Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

الشاشات الوراثية المجمعة المستندة إلى كريسبر في خلايا الثدييات

Published: September 4, 2019 doi: 10.3791/59780
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2,3
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

توفر تقنية CRISPR-Cas9 طريقة فعالة لتحرير الجينوم الثدييات بدقة في أي نوع من أنواع الخلايا وتمثل وسيلة جديدة لأداء الشاشات الوراثية على نطاق الجينوم. ويرد هنا بروتوكول مفصل يناقش الخطوات اللازمة للنجاح في أداء شاشات كريسبر-كاس9 المجمعة على نطاق الجينوم.

Abstract

وقد أدى تحرير الجينوم باستخدام نظام كريسبر-كاس إلى تقدم كبير في القدرة على تحرير الجينومات من مختلف الكائنات الحية بدقة. وفي سياق خلايا الثدييات، تمثل هذه التكنولوجيا وسيلة جديدة لإجراء شاشات جينية على نطاق الجينوم من أجل دراسات علم الجينوم الوظيفية. تسمح مكتبات الإرشاد RNAs (sgRNA) التي تستهدف جميع إطارات القراءة المفتوحة بتوليد الآلاف من الاضطرابات الوراثية السهلة في مجموعة واحدة من الخلايا التي يمكن فحصها لأنواع ظاهرية محددة لتوريط وظيفة الجينات والعمليات الخلوية في بطريقة غير متحيزة ومنهجية. توفر شاشات CRISPR-Cas للباحثين طريقة بسيطة وفعالة وغير مكلفة للكشف عن المخططات الوراثية للأنماط الظاهرية الخلوية. وعلاوة على ذلك، فإن التحليل التفاضلي للشاشات التي يتم إجراؤها في مختلف خطوط الخلايا ومن أنواع السرطان المختلفة يمكن أن يحدد الجينات الضرورية من حيث السياق في الخلايا السرطانية، مما يكشف عن الأهداف المحتملة لعلاجات محددة مضادة للسرطان. ويمكن أن يكون أداء الشاشات على نطاق الجينوم في الخلايا البشرية أمراً شاقاً، لأن ذلك ينطوي على معالجة عشرات الملايين من الخلايا ويتطلب تحليلاً لمجموعات كبيرة من البيانات. غالباً ما يتم تجاهل تفاصيل هذه الشاشات، مثل توصيف خط الخلية، واعتبارات مكتبة CRISPR، وفهم حدود وقدرات تقنية CRISPR أثناء التحليل. ويرد هنا بروتوكول مفصل للأداء الناجح للشاشات المجمعة على نطاق الجينوم CRISPR-Cas9.

Introduction

كريسبر-كاس، قصيرة لتتجمع بانتظام بين المسافات قصيرة باليندروميك وتكرار المرتبطة كريسبر، يتكون من بروتين nuclease واحد (على سبيل المثال، Cas9) في مجمع مع الحمض النووي الريبي دليل الاصطناعية (sgRNA). يستهدف هذا المركب الريبونوكليوبروتين إنزيم Cas9 للحث على فواصل الحمض النووي المزدوج ة في موضع جيني محدد1. يمكن إصلاح الفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل عن طريق إصلاح موجه ة (HDR) أو، بشكل أكثر شيوعًا، من خلال الانضمام النهائي غير المتجانس (NHEJ)، وهي آلية إصلاح عرضة للخطأ تؤدي إلى الإدراج و/أو الحذف (INDELS) التي تعطل في كثير من الأحيان وظيفة الجينات 1.كفاءة وبساطة كريسبر تمكن من مستوى لا يمكن تحقيقه من قبل من استهداف الجينوم الذي يتجاوز بكثير تقنيات تحرير الجينوم السابقة [أي، الزنك الاصبع nucleases (ZNF) أو الفاعل المنشط النسخ مثل nucleases ( TALENS)، وكلاهما يعاني من تعقيد التصميم المتزايد، وانخفاض كفاءة التغوط، والقيود في تحرير الجينات متعددة2].

وقد أتاح التطبيق البحثي الأساسي لتحرير الجينوم القائم على الحمض النووي الريبي من كريسبر بكفاءة وبتكلفة زهيدة للعلماء أن يستجوبوا بكفاءة وبتكلفة غير مكلفة وظائف الجينات الفردية وطبولوجيا شبكات التفاعل الجيني. وقد تعززت القدرة على أداء الشاشات الوظيفية على نطاق الجينوم إلى حد كبير باستخدام نظام كريسبر-كاس، لا سيما عند مقارنتها بتكنولوجيات الاضطراب الجيني السابقة مثل تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) وموت فخ الجينات. على وجه الخصوص، RNAi يعاني من آثار عالية خارج الهدف وضربة قاضية غير مكتملة، مما أدى إلى انخفاض الحساسية والخصوصية بالمقارنة مع كريسبر3،4،5،في حين أن أساليب فخ الجينات هي ممكنة فقط في haploid خلايا لشاشات فقدان وظيفة، والحد من نطاق نماذج الخلية التي يمكن استجوابها6. قدرة كريسبر على توليد الجينات كاملة خروج المغلوب يوفر نظام أكثر قوة بيولوجيا لاستجواب الأنماط الظاهرية متحولة، مع انخفاض مستوى الضجيج، والحد الأدنى من الآثار خارج الهدف والنشاط المستمر عبر الكواشف5. تتوفر الآن على نطاق واسع مكتبات CRISPR-Cas9 sgRNA التي تستهدف الجينوم البشري بأكمله، مما يسمح بتوليد الآلاف من الضربات الذاتية للجين في تجربةواحدة3و7و8و9 .

لقد قمنا بتطوير مكتبات فريدة من نوعها على نطاق الجينوم كريسبر-Cas9 sgRNA lentiviral تسمى مكتبات تورونتو خروج المغلوب (TKO) (المتاحة من خلال Addgene) التي هي المدمجة وتسلسل الأمثل لتسهيل شاشات الجينوم وظيفية عالية الدقة. أحدث مكتبة، TKOv3، تستهدف ~ 18،000 الجينات الإنسان البروتين الترميز مع 71،090 أدلة الأمثل لكفاءة التحرير باستخدام البيانات التجريبية10. بالإضافة إلى ذلك، TKOv3 متاح كمكتبة مكون واحد (LCV2::TKOv3، معرف Addgene #90294) التعبير عن Cas9 وsgRNAs على متجه واحد، مما يخفف من الحاجة إلى توليد خلايا ثابتة التعبير عن Cas9، مما يتيح ضرب على نطاق الجينوم عبر مجموعة واسعة من أنواع الخلايا الثدييات. TKOv3 هو متاح أيضا في ناقلات دون Cas9 (pLCKO2::TKOv3, معرف Addgene # 125517) ويمكن استخدامها في الخلايا التي تعبر Cas911.

يمكن أن يتعرض عدد الخلايا المحررة من CRISPR-Cas9 على نطاق الجينوم لظروف نمو مختلفة، مع وفرة sgRNAs مع مرور الوقت كمياً من خلال تسلسل الجيل التالي، مما يوفر قراءة لتقييم التسرب أو إثراء الخلايا ذات الجينات الوراثية التي يمكن تتبعها الاضطرابات. يمكن تسخير مكتبات كريسبر للخروج من الباب لتحديد الجينات التي تسبب، عند الاضطراب، عيوب ًا في اللياقة البدنية الخلوية، أو حساسية معتدلة للأدوية (مثل الجينات الحساسة أو المقاومة)، أو تنظم التعبير عن البروتين (مراسل، على سبيل المثال)، أو تكون مطلوبة لمعين وظيفة المسار والدولة الخلوية12،13،14. على سبيل المثال، شاشات اللياقة البدنية التفاضلية في خط الخلايا السرطانية يمكن تحديد كلمن استنفاد أو الحد من الأنكوجينيات والإثراء أو زيادة الجينات مثبطات الورم3،14،15. وبالمثل، يمكن استخدام جرعات وسيطة من الأدوية العلاجية تكشف عن كل من مقاومة المخدرات وجينات التوعية16،17.

وترد هنا بروتوكول فحص مفصل لفحص فقدان الوظائف على نطاق الجينوم CRISPR-Cas9 باستخدام مكتبات تورونتو للخروج من الباب العام (TKOv1 أو v3) في خلايا الثدييات من توليد المكتبات، وأداء الفرز إلى تحليل البيانات. على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم تحسينه للفرز باستخدام مكتبات تورونتو خروج المغلوب، فإنه يمكن تطبيقه وتصبح قابلة للتحجيم لجميع المكتبات تجمع كريسبر sgRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وينبغي أن تتبع التجارب المبينة أدناه المبادئ التوجيهية لمكتب الصحة والسلامة البيئيين التابع للمعهد.

1. مجمعة كريسبر sgRNA مكتبة لينفيروسيت تضخيم بلازميد

  1. تمييع مكتبة الحمض النووي البلازميد البلازميد الجاهز ة كريسبر إلى 50 نانوغرام/ميكرولتر في TE (على سبيل المثال، TKOv3).
  2. الكهربائي المكتبة باستخدام الخلايا الكهربائية المختصة. إعداد ما مجموعه أربعة تفاعلات الكهربائي كما هو موضح أدناه.
    1. إضافة 2 ميكرولتر من 50 نانوغرام /ميكرولتر مكتبة TKO إلى 25 ميكرولتر من الخلايا الكهربائية المذابة إلى cuvettes المبردة مسبقا (1.0 ملم) على الجليد.
    2. الكهربائي باستخدام الإعدادات المثلى المقترحة من قبل بروتوكول الشركة المصنعة. في غضون 10 ثانية من النبض، إضافة 975 درجة مئوية من الانتعاش المتوسطة (أو SOC المتوسطة) إلى كوفيت.
    3. نقل الخلايا الكهربائية إلى أنبوب الثقافة وإضافة 1 مل من الانتعاش المتوسطة. أنابيب الحضانة في حاضنة تهتز في 250 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
  3. إعداد لوحة تخفيف لtiter المكتبة وتقدير كفاءة التحول.
    1. تجمع جميع 8 مل من الخلايا المستردة ومزيج جيدا. نقل 10 ميكرولتر من الخلايا المجمعة إلى 990 ميكرولتر من الانتعاش المتوسطة لتخفيف 800 أضعاف وتخلط جيدا.
    2. لوحة 20 درجة مئوية من التخفيف على 10 سم مسخن مسبقا LB + carbenicillin (100 ميكروغرام / لتر) لوحة أجار. وهذا يؤدي إلى تخفيف 40،000 أضعاف من التحولات التي سيتم استخدامها لحساب كفاءة التحول.
    3. لوحة 400 درجة مئوية من الخلايا المستردة على كل لوحة عبر ما مجموعه 20 قبل تسخينها 15 سم LB + carbenicillin لوحات أجار. احتضان لوحات لمدة 14-16 ساعة عند 30 درجة مئوية.
      ملاحظة: النمو في هذه درجة الحرارة المنخفضة يقلل من إعادة التركيب بين تكرار المحطة الطرفية الطويلة (LTR)18.
    4. لحساب كفاءة التحويل، عد عدد المستعمرات على لوحة التخفيف 40،000 أضعاف (الخطوة 1.3.2). ضرب عدد المستعمرات التي تم عدها بـ 40,000 للحصول على العدد الإجمالي للمستعمرات على جميع اللوحات. المضي قدما إذا كان العدد الإجمالي للمستعمرات يمثل تغطية مكتبة تعادل الحد الأدنى من المستعمرات 200x لكل sgRNA (الأكثر الأمثل هو 500-1000x).
      1. على سبيل المثال، الحد الأدنى لعدد المستعمرة لمكتبة TKOv3 (71,090 sgRNA) هو 1.4 × 107، وهو ما يعادل 200x المستعمرات لكل sgRNA. إذا كان تمثيل المستعمرة غير كاف، قم بزيادة عدد البُرَسِّة في الخطوة 1.2 استناداً إلى عدد المستعمرات على لوحة التخفيف لتحقيق الحد الأدنى من تغطية المكتبة.
  4. حصاد المستعمرات كما هو موضح أدناه
    1. إلى كل لوحة 15 سم، إضافة 7 مل من LB + carbenicillin (100 ميكروغرام / لتر) المتوسطة، ثم كشط المستعمرات قبالة مع موزع الخلية. مع ماصة 10 مل، نقل الخلايا كشط في قارورة مخروطية معقمة 1 L أو زجاجة.
    2. مرة أخرى شطف لوحة مع 5 مل من LB + carbenicillin المتوسطة ونقل الحل إلى زجاجة.
    3. كرر لجميع لوحات لتجميع الخلايا من 20 لوحات في زجاجة معقمة.
  5. خلط الخلايا التي تم جمعها مع شريط تحريك لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) لتفريق كتل الخلية. نقل الخلايا إلى زجاجات الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي تزن مسبقا في 7000 × ز إلى البكتيريا بيليه، ثم تجاهل وسائل الإعلام.
  6. وزن بيليه الخلية الرطبة وطرح وزن زجاجة الطرد المركزي لتحديد الوزن النهائي للبيليه الرطب. تنقية الحمض النووي بلازميد باستخدام مجموعة تنقية بلازميد ماكسي أو ميجا النطاق اعتمادا على كمية من الكريات البكتيرية كل عمود يمكن معالجة.

2. على نطاق واسع كريسبر sgRNA مكتبة إنتاج فيروس لينتي

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في هذا القسم من البروتوكول في مرفق BSL2+ في خزانة السلامة الأحيائية من النوع A2 من الفئة الثانية.

  1. حساب عدد لوحات 15 سم المطلوبة لإنتاج الفيروس استناداً إلى تقدير أن 18 مل من الفيروس يتم حصادها عادة من لوحة واحدة 15 سم.
  2. إعداد الخلايا للمتدخلة عن طريق زرع خلايا التعبئة والتغليف HEK-293T في وسائل الإعلام نمو منخفض المضادات الحيوية (DMEM + 10٪ FBS + اختياري: 0.1X القلم / العقديات) في 8 × 106 خلايا لكل لوحة 15 سم في 20 مل من وسائل الإعلام. حضانة الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. تأكد من أن الخلايا المطلية هي 70٪ -80٪ مترافقة وتنتشر بالتساوي في لحظة من التغوط.
  3. في اليوم التالي، قم بإعداد ثلاثة خليط بلازميدات الانفعلى النحو المبين في الجدول 1 للوحات 15 سم. حساب كمية البلازميد اللازمة للمغيرات واحد وجعل مزيج من بلازميدات لعدد من لوحات، بالإضافة إلى واحد ليتم نقلها.
  4. إعداد كاشف الانف القابل للتغوط القائم على الدهون لكل عملية نقل على النحو المبين في الجدول 2. خفضت Aliquot وسائل الإعلام المصل في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 مل الفردية لعدد من لوحات ليتم نقلها. يُضاف كاشف الإنفذيب، ويُمزج برفق، ويُحضن لمدة 5 دقائق في RT.
  5. بعد 5 دقائق الحضانة، إضافة كمية الحمض النووي المطلوبة لالتغوط واحد إلى كاشف التغوط لنسبة 3:1 من الكاشف transfection إلى ميكروغرام من مجمع الحمض النووي. يُمزج المزيج برفق والحضانة لمدّة 30 دقيقة في RT.
    ملاحظة: يمكن إعداد عمليات التغوط اللاحقة في مجموعات من خمسة أو أقل، مع فواصل 5 دقائق لتحسين الوقت وتجنب الإفراط في الحضانة.
  6. بعد 30 دقيقة من الحضانة، نقل بعناية كل مزيج transfection إلى كل لوحة من خلايا التعبئة والتغليف. أضف المزيج بأكمله باستخدام طرف ماصة 1 مل في حركة دائرية متعرجة دون إزعاج الطبقة الأحادية للخلية. حضانة الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة في 5٪ CO2.
  7. إعداد وسائل الإعلام الحصاد الفيروسي: 500 مل من DMEM المتوسطة + 32 مل من مخزون BSA (20 غرام / 100 مل، حل في DMEM، وتصفيتها مع فلتر 0.22 م) + 5 مل من 100X القلم / العقدية.
  8. بعد 18 ساعة، إزالة وسائل الإعلام (استخدام المناولة السليمة من النفايات لينتيفيروس مثل الحضانة في 1٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 30 دقيقة قبل التخلص منها). استبدال بلطف مع 18 مل من وسائل الإعلام الحصاد الفيروسي إلى كل لوحة. حضانة الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة في 5٪ CO2.
  9. بعد 24 ساعة، تحقق من خلايا التعبئة والتغليف للمورفولوجيا غير طبيعية وتنصهر كمؤشر على إنتاج الفيروس جيدة. ثم، حصاد الفيروس اللين عن طريق جمع كل supernatant ونقل هافين إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطية العقيمة.
  10. تدور وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس في 300 × ز لمدة 5 دقائق وبيليه خلايا التعبئة والتغليف. Aliquot supernatant في أنبوب البولي بروبلين المعقمة دون إزعاج بيليه.
  11. تخزين الفيروس في 4 درجة مئوية لفترات قصيرة (أقل من 1 أسبوع) أو على الفور في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. Aliquot فيروس على نطاق واسع تستعد لأحجام استخدام واحد للتخزين على المدى الطويل لتجنب تجميد / ذوبان.

3- توصيف خط الخلية للفحص

  1. حدد خط الخلية المطلوب.
    1. قياس وتسجيل الوقت تقريبا مضاعفة من الخلايا.
    2. تحديد كثافة طلاء الخلايا المثلى لخلايا الزراعة كل 3-4 خلايا تتضاعف في وعاء زراعة الأنسجة المفضل (على سبيل المثال، لوحات زراعة الأنسجة 15 سم).
  2. تحديد تركيز البورومسين لاستخدامه في خط الخلية المطلوب لاختيار مكتبات TKO التي تحتوي على علامة مقاومة البوروميسين على النحو التالي:
    1. خلايا البذور في لوحة بئر 12 في الكثافة المطلوبة للوصول إلى التقاء بعد 72 ساعة، ثم حضانة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
    2. في اليوم التالي، تغيير إلى وسائل الإعلام التي تحتوي على مجموعة تخفيف تركيزات البورومسين من 0 ميكروغرام / مل إلى 10 ميكروغرام / مل، في زيادات 0.5 ميكروغرام / مل. حضانة الخلايا لمدة 48 ساعة.
    3. بعد 48 ساعة، قياس صلاحية الخلية عن طريق عد الخلايا أو تلطيخ alamarBlue.
    4. تحديد أدنى تركيز يقتل 100% من الخلايا في 48 ح. استخدم هذا التركيز لتحديد مجموعات الخلايا المستحثة لمكتبة كريسبر في الخطوتين 4-6 و5-2-6.
      ملاحظة: بالنسبة لخطوط الخلايا مع أوقات مضاعفة أطول، يمكن التسامح مع الحضانة أطول مع البوروميسين. في هذه الحالات، حدد منحنى القتل لوقت الحضانة المطلوب لمضاعفة الخلية <3. تقليل وقت الاختيار لتجنب تسرب الجينات الأساسية قبل بدء الفحص.
  3. فحص الخلايا للتأكد من حساسيتها لبروميد سداسي الديميثرين (حتى 8 ميكروغرام/مل) عن طريق إجراء منحنى استجابة للجرعة بنفس الطريقة المستخدمة لقياس حساسية البورومسين (الخطوة 3-2). إذا لوحظت سمية مع <8 ميكروغرام/مل من بروميد سداسي الديمثيرين، لا تستخدم.

4. المعايرة الوظيفية لمكتبة فيروس لينتي كريسبر المجمعة لتحديد وزارة الداخلية

  1. قم بذوبان مجموعة جديدة من الـ 100 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000
  2. تصميم سلسلة من وحدات تخزين الفيروس لاختبار ما بين نطاق 0-2 مل (أي 0 مل، 0.25 مل، 0.5 مل، 1 مل، و 2 مل).
  3. حصاد الخلايا المستهدفة وخلايا البذور في لوحات 15 سم في الكثافة المطلوبة للوصول إلى التقاء في 72 ساعة.
  4. لكل حجم فيروس ليتم اختبارها، وإعداد لوحات مكررة. إضافة الخلايا، والفيروس، وبروميد سداسي الديمثيرين (8 ميكروغرام/مل)، والوسائط إلى حجم نهائي قدره 20 مل. لوحات مزيج تماما، والجلوس مستوى لوحات في حاضنة وحضانة لمدة 24 ساعة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
  5. بعد 24 ساعة، إزالة الفيروس الذي يحتوي على وسائل الإعلام والتخلص (استخدام احتياطات السلامة البيولوجية للتعامل مع النفايات lentivirus). اختياريا، غسل بلطف لوحة مع PBS الدافئة لإزالة الفيروس الدخيل.
  6. لكل حالة فيروس، يستعاض عن 20 مل من الوسائط التي تحتوي على البورومسين باستخدام التركيز المحدد لقتل الخلايا في القسم 3، إلى لوحة واحدة تكرار. إلى لوحة أخرى، إضافة 20 مل من وسائل الإعلام الطازجة دون البورومسين. حضانة لمدة 48 ساعة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
  7. بعد 48 ساعة، تحقق من أن جميع الخلايا غير المصابة (0 مل حالة الفيروس) تعامل مع البورومسين قد لقوا حتفهم. حصاد جميع لوحات على حدة وتفريق الخلايا عن طريق الأنابيب لطيف المتكررة.
  8. عد الخلايا من جميع اللوحات وحساب وزارة الداخلية لكل حجم الفيروس عن طريق مقارنة عدد الخلايا مع اختيار البورومسين إلى عدد الخلايا دون البوروميسين (أي + / - بورومسين).
  9. نتائج الرسم البياني لتحديد حجم الفيروس الذي يؤدي إلى 30٪ -40٪ بقاء الخلية مع اختيار البوروميسين مقابل دون البوروميسين. استخدم حجم الفيروس هذا لتحقيق وزارة الداخلية من 0.3-0.4 أثناء الشاشة تحت نفس ظروف زراعة الأنسجة.

5. عدوى الشاشة الأساسية، واختيار، وتمرير الخلية

  1. حدد تغطية مكتبة كريسبر sgRNA ليتم الاحتفاظ بها في جميع أنحاء الشاشة (يوصى بالحد الأدنى 200 ضعف).
    1. استناداً إلى تغطية المكتبة، حدد عدد الخلايا المطلوبة للحفاظ على هذه التغطية لكل sgRNA وعدد الخلايا المطلوبة للعدوى في وزارة الداخلية 0.3(الجدول 3).
    2. تحديد عدد اللوحات المطلوبة لإعداد العدوى(الجدول 4).
  2. إصابة الخلايا بمكتبة كريسبر
    1. حصاد الخلايا والبذور رقم الخلية المطلوبة لكل لوحة 15 سم.
    2. يُضاف بروميد سداسي الديمثيرين (8 ميكروغرام/مل) إلى جميع الأطباق.
    3. إضافة الفيروس في وحدة التخزين المطلوبة لMOI 0.3 إلى الفرز ولوحات التحكم 2. للتحكم 1 لا تقم بإضافة فيروس واستبدال وحدة التخزين هذه مع الوسائط.
    4. مزيج لوحات جيدا عن طريق إمالة. وضع لوحات في حاضنة، والتأكد من أنها على مستوى.
      ملاحظة: يمكن أن يتم العدوى دفعة عن طريق الجمع بين مزيج رئيسي من الفيروس، وسائل الإعلام، وبروميد هيكساديميثيرين إلى الخلايا في تعليق قبل الطلاء.
    5. إزالة وسائل الإعلام واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة التي تحتوي على البورومسين في التركيز المحدد في الخطوة 3.2.4 إلى فحص والسيطرة 1 لوحات 24 ساعة بعد العدوى بالفيروس. إضافة وسائل الإعلام الطازجة مع عدم وجود البورومسين إلى لوحة التحكم 2. حضانة الخلايا لمدة 48 ساعة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
    6. 48 ح بعد إضافة البورومسين، تأكد من أن جميع الخلايا غير المصابة ميتة (السيطرة 1) لتأكيد نشاط البورومسين، ثم حصاد الخلايا المصابة.
  3. حصاد خلايا مصابة وتمرير الخلايا
    1. حصاد الخلايا التي اختارها البورومسين من جميع لوحات الفحص في حاوية معقمة واحدة. جمع الخلايا من كل لوحة التحكم على حدة. تفريق الخلايا عن طريق الأنابيب المتكررة لطيف.
    2. عد الخلايا من خلايا الفحص المجمعة، والتحكم 1، والتحكم في 2 بشكل منفصل وحساب عدد الخلايا لكل 1 مل.
    3. حساب وزارة الداخلية وأضعاف التغطية التي تحققت على النحو التالي:
      Equation 1
      Equation 2
    4. جمع ثلاثة نسخ من الكريات الخلية من الخلايا المجمعة في تغطية المكتبة المختارة لاستخراج الحمض النووي الجينومي. الطرد المركزي الخلايا في 500 × ز لمدة 5 دقائق. تسمية الأنابيب وتجميد الجافة الكريات الخلية في -80 درجة مئوية (هذه هي عينات مرجعية T0).
    5. تقسيم مجموعة الخلايا المصابة إلى ثلاث مجموعات نسخ متماثل (على سبيل المثال، نسخ A، نسخ B، نسخ متماثل C)، مع الحفاظ على تغطية المكتبة داخل كل تكرار. خلايا البذور في نفس كثافة البذر كما يمكن استخدامها عادة عند توسيعها. استخدم نفس عدد الخلايا لكل لوحة نسخ متماثل ونفس العدد الإجمالي للخلايا بين النسخ المتماثل.
    6. الاستمرار في مرور الخلايا وحصاد ثلاثة نسخ من الكريات الخلية من كل تكرار للخلايا المصابة مجمعة على النحو الوارد أعلاه، كل 3-8 أيام اعتمادا على خط الخلية، لمدة تصل إلى 15-20 الخلية مضاعفة. في كل ممر، حصاد الخلايا من جميع لوحات في كل مجموعة تكرار مع بعضها البعض (أي، يتم إعادة خلط جميع الخلايا من لوحات A تكرار معا، يتم إعادة خلط جميع الخلايا من لوحات B تكرار معا، وما إلى ذلك).
    7. تسمية كل بيليه مع الوقت (T) وتكرار تعيين. وهذا يتوافق مع عدد الأيام بعد T0 يتم جمع بيليه (على سبيل المثال، T3_A، T3_B، T3_C، الخ).
  4. لاختيار شاشات المخدرات السلبية، والسماح للخلايا لاسترداد لمرور واحد على الأقل بعد T0 قبل العلاج. في T3 أو T6، تقسيم الخلايا من كل مجموعة تكرار (A، B، C) إلى العلاج من المخدرات والسيطرة على السكان، وذلك باستخدام نفس كثافة البذر المستخدمة في الخطوة 5.3.5.
    1. بشكل منفصل تجميع عدد الخلايا المطلوبة لتغطية المكتبة لكل تكرار في مجموعة العلاج من المخدرات. إضافة الدواء في تركيزات وسيطة (IC20-IC50). بذور الخلايا والحضانة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2)حتى مرور المقبل.
    2. بشكل منفصل تجمع عدد الخلايا المطلوبة لتغطية المكتبة لكل تكرار في مجموعة التحكم في السيارة. إضافة التحكم في السيارة باستخدام نفس حجم المخدرات (<0.5% v/v). بذور الخلايا والحضانة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2)حتى الممر التالي.
    3. الاستمرار في مرور الخلايا وحصاد الكريات الخلية للحمض النووي الجينومي كل 3 أيام كما هو موضح في الخطوة 5.3.5، في حين تحديث الدواء أو السيارة في كل ممر.
  5. لاختيار إيجابي أو شاشات مقاومة المخدرات، وتقسيم كل مجموعة تكرار وفقا لعدد الخلايا المطلوبة لتغطية المكتبة. إضافة IC90 تركيزات المخدرات إلى كل تكرار. في IC90، سيتم قتل غالبية الخلايا. السماح للسكان المقاومين بالنمو وجمع كريات الخلايا (1-2 × 107 خلايا) لاستخراج الحمض النووي الجينومي.

6. كريسبر إعداد العينة وتسلسل

  1. تنقية الحمض النووي الجينومي
    1. احتضان الكريات الخلية المجمدة لمدة 5-10 دقيقة في RT للذوبان.
    2. إضافة 1.4 مل من PBS إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على بيليه الخلية. دوامة لمدة 20 ق لإعادة تعليق الخلايا والراحة لمدة 1 دقيقة. إذا لزم الأمر، ماصة 15X مع P1000 لتفريق كتل الخلية المتبقية. إذا نقل الخلايا من أنبوب 15 مل أو 1.5 مل، إعادة تعليق الخلايا مع 1 مل من PBS، ثم نقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل وشطف الأنبوب الأصلي مع 400 درجة مئوية من PBS.
    3. إضافة 5 مل من محلول الليسيس النووي إلى الخلايا التي تم تعليقها. باستخدام ماصة 10 مل، مزيج العينة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 5X.
    4. إضافة 32 ميكرولتر من RNase A (20 ملغ/مل؛ للحصول على تركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام/مل) إلى الليسات النووية وخلط العينة عن طريق عكس الأنبوب 5X. تحضن الخليط في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة والسماح للعينة لتبرد لمدة 10 دقائق في RT.
    5. إضافة 1.67 مل من محلول هطول الأمطار البروتين إلى lysate ودوامة بقوة لمدة 20 ق. كتل البروتين الصغيرة قد تكون مرئية بعد الخلط.
    6. الطرد المركزي في 4500 × ز لمدة 10 دقائق في RT.
    7. باستخدام ماصة 10 مل، نقل supernatant إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على 5 مل من isopropanol. خلط بلطف الحل 10X عن طريق الانعكاس حتى يتم ملاحظة الحمض النووي.
      ملاحظة: يمكن ملاحظة الحمض النووي كخيوط بيضاء تشبه الخيط تشكل كتلة مرئية.
    8. الطرد المركزي في 4500 × ز لمدة 5 دقائق في RT لبيليه الحمض النووي.
    9. باستخدام ماصة 10 مل، وإزالة بعناية supernatant وتجنب خلع بيليه الحمض النووي. إضافة 5 مل من الإيثانول 70٪ في RT إلى الحمض النووي. تدوير بلطف أنبوب لغسل بيليه الحمض النووي والجانبين من أنبوب الطرد المركزي.
    10. الطرد المركزي في 4500 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
    11. باستخدام ماصة 10 مل، وإزالة بعناية الإيثانول 70٪ وتجنب خلع بيليه الحمض النووي. الحمض النووي الجينومي الجاف لمدة 10 دقائق في RT.
    12. إضافة 400 درجة مئوية من حل TE إلى الأنبوب والسماح للحمض النووي تذوب عن طريق الحضانة في 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إذا كان الحمض النووي لا يذوب تماما، وحضانة أنبوب في 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة إضافية في حين نفض الغبار بلطف الأنبوب كل 15 دقيقة، وتركها في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    13. الطرد المركزي في 4500 × ز لمدة دقيقة واحدة في RT ونقل الحمض النووي الجيني إلى أنبوب 1.5 مل منخفضة ملزمة.
    14. قياس وقياس نقاء الحمض النووي الجينومي على كل من مقياس الطيف الضوئي (لإجمالي محتوى الحمض النووي) ومقياس الفلور (لمحتوى الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل).
  2. اختياريا، يعجل الحمض النووي الجينومي إذا كان هناك مشاكل مع تضخيم PCR المصب من sgRNA على النحو التالي.
    1. نقل 400 ميكرولتر الحمض النووي الجينومي في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل.
    2. إضافة 18 ميكرولتر من 5 M NaCl (التركيز النهائي من 0.2 M) و 900 درجة مئوية من الإيثانول 95٪.
    3. عكس أنبوب 10X حتى مختلطة تماما، ثم الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في RT.
    4. إزالة بعناية supernatant وتجنب خلع بيليه الحمض النووي. غسل بيليه الحمض النووي مع 500 درجة مئوية من الإيثانول 70٪. تدوير بلطف أنبوب لغسل بيليه الحمض النووي.
    5. الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
    6. إزالة بعناية supernatant وتجنب خلع بيليه الحمض النووي. الحمض النووي الجينومي الجاف لمدة 10 دقائق في RT.
    7. إضافة 300 درجة مئوية من TE لإذابة الحمض النووي كما هو موضح في الخطوات 6.1.12.
    8. تحديد وقياس نقاء الحمض النووي الجينومي على النحو المبين في الخطوة 6-1-14.
  3. إعداد مكتبة تسلسل كريسبر
    1. إعداد PCR 1 على النحو المبين في الجدول 5 باستخدام ما مجموعه 100 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي. إضافة 3.5 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي لكل رد فعل 50 ميكرولتر وإعداد ردود فعل متطابقة 50 ميكرولتر لتحقيق التغطية المطلوبة. يسرد الجدول 6 أمثلة للتسلسلات التمهيدية لتضخيم مكتبات التسلسل LCV2::TKOv3. يسرد الجدول 7 أمثلة للتسلسلات التمهيدية لتضخيم مكتبات التسلسل pLCKO2::TKOv3.
    2. تضخيم تفاعلات PCR 1 في دراجة حرارية باستخدام البرنامج المبين في الجدول 8.
    3. تحقق من تضخيم PCR 1 عن طريق تشغيل 2 ميكرولتر من منتج PCR على هلام أغاروز 1٪. PCR 1 ينتج منتج من 600 نقطة أساس.
    4. تجمع جميع ردود الفعل الفردية 50 درجة مئوية لكل عينة الحمض النووي الجينومي ومزيج من دوامة.
    5. إعداد تفاعل PCR 2 واحد (50 ميكرولتر) لكل عينة على النحو المبين في الجدول 9 باستخدام 5 ميكرولتر من منتج PCR 1 المجمع كقالب. استخدم تركيبات التمهيدي ة الفريدة لكل عينة فردية للسماح بتجميع عينات مكتبة التسلسل.
    6. تضخيم تفاعل PCR 2 في دراجة حرارية باستخدام البرنامج المبين في الجدول 10.
    7. تنظيف معدات هلام أغاروز لتنقية المنتجات تضخيم مع 0.1 N حمض الهيدروكلوريك لمدة 10 دقيقة قبل صب هلام. إعداد هلام أغاروز 2٪ تحتوي على وصمة عار الحمض النووي لتنقية PCR 2 تضخيم المنتجات.
    8. تشغيل المنتج PCR 2 على هلام أجاروز 2٪ في الجهد المنخفض (1.0-1.5 ساعة تشغيل). PCR 2 ينتج منتج من 200 نقطة أساس.
    9. تصور منتجات PCR على مضيء الضوء الأزرق. قم باستئصال النطاق 200 نقطة أساس وتنقية الحمض النووي من شريحة هلام أغاروز باستخدام مجموعة استخراج الجل. تحديد وقياس نقاء مكتبة التسلسل على كل من مقياس الطيف الضوئي ومقياس الفلور.
      ملاحظة: يتراوح تركيز مكتبة التسلسل المنقّي للجل النموذجي من 5-10 نانوغرام/ميكرولتر وغلة إجمالية تتراوح بين 150 و300 نانوغرام.
  4. تسلسل عالي الإنتاجية
    1. تسلسل مكتبات تسلسل CRISPR على أجهزة التسلسل من الجيل التالي.
    2. تسلسل مرجع عينات T0 في عمق القراءة أعلى من 400-500 أضعاف تغطية المكتبة. تسلسل عينات الوقت التجريبية للشاشات المنسدلة في عمق القراءة على الأقل من 200 أضعاف. بالنسبة لشاشات الاختيار الإيجابية القوية، يكفي الحد الأدنى من عمق القراءة من تغطية 50 ضعفًا لتحديد sgRNAs المخصب.
      ملاحظة: من الضروري تسلسل نموذج T0 لتحديد تمثيل المكتبة لشاشة معينة و تكون مرجعاً لتحديد التغييرات أضعاف sgRNA مع مرور الوقت.

7 - تحليل البيانات

  1. محاذاة التسلسل باستخدام برامج مثل Bowtie لتعيين تسلسل يقرأ إلى المكتبة المرجعية باستخدام المعلمات التالية: -v2 (السماح اثنين من عدم التطابق) و -m1 (تجاهل أي قراءة التي تم تعيينها إلى أكثر من تسلسل واحد في المكتبة).
  2. تطبيع عدد القراءات المعينة بشكل فريد لكل sgRNA لعينة معينة إلى 10 مليون قراءة لكل عينة كما يلي:
    Equation 3107
  3. حساب تغيير أضعاف log2 من كل sgRNA لكل تكرار في كل point timepoint (Tn) مقارنة مع نموذج T0 (Tn/T0). إضافة عدد زائف من 0.5 يقرأ إلى كافة عمليات قراءة عمليات التوقف لمنع الانقطاع عن الأصفار. استبعاد sgRNAs مع <30 يقرأ الخام في عينة T0 من حساب تغيير الطي وتحليل المصب.
  4. تحليل التغييرات أضعاف مع تحليل بايزي للجينات الأساسية (BAGEL) خوارزمية , باستخدام مجموعات التدريب الأساسية وغير الأساسية المحددة سابقا19 لشاشات أساسيات الجينات ( الجدول التكميلي S1) أو DrugZ لشاشات المخدرات20.
  5. حساب الدقة والاستدعاء لتقييم أداء الشاشة باستخدام درجات BF. استخدم المجموعة الأساسية من الخطوة 7.4 كقائمة إيجابية حقيقية لدالة precision_recall_curve مكتبة Scikit-learn لPython، جنباً إلى جنب مع المجموعة الفرعية درجة BF أعلاه. بدلاً من ذلك، تنفيذ نفس باستخدام حزمة PRROC في R.
  6. حساب متوسط تغيير أضعاف من جميع الأدلة لكل جين. توليد قطع أرض الكثافة للجينات الأساسية وغير الأساسية (انظر الخطوة 7.4) في R أو ما يعادلها من البرامج. في R، إذا كان x.ess هو متجه يحتوي على قيم تغيير أضعاف السجل للجينات الأساسية وx.nonEss تحتوي على جينات غير أساسية، رسم باستخدام الأمر التالي:
    مؤامرة (كثافة (x.ess)، xlab = "يعني logFC"، كول = "الأحمر"، lwd = 2 )
    خطوط (كثافة (x.nonEss)، كول = "الأزرق"، lwd = 2 )
    ملاحظة: للاطلاع على تفاصيل إصدار Python والحزم المستخدمة، راجع scikit-learn v0.19.1: (نشرت من قبل Pedregosa et al.21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نظرة عامة على سير عمل فحص كريسبر على نطاق الجينوم

يوضح الشكل 1 لمحة عامة عن تدفق أعمال فحص كريسبر المجمع، بدءاً من إصابة الخلايا المستهدفة بفيروس لينتي في مكتبة كريسبر في محطة وزارة الداخلية المنخفضة لضمان أحداث تكامل واحدة وتمثيل كاف ٍ للمكتبة (عادةً 200 إلى 1000 -أضعاف). بعد العدوى ، يتم علاج الخلايا بالبورومسين بالمضادات الحيوية لاختيار الخلايا المستحثة. بعد الاختيار، يتم جمع خط الأساس T0 خلية بيليه لتقييم توزيع المكتبة في بداية الفرز. أما الخلايا المتبقية، التي تتألف من مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات الوراثية، فتمر في تمثيل المكتبة المطلوب كل 3-4 أيام لمدة 15-20 مرة واحدة للسماح بتحرير الجينات وما يترتب على ذلك من آثار للظهور. عادة ما تضاف الشاشات مع علاجات المخدرات في T3 أو T6 بعد أن تعافى الخلايا من عدوى الفيروس واختيار البورومسين. يتم حصاد الخلايا في تمثيل المكتبة المطلوب في كل ممر للحمض النووي الجينومي، لتحديد وفرة الدليل من قبل الجيل القادم التسلسل في النقاط الزمنية المطلوبة.

من المستحسن جمع عينات متعددة في حالة حدوث أي ة فشل قد تحدث في خطوات إعداد مكتبة التسلسل المتلقين للمعلومات. الشاشات المجمعة هي عادة الاختبارات المستندة إلى الجدوى التي تم تصميمها إما لاختيار إيجابي أو سلبي من sgRNAs الأساسية. الشاشات الإيجابية تحديد الجينات التي تظهر المقاومة أو زيادة البقاء على قيد الحياة تحت ضغط اختيار محددة (على سبيل المثال، المخدرات أو خط الخلية متحولة). في هذه الحالة، سوف تموت معظم الخلايا من الاختيار، وسيتم إثراء الخلايا المتبقية لsgRNAs استهداف الجينات التي هي مقاومة للدواء أو الشرط الذي يجري اختباره. تحدد شاشات الاختيار السلبية أو شاشات "التسرب" الجين مع زيادة الحساسية أو فقدان البقاء على قيد الحياة تحت ضغط اختيار الشاشة. لتحديد الاضطرابات التي لها تأثير فينوتيبيك مثل عيب النمو، يتم قياس وفرة دليل في كل نقطة زمنية من خلال تسلسل الجيل التالي ومقارنتها T0 لتقييم التسرب أو إثراء الأدلة على مدار الشاشة. باستخدام منصات التحليل، يتم قياس التغييرات أضعاف السجل للأدلة، ويمكن تطبيق خوارزميات مثل BAGEL لتمكين ترتيب الزيارات الجينية.

تضخيم المكتبة والحفاظ على تمثيل المكتبة في شاشات كريسبر المجمعة

ويوضح الشكل 2 التوزيع المتوقع للأدلة بعد تضخيم مكتبة البلازميد. تتكون مكتبة TKOv3 من 71,090 sgRNAs مع أربعة sgRNAs لكل جين, تستهدف ~ 18,000 الجينات البروتين الترميز10. يجب أن يكون مكتبة مثالية كل sgRNA واحد ممثلة بكميات مماثلة. ولذلك، يوصى بتأكيد توزيع الأدلة في المكتبة الموسعة بواسطة الجيل التالي من التسلسل. تظهر هنا مكتبة مكبرة مع توزيع ضيق جدا من sgRNAs، مما يؤكد أن > 95٪ من جميع sgRNAs هي ضمن نطاق توزيع 4 أضعاف(الشكل 2). وسيشير توزيع أوسع للأدلة الواسعة الحجم إلى أن وفرة أدلة المكتبة غير ممثلة على قدم المساواة ويمكن أن تسهم في الضوضاء في الشاشات المجمعة.

تقييم أداء الشاشة

يوضح الشكل 3 أنه يمكن تقييم جودة أداء الشاشة من خلال تقييم توزيع تغيير الطي لجميع sgRNA مقابل قائمة مرجعية قياسية من الذهب (684 جين) وجينات غير أساسية (926 مورثة) وتصورها على أنها الدقة أذكر منحنيات10. باستخدام مجموعات المراجع القياسية الذهبية، يتم حساب درجات Bayes Factor (BF) لنقطة نهاية الشاشة، ويتم رسم منحنيات استدعاء الدقة. يتم حساب درجات BF عن طريق تحليل تغيير أضعاف السجل لجميع الأدلة التي تستهدف جين باستخدام إطار Bayesian (خوارزمية BAGEL الموصوفة سابقا19) لمقارنة توزيعات مجموعات الدليل الأساسية وغير الأساسية المعروفة. يتم اشتقاق معدلات الاكتشاف الكاذبة (FDR) تجريبياً باستخدام نفس مجموعات المراجع القياسية الذهبية. يجب على الشاشة عالية الأداء استرداد عدد كبير من الجينات الأساسية عند عتبة BF >6 و FDR <5%، كما يتضح من "الكوع" الحاد في معظم المنحنيات وخط مستقيم إلى نقطة المحطة الطرفية كما هو مبين من قبل الخط الأزرق في الشكل 3A. كما ينبغي دراسة تسرب الأدلة التي تستهدف الجينات الأساسية وغير الأساسية(الشكل 3 باء). يجب أن تظهر الأدلة التي تستهدف الجينات غير الضرورية المرجعية توزيعًا متماثلًا إلى حد كبير للتغييرات ذات الطي اللوغاري التي تتمحور عند الصفر، كما يتضح من الخط المتقطع في الشكل 3B. يظهر توزيع تغيير الطي للأدلة التي تستهدف الجينات الأساسية تحولاً سلبياً قوياً بالنسبة لتوزيع الأدلة التي تستهدف الجينات غير الأساسية، كما يتضح من الخط الصلب في الشكل 3B.

الجينات الأساسية

أحد التطبيقات الأساسية للشاشات المجمعة على نطاق الجينوم هو تحديد الجينات الأساسية. الجينات الأساسية، وهي فئة فرعية من جينات اللياقة البدنية، هي الجينات التي يسبب اضطرابها فتكا الخلايا، كما تعتبر فضفاضة كجينات الانتشار. في سياق بيولوجيا السرطان، من الممكن تحديد الضروريات الخاصة بالسياق من أجل تحديد التبعيات لخط خلية ورم معين. ويبين الشكل 4رتبة الجينات الأساسية باستخدام درجات "عامل بايز"، المستمدة من خوارزمية BAGEL. Bayes Factor (BF) يمثل مقياس ثقة بأن الجين يؤدي إلى عيب في اللياقة البدنية. وتشير الدرجات الأكثر إيجابية إلى زيادة الثقة في أن الاضطراب يسبب انخفاضا في اللياقة البدنية.

شاشة اختيار إيجابية

ويمكن زراعة برك الخروج على نطاق الجينوم في وجود عامل المخدرات الزائد للبحث عن جينات المثبطة/المقاومة. يظهر هنا مثال على خلايا HCT116 التي تم فحصها في وجود الثيميدين للبحث عن المثبطين من G1 / S اعتقال3. يمكن العثور على تفاصيل هذه الشاشة في منشور سابق3. باختصار، بعد 6 أيام من اختيار الخلايا المصابة مكتبة كريسبر، تم تقسيم الخلايا إلى تكرار الحفاظ على تغطية المكتبة وعلاجها مع الثيميدين. تم مرور الخلايا في وجود المخدرات حتى تم استعادة خلايا مقاومة وافرة لأخذ عينات الحمض النووي الجينومي. يمكن ترتيب الاختيارات الإيجابية (عمق القراءة) في تغطية أقل من الشاشات السلبية حيث أن جزء ًا صغيرًا فقط من الأدلة سيبقى بسبب الضغط الانتقائي القوي. في هذا المثال، تم الحصول على التسلسل مع عدد قليل من مليون قراءة، وتم استرداد 11 من 12 sgRNAs التي تستهدف كيناز الثيميدين (TK1) وإثراؤها كما هو متوقع(الشكل 5).

تم تحديد المبالغ على أساس نسبة الأضراس من 1:1:1
مكون المبلغ لكل لوحة 15 سم (أ)
LCV2::TKOv3 محمد الدوسري
محمد الدوسري 4.8 ميكروغرام 7.0 ميكروغرام
pMD2.G 3.8 ميكروغرام 4.0 ميكروغرام
TKOv3b 8.0 ميكروغرام 5.0 ميكروغرام
(أ) المبالغ المحددة على أساس تركيبة بلازميد الأكثر إنتاجية لمكتبة TKO بنسبة 1:1:1 الأضراس
(ب) كمية TKO بلازميد على أساس العمود الفقري ناقلات مكتبة كريسبر. LCV2 متجه الكل في واحد = 13 كيلو بايت, غير Cas9 pLCKO2 متجه = 7.6 كيلو بايت

الجدول 1: الكمية الموصى بها من البلازميد لـ TKOv3 transfection.

مكون المبلغ لكل لوحة 15 سم
أوبتي-ميم 800 درجة مئوية
كاشف الانتراب 48 ميكرولتر

الجدول 2: تركيب كاشف الانف القائم على الدهون.

تغطية قابلة للطي عدد الخلايا لكل sgRNAb  عدد الخلايا اللازمة للإصابةب(ب)
(حجم مكتبة sgRNA × أضعاف التغطية) (حجم مكتبة sgRNA × تغطية أضعاف ‹ 0.3 وزارة الداخلية)
200 1.5 × 107 5 x 107
500 3.6 × 107 1.2 × 108
1000 7.1 × 107 2.4 × 108
(أ) استنادًا إلى حجم مكتبة TKOv3 = 71,090 sgRNA
(ب) يتم تقريب الأرقام

الجدول 3: تحديد أرقام الخلايا اللازمة لعدوى مكتبة TKOv3 CRISPR وطلاء الخلايا في مختلف التغطية القابلة للطي.

العلاج عدد اللوحات اللازمة للإصابة
لوحات الفحص فيروس، + بورومايسين (حجم مكتبة sgRNA × 200 أضعاف) ‹ 0.3 MOI ‹ كثافة بذر الخلايا في العدوى = عدد الأطباقالمطلوبة
التحكم 1 لا يوجد فيروس، + بورومسين (0٪ السيطرة على البقاء على قيد الحياة) 1
التحكم 2 فيروس، + لا بورومسين (100٪ السيطرة على البقاء على قيد الحياة) 1
(أ) إدراج لوحات إضافية لاستيعاب تقلبات وزارة الداخلية ومعدلات النمو

الجدول 4: حساب إعداد العدوى.

الكواشف المبلغ لكل 1x رد فعل
2X ماستر ميكس 25 ميكرولتر
10 m PCR 1 LCV2 التمهيدي إلى الأمام 2.5 ميكرولتر
10 مل PCR 1 LCV2 التمهيدي العكسي 2.5 ميكرولتر
الحمض النووي الجينومي 3.5 ميكروغرام
المياه حتى 50 ميكرولتر
مجموع 50 ميكرولتر

الجدول 5: الإعداد PCR 1.

الجدول 6: التمهيديات PCR لتضخيم مكتبات التسلسل LCV2::TKOv3. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول 7: التمهيديات PCR لتضخيم مكتبات التسلسل pLCKO2::TKOv3. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

خطوه درجه الحراره الوقت
1 98 درجة مئوية 30 ثانية
2 98 درجة مئوية 10 ثوان 25 دورة (الخطوة 2 – 4)
3 66 درجة مئوية 30 ثانية
4 72 درجة مئوية 15 ثانية
5 72 درجة مئوية 2 دقيقة
6 10 درجة مئوية عقد

الجدول 8: بارامترات دورة PCR 1.

الكواشف المبلغ لكل 1x رد فعل
2X ماستر ميكس 25 ميكرولتر
10 mM i5 التمهيدي إلى الأمام 2.5 ميكرولتر
10 mm i7 عكس التمهيدي 2.5 ميكرولتر
PCR 1 المنتج 5 ميكرولتر
المياه 15 ميكرولتر
مجموع 50 ميكرولتر

الجدول 9: الإعداد PCR 2.

خطوه درجه الحراره الوقت
1 98 درجة مئوية 30 ثانية
2 98 درجة مئوية 10 ثوان 10 دورات (الخطوة 2 – 4)
3 55 درجة مئوية 30 ثانية
4 65 درجة مئوية 15 ثانية
5 65 درجة مئوية 5 دقائق
6 10 درجة مئوية عقد

الجدول 10: بارامترات دورة PCR 2.

الجدول التكميلي S1. TKO مجموعات الجينات المرجعية الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية لسير عمل الفحص المجمع. (أ)يتم إصابة السكان الخلايا المستهدفة مع مكتبة كريسبر lentivirus في وزارة الداخلية منخفضة لضمان أن معظم الخلايا تلقي التكامل الفيروسي واحد والحفاظ على تمثيل المكتبة. الألوان المختلفة تمثل sgRNAs مختلفة في كل الجسيمات الفيروسية. يتم تحديد تجمعات الخلايا المعدلة وراثيا. بمجرد اكتمال التحديد، يتم أخذ عينات من الخلايا للرجوع إلى T0 ويتم تمريرها تسلسلياً. (ب)في المقطع الأول بعد T0، وقد تعافى الخلايا من العدوى ويمكن إضافة علاجات المخدرات، إذا لزم الأمر. بعد العلاج، يتم مرور مجموعات الخلايا بشكل تسلسلي لعدة أسابيع. خلال كل ممر، يتم جمع الخلايا للحمض النووي الجينومي وإعادة زرعها في التغطية القابلة للطي المطلوبة لمكتبة sgRNA. (C)يمكن تنفيذ نوعين من الشاشات: 1) شاشات الاختيار الإيجابية، التي تحدد الخلايا المتحولة التي تظهر المقاومة أو زيادة البقاء على قيد الحياة تحت ضغط اختيار معين (على سبيل المثال، المخدرات أو خط الخلية متحولة)، كما سيتم إثراء خلال الشاشة ، وعندما كان هناك الكثير من ال أو 2) شاشات الاختيار السلبية، والتي تحدد الخلايا المتحولة مع زيادة الحساسية أو فقدان البقاء على قيد الحياة تحت ضغط اختيار الشاشة، كما أنها سوف تضيع خلال الشاشة. (د)يتم حصاد الحمض النووي الجينومي وتضخيم PCR لإثراء المناطق الإرشادية. (هـ)يتم تحديد وفرة الدليل كمياً من خلال تسلسل الجيل التالي، ويتم تحديد الأدلة المنضبة لتحديد "الضربة". الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: جودة مكتبة كريسبر sgRNA المكبرة. يتم تحليل بلازميدات المكتبة المكبرة بواسطة تسلسل الجيل التالي (القراءات الموصى بها: 30 مليون قراءة، وهو ما يقابل تمثيل المكتبة بمقدار 400 ضعف تقريبًا). تظهر هنا مكتبة ذات توزيع محكم لـ sgRNAs، مع >95% من جميع sgRNAs ضمن نطاق توزيع 4 أضعاف.  الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تقييم جودة الشاشة المتسربة باستخدام مجموعات مرجعية جينية أساسية قياسية بالذهب. (أ)تحليل الدقة استدعاء نتائج الفرز في استرداد الجينات الأساسية على عتبة BF >6 وFDR من 5٪. يتم تمثيل الشاشة عالية الأداء من قبل الخط الأزرق ويتم تمثيل الشاشات ذات الأداء المنخفض بواسطة الخط الأحمر. (ب)أضعاف تغيير توزيع sgRNA استهداف الجينات الأساسية (خط صلب) والجينات غير الأساسية (خطوط منقط). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحديد الأساسيات الجينية. Bayes عامل الترتيب من الجينات أساسا في شاشة معينة. Bayes Factor (BF) يمثل مقياس ثقة بأن الجين يؤدي إلى عيب في اللياقة البدنية. أعلى بايز العوامل تشير إلى زيادة الثقة في أن الجينات خروج المغلوب يؤدي في عيب اللياقة البدنية، (النقاط الحمراء). تشير درجات "عامل الخلجان السفلى" إلى أن الخروج من الباب العام يوفر ميزة النمو (النقاط الزرقاء). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: شاشة اختيار إيجابية لقمع كتلة الثيميدين في خلايا HCT116. يعد ّ قراءة عاديّة ل كلّ [سّرن] في [ت0] يخطّط ضدّ يعني عاديّة يقرأ حسابات ل [ثيميدين] يعامل عينات. لشاشات الاختيار الإيجابية (أي، باستخدام تركيز IC90 من المخدرات)، ومن المتوقع أن يكون عدد الاضطرابات التي من شأنها أن تضفي مقاومة للدواء صغيرة. لهذا السبب، يمكن أن يكون عمق القراءة أقل مما هو مطلوب للشاشات السلبية، في whch معظم المكتبة من المتوقع أن تكون ممثلة. يتم تدوير TK1 sgRNAs باللون الأحمر. تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نظرًا لبساطتها في الاستخدام والموثوقية العالية، فقد تم اعتماد تقنية CRISPR على نطاق واسع كأداة اختيار لتحرير الجينوم بدقة. يوفر فحص كريسبر المجمع طريقة لاستجواب الآلاف من الاضطرابات الوراثية في تجربة واحدة. في الشاشات المجمعة، تعمل مكتبات sgRNA كالباركود الجزيئي، حيث أن كل تسلسل فريد ويتم تعيينه إلى الجين المستهدف. من خلال عزل الحمض النووي الجينومي من سكان الخلايا، يمكن تحديد الجينات التي تسبب النمط الظاهري للاهتمام عن طريق قياس وفرة sgRNA من قبل تسلسل الجيل القادم. وتُستخدم أساليب التسلسل المتوازية على نطاق واسع لتحديد الـ sgRNAs في العينات، مما يعني أنه يمكن تجميع مجموعات خلايا مستقلة متعددة في نفس ممر التسلسل لتقليل التكلفة إلى أدنى حد.

وقبل الشروع في مشروع فرز واسع النطاق، من المهم أن يكون هناك نموذج يتميز بشكل جيد ومحسن من الناحية التقنية. الخلفية الوراثية، ومعدل النمو، وكفاءة التحويل هي عوامل هامة عند اختيار خطوط الخلايا الخاصة بك للفحص. فعلى سبيل المثال، ستحدد معدلات النمو وكفاءة التحرير قابلية التوسع والملاءمة التقنية للنموذج. من أجل تمثيل مكتبات sgRNA الكبيرة بشكل كاف، هناك حاجة إلى عشرات الملايين من الخلايا، وبالتالي يمكن أن يكون رقم الخلية عاملا ً مقيداً في فحص الجدوى لخطوط الخلايا مع مضاعفة أبطأ أو تلك التي ليس لديها قدرة انتشار جيدة (على سبيل المثال، الخلايا الأساسية). واستناداً إلى معدلات النمو، ينبغي اختيار ظروف زراعة الخلايا مثل كثافة بذر الخلايا وحجم اللوحة لفحصها وفقاً لذلك. فمن المستحسن لخلايا الثقافة في أكبر سفينة التي هي عملية ومجدية من الناحية التقنية للشاشة.

تختلف كفاءة تحويل فيروس لينتي بين أنواع الخلايا، حيث تختلف الخلايا في العدوى المتأصلة. ونتيجة لذلك، فإن حجم الفيروس اللازم لتحقيق عدوى كافية في نوع خلية واحدة لن يكون بالضرورة هو نفسه في خلية أخرى. ولذلك، من الأهمية بمكان أن تقوم كل دفعة من مكتبة فيروس اللين المنتجة في خط الخلية بفحصها لضمان تغطية كافية للمكتبة وأحداث نقل واحدة في معظمها لكل خلية عن طريق نقل كل من وزارة الداخلية إلى أقل من 0.3 (القسم 4). ويمكن أيضا أن تتأثر كفاءة الاندوسشن بظروف ثقافة الخلايا؛ لذلك، يجب تحديد titers الوظيفية باستخدام نفس شروط الخلية التي سيتم استخدامها في الشاشة. وهذا يعني، من المهم استخدام نفس الأوعية زراعة الأنسجة، ومكونات وسائل الإعلام وحجمها، وكثافة طلاء الخلايا، والإعدادية الفيروس دون ذوبان مسبق. والقياسات التي أجريت بأشكال أو شروط مختلفة لن تتدرج بشكل موثوق إلى شكل الفرز.

على الرغم من ميزة استخدام مكتبات دليل CRISPR-Cas9 الكل في واحد مثل LCV2::TKOv3، ترميز الجينات Cas9 كبير جدا، مما يجعل من الصعب حزم بكفاءة في الجسيمات الفيروسية (105-106 TU / mL). يمكن أن يكون تقديم أجهزة التئاب منخفضة من الـ lentiviral قيدًا على خطوط الخلايا التي يصعب تحويلها، حيث أنها سوف تواجه صعوبة أكبر مع مكتبات كل واحد كريسبر. وللتخفيف من حدة ذلك، ينبغي التعبير عن Cas9 في خط الزنزانة مسبقاً، يليه تسليم مكتبات كريسبر التي لا تحتوي إلا على sgRNAs (على سبيل المثال، pLCKO2::TKOv3)، والتي يمكن إجراؤها في أجهزة تحويل أعلى بكثير (107-108 TU/mL). كما أن وجود خط خلية مهم أيضاً، لأنه يحدد عدد المواقع المستهدفة التي تحتاج إلى تعديل. القدرة على توليد ضربات قاضية كاملة في الخلايا الهابلويد أكثر كفاءة مما كانت عليه في الخلايا مع نسخ متعددة من جين معين. لذلك، قد تكون الشاشات في الخلايا haploid أكثر حساسية وتسفر عن بيانات ذات جودة أعلى من الشاشات التي يتم تنفيذها في خطوط الخلايا ثنائية أو aneuploid6. سيساعد اختبار الجينات المعروفة المرتبطة بالنمط الظاهري في تحديد قدرة الشاشة لنموذج خط الخلية. على سبيل المثال، بالنسبة لشاشات الأساسيات، يمكن استخدام الأدلة التي تستهدف وحدة فرعية من بروتياسوم 26S، PSMD1 (Addgene: plasmid #74180)، وهو جين أساسي أساسي أساسي، لاختبار كفاءة التحرير وإمكانية العدوى لخطوط الخلايا، كاضطراب في PSMD1 سيؤدي إلى موت الخلية.

تعتمد متانة الشاشات المجمعة بشكل كبير على تمثيل sgRNA. هذا مقياس مهم يحدد أداء المكتبة أثناء الشاشة والقدرة على تحديد عدد الزيارات. تنوع المكتبات منحاز في تمثيل كل sgRNA; ولذلك، ينبغي أن يكون عدد الخلايا التي سيتم فحصها وتحليلها كبيرة بما فيه الكفاية لضمان القبض على sgRNAs ناقصة التمثيل6. 200-إلى 1000 أضعاف تمثيل كل sgRNA هو التغطية النموذجية التي تم استخدامها في الشاشات المنشورة (أي، 200-1000 خلية لكل sgRNA)10،15. وينبغي الحفاظ على هذا التمثيل عند تضخيم بلازميد المكتبة (القسم 1) وفي جميع أنحاء الشاشة عن طريق إصابة وتمرير رقم الخلية المطلوبة (القسم 5) لتمثيل تغطية المكتبة المطلوبة وأثناء التسلسل الإعداد (البروتوكول 6)، كما هو موضح في جميع أنحاء البروتوكول. على سبيل المثال، لتحقيق تغطية تبلغ حوالي 200 ضعف لمكتبة TKOv3 يتطلب اختيار وتمرير 15 مليون خلية مصابة. أثناء التسلسل، على افتراض أن الجينوم البشري ثنائي البليلويد يحتوي على حوالي 7.2 بيكوغرام من الحمض النووي و1 sgRNA لكل جينوم، مطلوب ما مجموعه 100 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي لتوليد مكتبة التسلسل ل15 مليون قراءة تسلسل. وسيتوقف قرار التغطية على حجم المكتبة، لأن تغطية المكتبات الكبيرة ستتطلب زراعة عدد أكبر من الخلايا التي يمكن أن يكون من الصعب صيانتها وغير عملية من الناحية التقنية. يوصى بتغطية لا تقل عن 200 ضعف مع مكتبات TKOv3، حيث يوفر 200 ضعف التوازن الأمثل بين لوجستيات فحص عدد كبير من الخلايا والحفاظ على نطاق ديناميكي كاف للكشف عن التسربات البيولوجية الحقيقية مع محدودية الضوضاء من استنفاد عشوائي22،23. سيؤدي تمثيلات المكتبة القابلة للطي العالي إلى تحسين قابلية التكرار وضمان وجود نافذة كافية للكشف عن التغيرات في وفرة sgRNA، وخاصة بالنسبة للاختيارات السلبية. ميزة الحد من الشاشات السلبية هي أن الاضطراب لا يستنفد إلا بقدر ما كان موجودا في مكتبة البداية24. وبالمقارنة، فإن النطاق الديناميكي لشاشات الاختيار الإيجابية أكبر بكثير، لأنها تعتمد على إثراء الخلايا، ويمكن أن تثري إلى 100٪ من السكان النهائي23. ولذلك، بالنسبة لشاشات الاختيار الإيجابية (مثل شاشات مقاومة المخدرات)، يمكن تخفيض تغطية المكتبة وعمق القراءة إلى تمثيل يتراوح بين 50 و 100 ضعف، حيث يتوقع أن يبقى على قيد الحياة سوى عدد صغير من الخلايا.

بروتوكول مكتبة التسلسل الموضح هنا هو PCR من خطوتين الأمثل لمكتبات TKOv3 CRISPR في كل من العمود الفقري المتجه وتسلسل على منصة تسلسل Illumina. ويمكن أيضاً إنشاء مكتبات التسلسل هذه باستخدام بروتوكول واحد من الـ PCR، مماثل للبروتوكول الموصوف في Hart et al.3. وبالنسبة للمكتبات الجاهزة الأخرى، ينبغي الرجوع إلى النماذج التمهيدية وبروتوكولات التسلسل المقدمة لتلك المكتبات. عند إعداد عينات الحمض النووي الجينومي وPCR، من الضروري مراعاة احتياطات التلوث. على سبيل المثال، ينصح بشدة منطقة مخصصة لتنقية الحمض النووي الجينومي. كما ينبغي أن تكون متميزة ماديا عن الإعدادية بلازميد البكتيرية، والتي هي الملوثات الشائعة الموجودة في عينات الحمض النووي الجينومي. وينبغي أن تُنشأ ردود فعل تفاعل PCR في غطاء محرك السيارة المخصص لتفاعل الـPCR، لأن ذلك سيقلل إلى أدنى حد من التلوث الناجم عن البلازميدات وغيرها من مكتبات التسلسل. للممارسة الجيدة، يمكن تضمين التحكم السلبي بدون قالب للمساعدة في رصد التلوث PCR.

تحليل البيانات لترجمة تسلسل القراءة من الشاشات مهمة غير تافهة، نظرا لحجم وتنوع مجموعات البيانات هذه. وبمجرد محاذاة وتطبيع قراءة التسلسل، تتوفر عدة أدوات للمعلوماتية الحيوية للمساعدة في تقييم أداء الشاشة (الشكل 3)وتحديد الضربات(الشكل 4). ويوصف BAGEL في هذا البروتوكول بأنه الأداة الرئيسية لتحليل البيانات. يستخدم BAGEL إطار ًا بايزيًا لمقارنة توزيعمجموعات الجينات الأساسية وغير الأساسية المعروفة بالتغير المزدوج لجميع الأدلة التي تستهدف الجين. ويرد وصف لهذه الطريقة بالتفصيل في هارت وآخرون3. بالإضافة إلى BAGEL، يمكن أيضا استخدام خوارزميات أخرى مصممة لتحديد كل من sgRNAs المخصب والمستنفدة، مثل MAGeCK25. لشاشات المخدرات، فمن المستحسن استخدام خوارزمية DrugZ لتحديد كل من التفاعلات الوراثية الكيميائية التآزرية والقمعية. تم تصميم DrugZ لمقارنة الوفرة النسبية من sgRNA في السكان المعالجة إلى الوفرة النسبية من sgRNA في السكان غير المعالجة في نفس الوقتنقطة 20.

وهناك قيود على شاشات كريسبر هو أن Cas9 لا يؤدي دائما إلى خروج المغلوب، كما أن هناك دائما احتمال أن الإندلات التي تم إنشاؤها هي الطفرات في الإطار، وترك وظيفة الجينات سليمة13. وهذا يؤدي إلى مجموعة مختلطة من السكان، مما يجعل الشاشة "صاخبة" وتفسير البيانات صعبة. يمكن أن يؤدي استخدام sgRNAs المستقلة المتعددة التي تستهدف الجين إلى زيادة التكرار، مما يقلل من تأثير sgRNAs مع انخفاض النشاط. تحذير إضافي لدراسات كريسبر هو تأثير فواصل حبلا مزدوجة التي أنشأتها Cas9 nuclease، والتي يمكن أن تؤدي إلى فتكا الخلوية مستقلة عن الجين المستهدف. هذا التأثير المضادة للانتشار يزيد مع رقم نسخة الموقع المستهدف، مما يؤدي إلى تحديد إيجابي زائف للجينات داخل المناطق الموسعة للغاية26. وقد وضعت الأساليب الحسابية مثل CERES لتصحيح تأثيرات عدد النسخ27. تعتبر مهام سير العمل هذه تأثير رقم النسخة لتقدير مستويات الاعتماد على الجينات في شاشات الأساسيات المستندة إلى خروج المغلوب. الفحص الدقيق للمواقع الجينية للجينات الهيت في المناطق المضخمة يمكن أن يساعد في تحديد الإيجابيات الخاطئة التي تعزى إلى تعدد آثار القطع13. يمكن للشاشات الأساسية فقط تحديد عدد الزيارات المحتملة. من المهم المتابعة بشاشة ثانوية أو بروتوكول للتحقق من صحة الضربات والتمييز بين الأهداف والآثار غير المستهدفة، والتخلص من الإيجابيات الخاطئة وضمان عدم ترك الجينات التي سجلت ضعيفة بسبب الاضطرابات غير الفعالة وراءها على أنها كاذبة السلبيات23.

ويركز هذا البروتوكول على نُهُج الفرز القائمة على الجدوى، التي ينبغي أن تؤدي فيها حالة الدراسة إلى عيب في الانتشار أو إلى موت الخلايا. وبالنسبة للعمليات التي لا تؤدي إلى تغيير في صلاحية الخلايا الخلوية، يمكن أن تكون طريقة الفحص المجمع القائم على الجدوى تقييدية. والبديل هو إجراء الشاشات باستخدام المراسل أو الاختبارات المستندة إلى العلامات والإثراء عن طريق نهج فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS). في شاشات الاختيار المستندة إلى علامة، ويستند النمط الظاهري على الطفرات التي تنظم التعبير الجيني علامة بدلا من صحة الخلية13،23. كما تتوفر تنسيقات كريسبر المعفرة لجين واحد لكل فحص للبئر. تكون التنسيقات المعدّسة أكثر قابلية للقراءة المعقدة أو المستندة إلى الفحص المجهري. ومع ذلك، تتطلب الأشكال المعدّسة معدات آلية وكميات كبيرة من الكواشف28.

يستخدم بروتوكول الفرز الذي تمت مناقشته هنا S. pyogenes Cas9 nuclease لإنشاء الأليلات الفارغة، والتي هي الأكثر استخداماً على نطاق واسع للشاشات الوراثية والتي تتوفر لها العديد من المكتبات (Addgene: المكتبات المجمعة). كما تتوفر خيارات بديلة لمكتبات الخروج، والتي تستخدم dCas9 الميت ة الحفازة المربوطة ببروتينات معدّل الكروماتين لمنع (كريسبري) أو تنشيط نسخ الجينات (كريسبها). على غرار RNAi، تقدم CRISPRi القدرة على دراسة الآثار الفينوتية في جرعات جينية مختلفة والجينات الأساسية التي لا يمكن أن تتسامح مع الضربة القاضية كاملة، في حين يمكن استخدام كريسبيرا لأداء شاشات كسب الوظيفة. كل من هذه التكنولوجيات لها مزاياها، ولكن بشكل عام، نهج خروج المغلوب كريسبر هو الأكثر تطورا. وقد ثبت أن أداء جيدا مع انخفاض مستوى الضجيج، والحد الأدنى من الآثار خارج الهدف، والاتساق التجريبي، وخاصة في شاشات الجينات الأساسية القائمة على الفتك، بالمقارنة مع نهج هدم باستخدام إما كريسبري وshRNAs5. وعلى الرغم من إمكانية تطبيقتكنولوجيا الفحص على نطاق واسع حتى الآن، لا تزال في مراحلها الأولى. ولا تزال هناك أدوات جديدة يتم بناؤها من المكونات الأساسية لـ CRISPR. وتشمل هذه الاستراتيجيات تحرير الجينات المؤتلفة التي يمكن أن تستهدف مواقع جينية متعددة، وتحسين إنزيمات كاس المتعامدة، والتعديلات مع المجالات الوظيفية الكروماتين لتنويع أنشطة Cas9. ومع استمرار نمو تكنولوجيا كريسبر، فإن اقترانها بنهج الفحص الوراثي سيكون بمثابة منصة قوية للاكتشاف الوظيفي في علم الوراثة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل جينوم كندا، وصندوق أونتاريو للبحوث، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (MOP-142375, PJT-148802).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 micron filter
30°C plate incubator
37°C shaking incubator
37°C, 5% CO2 incubator
5 M NaCl Promega V4221
50X TAE buffer BioShop TAE222.4
6 N Hydrochloric acid solution BioShop HCL666.500
95% Ethanol
Alamar blue ThermoFisher Scientific DAL1025
Blue-light transilluminator ThermoFisher Scientific G6600
Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade Bioshop ALB001.250
Dulbecco's Modification of Eagles Medium Life Technologies 11995-065 Cel culture media
Electroporation cuvettes BTX 45-0134
Electroporator BTX 45-0651
Endura electrocompetent cells Lucigen 90293
Fetal Bovine Serum GIBCO 12483-020
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216 recommend passage number <15
Hexadimethrine Bromide (Polybrene) Sigma H9268 Cationic polymer to enhance transduction efficiency
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)
LB agar plates with carbenicillin
LB medium with carbenicillin
Low molecular weight DNA ladder New England Biolabs N3233S
Nanodrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544L
Opti-MEM Life Technologies 31985-070 Reduced serum media
Plasmid maxi purification kit Qiagen 12963
pMD2.G (envelope plasmid) Addgene Plasmid #12259 lentiviral system
psPAX2 (packaging plasmid) Addgene Plasmid #12260 lentiviral system
Puromycin Wisent 400-160-UG
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
Qubit dsDNA BR assay ThermoFisher Scientific Q32853
Qubit fluorometer ThermoFisher Scientific Q33226
RNAse A Invitrogen 12091021
S.O.C recovery medium Invitrogen 15544034
SYRB Safe DNA gel stain ThermoFisher Scientific S33102
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included Addgene Addgene ID #90203 Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 Addgene Addgene ID #125517 Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA
Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0
UltraPure agarose ThermoFisher Scientific 16500500
Wizard genomic DNA purification kit Promega A1120
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 06 365 809 001 Lipid based transfection reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
  2. Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
  3. Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  4. Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
  5. Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  6. Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
  7. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  8. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  9. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  10. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  11. Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
  12. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
  15. Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
  16. Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
  17. Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
  18. Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
  19. Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
  20. Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , Available from: https://doi.org/10.1101/232736 (2017).
  21. Pedregosa, F. V., G,, et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
  22. Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
  23. Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
  24. Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
  25. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
  26. Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
  27. Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
  28. Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).

Tags

علم الوراثة، العدد 151، كريسبر-كاس9، مكتبات sgRNA، تورنتو-خروج، فحص كريسبر على نطاق الجينوم، شاشات التسرب المجمعة، علم الجينوم الوظيفي، الجينات الأساسية، اللياقة البدنية للخلايا، الانتشار
الشاشات الوراثية المجمعة المستندة إلى كريسبر في خلايا الثدييات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K.… More

Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (151), e59780, doi:10.3791/59780 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter