En ramp på-140 mV till + 40 mV applicerades på plåstret över 400 MS. bad lösningen innehöll 60 mM K+ och reverseringspotentialen var ~-20 MV. De representativa spåren genererades från en endotelcell nyligen isolerad från mus mesenteriala artärer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: exempel på läckage subtraktion för noggrann analys av mechanoactivated Kir ström. (A) representativ obehandlad registrering av Kir ström från en primär mus mesenterisk endotelcell med anmärkningsvärd linjär utläckström (Iläcka). En ramp på-140 mV till + 40 mV applicerades på plåstret över 400 MS. bad lösningen innehöll 60 mM K+ och reverseringspotentialen var ~-20 MV. (B) jagläcka förhindrar analys av Real Kir Channel aktivitet. För att subtrahera jagläcka, först beräkna linjär lutning värmeledningsförmåga avi läcka (Glutning = (Ia-ib)/(Va-Vb)). Multiplicera Glutning med motsvarande spänningar av hela rå spår till Plot jagläcka på rådata. Linjen ska överlagra den yttre linjära läckan exakt. (C) subtrahera den plottade jagläcker från hela spåret så att den linjära utåt strömmen är ~ 0 pa/PF och den verkliga Kir ström kan analyseras. Observera i panel C att inåtgående Kir-strömmen är ungefär hälften så stor som den ursprungliga rådata spårningen i panel A. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Höjd (mm) | Bredd (mm) | Längd (mm) | Ytterligare information | ||
| Piece en | 8 | 80 | 98 | Innehåller ett hål på 3 mm diameter för inlopps per fusions slang (se tabell över material) och 53 mm x 60 mm rektangulärt utrymme för tillgång till mellersta stycken och celler | |
| Piece B | 1 | 80 | 98 | Innehåller ett blanksteg (20 mm diagonalt) under per fusions hålet i stycke A och tre 2 mm x 17 mm slits för åtkomst till celler | |
| Stycke C | 1 | 80 | 98 | Innehåller ett 22 mm x 50 mm utrymme där stycke D följs med hjälp av silikonelastomerlösningen (se tabell över material) | |
| Stycke D | 0,16 | 24 | 40 | Rektangulär glas glida botten av flödet kammaren | |
| Piece E | 5 | 80 | 120 | Innehåller en 45 mm x 50 mm utrymme för att möjliggöra visualisering av celler på stycke D. Ett 20 mm x 45 mm utrymme finns för reservoarens vakuum utlopp, stycke F, som ska följas | |
| Piece F | 0,16 | 24 | 50 | Rektangulär glas glida botten av vakuum utlopp reservoar | |
| Monterade MPP | 15 | 80 | 120 | Flödes kammaren separeras från inlopps perfusion och utlopp vakuum med två steg för att undvika störningar av väldefinierade laminär skjuvning | |
| Flödes kammare monterad MPP | 1 | 22 | 42 | Stycke D är glas Skjut botten av flödes kammaren | |
Tabell 1: mått på MPP (monterad och demonterad) och ytterligare information som är specifik för varje del av anordningen.
| Lösning | Recept (i mM) | Ph | ||
| Dissociation | 55 NaCl, 80 na-Glutamat, 6 KCl, 2 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 glukos, 10 Hepes | 7,3 | ||
| (Cell isolering) | ||||
| Bad (elektrofysiologi) | 80 NaCl, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 glukos, 10 Heper | 7,4 | ||
| Pipett (elektrofysiologi) | 5 NaCl, 135 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl2,5glukos, 10 Heper | 7,2 | ||
Tabell 2: exempel på lösningar med recept som används i experimenten.
| Protokoll för endotelcellisolering | Referenser | |
| Cocktail av neutral proteas och elastase (0,5 mg/mL vardera; 1 h vid 37 ° c) följt av kollagenastyp I (0,5 mg/mL; 2,5 min) | 6, 7 | |
| Skonsam mekanisk skrapning av en 5-cm2 region belägen vid den inre väggen i fallande bröstkorg aorta | 11 | |
| Na | 17 | |
| Na | 3 | |
| Kollagenastyp IA (1 mg/mL) i 14 min vid 37 ° c | 8 | |
Tabell 3: metodik för att studera mekanankänsliga jonkanaler med elektrofysiologiska metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det vaskulära systemet utsätts ständigt för aktiva hemodynamiska krafter, som aktiverar mechanosensitive jonkanalerna3,22 , men de fysiologiska rollerna hos dessa kanaler i skjuvning stressinducerad meanotransduktion är endast börjar dyka upp4,6,8. Mekanismerna som ansvarar för mechanosensitiviteten hos skjuvspännings aktiverade kanaler är fortfarande okända. Det protokoll som beskrivs här beskriver metoden för direkt utredning av mechanosensitive jonkanaler som utsätts för laminär skjuvning stress i realtid.
Det kritiska och nödvändiga steget i detta protokoll är användningen av en modifierad parallell plattans flödes kammare som har smala öppningar för att låta en Elektrofysiologisk pipett sänkas ner i kammaren och få tillgång till celler underflöde. Den allmänna principen för denna enhet är att om öppningarna är tillräckligt smala, kan fysiologiska skjuvning stress (upp till 15 dyn/cm2) uppnås utan lösning overflow på grund av ytspännings styrkor10. För att utföra dessa experiment framgångsrikt, är det viktigt: (i) att frö celler i området av bottenplattan som är direkt under öppningarna; II) upprätta en Giga-ohms tätning innan flödet påbörjas eller under mycket långsamma (< 0,01 dyn/cm2) bakgrunds flöde, III upprätthålla en stabil tätning samtidigt som man intensifierar flödet. Dimensionerna för den fyrdelade akryl apparat som används i vårt laboratorium tillhandahålls tillsammans med detaljerade scheman (figur 1) så att MPP-flödeskammaren och flödes systemet (figur 2) kan replikeras för användning i alla laboratorieundersökningar mekanankänsliga jonkanaler. Dessa dimensioner kan också ändras för att öka arean seedade av celler och för att ändra höjden på flödeskanalen, vilket skulle förändra förhållandet mellan flödet och skjuvspänningen. En sänkning av höjden på flödes kammaren skulle resultera i högre skjuvning stress för samma flöde, vilket kan vara fördelaktigt för att uppnå högre skjuvning spänningar. Kammaren kan också modifieras för att inkludera en flödes separationsbarriär som inducerar en lokal region av recirkulerande stört flöde23.
De stora fördelarna med att använda MPP Flow Chamber inkluderar (1) realtids utredning av skjuvaktiverade jonkanaler från endotelceller i kultur och celler som nyligen isolerats från vaskulär vävnad, (2) exponering av celler och respons från mekanankänsliga Jon kanaler till fysiologiskt relevanta nivåer av skjuvning stress, och (3) enkel montering och demontering med perfusion alternativ för experiment. När det gäller andra befintliga metoder, den enda andra metoden som gör det möjligt att utföra elektrofysiologiska inspelningar under väldefinierad skjuvning stress är seedning cellerna inuti en kapillär och sätta in inspelningspipett i kapilläröppningen, som gjordes i de tidiga studierna3,22. Det finns dock flera nackdelar jämfört med den metod som beskrivs här, såsom svårigheten att sådd celler i kapillärer, tillgång till ett mycket litet antal celler som är tillräckligt nära kapilläränden för att pipetten ska kunna nå dem, och flödes störningar i slutet av flödeskanalen (kapillär i detta fall). Var och en av dessa nackdelar gör det svårt att utföra elektrofysiologi underflöde i celler odlade i kapilläröppningen och praktiskt taget omöjligt att lappa eller till och med frö celler färskt isolerade från vaskulaturen. Det är också omöjligt att införa ett steg för att skapa ett område med stört flöde. Alla andra befintliga metoder som antingen använder öppna kammare24,25 eller puffing lösningar direkt på en cell17,18 inte efterlikna den hemodynamiska miljön i blodkärlet.
Den huvudsakliga begränsningen av denna metod är dock en begränsning för att uppnå skjuvning stress på högre nivåer av det fysiologiska intervallet. Specifikt, fysiologiska skjuvning stressnivåer har uppskattats att nå upp till 70 dyn/cm2 i friska artärer26. Däremot var den högsta skjuvning stressnivå som vi kunde uppnå i den nuvarande konfigurationen av kammaren 15 dyn/cm2, varefter ytspännings styrkor blir inte tillräckligt för att förhindra att lösningen att spilla ut av öppningarna10. Det är möjligt att minska höjden på flödeskanalen kan möjliggöra att uppnå högre skjuvning stressnivåer. Att upprätthålla en stabil Giga-ohm tätning under hög skjuvning stress är en annan utmaning, men framgången är rimligt med praxis. Vi fann att användning av perforerad patchteknik (inklusive det antibiotiska amfotericin B i pipettlösningen som beskrivits ovan) ger stabilare inspelningar än standardkonfigurationen för hela cellen. Dessutom, den MPP Flow kammare och lösningar som används inte exakt replikera skjuvning av blodflödet i artärer. Blod är en trögflytande, icke-newtonisk vätska som vi inte har replikerat i våra in vitro-experiment. Dessutom, den kammare som används här är en parallell kammare medan skjuvning stress i artärer är bäst beräknas med hjälp av formeln för skjuvning i en cylinder.
Det finns viktiga överväganden och begränsningar för att utföra en-kanals inspelningar under Flow. Denna metod är lämplig för en cellmonterad konfiguration (pipett fäst på membranet i en intakt cell), vilket ger stabila tätningar. Det är dock viktigt att vara medveten om att enstaka kanaler vars aktivitet spelas in inte direkt utsätts för skjuvning stress eftersom de är avskärmade med inspelningspipett, särskilt i den inifrån-ut konfigurationen27. Vi anser att de exciderade patchkonfigurationerna inte är de mest pålitliga när de används för att testa känsligheten hos jonkanalerna för att flöda eftersom det exciderade membranet vanligtvis dras in i inspelningspipetten och därmed inte utsätts för ett väldefinierat flöde.
När det gäller den typ av celler som kan användas i dessa experiment, vaskulära endotelceller representerar den mest tillämpliga celltypen att studera skjuvning stress och mechanosensitive kanalerna. Tidigare studier fokuserade främst på odlade endotelceller3,28 som är lätt tillgängliga. Vi har testat och utökat användningen av denna metod för att endotelceller nyisolerade från mus resistens artärer6,7. Andra celltyper bör definitivt övervägas. Vaskulära glatta muskelceller, till exempel, kan bli utsatt för skjuvning stress under sjukdomstillstånd där endotelet har skadats och avlägsnas29,30. Detta är ett spännande område av studier där mechanosensitive kanaler som bor i glatt mus kula, som annars skulle vara opåverkad av skjuvning stress, skulle nu bidra till potentiellt patofysiologiska sjukdomsmekanismer. Dessutom är transfektion av fordonets cellinjer som HEK eller CHO med genen kodning kanalen av intresse en utmärkt plattform för biofysiska analyser av kanaler i kombination med användning av MPP Flow Chamber.
Det är också viktigt att notera att medan den ursprungliga avsikten för MPP Flow Chamber var för realtid utredning av Jon kanals mechanoactivation, kan tillämpningen av enheten sträcka sig bortom detta mål. Specifikt, samma metod kan användas för studier som använder elektrod sensorer, såsom en kväveoxid (NO) sensor för att bestämma frisläppandet av NO som svar på skjuvning stress. Därför tillhandahåller vi en generell metod för dem med intresse av att undersöka mekaniskt reglerade biologiska processer i realtid och främja ytterligare modifiering av MPP-kammaren för att tillgodose specifika forskningsbehov för dem som studerar mechanosensitive processer i en mängd olika områden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Heart, lung, och Blood Institute (R01 HL073965, IL) och (T32 HL007829-24, ISF). Författarna skulle också vilja erkänna den vetenskapliga maskin butiken vid University of Illinois i Chicago för att skapa våra senaste MPP Flow Chambers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 G syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| Elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| Neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
