Summary
CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.
Abstract
CRISPR-Cas 시스템을 이용한 게놈 편집은 다양한 유기체의 게놈을 정밀하게 편집하는 능력을 크게 향상시켰습니다. 포유류 세포의 맥락에서, 이 기술은 기능적 유전체학 연구를 위한 게놈 전체 유전 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타낸다. 모든 개방된 판독 프레임을 대상으로 하는 가이드 RNA(sgRNA) 라이브러리는 특정 표현형에 대해 선별될 수 있는 단일 세포 풀에서 수천 개의 유전 적 교란을 생성하여 유전자 기능 및 세포 프로세스에 연루되도록 허용합니다. 편견과 체계적인 방법. CRISPR-Cas 스크린은 세포 표현형을 위한 유전 청사진을 밝히기 위하여 간단하고, 능률적이고, 저렴한 방법을 연구원에게 제공합니다. 게다가, 각종 세포주및 다른 암 모형에서 수행된 스크린의 차등 분석은 특정 항암 치료에 대한 잠재적인 표적을 드러내는 종양 세포에 문맥상 필수적인 유전자를 확인할 수 있습니다. 인간 세포에서 게놈 전체 스크린을 수행하는 것은 수천만 개의 세포를 처리하는 것을 포함하고 대량의 데이터 집합의 분석을 요구하기 때문에 어려울 수 있습니다. 세포주 특성화, CRISPR 라이브러리 고려 사항, 분석 중 CRISPR 기술의 한계와 기능 이해 와 같은 이러한 화면의 세부 사항은 종종 간과됩니다. 여기에 제공된 풀드게놈 전체 CRISPR-Cas9 기반 스크린의 성공적인 성능을 위한 상세한 프로토콜이 제공됩니다.
Introduction
CRISPR-Cas는 정기적으로 스패니싱된 짧은 팔린드로믹 반복 및 CRISPR 관련 뉴클레아제에 대한 짧은, 합성 가이드 RNA(sgRNA)와 복합체에서 단일 뉴클레아제 단백질(예를 들어, Cas9)으로 구성된다. 이 리보뉴클레오 단백질 복합체는 Cas9 효소를 표적으로 하여 특정 게놈 궤적1에서이중 가닥 DNA 분리를 유도합니다. 이중 가닥 휴식은 상동성 지시 수리 (HDR) 또는, 더 일반적으로, 비 상동성 끝 접합을 통해 복구 할 수 있습니다 (NHEJ), 삽입 및 / 또는 삭제 (INDELS)를 자주 중단하는 오류 경향이 수리 메커니즘 1. CRISPR의 효율성과 단순성은 이전의 게놈 편집 기술 [즉, 아연 손가락 뉴클레아제 (ZNF) 또는 전사 활성제 와 같은 이펙터 뉴클레아제 (nucleion)를 훨씬 능가하는 이전에 는 달성 할 수없는 수준의 게놈 표적화를 가능하게합니다. TALENS), 둘 다 높아진 설계 복잡성, 낮은 형질 감염 효율 및 멀티플렉스 유전자 편집의 한계로 고통받고있습니다 2].
CRISPR 단일 가이드 RNA 기반 게놈 편집의 기본 연구 응용 프로그램은 과학자들이 개별 유전자의 기능과 유전자 상호 작용 네트워크의 토폴로지의 기능을 효율적이고 저렴하게 심문할 수 있게 해 주어왔습니다. 기능적 게놈 전체 스크린을 수행하는 능력은 CRISPR-Cas 시스템의 사용에 의해 크게 향상되었습니다, 특히 RNA 간섭과 같은 초기 유전 섭동 기술과 비교할 때 (RNAi) 및 유전자 트랩 돌연변이 발생. 특히, RNAi는 높은 오프 타겟 효과와 불완전한 녹다운으로 고통받고 있으며, CRISPR3,4,5에비해 감도와 특이성이 낮으며 유전자 트랩 방법은 haploid에서만 가능합니다. 기능 상실 스크린을 위한 셀, 심문될 수 있는 세포 모형의 범위를 제한하는6. 완전한 유전자 녹아웃을 생성하는 CRISPR의 능력은 낮은 소음, 최소한의 오프 타겟 효과 및 시약 전반에 걸쳐 일관된 활성으로 돌연변이 표현형을 심문하는 보다 생물학적으로 견고한 시스템을 제공합니다5. 전체 인간 게놈을 표적으로 하는 CRISPR-Cas9 sgRNA 라이브러리는 이제 널리 사용가능하여 단일 실험3,7,8,9에서 수천 개의 유전자 녹아웃을 동시에 생성할 수 있습니다. .
우리는 고해상도 기능 유전체 학 스크린을 용이하게하기 위해 컴팩트하고 시퀀스 최적화 된 토론토 녹아웃 (TKO) 라이브러리 (Addgene를 통해 사용 가능)라는 독특한 CRISPR-Cas9 게놈 넓은 sgRNA 렌티 바이러스 라이브러리를 개발했습니다. 최신 라이브러리인 TKOv3는 경험적 데이터를 사용하여 편집 효율에 최적화된 71,090개의 가이드를 사용하여 ~18,000개의 인간 단백질 코딩 유전자를 대상으로합니다 10. 또한 TKOv3는 단일 벡터에서 Cas9 및 sgRNAs를 발현하는 단일 구성 요소 라이브러리(LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294)로 사용할 수 있으므로 안정적인 Cas9 발현 셀을 생성할 필요성을 완화하여 광범위한 범위에서 게놈 전체 녹아웃을 가능하게 합니다. 포유류 세포 유형. TKOv3는 Cas9(pLCKO2:TKOv3, Addgene ID# 125517)가 없는 벡터에서도 사용할 수 있으며 Cas911을발현하는 셀에서 활용될 수 있다.
게놈 넓은 CRISPR-Cas9 편집된 세포 인구는 다른 성장 조건에 드러낼 수 있고, 차세대 염기서열로 정량화된 sgRNAs의 풍부와 함께, 추적 가능한 유전을 가진 세포의 중퇴 또는 농축을 평가하기 위하여 판독을 제공하 교란. CRISPR 녹아웃 라이브러리는 섭동시, 세포 적당 결함, 적당한 약물 민감도(예: 민감하거나 내성 있는 유전자), 단백질 발현 조절(예: 리포터) 또는 특정에 필요한 유전자를 식별하기 위해 활용될 수 있습니다. 통로 기능 및 세포 상태12,13,14. 예를 들어, 암 세포주에서의 차동 피트니스 스크린은 종양 억제유전자 유전자3,14,15의고갈 또는 감소 또는 종양 억제유전자의 증가를 식별할 수 있다. 유사하게, 치료약물의 중간 용량을 사용하면 약물 내성 및 과민성 유전자 둘 다 를 나타낼 수있다 16,17.
여기에 제공된 유전체 스케일 CRISPR-Cas9 기능 손실 스크리닝을 위한 상세한 스크리닝 프로토콜은 라이브러리 생성으로부터 포유류 세포에서 토론토 녹아웃 라이브러리(TKOv1 또는 v3)를 사용하여, 데이터 분석에 대한 스크리닝 성능이다. 이 프로토콜은 토론토 녹아웃 라이브러리를 사용하여 스크리닝에 최적화되었지만 모든 CRISPR sgRNA 풀린 라이브러리에 적용하여 확장 가능해질 수 있습니다.
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Protocol
아래에 설명된 실험은 연구소의 환경 보건 및 안전 사무소 지침을 따라야 합니다.
1. 풀드 CRISPR sgRNA 렌티 바이러스 라이브러리 플라스미드 증폭
- 기성화된 CRISPR sgRNA 플라스미드 DNA 라이브러리를 TE(예: TKOv3)에서 50 ng/μL로 희석한다.
- 전기 적격 세포를 사용하여 라이브러리를 전기화합니다. 아래에 설명된 바와 같이 총 4개의 전기 화반응을 설정한다.
- 얼음에 미리 차가운 큐벳 (1.0 mm)에 해동 된 전기 유능한 세포의 25 μL에 50 ng / μL TKO 라이브러리 2 μL을 추가하십시오.
- 제조업체의 프로토콜에서 제안한 최적의 설정을 사용하는 전기분해기. 펄스의 10s 이내, 큐벳에 975 μL의 회수 매체 (또는 SOC 매체)를 추가하십시오.
- 배양 튜브에 전기 세포를 전달하고 회수 매체의 1 mL를 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 250 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 튜브를 인큐베이터.
- 라이브러리를 적시하고 변환 효율을 추정하기 위해 희석 판을 설정합니다.
- 복구 된 세포의 모든 8 mL을 풀하고 잘 섞습니다. 풀된 세포의 10 μL을 800배 희석을 위해 990 μL의 회수 배지로 옮기고 잘 섞는다.
- 미리 온난한 10 cm LB + 카르베니실린 (100 μg / L) 한천 플레이트에 희석의 플레이트 20 μL. 이로 인해 변환 효율을 계산하는 데 사용되는 형질전환물의 40,000배 희석이 발생합니다.
- 플레이트 400 μL 각 플레이트에 총 20개의 미리 온난화된 15 cm LB + 카르베니실린 한천 플레이트에 걸쳐. 30 °C에서 14-16 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
참고: 이 낮은 온도에서 성장하면 긴 단자 반복(LTR)18간의 재결합을 최소화합니다. - 변환 효율을 계산하려면 40,000배 희석 판의 콜로니 수를 계산합니다(단계 1.3.2). 모든 판에 총 식민지 수를 얻기 위해 40,000으로 계산 된 식민지의 수를 곱합니다. 총 콜로니 수가 sgRNA당 최소 200x 콜로니에 해당하는 라이브러리 커버리지를 나타내는 경우 진행합니다(가장 최적은 500-1000x).
- 예를 들어, TKOv3 라이브러리(71,090 sgRNA)에 대한 최소 콜로니 번호는 1.4 x 107이며,이는 sgRNA당 200x 콜로니와 동일합니다. 콜로니 표현이 불충분하면 희석판의 콜로니 수에 따라 1.2단계에서 전기개수를 늘려 최소 라이브러리 커버리지를 달성한다.
- 아래에 설명된 대로 식민지 수확
- 각 15cm 접시에 LB + 카르베니실린 (100 μg / L) 배지 7 mL를 추가 한 다음 세포 스프레더로 식민지를 긁어 냅니다. 10 mL 파이펫으로 긁힌 세포를 멸균 된 1 L 원추형 플라스크 또는 병으로 옮니다.
- 다시 한번 LB + 카르베니실린 배지 5 mL로 접시를 헹구고 용액을 병에 옮김을 옮김하십시오.
- 모든 플레이트에서 20개의 플레이트에서 세포를 멸균 병으로 풀에 반복합니다.
- 수집된 세포를 실온(RT)에서 1시간 동안 교반 막대와 혼합하여 세포 덩어리를 분해합니다. 세포를 미리 칭량한 원심분리기 병과 원심분리기로 7,000 x g의 펠릿 박테리아로 옮긴 다음 매체를 폐기합니다.
- 젖은 세포 펠릿의 무게를 측정하고 습식 펠릿의 최종 중량을 결정하기 위해 원심 분리기 병의 무게를 뺍니다. 각 컬럼이 처리할 수 있는 세균 펠릿의 양에 따라 맥시 또는 메가 스케일 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제한다.
2. 대규모 CRISPR sgRNA 라이브러리 렌티바이러스 생산
참고: 프로토콜의 이 섹션의 모든 단계는 클래스 II, 유형 A2 생체 안전 캐비닛의 BSL2+ 시설에서 수행됩니다.
- 바이러스의 18 mL가 일반적으로 하나의 15cm 플레이트에서 수확된다는 추정에 기초하여 바이러스 생산에 필요한 15cm 플레이트의 수를 계산한다.
- 저항생제 성장 매체 (DMEM + 10 % FBS + 선택 사항 : 0.1x 펜 / 스트렙)에서 HEK-293T 포장 세포를 20 mL의 20 mL에서 15cm 플레이트 당 8 x 106 셀로 시드하여 형질 감염을위한 세포를 준비하십시오. 37°C, 5%CO2에서밤새 세포를 배양한다. 도금 된 세포가 70 % - 80 % 수렴하고 형질 전환 순간에 균등하게 퍼지도록하십시오.
- 다음날, 15 cm 플레이트에 대해 표 1에 설명된 대로 3개의 형질감염 플라스미드 혼합물을 준비한다. 하나의 형질 감염에 필요한 플라스미드의 양을 계산하고 플레이트 수에 대한 플라스미드를 혼합하고 형질감염되는 플라스미드를 만듭니다.
- 표 2에 설명된 바와 같이 각 형질감염에 대한 지질계 형질감염 시약을 준비한다. Aliquot는 개별 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브로 혈청 매체를 감소시고 형질전환되는 플레이트의 수를 감소시다. 트랜스펙션 시약을 추가하고, 부드럽게 섞고, RT에서 5분간 배양하세요.
- 5 분 배양 후, DNA 복합체의 형질 감염 시약 대 μg의 3:1 비율에 대한 형질 감염 시약에 하나의 형질 감염에 필요한 DNA의 양을 추가합니다. 부드럽게 섞고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
참고 : 후속 형벌은 시간을 최적화하고 과잉 배양을 피하기 위해 5 분 간격으로 5 개 이하의 세트로 준비 할 수 있습니다. - 30 분 의 배양 후, 조심스럽게 포장 세포의 각 접시에 각 형질 전환 믹스를 전송합니다. 셀 단층을 방해하지 않고 원형, 지그재그 운동에 1 mL 파이펫 팁을 사용하여 전체 믹스를 추가합니다. 5%CO2에서18 시간 동안 37 °C에서 세포를 배양합니다.
- 바이러스 수확 매체 준비 : 500 mL의 DMEM 매체 + BSA 스톡 32 mL (20 g / 100 mL, DMEM에 용해, 0.22 μm 필터로 살균 된 필터) + 100x 펜 / 스트렙 5 mL.
- 18 시간 후, 매체를 제거하십시오 (폐기 하기 전에 30 분 동안 1 % 하이포 아염소산나트륨에서 배양과 같은 렌티 바이러스 폐기물을 적절하게 처리하십시오). 각 접시에 18 mL의 바이러스 성 수확 매체로 부드럽게 교체하십시오. 5%CO2에서18 시간 동안 37 °C에서 세포를 배양합니다.
- 24 시간 후, 좋은 바이러스 생산의 표시로 이상하고 융합 된 형태에 대한 포장 세포를 확인합니다. 그런 다음 모든 상월체를 수집하고 멸균 원추형 원추형 원심 분리관으로 옮겨 렌티 바이러스를 수확합니다.
- 바이러스가 함유된 매체를 300 x g에서 5분 동안 돌리고 포장 셀을 펠릿합니다. 상급체를 펠릿을 방해하지 않고 멸균 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다.
- 바이러스를 단기간(1주일 미만) 4°C에서 보관하거나 장기 보관을 위해 -80°C에서 즉시 보관하십시오. Aliquot 대규모 바이러스 준비는 동결/해동을 방지하기 위해 장기 저장을 위한 일회용 볼륨에 대한 준비를 제공합니다.
3. 스크리닝용 세포주 특성화
- 원하는 세포줄을 선택합니다.
- 세포의 대략적인 두 배 시간을 측정하고 기록합니다.
- 선택한 조직 배양 용기(예를 들어, 15cm 조직 배양 판)에서 3-4개의 세포 배양 세포마다 배양 세포를 위한 최적의 세포 도금 밀도를 결정한다.
- 푸르마이신 저항 마커를 함유하는 TKO 라이브러리의 선택을 위해 원하는 세포주에서 사용하는 순혈로마이신 농도를 다음과 같이 결정한다:
- 종자 세포는 72시간 후에 합류에 도달하는 데 필요한 밀도에서 12웰 플레이트에서, 그 후 밤새 배양한다(37°C, 5%CO2).
- 다음 날, 0.5 μg/mL 단위로 0 μg/mL에서 10 μg/mL로 의 puromycin 농도의 희석 범위를 포함하는 매체로 변경하십시오. 세포를 48 시간 동안 배양하십시오.
- 48 시간 후, 세포 계수 또는 alamarBlue 염색에 의해 세포 생존력을 측정합니다.
- 48시간 동안 세포의 100%를 죽이는 가장 낮은 농도를 결정합니다.
참고: 두 배 더 긴 세포주의 경우, 퓨로마이신을 가진 더 긴 배양은 허용될 수 있습니다. 이러한 상황에서는 <3 셀 이중화에 필요한 배양 시간에 대한 킬 곡선을 결정합니다. 선별이 시작되기 전에 필수 유전자의 탈락을 피하기 위해 선택 시간을 최소화합니다.
- 헥사디메트린 브로마이드(최대 8 μg/mL)에 대한 민감도를 검사하여 푸로마이신 민감도 측정에 사용되는 것과 동일한 방법으로 투여 반응 곡선을 수행하였다(단계 3.2). 헥사디메트린 브로마이드의 <8 μg/mL로 독성이 관찰되면 사용하지 마십시오.
4. MOI의 결정을 위해 풀린 된 CRISPR 렌티 바이러스 라이브러리의 기능 적정
- 풀린 CRISPR sgRNA 라이브러리 렌티바이러스(예: LCV2::TKOv3)의 신선한 알리쿼트를 해동하고 얼음을 계속 유지합니다.
- 0-2mL 범위(예: 0mL, 0.25mL, 0.5mL, 1mL 및 2mL) 사이에서 테스트할 일련의 바이러스 볼륨을 설계합니다.
- 72 시간에서 합류에 도달하는 데 필요한 밀도로 15cm 플레이트에서 표적 세포와 종자 세포를 수확합니다.
- 테스트할 각 바이러스 볼륨에 대해 중복 플레이트를 준비합니다. 세포, 바이러스, 헥사디메트린 브로마이드(8 μg/mL) 및 미디어를 최종 부피 20 mL에 첨가합니다. 플레이트를 철저히 혼합하고, 인큐베이터에 플레이트 레벨을 앉고 24 시간 동안 배양하십시오 (37 °C, 5 %CO2).
- 24 시간 후, 미디어를 포함하는 바이러스를 제거하고 폐기 (렌티 바이러스 폐기물의 처리를위한 생물 안전 주의 사항을 사용). 선택적으로, 따뜻한 PBS로 접시를 부드럽게 씻어 외부 바이러스를 제거하십시오.
- 각 바이러스 상태에 대해, 섹션 3에서 세포를 죽이기로 결정된 농도를 사용하여 puromycin을 함유하는 20 mL의 매체로 대체하고, 하나의 복제 판으로 대체한다. 다른 접시에, puromycin없이 신선한 매체의 20mL를 추가합니다. 48 시간 동안 배양 (37 °C, 5 %CO2).
- 48 시간 후, puromycin으로 처리 된 모든 감염되지 않은 세포 (0 mL 바이러스 상태)가 죽어 있는지 확인하십시오. 모든 플레이트를 개별적으로 수확하고 반복된 부드러운 파이펫팅으로 세포를 분산시냅니다.
- 모든 플레이트에서 세포를 카운트하고 puromycin없이 세포 수에 puromycin 선택과 세포 수를 비교하여 각 바이러스 볼륨에 대한 MOI를 계산 (즉, +/- puromycin).
- 그래프 결과는 puromycin 없이 대 puromycin 선택을 가진 30%-40% 세포 생존에 지도하는 바이러스 양을 결정하기 위하여. 동일한 조직 배양 조건 하에서 화면 동안 0.3-0.4의 MOI를 달성하기 위해이 바이러스 볼륨을 사용합니다.
5. 1 차 적인 스크린 감염, 선택 및 세포 통과
- 화면 전체에 유지관리될 CRISPR sgRNA 라이브러리 커버리지를 선택합니다(권장 최소 200배).
- 라이브러리 커버리지에 기초하여, sgRNA당 이러한 커버리지를 유지하는 데 필요한 셀의 수와 MOI 0.3(표3)에서감염에 필요한 셀의 수를 결정한다.
- 감염을 설정하는 데 필요한 플레이트의 수를 결정합니다(표4).
- CRISPR 라이브러리로 세포 감염
- 각 15cm 플레이트에 필요한 세포 번호를 수확하고 종자한다.
- 모든 플레이트에 헥사디메트린 브로마이드(8 μg/mL)를 첨가합니다.
- MOI 0.3에 필요한 부피에 바이러스를 스크리닝 및 대조군 2 플레이트에 추가합니다. 컨트롤 1의 경우 바이러스를 추가하지 말고 해당 볼륨을 미디어로 바꿉니다.
- 기울어져 플레이트를 완전히 섞어 줍니다. 접시를 인큐베이터에 놓고 레벨이 있는지 확인합니다.
참고 : 배치 감염은 도금 전에 현탁액의 세포에 바이러스, 미디어 및 헥사디메트린 브로마이드의 마스터 믹스를 결합하여 수행 할 수 있습니다. - 3.2.4단계에서 결정된 농도에서 푸로마이신을 함유한 신선한 매체를 제거하고 바이러스 감염 후 24시간 동안 스크리닝 및 대조군 1플레이트를 대조한다. 컨트롤 2 플레이트에 푸로마이신이 없는 신선한 매체를 추가합니다. 48 시간 동안 세포를 배양 (37 °C, 5 %CO2).
- 48 h 를 첨가한 후, 모든 감염되지 않은 세포가 죽는지 확인(대조군 1)하여 푸로마이신 활성을 확인한 다음 감염된 세포를 수확한다.
- 감염된 세포 집단 및 세포 통과 수확
- 모든 스크리닝 플레이트에서 푸로마이신이 선택한 세포를 하나의 멸균 용기에 수확합니다. 각 대조판으로부터 세포를 따로 수집한다. 부드럽게 반복된 파이펫팅으로 세포를 분산시입니다.
- 풀풀된 스크리닝 셀에서 세포를 카운트하고, 대조군 1을 제어하고, 2를 개별적으로 제어하고 1mL당 셀 수를 계산합니다.
- 다음과 같이 달성 MOI 및 접기 범위를 계산 :
- 게놈 DNA 추출을 위해 선택된 라이브러리 커버리지에서 풀된 세포로부터 세포 펠릿의 3개의 복제를 수집합니다. 500 x g에서 5 분 동안 세포를 원심 분리합니다. 튜브에 라벨을 부착하고 세포 펠릿을 -80 °C에서 동결 건조시십시오 (이들은 T0 기준 샘플입니다).
- 감염된 셀 풀을 세 개의 복제 그룹(예: 복제 A, 복제 B, 복제 C)으로 분할하는 동시에 각 복제 내의 라이브러리 커버리지를 유지합니다. 종자 세포는 종자 밀도와 동일한 종자 밀도로 확장시 일반적으로 사용되는 것과 같습니다. 각 복제 플레이트에 대해 동일한 수의 셀과 복제 간에 동일한 총 셀 수를 사용합니다.
- 세포통로를 계속하고 위와 같이 풀링된 감염된 세포의 각 복제물에서 세포 펠릿의 3개의 복제를 수확하고, 세포주에 따라 매 3-8일마다, 최대 15-20개의 세포 두 배를 위해. 각 통로에서, 각 복제 기의 모든 플레이트에서 세포를 서로 수확합니다(즉, 복제 A 플레이트의 모든 세포는 함께 재혼합되고, 복제 B 플레이트의 모든 세포는 함께 재혼합됩니다.)
- 각 펠릿에 시간(T)을 표시하고 지정을 복제합니다. 이는 펠릿이 수집된 T0 이후의 일 수에 해당합니다(예를 들어, T3_A, T3_B, T3_C 등).
- 음성 선택 약물 스크린의 경우, 세포가 치료 전에 T0 후 적어도 하나의 통로동안 회복되도록 허용한다. T3 또는 T6에서, 각 복제 군(A, B, C)으로부터 세포를 약물 치료 및 대조군으로 분할하고, 5.3.5단계에서 사용된 것과 동일한 시드 밀도를 사용한다.
- 약물 치료 그룹에서 각 복제에 대한 라이브러리 커버리지에 필요한 셀 수를 별도로 풀. 중간 농도에서 약물을 추가하십시오 (IC20-IC50). 세포를 종자하고 다음 통로까지 배양(37°C, 5%CO2)한다.
- 차량 제어 그룹의 각 복제에 대한 라이브러리 범위에 필요한 셀 수를 별도로 풀입니다. 약물과 동일한 부피를 사용하여 차량 제어를 추가합니다(<0.5% v/v). 세포를 종자하고 다음 통로까지 배양(37°C, 5%CO2)한다.
- 5.3.5단계에서 기재된 바와 같이 세포를 통과시키고 3일마다 게놈 DNA에 대한 세포 펠릿을 수확하고, 각 통로에서 약물 또는 비히클을 상쾌하게 한다.
- 양성 선택 또는 약물 내성 스크린의 경우, 라이브러리 커버리지에 필요한 셀의 수에 따라 각 복제군을 분할한다. 각 복제에 IC90 약물 농도를 추가합니다. IC90에서,세포의 대다수는 살해될 것입니다. 내성 인구가 게놈 DNA 추출을 위해 세포 펠릿 (1-2 x 107 세포)을 증가시키고 수집 할 수 있습니다.
6. CRISPR 샘플 준비 및 시퀀싱
- 유전체 DNA 정제
- 동결 된 세포 펠 릿을 해동을 위해 RT에서 5-10 분 동안 배양하십시오.
- 1.4 mL의 PBS를 세포 펠릿을 함유하는 50 mL 원심 분리기 튜브에 추가합니다. 20 s의 소용돌이세포를 다시 중단하고 1 분 동안 휴식을 취하십시오. 필요한 경우 P1000을 사용하여 파이펫 15x를 사용하여 나머지 셀 덩어리를 분해합니다. 15 mL 또는 1.5 mL 튜브에서 세포를 전송하는 경우, PBS의 1 mL로 세포를 다시 일시 중단한 다음 세포를 50 mL 튜브로 옮기고 400 μL의 PBS로 원래 튜브를 헹구십시오.
- 다시 중단된 세포에 5 mL의 핵 용해 액을 추가합니다. 10mL 파이펫을 사용하여 샘플을 위아래로 5x 씩 파이펫팅하여 혼합합니다.
- RNase A (20 mg /mL; 100 μg /mL의 최종 농도를 얻으려면)의 32 μL을 핵 용해액에 넣고 튜브를 5배 반전시켜 샘플을 혼합합니다. 혼합물을 37°C에서 15분 동안 인큐베이션하고 RT에서 10분 동안 시료를 식힙니다.
- 용해액과 와류에 1.67 mL의 단백질 침전 액을 20 초 동안 힘차게 추가하십시오.
- RT에서 10 분 동안 4,500 x g의 원심 분리기.
- 10 mL 파이펫을 사용하여 상급체를 이소프로판올 5 mL를 함유하는 50 mL 원심분리기 튜브로 옮김. DNA가 관찰될 때까지 용액을 반전하여 10배 부드럽게 섞습니다.
참고 : DNA는 가시 질량을 형성하는 흰색, 실 과 같은 가닥으로 관찰 될 수있다. - 4,500 x g에서 5 분 동안 RT에서 DNA를 펠렛합니다.
- 10 mL 파이펫을 사용하여 상류자를 조심스럽게 제거하고 DNA 펠릿을 제거하지 마십시오. DNA에 RT에서 70% 에탄올 5 mL를 추가합니다. 원심분리기 튜브의 DNA 펠릿과 측면을 세척하기 위해 튜브를 부드럽게 회전시다.
- RT에서 5분 동안 4,500 x g의 원심분리기.
- 10 mL 파이펫을 사용하여 70 % 에탄올을 조심스럽게 제거하고 DNA 펠릿을 떨어 들이지 않도록하십시오. RT에서 10 분 동안 공기 건조 게놈 DNA.
- 튜브에 TE 용액 400 μL을 추가하고 DNA가 65 °C에서 1 시간 동안 배양하여 용해시키십시오. DNA가 완전히 용해되지 않으면, 튜브를 15분마다 부드럽게 쓸어넘기면서 추가로 1시간 동안 65°C에서 튜브를 배양하고, 밤새 4°C에서 방치한다.
- RT에서 1분 동안 4,500 x g의 원심분리기를 하고 게놈 DNA를 1.5 mL 저결합 튜브로 옮긴다.
- 분광광도계(총 핵산 함량)와 형광계(이중 가닥 DNA 함량)에서 게놈 DNA의 순도를 정량화하고 측정합니다.
- 선택적으로, sgRNA의 하류 PCR 증폭에 문제가 있는 경우 유전체 DNA를 침전하는 것은 다음과 같다.
- 400 μL 게놈 DNA를 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김.
- 5 M NaCl (0.2 M의 최종 농도)의 18 μL과 95 % 에탄올의 900 μL을 추가합니다.
- 튜브를 완전히 혼합할 때까지 10x 를 반전한 다음 RT에서 10분 동안 16,000 x g에서 원심분리기를 합니다.
- 조심스럽게 상류를 제거하고 DNA 펠릿을 제거하지 마십시오. DNA 펠릿을 70% 에탄올 500 μL로 세척합니다. 튜브를 부드럽게 회전하여 DNA 펠릿을 세척합니다.
- RT에서 5분 동안 16,000 x g의 원심분리기.
- 조심스럽게 상류를 제거하고 DNA 펠릿을 제거하지 마십시오. RT에서 10 분 동안 공기 건조 게놈 DNA.
- 단계 6.1.12에 기재된 바와 같이 DNA를 용해시키기 위해 TE의 300 μL을 추가한다.
- 단계 6.1.14에 기재된 바와 같이 게놈 DNA의 순도를 정량화하고 측정한다.
- CRISPR 시퀀싱 라이브러리 준비
- 총 100 μg의 게놈 DNA를 사용하여 표 5에 설명된 바와 같이 PCR 1을 설정한다. 50 μL 반응당 3.5 μg의 게놈 DNA를 추가하고 원하는 커버리지를 달성하기 위해 동일한 50 μL 반응을 설정합니다. 표 6은 LCV2::TKOv3 시퀀싱 라이브러리의 증폭을 위한 프라이머 시퀀스의 예를 나열합니다. 표 7은 pLCKO2::TKOv3 시퀀싱 라이브러리의 증폭을 위한 프라이머 서열의 예를 나열합니다.
- 표 8에설명된 프로그램을 사용하여 열자전거에서 PCR 1 반응을 증폭합니다.
- 1% 아가로즈 젤에서 PCR 제품의 2 μL을 실행하여 PCR 1 증폭을 확인합니다. PCR 1은 600bp의 제품을 산출합니다.
- 각 게놈 DNA 샘플에 대한 모든 개별 50 μL 반응을 풀링하고 소용돌이에 의해 혼합한다.
- 당해 PCR 1 제품의 5 μL을 템플릿으로 사용하여 표 9에 설명된 바와 같이 각 샘플에 대해 하나의 PCR 2 반응(50 μL)을 설정한다. 각 개별 샘플에 대해 고유한 인덱스 프라이머 조합을 사용하여 시퀀싱 라이브러리 샘플을 풀링할 수 있습니다.
- 표 10에설명된 프로그램을 사용하여 열자전거러에서 PCR 2 반응을 증폭한다.
- 젤을 캐스팅하기 전에 10 분 동안 0.1 N HCl로 증폭 제품을 정화하기위한 아가로즈 젤 장비를 청소하십시오. PCR 2 증폭 제품을 정화하기 위해 DNA 얼룩이 함유 된 2 % 아가로즈 젤을 준비하십시오.
- 저전압(1.0-1.5회 실행)에서 2% 아가로즈 젤에서 PCR 2 제품을 실행합니다. PCR 2는 200bp의 제품을 산출합니다.
- 파란색 광 트랜지미너레이터에서 PCR 제품을 시각화합니다. 겔 추출 키트를 사용하여 200 bp 밴드를 소비하고 아가로즈 겔 슬라이스로부터 DNA를 정제한다. 분광광도계와 형광계 모두에서 시퀀싱 라이브러리의 순도를 정량화하고 측정합니다.
참고: 일반적인 겔 정제 시퀀싱 라이브러리 농도는 5-10 ng/μL이며 총 수율은 150-300 ng입니다.
- 고처리량 시퀀싱
- 차세대 시퀀서에서 CRISPR 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱합니다.
- 400- 500배 라이브러리 커버리지의 더 높은 판독 깊이에서 T0 샘플을 참조하는 시퀀스. 200배의 최소 읽기 깊이에서 드롭아웃 스크린을 위한 실험 타임포인트 샘플을 시퀀스합니다. 강력한 포지티브 선택 화면의 경우 최소 50배 범위의 판독 깊이는 농축된 sgRNAs를 식별하는 데 충분합니다.
참고: T0 샘플을 시퀀싱하여 특정 스크린에 대한 라이브러리 표현을 결정하고 시간에 따라 sgRNA 접기 변화를 결정하는 기준역할을 하는 것이 중요합니다.
7. 데이터 분석
- Bowtie와 같은 프로그램을 사용하여 시퀀스를 매핑하여 시퀀스를 매핑하는 순서를 -v2(두 개의 불일치 허용) 및 -m1(라이브러리에서 둘 이상의 시퀀스에 매핑된 읽기를 삭제)을 사용하여 참조 라이브러리에 순서를 정렬합니다.
- 주어진 샘플에 대한 각 sgRNA에 대해 고유하게 매핑된 읽기 수를 다음과 같이 샘플당 1,000만 읽기로 정규화합니다.
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- T0 샘플(Tn/T0)과 비교하여 각 매 번의 매 번 복제(Tn)에 대한 각 sgRNA의 log2 배 변화를 계산합니다. 의사 수 0.5를 모든 읽기 카운트에 추가하여 불연속이 0으로 발생하지 않도록 합니다. T0 샘플에서 <30 원시 판독을 사용하여 접합 변경 계산 및 다운스트림 분석에서 sgRNAs를 제외합니다.
- 유전자 본질성 (BAGEL) 알고리즘의 베이지안 분석 (BAGEL) 알고리즘으로 접기 변화를 분석 & https://github.com/hart-lab/bagel>, 유전자 본질성 스크린에 대해 이전에 정의 된 핵심 필수 및 비 필수 교육 세트를 사용하여19 ) 보충 표 S1)또는 DrugZ & lt;https://github.com/hart-lab/drugZ> 약물 스크린에 대 한20.
- BF 점수를 사용하여 화면 성능 평가에 대한 정밀도와 리콜을 계산합니다. 위의 BF 점수 하위 집합과 함께 파이썬에 대한 Scikit 학습 라이브러리의 precision_recall_curve 함수에 대한 진정한 긍정 목록으로 7.4 단계의 필수 집합을 사용합니다. 또는 R에서 PRROC 패키지를 사용하여 동일한 작업을 수행합니다.
- 각 유전자에 대한 모든 가이드의 평균 접기 변화를 계산합니다. R 또는 이에 상응하는 소프트웨어에서 필수적이고 필수적이지 않은 유전자에 대한 밀도 플롯을 생성합니다(단계 7.4 참조). R에서 x.ess가 필수 유전자의 로그 폴드 변경 값을 포함하는 벡터이고 x.nonEss는 필수적이지 않은 유전자를 포함하고, 다음 명령을 사용하여 플롯:
플롯(밀도(x.ess), xlab="평균 logFC", col="빨간색", lwd=2)
선(밀도(x.nonEss), col="파란색", lwd=2)
참고: 파이썬 버전 세부 정보 및 사용된 패키지는 scikit-learn v0.19.1: (페드레고사 등21)을참조하십시오.
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Representative Results
게놈 스케일 CRISPR 스크리닝 워크플로우 개요
그림 1은 단일 통합 이벤트와 적절한 라이브러리 표현(일반적으로 200- 1000)을 보장하기 위해 낮은 MOI에서 CRISPR 라이브러리 렌티바이러스를 가진 표적 세포의 감염으로 시작하여 풀린 CRISPR 스크리닝 작업 흐름에 대한 개요를 보여줍니다. -접기). 감염 다음, 세포는 변환 된 세포를 선택하는 항생제 puromycin으로 치료됩니다. 선택 후, 기준선 T0 세포 펠릿은 스크리닝 시작 시 라이브러리 분포를 평가하기 위해 수집된다. 유전 섭동의 이기종 인구로 구성된 나머지 세포는 유전자 편집및 결과 효력이 명시하는 것을 허용하기 위하여 15-20 배동안 매 3-4 일마다 원하는 도서관 표현에서 통과됩니다. 약물 치료를 가진 스크린은 전형적으로 세포가 바이러스 감염 및 puromycin 선택에서 복구한 후에 T3 또는 T6에서 추가됩니다. 세포는 게놈 DNA를 위한 모든 통로에서 원하는 라이브러리 표현에서 수확되고, 원하는 시점에서 차세대 염기서열 분석에 의한 가이드 풍부를 결정합니다.
다운스트림 시퀀싱 라이브러리 준비 단계에서 발생할 수 있는 오류가 발생할 경우 여러 샘플을 수집하는 것이 좋습니다. 풀린 스크린은 필수 sgRNAs의 양성 또는 음성 선택을 위해 디자인된 전형적으로 생존성 기지를 둔 분석입니다. 양성 스크린은 특정 선택 압력하에서 저항을 보여주거나 생존을 증가시키는 유전자를 확인합니다 (예를 들어, 약물 또는 돌연변이 세포주). 이 경우에, 대부분의 세포는 선택에서 정지할 것이고, 남아 있는 세포는 시험되는 약 또는 조건에 대해 저항하는 유전자를 표적으로 하는 sgRNAs를 위해 풍부하게 될 것입니다. 네거티브 선택 화면 또는 "드롭 아웃" 화면은 화면 선택 압력하에서 생존에 대한 민감도 또는 손실이 증가한 유전자 녹아웃을 식별합니다. 성장 결함과 같은 표현형 효과가 있는 교란을 식별하기 위해 각 시점에서 의 회생량은 차세대 시퀀싱으로 정량화되고 T0과 비교하여 화면 의 과정에서 가이드의 드롭아웃 또는 농축을 평가합니다. 분석 플랫폼을 사용하여 가이드에 대해 로그 폴드 변경 사항을 측정하고 BAGEL과 같은 알고리즘을 적용하여 유전자 적중 순위를 설정할 수 있습니다.
풀린 CRISPR 화면에서 라이브러리 표현의 라이브러리 증폭 및 유지 관리
도 2는 플라스미드 라이브러리의 증폭 후 가이드의 예상 분포를 도시한다. TKOv3 라이브러리는 유전자당 4개의 sgRNAs를 가진 71,090sgRNAs로 이루어져, 표적화 ~18,000 단백질 코딩 유전자10. 이상적인 라이브러리는 모든 단일 sgRNA가 유사한 수량으로 표현되어야 합니다. 따라서 차세대 시퀀싱을 통해 증폭된 라이브러리에서 가이드의 분포를 확인하는 것이 좋습니다. 여기에 표시된 sgRNAs의 매우 엄격한 분포를 가진 증폭된 라이브러리는 모든 sgRNAs의 >95%가 4배 분포 범위 내에 있음을 확인합니다(그림2). sgRNAs의 광범위한 분포는 라이브러리 가이드의 풍부가 동일하게 표현되지 않고 풀린 화면의 노이즈에 기여할 수 있음을 나타냅니다.
화면 성능 평가
도 3은 모든 sgRNA의 배 변화 분포를 필수(684개 유전자) 및 불필요한 유전자(926개 유전자)에 대해 평가하여 화면의 성능 품질을 평가하고 가시화할 수 있음을 보여 준다. 정밀 리콜 곡선10. 골드 표준 참조 세트를 사용하여 화면 끝점에 대해 베이즈 계수(BF) 점수가 계산되고 정밀도 회수 곡선이 플롯됩니다. BF 점수는 베이지안 프레임워크(앞서19일설명한 BAGEL 알고리즘)를 사용하여 유전자를 표적화하는 모든 가이드에 대한 로그 폴드 변화를 분석하여 알려진 필수 및 비필수 가이드 세트의 분포를 비교함으로써 계산됩니다. 거짓 발견 률(FDR)은 동일한 골드 표준 기준 세트를 사용하여 경험적으로 파생됩니다. 고성능 스크린은 대부분의 곡선에서 날카로운 "팔꿈치"와 그림 3A의 파란색 선에 표시된 대로 터미널 지점에 직선으로 입증 된 바와 같이 BF >6 및 FDR <5%의 임계값에서 높은 수의 필수 유전자를 복구해야합니다. 필수적이고 불필요한 유전자를 표적으로 하는 가이드의 탈락은 또한 검토되어야 합니다(그림 3B). 기준이 아닌 필수 유전자를 타겟팅하는 가이드는 도 3B의파선에 나타난 바와 같이 0을 중심으로 로그 폴드 변화의 대체대칭 분포를 나타내야 한다. 필수 유전자를 표적화하는 가이드의 접이식 분포는 도 3B의실선에 의해 나타난 바와 같이 필수적이지 않은 유전자를 표적화하는 가이드의 분포에 비해 강한 부정적 변화를 나타낸다.
필수 유전자
풀드게놈 전체 드롭아웃 스크린의 기본 응용 중 하나는 필수 유전자를 식별하는 것입니다. 필수 유전자, 피트 니스 유전자의 하위 범주, 그의 섭동 세포 치사 원인 유전자, 또한 확산 유전자로 느슨하게 간주. 암 생물학의 맥락에서, 특정 종양 세포주에 대한 종속성을 확인하기 위해 문맥 특이적 필수 사항을 식별할 수 있다. 도 4는,베이즈 팩터 스코어를 이용한 필수 유전자의 유전자 순위를 나타내고, BAGEL 알고리즘으로부터 유래하였다. 베이즈 팩터(BF)는 유전자 녹아웃이 피트니스 결함을 초래한다는 신뢰도 척도를 나타낸다. 더 긍정적 인 점수는 섭동이 체력의 감소를 야기한다는 높은 자신감을 나타냅니다.
포지티브 선택 화면
게놈 전체 녹아웃 풀은 억제기/내성 유전자를 찾기 위해 과잉 약물 에이전트가 있는 경우 배양될 수 있습니다. 여기에 나타난 것은 G1/S 검거3의억제기를 찾기 위해 티미딘의 존재에서 스크리밍된 HCT116 세포의 예이다. 이 화면의 세부 정보는 이전 발행물3에서찾을 수 있습니다. 간단히, CRISPR 라이브러리 감염 세포의 선택 후 6 일, 세포는 라이브러리 커버리지를 유지 복제로 분할하고 티미딘으로 처리. 세포는 유전체 DNA 샘플링을 위해 충분한 내성 세포를 회수할 때까지 약물의 존재에서 통과되었다. 가이드의 작은 부분만 강한 선택적 압력으로 인해 남아 있기 때문에 긍정적 인 선택은 네거티브 스크린보다 낮은 범위에서 시퀀스 (읽기 깊이)할 수 있습니다. 이 예에서, 시퀀싱은 몇 백만 개의 판독값으로 수득되었고, 티미딘 키나아제(TK1)를 대상으로 하는 12개의 sgRNAs 중 11개가 예상대로 회수 및 농축되었다(도5).
| 금액은 1:1:1의 몰 비율에 기초하여 결정되었습니다. | ||
| 구성 요소 | 15cm 플레이트 당 양 a. | |
| LCV2::TKOv3 | pLCKO2::TKOv3 | |
| psPAX2 | 4.8 μg | 7.0 μg |
| pMD2.G | 3.8 μg | 4.0 μg |
| TKOv3b | 8.0 μg | 5.0 μg |
| a. 1:1:1 몰 비에서 TKO 라이브러리에 대한 가장 생산적인 플라스미드 조합을 기준으로 결정된 금액 | ||
| b CRISPR 라이브러리 벡터 백본을 기반으로 하는 TKO 플라스미드 양. LCV2 올인원 벡터 =13kb, 비Cas9 pLCKO2 벡터 = 7.6kb | ||
표 1: TKOv3 형질감염에 권장되는 플라스미드 량.
| 구성 요소 | 15cm 플레이트 당 양 |
| 옵티-MEM | 800 μL |
| 형질감염 시약 | 48 μL |
표 2: 지질 계 형질감염 시약 설정.
| 접이식 커버리지 | sgRNAb당 세포 수 | 감염b에 필요한 셀 수 |
| (sgRNA 라이브러리 크기× 접기 범위) | (sgRNA 라이브러리 크기 × 접기 범위 0.3 MOI) | |
| 200 | 1.5 x 107 | 5 x 107 |
| 500 | 3.6 x 107 | 1.2 x 108 |
| 1000 | 7.1 x 107 | 2.4 x 108 |
| a. TKOv3 라이브러리 크기 기준 = 71,090 sgRNA | ||
| b 숫자가 반올림됩니다. | ||
표 3: 다양한 접합 범위에서 TKOv3 CRISPR 라이브러리 감염 및 셀 도금에 필요한 셀 번호 의 결정.
| 치료 | 감염에 필요한 플레이트 수 | |
| 스크리닝 플레이트 | 바이러스, + 푸로마이신 | (sgRNA 라이브러리 크기 × 200 배) 0.3 MOI 감염 시 세포 파종 밀도 = 플레이트 수가필요함 |
| 제어 1 | 바이러스 없음, + 푸로마이신 (0% 생존 제어) | 1 |
| 제어 2 | 바이러스, + 푸로마이신 없음 (100% 생존 제어) | 1 |
| a MOI 변동 및 성장률을 수용할 수 있는 추가 플레이트 포함 | ||
표 4: 감염 설정 계산.
| 시약 | 반응 1배당 양 |
| 2x 마스터 믹스 | 25 μL |
| 10 mM PCR 1 LCV2 전진 프라이머 | 2.5 μL |
| 10 mM PCR 1 LCV2 리버스 프라이머 | 2.5 μL |
| 게놈 DNA | 3.5 μg |
| 물 | 최대 50 μL |
| 총 | 50 μL |
표 5: PCR 1 설정.
표 6: LCV2::TKOv3 시퀀싱 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 프라이머. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 7: pLCKO2::TKOv3 시퀀싱 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 프라이머. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 단계 | 온도 | 시간 | |
| 1 | 98°C | 30초 | |
| 2 | 98°C | 10초 | 25 사이클 (단계 2 – 4) |
| 3 | 66°C | 30초 | |
| 4 | 72°C | 15초 | |
| 5 | 72°C | 2분 | |
| 6 | 10°C | 개최 |
표 8: PCR 1 사이클 파라미터.
| 시약 | 반응 1배당 양 |
| 2x 마스터 믹스 | 25 μL |
| 10 mM i5 포워드 프라이머 | 2.5 μL |
| 10 mM i7 리버스 프라이머 | 2.5 μL |
| PCR 1 제품 | 5 μL |
| 물 | 15 μL |
| 총 | 50 μL |
표 9: PCR 2 설정.
| 단계 | 온도 | 시간 | |
| 1 | 98°C | 30초 | |
| 2 | 98°C | 10초 | 10 사이클 (단계 2 – 4) |
| 3 | 55°C | 30초 | |
| 4 | 65°C | 15초 | |
| 5 | 65°C | 약 5분 | |
| 6 | 10°C | 개최 |
표 10: PCR 2 사이클 파라미터.
보충 표 S1. TKO 참조 유전자 세트이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1: 풀리된 선별 워크플로우의 회로도 개요입니다. (a)표적 세포 집단은 대부분의 세포가 하나의 바이러스 통합을 수신하고 라이브러리 표현이 유지되도록 낮은 MOI에서 CRISPR 라이브러리 렌티바이러스에 감염된다. 상이한 색상은 각 바이러스 입자에서 서로 다른 sgRNAs를 나타냅니다. 유전자 변형 세포 풀이 선택됩니다. 선택이 완료되면 셀은 T0 참조를 위해 샘플링되고 직렬로 통과됩니다. (B)T0 후 첫 번째 통로에서, 세포는 감염으로부터 회복되고 약물 치료는 필요한 경우 첨가될 수 있다. 처리 다음, 세포 인구는 몇 주 동안 연속적으로 통과됩니다. 각 통로 동안, 세포는 게놈 DNA를 위해 집합되고 sgRNA 라이브러리의 필수 배 커버리지에서 다시 시드된다. (C)두 가지 유형의 스크린을 수행 할 수 있습니다 : 1) 양성 선택 스크린, 이는 특정 선택 압력 (예를 들어, 약물 또는 돌연변이 세포주)에서 저항또는 증가 생존을 나타내는 돌연변이 세포를 식별하는 동안 농축 될 것이다. 화면; 또는 2) 화면 선택 압력하에서 생존에 대한 민감도 또는 손실이 증가한 돌연변이 세포를 식별하는 음성 선택 화면은 화면 중에 손실됩니다. (D)유전체 DNA를 수확하고 PCR 증폭하여 가이드 부위를 풍부하게 한다. (e)가이드 풍부도는 차세대 시퀀싱에 의해 정량화되고 농축되거나 고갈된 가이드는 "히트" 식별을 위해 결정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 증폭된 CRISPR sgRNA 라이브러리의 품질. 증폭 된 라이브러리 플라스미드는 차세대 시퀀싱에 의해 분석됩니다 (권장 읽기 : 라이브러리의 ~ 400 배 표현에 해당하는 3천만 읽기). 여기에 표시된 라이브러리는 sgRNAs의 단단한 분포를 가지며, 모든 sgRNAs의 >95%는 4배 분포 범위 내에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 골드 표준 필수 유전자 참조 세트를 사용한 드롭아웃 화면 품질 평가. (A)BF >6 및 FDR 5%의 임계값에서 필수 유전자를 회수한 스크리닝 결과의 정밀 리콜 분석. 고성능 화면은 파란색 선으로 표시되고 성능이 낮은 화면은 빨간색 선으로 표시됩니다. (B)sgRNA 표적화 필수 유전자(실선) 및 불필요한 유전자(점선)의 배변화 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 유전자 본질성의 결정. 특정 화면에서 유전자의 베이즈 인자 순위. 베이즈 팩터(BF)는 유전자 녹아웃이 피트니스 결함을 초래한다는 신뢰도 척도를 나타낸다. 더 높은 베이즈 인자는 유전자 녹아웃이 피트니스 결함(빨간 점)을 초래한다는 자신감을 증가시켰음을 나타냅니다. 낮은 베이즈 팩터 점수는 녹아웃이 성장 이점(파란색 점)을 제공한다는 것을 시사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: HCT116 세포에서 티미딘 블록의 억제기용 포지티브 선택 화면. 티미딘 처리 된 샘플에 대한 평균 정규화 된 읽기 개수에 대해 플롯 된 T0의 모든 sgRNAs에 대한 정규화 된 읽기 카운트. 양성 선택 스크린(즉, IC90 농도의 약물)의 경우, 약물에 대한 내성을 부여하는 교란의 수는 작을 것으로 예상된다. 이러한 이유로, 읽기 깊이는 음수 스크린에 필요한 것보다 낮을 수 있으며, 대부분의 라이브러리가 표현될 것으로 예상된다. TK1 sgRNAs는 빨간색으로 동그라미를 친다. 이 그림은 이전 발행물3에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
사용의 단순성과 높은 유연성으로 인해 CRISPR 기술은 정밀한 게놈 편집을 위한 도구로 널리 채택되었습니다. 풀린 CRISPR 스크리닝은 단일 실험에서 수천 개의 유전적 교란을 심문하는 방법을 제공합니다. 풀린 스크린에서, sgRNA 라이브러리는 각 순서가 고유하고 표적으로 한 유전자에 매핑되기 때문에 분자 바코드로 봉사합니다. 세포 집단으로부터 게놈 DNA를 분리함으로써, 관심표현형을 일으키는 유전자는 차세대 염기서열 분석에 의해 sgRNA 풍부를 정량화함으로써 결정될 수 있다. 대규모 병렬 시퀀싱 방법은 샘플에서 sgRNAs를 정량화하는 데 사용되며, 이는 여러 개의 독립적인 셀 채우기를 동일한 시퀀싱 레인으로 풀링하여 비용을 최소화할 수 있음을 의미합니다.
대규모 선별 프로젝트에 착수하기 전에 특성이 좋고 기술적으로 최적화된 모델을 가지고 있어야 합니다. 유전적 배경, 성장 속도 및 형질전환 효율은 스크리닝을 위해 세포주를 선택할 때 중요한 요소입니다. 예를 들어 성장률과 편집 효율성은 모델의 확장성과 기술적 적합성을 결정합니다. 큰 sgRNA 라이브러리를 적절하게 나타내기 위해서는 수천만 개의 세포가 필요하므로 세포 수는 느린 이중으로 세포주 또는 증식 능력이 양호하지 않은 세포주에 대한 선별 타당성에 제한 요인이 될 수 있습니다(예: 1차 셀). 성장 속도에 기초하여, 세포 시종 밀도 및 스크리닝을 위한 플레이트 크기와 같은 세포 배양 조건은 그에 따라 선택되어야 한다. 스크린을 위해 실용적이고 기술적으로 가능한 가장 큰 용기에 있는 배양 세포에 추천됩니다.
Lentivirus transduction 효율성은 세포가 내재된 감염성에서 다르기 때문에 세포 모형 사이에서 변화합니다. 결과적으로, 한 세포 유형에서 충분한 감염을 달성하는 데 필요한 바이러스의 양이 반드시 다른 세포에서 동일하지는 않을 것이다. 따라서, 세포주에서 생성된 렌티바이러스 라이브러리의 각 배치를 기능적으로 역투하여 약 0.3(섹션 4)에서 트랜스듀싱함으로써 세포당 라이브러리 및 대부분 단일 트랜스덕션 이벤트의 충분한 커버리지를 보장하기 위해 선별하는 것이 중요하다. 감전 효율은 또한 세포 배양 조건에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 기능적 적시자는 화면에서 사용되는 것과 동일한 셀 조건을 사용하여 결정되어야 합니다. 즉, 동일한 조직 배양 혈관, 배지 성분 및 부피, 세포 도금 밀도 및 바이러스 준비를 사전 해동 없이 사용하는 것이 중요하다. 다양한 형식 또는 조건에서 측정된 측정은 스크리닝 형식으로 안정적으로 확장되지 않습니다.
LCV2::TKOv3와 같은 올인원 CRISPR-Cas9 가이드 라이브러리를 사용하는 이점에도 불구하고 Cas9를 코딩하는 유전자는 매우 커서 바이러스 입자(105-106 TU/mL)로 효율적으로 패키징하기가 어렵습니다. 더 낮은 렌티바이러스 적티를 전달하는 것은 올원-CRISPR 라이브러리에 더 많은 어려움을 가지기 때문에 트랜스듀서하기 어려운 세포주에게 는 한계가 될 수 있습니다. 이를 완화하기 위해 Cas9는 세포주에서 미리 발현되어야 하며, 그 다음에 는 훨씬 더 높은 티터(10 7-108 TU/mL)에서 이루어질 수 있는sgRNAs(예: pLCKO2::TKOv3)만을 포함하는 CRISPR 라이브러리의 전달이 뒤따릅니다. 세포주의 ploidy는 또한 중요합니다, 그것은 수정될 필요가 있는 표적 loci의 수를 결정하기 때문에. haploid 세포에 있는 완전한 녹아웃을 생성하는 기능은 주어진 유전자의 다중 사본이 있는 세포에서 보다는 더 효율적입니다. 따라서, haploid 세포에서의 스크린은 디플로이드 또는 이수엽 세포주에서 수행되는 스크린보다 더 민감하고 더 높은 품질의 데이터를 산출할 수있다 6. 표현형에 연결되는 알려진 유전자를 시험하는 것은 세포주 모형의 스크린 능력을 결정하는 것을 도울 것입니다. 예를 들어, 필수성 스크린의 경우, 26S 프로테아좀, PSMD1(Addgene: plasmid #74180)의 소부를 대상으로 하는 가이드는 PSMD1의 교란으로 세포주 편집 효율 및 감염성을 테스트하는데 사용될 수 있습니다. 세포 사멸을 초래할 것입니다.
풀화 된 스크린의 견고성은 sgRNA 표현에 크게 좌우됩니다. 이는 화면 중 라이브러리 성능과 조회수를 식별하는 기능을 결정하는 중요한 메트릭입니다. 라이브러리 다양성은 각 sgRNA의 표현에 편향되어; 따라서, 스크리닝 및 분석할 세포의 집단은 과소 대표되는 sgRNAs6의포획을 보장하기에 충분히 커야 한다. 각 sgRNA의 200-1000배 표현은 출판된 스크린(즉, sgRNA당 200-1000세포)에서 사용된 전형적인 커버리지(즉, sgRNA당 200-1000세포)10,15이다. 이 표현은 라이브러리 플라스미드(섹션 1)를 증폭할 때, 그리고 필요한 셀 번호(섹션 5)를 감염 및 통과시켜 서열 화 라이브러리 동안 에 걸쳐 유지되어야 합니다. 준비 (프로토콜 6), 프로토콜 전반에 걸쳐 설명된 대로. 예를 들어, TKOv3 라이브러리의 ~200배 커버리지를 달성하려면 1,500만 개의 감염된 세포를 선택및 통과시켜야 합니다. 시퀀싱 동안, 디플로이드 인간 게놈이 게놈 당 ~7.2 pg의 DNA 및 1 sgRNA를 함유한다고 가정하면, 총 100 μg의 게놈 DNA가 1,500만 서열 판독을 위한 시퀀싱 라이브러리를 생성하는 데 요구된다. 더 큰 라이브러리의 적용 범위는 유지 관리가 어렵고 기술적으로 실용적이지 않을 수 있는 더 많은 수의 셀을 배양해야 하므로 적용 범위의 결정은 라이브러리의 크기에 따라 달라집니다. TKOv3 라이브러리에서는 200배의 검사가 많은 수의 세포를 선별하고 제한된 실제 생물학적 sgRNA 드롭아웃을 감지하기에 충분한 동적 범위를 유지하는 것 사이의 최적의 균형을 제공하기 때문에 최소 200배 커버리지를 권장합니다. 임의 고갈에서 잡음22,23. 폴드 라이브러리 표현이 높을수록 재현성이 향상되고 특히 부정적인 선택의 경우 sgRNA 풍부도의 변화를 감지할 수 있는 충분한 창이 보장됩니다. 네거티브 스크린의 제한적인 특징은 섭동이 시작라이브러리(24)에존재했던 범위까지만 고갈된다는 것입니다. 비교에서, 양성 선택 스크린의 동적 범위는 세포의 농축에 의존하기 때문에 훨씬 더 크고, 최종 인구23의100 %까지 풍부할 수 있습니다. 따라서, 양성 선택 스크린(예를 들어, 약물 내성 스크린)의 경우, 라이브러리 커버리지 및 판독 깊이는 작은 세포 집단만이 살아남을 것으로 예상되기 때문에 50-100배 표현으로 감소될 수 있다.
여기서 설명된 시퀀싱 라이브러리 프로토콜은 벡터 백본 모두에서 TKOv3 CRISPR 라이브러리에 최적화된 2단계 PCR이며 일루미나 시퀀싱 플랫폼에서 시퀀싱됩니다. 이러한 시퀀싱 라이브러리는 또한 Hartet al.3에기재된 것과 유사한 단일 PCR 프로토콜을 사용하여 생성될 수 있다. 다른 기성 라이브러리의 경우 해당 라이브러리에 대해 제공되는 프라이머 및 시퀀싱 프로토콜을 참조해야 합니다. 게놈 DNA 및 PCR 견본을 준비할 때, 오염 예방조치를 배려하는 것이 필수적입니다. 예를 들어, 게놈 DNA 정제를 위한 전용 영역은 적극 권장됩니다. 그것은 또한 게놈 DNA 견본에서 찾아낸 일반적인 오염물질인 세균성 plasmid 준비에서 물리적으로 구별되어야 합니다. PCR 반응은 플라스미드 및 기타 시퀀싱 라이브러리의 오염을 최소화하기 때문에 전용 PCR 후드에 설정해야 합니다. 좋은 사례를 위해 PCR 오염을 모니터링하는 데 도움이 되는 템플릿 없음 음성 제어를 포함할 수 있습니다.
화면에서 시퀀싱 읽기를 번역하는 데이터 분석은 이러한 데이터 집합의 크기와 다양성을 고려할 때 사소한 작업입니다. 시퀀스 판독이 정렬되고 정규화되면 여러 생물정보학 도구를 사용하여 화면 성능 평가를 지원할 수있습니다(그림 3)및 적중 식별(그림4). BAGEL은 이 프로토콜에서 데이터 분석을 위한 핵심 도구로 설명합니다. BAGEL은 베이지안 프레임워크를 사용하여 알려진 필수 및 비필수 유전자 세트의 분포를 유전자를 표적으로 하는 모든 가이드의 로그 폴드 변경과 비교합니다. 이 방법은 Hart etal3에자세히 설명되어 있습니다. BAGEL 외에도 MAGeCK25와 같이 농축 및 고갈된 sgRNAs를 모두 식별하도록 설계된 다른 알고리즘도 사용할 수 있습니다. 약물 스크린의 경우, DrugZ 알고리즘을 사용하여 시너지 및 억제기 화학 적 유전 적 상호 작용을 식별하는 것이 좋습니다. DrugZ는 치료된 집단에서 sgRNA의 상대적 풍부도를 동일한 시점20에서치료되지 않은 집단에서 의 sgRNA의 상대적 풍부와 비교하도록 설계되었다.
CRISPR 스크린의 한계는 Cas9가 생성된 인델이 프레임 내 돌연변이일 가능성이 항상 있기 때문에, 유전자 기능을 그대로13을남기기 때문에 항상 녹아웃으로 이끌어 내는 것은 아니라는 것입니다. 이로 인해 인구가 혼합되어 화면이 "시상"하고 데이터 해석이 어려워지게 됩니다. 유전자를 표적으로 하는 다중 독립적인 sgRNAs를 사용하여 낮은 활동으로 sgRNAs의 효력을 감소시키는 중복을 구축할 수 있습니다. CRISPR 연구 결과에 추가 주의는 표적으로 되는 유전자의 독립적인 세포 치사로 이끌어 낼 수 있는 Cas9 뉴클레아제에 의해 생성된 이중 가닥 나누기의 효력입니다. 이러한 항증식 효과는 표적 부위 카피 수에 따라 증가하며, 고도로 증폭된 영역26내에서 유전자의 거짓 양성 식별을 이끈다. CERES와 같은 전산 방법은 카피 수 효과27을수정하기 위해 개발되었습니다. 이러한 워크플로우에서는 녹아웃 기반 필수 화면에서 유전자 종속성 수준을 추정하기 위해 복사 수 효과를 고려합니다. 증폭된 지역에서 히트 유전자의 게놈 위치를 주의 깊게 검사하면 절단 효과13의복합성으로 인한 거짓 긍정을 결정하는 데 도움이 될 수 있다. 기본 화면은 잠재적인 조회만 식별할 수 있습니다. 히트를 확인하고 오프 타겟 효과에서 대상을 구별하기 위해 보조 화면 또는 프로토콜로 후속 조치가 중요합니다, 거짓 긍정을 제거하고 비효율적인 교란으로 인해 약하게 득점 유전자를 보장 거짓으로 뒤에 남아 있지 않습니다 네거티브23.
이 프로토콜은 생존 성 기반 스크리닝 접근법에 초점을 맞추고, 연구의 상태는 세포의 증식 결함 또는 죽음으로 이어질 한다. 세포 생존력의 변화로 이어지지 않는 프로세스의 경우, 생존 성 기반 풀링 스크리닝 방법은 제한적일 수 있습니다. 대안은 형광 활성화 세포 선별(FACS) 접근법에 의한 리포터 또는 마커 기반 의 세포 및 농축을 사용하여 스크린을 수행하는 것이다. 마커 기반 선택 화면에서, 표현형은 세포 건강13,23보다는마커 유전자 발현을 조절하는 돌연변이에 기초한다. 배열된 CRISPR 형식은 또한 잘 검열 당 1개의 유전자를 위해 유효합니다. 배열된 형식은 복잡하거나 현미경 검사법 기반 판독에 더 많이 사용할 수 있습니다. 그러나 배열 된 형식은 자동화 된 장비와 많은 양의 시약28을필요로합니다.
여기에서 논의된 스크리닝 프로토콜은 S. pyogenes Cas9 뉴클레아제를 사용하여 유전자 스크린에 가장 널리 사용되고 많은 라이브러리가 사용할 수 있는 null alleles를 생성합니다(Addgene: Pooled Library). 녹아웃 라이브러리에 대한 대체 옵션도 사용할 수 있습니다, 이는 촉매 죽은 dCas9를 사용하여 크로마틴 수정단백질에 묶여 억제 (CRISPRi) 또는 활성화 (CRISPRa) 유전자의 전사. RNAi와 유사하게, CRISPRi는 완전한 녹아웃을 견딜 수 없는 다른 유전자 복용량 및 필수 유전자에 있는 현상형 효력을 공부하는 기능을 제안합니다, CRISPRa는 기능의 이득 스크린을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 있는 동안. 이러한 각 기술에는 장점이 있지만 일반적으로 CRISPR 녹아웃 접근 방식이 가장 많이 개발됩니다. CRISPRi 및 shRNAs5를사용하는 노크 다운 접근법과 비교할 때 특히 치사성 기반 필수 유전자 화면에서 낮은 노이즈, 최소한의 오프 타겟 효과 및 실험 일관성으로 잘 수행하는 것으로 입증되었습니다. 현재까지 광범위한 적용 가능성에도 불구하고 CRISPR 스크리닝 기술은 초기 단계에 있습니다. CRISPR의 기본 구성 요소에서 새로운 도구가 계속 빌드되고 있습니다. 여기에는 다중 게놈 loci를 표적으로 할 수 있는 조합 유전자 편집 전략, 직교 Cas 효소의 최적화, 및 Cas9 활동을 다양화하기 위하여 염색질 기능성 도메인을 가진 수정이 포함됩니다. CRISPR 기술이 계속 성장함에 따라, 유전자 스크리닝 접근법에 대한 결합은 유전학에서 기능적 발견을 위한 강력한 플랫폼이 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 일은 게놈 캐나다, 온타리오 연구 기금 및 건강 연구를 위한 캐나다 학회 (MOP-142375, PJT-148802)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
References
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