Summary
CRISPR-Cas9技術は、あらゆる細胞型の哺乳類ゲノムを正確に編集する効率的な方法を提供し、ゲノム全体の遺伝スクリーンを実行する新しい手段を表します。プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9スクリーンのパフォーマンスを成功させるには必要な手順を説明する詳細なプロトコルをここで提供します。
Abstract
CRISPR-Casシステムを用いてゲノム編集を行い、様々な生物のゲノムを精密に編集する能力を大幅に向上させています。哺乳類細胞の文脈では、この技術は、機能的ゲノミクス研究のためのゲノム全体の遺伝的スクリーンを実行するための新しい手段を表す。すべての開いた読み取りフレームを標的とするガイドRNA(sgRNA)のライブラリは、遺伝子機能および細胞プロセスを含む特定の表現型をスクリーニングすることができる細胞の単一プール内の何千もの遺伝的摂動の顔の生成を可能にする公平で体系的な方法。CRISPR-Casスクリーンは、細胞の型示体の遺伝的青写真を明らかにするために、簡単で効率的で安価な方法を研究者に提供します。さらに、様々な細胞株や異なるがんタイプから行われるスクリーンの微分解析により、腫瘍細胞に文脈的に不可欠な遺伝子を同定し、特定の抗癌治療の潜在的な標的を明らかにすることができます。ヒト細胞でゲノム全体のスクリーンを実行することは、数千万個の細胞の処理を伴い、大規模なデータセットの分析を必要とするので、困難な場合があります。セルラインの特性認識、CRISPR ライブラリの考慮事項、解析中の CRISPR テクノロジの制限と機能の理解など、これらの画面の詳細は見落とされることがよくあります。ここでは、プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9ベースの画面の正常なパフォーマンスのための詳細なプロトコルを提供します。
Introduction
CRISPR-Casは、クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピートおよびCRISPR関連ヌクレアーゼの略で、合成ガイドRNA(sgRNA)と複合体内の単一のヌクレアーゼタンパク質(例えば、Cas9)から構成される。このリボヌクレオタンパク質複合体は、Cas9酵素を標的とし、特定のゲノム遺伝子座1で二本鎖DNA破断を誘導する。二本鎖の切断は、相同性指向修復(HDR)を介して修復することができ、より一般的には、非相同エンド結合(NHEJ)を介して、遺伝子機能を頻繁に破壊する挿入および/または欠失(INDELS)をもたらすエラーが発生しやすい修復メカニズム1.CRISPRの効率性とシンプルさは、以前のゲノム編集技術(すなわち、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZNF)または転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ()をはるかに上回る、これまで達成不可能なレベルのゲノムターゲティングを可能にします。TALENS)は、いずれも設計の複雑さの増大、トランスフェクション効率の低下、多重遺伝子編集2の限界に苦しんでいる。
CRISPRシングルガイドRNAベースのゲノム編集の基礎研究アプリケーションは、科学者が効率的かつ安価に個々の遺伝子の機能と遺伝的相互作用ネットワークのトポロジーを問うことを可能にしました。機能的ゲノムワイドスクリーンを実行する能力は、特にRNA干渉(RNAi)や遺伝子トラップ変異などの以前の遺伝的摂動技術と比較した場合、CRISPR-Casシステムの使用によって大幅に強化されました。特に、RNAiは高いオフターゲット効果と不完全なノックダウンに苦しんでおり、CRISPR3、4、5に比べて感度と特異性が低く、遺伝子トラップ法はハプロイドでのみ実現可能です。機能喪失画面のセルは、尋問可能なセルモデルの範囲を制限する 6.完全な遺伝子ノックアウトを生成するCRISPRの能力は、低ノイズ、最小限のオフターゲット効果と試薬5全体の一貫した活性で、変異型の現象型を調知するためのより生物学的に堅牢なシステムを提供します。ヒトゲノム全体を標的とするCRISPR-Cas9 sgRNAライブラリーが広く利用可能となり、1回の実験で何千もの遺伝子ノックアウトを同時に生成できる3、7、8、9.
トロントノックアウト(TKO)ライブラリー(Addgeneを通じて入手可能)と呼ばれる独自のCRISPR-Cas9ゲノムワイドsgRNAレンチウイルスライブラリを開発し、高解像度機能ゲノミクススクリーンを容易にするためにコンパクトでシーケンス最適化されています。最新のライブラリTKOv3は、経験データ10を使用して効率を編集するために最適化された71,090ガイドを持つ〜18,000人のヒトタンパク質コード遺伝子を対象としています。さらに、TKOv3は、単一のベクター上でCas9およびsgRNAを発現する1成分ライブラリ(LCV2:TKOv3、Addgene ID#90294)として利用可能であり、安定したCas9発現細胞を生成する必要性を緩和し、幅広いゲノムワイドノックアウトを可能にする。哺乳類細胞型。TKOv3は、Cas9(pLCKO2::TKOv3、アディジーンID#125517)を持たないベクターでも利用可能であり、Cas911を発現する細胞で利用することができる。
ゲノム全体のCRISPR-Cas9編集細胞集団は、次世代シーケンシングによって時間の経過とともに定量化されたsgRNAの豊富さと異なる増殖条件にさらされる可能性があります。摂 動。CRISPRノックアウトライブラリーは、摂動時に細胞フィットネス欠陥を引き起こし、中程度の薬物感受性(例えば、感受性または耐性遺伝子)、タンパク質発現を調節する(例えば、レポーター)、または特定の遺伝子を同定するために利用することができる。経路機能および細胞状態12、13、14。例えば、癌細胞株における差動適合性スクリーンは、腫瘍遺伝子および濃縮の枯渇または減少または腫瘍抑制遺伝子3、14、15の増加の両方を同定することができる。同様に、治療薬の中間用量を使用すると、薬剤耐性および感量遺伝子16、17の両方を明らかにすることができる。
ここでは、ライブラリー生成からデータ解析までの哺乳類細胞におけるトロントノックアウトライブラリー(TKOv1またはv3)を用いてゲノムスケールCRISPR-Cas9の機能喪失スクリーニングのための詳細なスクリーニングプロトコルを提供します。このプロトコルは、トロントノックアウトライブラリを使用してスクリーニング用に最適化されていますが、適用でき、すべてのCRISPR sgRNAプールライブラリにスケーラブルにすることができます。
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Protocol
以下に概説する実験は、研究所の環境保健安全局のガイドラインに従うべきである。
1. プールされたCRISPR sgRNAレンチウイルスライブラリープラスミド増幅
- 既製のCRISPR sgRNAプラスミドDNAライブラリーをTEで50ng/μL(例えば、TKOv3)に希釈します。
- エレクトロコンピテントセルを使用してライブラリを電気ポレートします。以下に説明するように合計4つのエレクトロポレーション反応を設定する。
- 氷上の予め冷やされたキュベット(1.0 mm)に解凍された電気有能な細胞の25 μLに50 ng/μL TKOライブラリの2 μLを追加します。
- 製造元のプロトコルによって提案される最適な設定を使用して電気ポレートします。パルスの10s以内に、975 μLの回収媒体(またはSOC培地)をキュベットに加えます。
- 電ポレートされた細胞を培養管に移し、回収培地の1mLを加える。37°Cで1時間250rpmで揺れるインキュベーターでチューブをインキュベートします。
- ライブラリを盛り上げ、変換効率を推定するために希釈プレートを設定します。
- 回収した細胞の全8mLをプールし、よく混ぜます。プールされた細胞の10 μLを回収媒体の990 μLに移し、800倍の希釈を行い、よく混合します。
- 予め温められた10 cm LB +カルベニシリン(100 μg/L)寒天板に希釈のプレート20 μL。これにより、変換効率の計算に使用される変換体の 40,000 倍の希釈が行われます。
- 各プレート上の回収細胞のプレート400 μLを、合計20個の予温められた15cm LB +カルベニシリン寒天プレートにわたってにわたって行う。30°Cで14-16時間プレートをインキュベートします。
注:この低い温度での成長は長端の反復(LTR)18間の再組み換えを最小にする。 - 変換効率を計算するには、40,000 倍の希釈プレート上のコロニーの数をカウントします (ステップ 1.3.2)。すべてのプレート上のコロニーの合計数を取得するために、40,000 でカウントされたコロニーの数を乗算します。コロニーの合計数が sgRNA あたりの最小 200x コロニーに相当するライブラリー カバレッジを表す場合に続行します (最も最適なのは 500 ~ 1000 倍)。
- 例えば、TKOv3ライブラリー(71,090 sgRNA)の最小コロニー数は1.4 x 107であり、sgRNA当たり200倍のコロニーに相当します。コロニー表現が不十分な場合は、希釈プレート上のコロニー数に基づいてステップ1.2のエレクトロポレーションの数を増やし、最小のライブラリーカバレッジを達成します。
- 以下に説明するようにコロニーを収穫
- 各15cmプレートに、LB+カルベニシリン(100μg/L)培地の7 mLを追加し、細胞拡散機でコロニーを削り取ります。10 mLピペットを使用して、スクローした細胞を無菌1L円錐フラスコまたはボトルに移します。
- もう一度LB +カルベニシリン培地の5 mLでプレートをすすいで、ボトルに溶液を転送します。
- すべてのプレートが20枚のプレートから無菌ボトルに細胞をプールするために繰り返します。
- 集めた細胞を室温(RT)で1時間かき混ぜて混ぜて細胞塊を分解する。細胞を予め計量された遠心ボトルに移し、7,000 x gの遠心分離機をペレット細菌に移し、培体を廃棄する。
- 湿った細胞ペレットを計量し、遠心分離機の重量を減算して、湿ったペレットの最終的な重量を決定します。各カラムが処理できる細菌ペレットの量に応じて、マキシまたはメガスケールのプラスミド精製キットを用いてプラスミドDNAを精製する。
2. 大規模なCRISPR sgRNAライブラリーレンチウイルス産生
注: プロトコルのこのセクションのすべてのステップは、クラス II、タイプ A2 バイオセーフティ キャビネットの BSL2+ 機能で実行されます。
- ウイルスの18 mLは、通常、1つの15センチメートルプレートから収穫される推定に基づいて、ウイルスの生産に必要な15センチメートルプレートの数を計算します。
- 低抗生物質増殖培地(DMEM+10%FBS+オプション:0.1xペン/ストレップ)でHEK-293T包装細胞を20mLの20mLの15cmプレート当たり8 x 106細胞で播種することによりトランスフェクション用の細胞を調製する。細胞を37°C、5%CO2で一晩インキュベートする。めっきされた細胞が70%~80%のコンフルエントであり、トランスフェクションの瞬間に均等に広がっていることを確認します。
- 翌日、表1に概説されているように、15cmプレート用に3つのトランスフェクションプラスミド混合物を調製する。1回のトランスフェクションに必要なプラスミドの量を計算し、プレートの数にプラスミドを混ぜて、トランスフェクションするプラスミドを作ります。
- 表2に概説されているように、トランスフェクション毎に脂質ベースのトランスフェクション試薬を調製する。アリコットは、トランスフェクトされるプレートの数のために、個々の1.5 mLマイクロ遠心管に血清培剤を減らしました。トランスフェクション試薬を追加し、穏やかに混合し、RTで5分間インキュベートします。
- 5分間のインキュベーションに続いて、トランスフェクション試薬に1回のトランスフェクションに必要なDNA量を加え、DNA複合体のトランスフェクション試薬とμgの3:1比を追加します。穏やかに混合し、RTで30分間インキュベートします。
注:その後のトランスフェクションは、時間を最適化し、オーバーインキュベーションを避けるために5分間隔で、5分以下のセットで準備することができます。 - インキュベーションの30分後、慎重に包装細胞の各プレートに各トランスフェクションミックスを転送します。セル単層を妨げることなく、円形のジグザグ運動で1 mLピペットチップを使用してミックス全体を追加します。細胞を37°Cで18時間、CO2でインキュベートする。
- ウイルス収穫媒体を調圧する:500 mLのDMEM培地+32mLのBSAストック(20g/100mL、DMEMに溶解し、0.22μmフィルターで殺菌したフィルター)+100倍ペン/ストレップの5mL。
- 18時間後、培地を取り除きます(処分前に1%次亜塩素酸ナトリウムでインキュベーションなどのレンチウイルス廃棄物を適切に取り扱います)。各プレートに18 mLのウイルス収穫培地をゆっくりと交換してください。細胞を37°Cで18時間、CO2でインキュベートする。
- 24時間後、良好なウイルス産生の指標として、異常および融合形態の包装細胞をチェックしてください。その後、すべての上清を収集し、無菌円錐遠心管に転送することにより、レンチウイルスを収穫します。
- ウイルスを含む培体を300xgで5分間回転させ、包装細胞をペレットにします。 上清をペレットを乱さずに無菌ポリプロピレンチューブに入れます。
- ウイルスを短期間(1週間未満)、または-80°Cで直ちに長期保存してください。Aliquotの大規模なウイルスは、凍結/解凍を避けるために、長期保存のための単一の使用量に準備します。
3. スクリーニング用セルラインの特性
- 目的のセルラインを選択します。
- セルのおおよその倍数を測定および記録します。
- 選択した組織培養容器(例えば、15cm組織培養プレート)で3〜4細胞倍増ごとに細胞を培養するための最適な細胞めっき密度を決定する。
- ピューロマイシン耐性マーカーを含むTKOライブラリーの選択のために所望の細胞株で使用するピューロマイシン濃度を次のように決定します。
- 72時間後に合流に達するために必要な密度で12ウェルプレート中の種子細胞を、次いで一晩インキュベートする(37°C、5%CO2)。
- 翌日、0 μg/mL から 10 μg/mL までのプロマイシン濃度の希釈範囲を含む培地に、0.5 μg/mL 単位で変更します。細胞を48時間インキュベートする。
- 48時間後、細胞計数またはアラマールブルー染色により細胞生存率を測定する。
- 48時間で細胞の100%を殺す最低濃度を決定する この濃度を使用して、ステップ4.6および5.2.6でCRISPRライブラリー変換細胞集団を選択します。
注:より長い倍増時間を持つ細胞株の場合、ピューロマイシンを使用したより長いインキュベーションを許容することができます。このような状況では、<3 細胞の倍増に必要なインキュベーション時間のキルカーブを決定します。スクリーニング開始前に必須遺伝子の脱落を避けるために、選択の時間を最小限に抑えます。
- プロマイシン感受性の測定と同じ方法で用量応答曲線を実行することにより、ブロミドヘキサジメトリン(最大8μg/mL)に対する細胞の感受性を確認してください(ステップ3.2)。ヘキサジメトリン臭化物の<8 μg/mLで毒性が認められる場合は使用しないでください。
4. MOIの決定のためのプールされたCRISPRレンチウイルスライブラリーの機能的滴定
- プールされたCRISPR sgRNAライブラリーレンチウイルス(例えば、LCV2:TKOv3)の新鮮なアリコートを解凍し、氷の上に保ちます。
- 0~ 2 mL の範囲 (0 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、および 2 mL) の範囲でテストする一連のウイルス ボリュームを設計します。
- 72時間で合流に達するために必要な密度で15cmプレートで標的細胞および種子細胞を収穫する。
- テストする各ウイルス量に対して、複製プレートを準備します。細胞、ウイルス、ヘキサジメトリン臭化物(8 μg/mL)、および培中を20mLの最終体積に加えます。プレートを十分に混合し、インキュベーターでプレートレベルに座り、24時間(37°C、5%CO2)のインキュベートを行います。
- 24時間後、培地を含むウイルスを除去し、処分する(レンチウイルス廃棄物の取り扱いにバイオセーフティの注意を使用する)。必要に応じて、温かいPBSでプレートを穏やかに洗浄し、無関係なウイルスを除去します。
- 各ウイルス状態について、セクション3で細胞を殺すと判定した濃度を用いてピューロマイシンを含む培地を20mLに置き換え、1つの複製プレートに置き換える。もう一方のプレートに、ピューロマイシンなしで20mLの新鮮な培地を加えます。48時間(37°C、5%CO2)のインキュベートを行います。
- 48時間後、ピューロマイシンで処理されたすべての未感染細胞(0 mLウイルス状態)が死んでいることを確認してください。すべてのプレートを個別に収穫し、穏やかなピペッティングを繰り返すことによって細胞を分散させます。
- すべてのプレートから細胞をカウントし、ピューロマイシンを含まない細胞数(すなわち+/-ピューロマイシン)と細胞数を比較することにより、各ウイルス体積のMOIを計算します。
- グラフの結果は、ピューロマイシンを選択した場合とピューロマイシンを選択した30%~40%の細胞生存につながるウイルス体積を決定する結果である。同じ組織培養条件下で画面中に0.3-0.4のMOIを達成するために、このウイルス量を使用してください。
5. 一次画面感染、選択、細胞通過
- 画面全体で維持する CRISPR sgRNA ライブラリ カバレッジを選択します(推奨される最小値は 200 倍)。
- ライブラリーカバレッジに基づいて、sgRNA当たりのカバレッジを維持するために必要な細胞数と、MOI 0.3(表3)で感染に必要な細胞の数を決定します。
- 感染をセットアップするために必要なプレートの数を決定します (表 4).
- CRISPR ライブラリを使用したセルへの感染
- 細胞を収穫し、各15cmプレートに必要な細胞数を播種する。
- すべてのプレートにヘキサジメトリン臭化(8 μg/mL)を加えます。
- MOI 0.3に必要な体積でウイルスをスクリーニングとコントロール2プレートに追加します。コントロール 1 の場合は、ウイルスを追加せず、そのボリュームをメディアに置き換えます。
- プレートを傾けてよく混ぜます。プレートをインキュベーターに入れ、水平であることを確認します。
注:バッチ感染は、めっき前に懸濁液中の細胞にウイルス、メディア、ヘキサジメトリン臭化物のマスターミックスを組み合わせることによって行うことができます。 - 培中を取り出し、スクリーニングにステップ3.2.4で決定した濃度でピューロマイシンを含む新鮮な培体に置き換え、ウイルス感染後24時間を制御する。コントロール2プレートにピューロマイシンを含む新鮮な媒体を追加します。48時間(37°C、5%CO2)の細胞をインキュベートする。
- ピューロマイシンを加えて48時間後、すべての未感染細胞が死んでいることを確認し(対1)、ピューロマイシン活性を確認し、感染した細胞を収穫する。
- 感染した細胞集団の収穫と細胞通過
- すべてのスクリーニングプレートからピューロマイシン選択細胞を1つの滅菌容器に収穫します。各コントロールプレートからセルを個別に収集します。穏やかな繰り返しピペッティングによって細胞を分散させる。
- プールされたスクリーニングセルから細胞をカウントし、制御1、および制御2を別々にカウントし、1 mLあたりの細胞数を計算する。
- MOI とフォールド カバレッジを次のように計算します。
- ゲノムDNA抽出のために選択されたライブラリーカバレッジでプールされた細胞から細胞ペレットの3つの複製を収集します。細胞を500 x gで5分間遠心分離し、PBSで洗います。チューブにラベルを付け、-80 °Cで細胞ペレットを凍結乾燥します(これらはT0リファレンスサンプルです)。
- 感染した細胞のプールを3つの反復群(例えば、反復A、反復B、複製C)に分割し、各反復内のライブラリーカバレッジを維持する。シードセルは、通常、それらを展開するときに使用されるのと同じシード密度でセル。反復プレートごとに同じ数のセルを使用し、反復間のセルの合計数を同じにします。
- 細胞を通過し続け、上記のようにプール感染細胞の各複製から3回の細胞ペレットの複製を、細胞株に応じて3〜8日ごとに、最大15〜20細胞の倍増のために収穫する。各通路において、各複製群内のすべてのプレートから細胞を収穫する(すなわち、複製Aプレートからのすべての細胞が再混合され、複製Bプレートからのすべての細胞が再混合される等)。
- 各ペレットに時間(T)のラベルを付け、指定を複製します。これは、ペレットが収集された T0 後の日数 (T3_A、T3_B、T3_C など) に対応します。
- 陰性選択薬物スクリーンの場合、治療前にT0後に少なくとも1回の経過のために細胞が回復することを可能にする。T3またはT6では、ステップ5.3.5で使用されるのと同じシード密度を使用して、各反復群(A、B、C)から薬物治療および対照集団に細胞を分割する。
- 薬物治療グループ内の各反復のライブラリーカバレッジに必要なセル数を別途プールします。中間濃度で薬剤を添加する(IC20-IC50)。細胞を播種し、次の通路までインキュベート(37°C、5%CO2)を入れる。
- 車両制御グループ内の各反復のライブラリ カバレッジに必要なセルの数を個別にプールします。薬物と同じ容積を使用して車両制御を追加します(<0.5% v/v)。細胞を播種し、次の通路までインキュベート(37°C、5%CO2)を入れる。
- ステップ5.3.5に記載されているように、細胞を通過させ、ゲノムDNAの細胞ペレットを3日ごとに収穫し、各通路で薬物または車両をリフレッシュする。
- 陽性選択または薬剤耐性スクリーンの場合は、ライブラリーカバレッジに必要なセル数に応じて各反復群を分割します。各反復にIC90の薬物濃度を加える。IC90では、細胞の大半が殺されます。耐性集団が成長し、ゲノムDNA抽出のための細胞ペレット(1-2 x 107細胞)を収集できるようにします。
6. CRISPRサンプルの調製とシーケンシング
- ゲノムDNA精製
- 解凍のためにRTで5-10分間凍結細胞ペレットをインキュベートします。
- セルペレットを含む50 mL遠心管に1.4mLのPBSを追加します。細胞を再中断し、1分間休息するために20sのための渦。必要に応じて、P1000を使用してピペット15xを使用して、残りの細胞塊を分解します。15 mLまたは1.5 mLチューブから細胞を転写する場合は、1mLのPBSで細胞を再転写し、50 mLチューブに細胞を移し、400 μLのPBSで元のチューブをすすいでください。
- 再懸濁した細胞に5 mLの核溶解溶液を添加する。10 mLピペットを使用して、上下5xをピペットでサンプルを混合します。
- 核リザートに32 μLのRNase A(20mg/mL;100 μg/mL)を加え、チューブ5xを反転してサンプルを混合します。37°Cで15分間インキュベートし、サンプルがRTで10分間冷却できるようにします。
- 1.67 mLのタンパク質沈殿液を溶解液に加え、20秒間激しく渦を加えると、混合後に小さなタンパク質塊が見える場合があります。
- RTで10分間4,500 x gの遠心分離機。
- 10 mLピペットを使用して、上清を5mLのイソプロパノールを含む50 mL遠心管に移します。DNAが観察されるまで、溶液10xを反転して穏やかに混合する。
注:DNAは、目に見える塊を形成する白い糸状の鎖として観察することができます。 - DNAをペレットするためにRTで5分間4,500 x gで遠心分離機。
- 10 mLピペットを使用して、上清を慎重に取り除き、DNAペレットを外さないようにしてください。RTで70%エタノールの5 mLをDNAに加えます。チューブをゆっくりと回転させて、遠心管のDNAペレットと側面を洗浄します。
- RTで5分間4,500 x gの遠心分離機。
- 10 mLピペットを使用して、70%のエタノールを慎重に除去し、DNAペレットを外さないようにしてください。RTで10分間の空気乾燥ゲノムDNA。
- チューブに400μLのTE溶液を加え、1時間ごとに65°CでインキュベートしてDNAを溶かします。DNAが完全に溶解しない場合は、チューブを15分ごとに穏やかにフリックしながら、さらに1時間65°Cでチューブをインキュベートし、一晩4°Cのままにします。
- RTで1分間4,500 x gの遠心分離機を用いて、ゲノムDNAを1.5mLの低結合チューブに移す。
- 分光光度計(全核酸含有量)と蛍光計(二本鎖DNA含有量の場合)の両方でゲノムDNAの純度を定量し、測定します。
- 必要に応じて、sgRNAの下流PCR増幅に問題がある場合は、以下のようにゲノムDNAを沈殿させる。
- 400 μL ゲノムDNAを1.5mLマイクロ遠心管に移す。
- 5 M NaCl の 18 μL (最終濃度 0.2 M) と 95% エタノールの 900 μL を追加します。
- チューブを完全に混合するまで10xを反転し、RTで10分間16,000 x gで遠心分離します。
- 上清を慎重に取り除き、DNAペレットを外さないようにしてください。70%エタノールの500 μLでDNAペレットを洗浄します。チューブをゆっくりと回転させてDNAペレットを洗浄します。
- RTで5分間16,000 x gの遠心分離機。
- 慎重に上清を取り除き、DNAペレットを外さないようにしてください。RTで10分間の空気乾燥ゲノムDNA。
- 手順6.1.12で説明されているようにDNAを溶解するためにTEの300 μLを追加します。
- ステップ6.1.14に記載されているゲノムDNAの純度を定量し、測定します。
- CRISPR シーケンス ライブラリの準備
- 表5に概説されているように、合計100μgのゲノムDNAを用いてPCR1をセットアップする。50 μL反応あたり3.5 μgのゲノムDNAを追加し、同一の50 μL反応を設定して、所望のカバレッジを達成します。表 6に、LCV2::TKOv3 シーケンス ライブラリの増幅のためのプライマー シーケンスの例を示します。表 7に、pLCKO2::TKOv3 シーケンスライブラリの増幅のためのプライマーシーケンスの例を示します。
- 表8に概説するプログラムを使用して、サーモサイクラー中のPCR 1反応を増幅する。
- 1%のアガロースゲルでPCR製品の2μLを実行してPCR1増幅を確認してください。PCR 1 は 600 bp の積を生成します。
- 各ゲノムDNAサンプルに対するすべての個々の50 μL反応をプールし、渦によって混合する。
- プールされた PCR 1 製品の 5 μL をテンプレートとして使用して、表 9に概説されているように、各サンプルに対して 1 つの PCR 2 反応 (50 μL) を設定します。個々のサンプルごとに固有のインデックス プライマーの組み合わせを使用して、シーケンス ライブラリ サンプルのプールを許可します。
- 表10に概説するプログラムを用いて、サーモサイクラー中のPCR2反応を増幅する。
- ゲルを鋳造する前に0.1 N HClで増幅された製品を10分間精製するためのクリーンアガロースゲル装置。PCR2増幅産物を精製するためのDNA染色を含む2%アガロースゲルを調剤する。
- PCR 2製品を低電圧(1.0~1.5h実行)で2%アガロースゲルで実行します。PCR 2 は 200 bp の製品を生成します。
- 青色光トランジユミレータでPCR製品を可視化します。200 bpバンドを切除し、ゲル抽出キットを使用してアガロースゲルスライスからDNAを精製します。分光光度計と蛍光計の両方でシーケンシングライブラリの純度を定量し、測定します。
注:典型的なゲル精製シーケンシングライブラリ濃度は、5〜10 ng/μLおよび150〜300 ngの総収率の範囲である。
- ハイスループットシーケンス
- 次世代シーケンサーで CRISPR シーケンス ライブラリをシーケンスします。
- 400~ 500 倍のライブラリ カバレッジの読み取り深度が高いシーケンスリファレンス T0 サンプル。ドロップアウト画面のシーケンス実験タイムポイントサンプルを、読み取り深度を 200 倍に抑えます。強い肯定的な選択のスクリーンのために、50倍のカバーの最低の読書の深さは濃縮されたsgRNAの識別のために十分である。
注: T0 サンプルをシーケンスして特定の画面のライブラリー表現を決定し、時間の経過に合った sgRNA フォールドの変化を決定するためのリファレンスとして機能することが重要です。
7. データ分析
- Bowtie などのプログラムを使用してシーケンスを並べ合わせて、次のパラメーターを使用して参照ライブラリにシーケンスの読み取りをマップします。
- 特定のサンプルの sgRNA ごとに一意にマップされた読み取りの数を、サンプルごとに 1,000 万読み取りとして正規化します。
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- T0 サンプル (Tn/T0) と比較して、各反復時 (Tn) ごとに各 sgRNA の log2 倍の変化を計算します。ゼロからの不連続性を防ぐために、すべての読み取りカウントに 0.5 読み取りの疑似カウントを追加します。折りたたみ変更計算およびダウンストリーム解析から、T0 サンプルの <30 未処理読み取りを含む sgRNA を除外します。
- 遺伝子本質のベイズ分析(BAGEL)アルゴリズムと共に折り畳みの変化を分析
- BF スコアを使用して、画面パフォーマンス評価の精度とリコールを計算します。上記の BF スコア サブセットと共に、Python の Scikit 学習ライブラリの precision_recall_curve 関数の真の正のリストとして、ステップ 7.4 の必須セットを使用します。または、R の PRROC パッケージを使用して同じ操作を実行します。
- 各遺伝子のすべてのガイドの平均折りたたみ変化を計算します。Rまたは同等のソフトウェアで、必須遺伝子および非必須遺伝子の密度プロットを生成します(ステップ7.4参照)。R では、x.ess が必須遺伝子のログフォールド変更値を含むベクターであり、x.nonEss に非必須遺伝子が含まれている場合は、次のコマンドを使用してプロットします。
プロット( 密度( x.ess) 、 xlab="平均 logFC"、col="赤"、lwd=2 )
線 ( 密度 ( x.nonEss ), col="青",lwd=2 )
注:使用されるPythonバージョンの詳細とパッケージについては、scikit-learn v0.19.1:(Pedregosa et al.21によって公開)を参照してください。
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Representative Results
ゲノムスケールCRISPRスクリーニングワークフローの概要
図1は、単一の統合イベントと適切なライブラリ表現(通常200~1000)を確保するために、低MOIでCRISPRライブラリーレンチウイルスを持つ標的細胞の感染から始まる、プールされたCRISPRスクリーニング作業フローの概要を示しています。-フォールド)。感染後、細胞は抗生物質ピューロマイシンで処理され、トランスプリケートされた細胞を選択する。選択後、ベースラインT0細胞ペレットを収集し、スクリーニング開始時のライブラリー分布を評価します。遺伝的摂動の不均一な集団で構成される残りの細胞は、遺伝子編集と結果の効果が現れるように、15〜20倍の3〜4日ごとに所望のライブラリー表現で通過する。薬物治療を伴うスクリーンは、通常、細胞がウイルス感染およびピューロマイシン選択から回復した後、T3またはT6で追加される。細胞は、ゲノムDNAの全ての通路で所望のライブラリー表現で採取され、所望の時点で次世代シーケンシングによってガイドの豊富さを決定する。
ダウンストリーム シーケンス ライブラリの準備手順で発生する可能性のある障害が発生した場合は、複数のサンプルを収集することをお勧めします。プールされたスクリーンは通常、本質的なsgRNAの肯定的または否定的な選択のために設計されている生存率ベースのアッセイである。陽性スクリーンは、特定の選択圧力(例えば、薬物または変異細胞株)の下で耐性を示すか、生存を増加させる遺伝子を同定する。この場合、ほとんどの細胞は選択から死んでしまい、残っている細胞は、試験中の薬剤または状態に対して耐性のある遺伝子を標的とするsgRNAのために濃縮されます。否定的な選択画面または「ドロップアウト」画面は、画面選択圧力下での生存の感度または損失の増加した遺伝子ノックアウトを識別します。成長欠陥などの表現型効果を持つ摂動を識別するために、各タイムポイントでのガイドの豊富さは、次世代のシーケンシングによって定量化され、T0と比較して、画面上のガイドのドロップアウトまたは濃縮を評価します。解析プラットフォームを使用して、ガイドのログフォールドの変化を測定し、BAGELなどのアルゴリズムを適用して遺伝子ヒットのランク付けを可能にします。
プールされたCRISPRスクリーンにおけるライブラリ表現のライブラリの増幅と保守
図2は、プラスミドライブラリーの増幅後のガイドの期待分布を示す。TKOv3ライブラリーは、遺伝子当たり4つのsgRNAを持つ71,090 sgRNAから構成され、約18,000個のタンパク質コード遺伝子10を標的とする。理想的なライブラリは、すべての単一のsgRNAを同様の量で表す必要があります。したがって、次世代シーケンシングにより増幅ライブラリ内のガイドの分布を確認することをお勧めします。ここに示すのは、sgRNAの非常にタイトな分布を持つ増幅ライブラリであり、すべてのsgRNAの95%が4倍の分布範囲内であることを確認しています(図2)。sgRNA の広範な分布は、ライブラリ ガイドの豊富さが均等に表現されず、プールされた画面のノイズに寄与する可能性があることを示します。
画面パフォーマンスの評価
図3は、必須遺伝子(684遺伝子)と非必須遺伝子(926遺伝子)のゴールドスタンダード基準リストに対してすべてのsgRNAの折りたたみ変化分布を評価し、スクリーンの性能品質を評価し、として可視化できることを示しています。精密リコール曲線10.ゴールドスタンダード参照セットを使用して、ベイズファクター(BF)スコアが画面エンドポイントに対して計算され、精密リコール曲線がプロットされます。BFスコアは、ベイズフレームワーク(前述のBAGELアルゴリズム)を使用して遺伝子を標的とするすべてのガイドの対数折り変化を分析して計算され、既知の必須ガイドセットと非必須ガイドセットの分布を比較します。偽検出率(FDR)は、同じゴールド標準参照セットを使用して経験的に導き出されます。高性能スクリーンは、ほとんどのカーブで鋭い「肘」と図3Aの青い線で示すように、端子点への直線によって証明されるように、BF >6およびFDR<5%の閾値で多数の必須遺伝子を回復する必要があります。必須遺伝子と必須でない遺伝子を標的とするガイドのドロップアウトも検討する必要があります(図3B)。参照非必須遺伝子を標的とするガイドは、図3Bの破線で示すように、ゼロを中心とした対数折り変化の主に対称分布を示す必要があります。必須遺伝子を標的とするガイドの折りたたみ変化分布は、図3Bの実線に示すように、非必須遺伝子を標的とするガイドの分布に対する強い負のシフトを示す。
必須遺伝子
プールされたゲノム全体のドロップアウトスクリーンの基本的な用途の1つは、重要な遺伝子を同定することです。フィットネス遺伝子のサブカテゴリーである必須遺伝子は、摂動が細胞死を引き起こす遺伝子であり、増殖遺伝子としても緩やかに考えられている。癌生物学の文脈では、特定の腫瘍細胞株の依存性を同定するために、コンテキスト特異的な必須物を同定することができる。図4は、BAGELアルゴリズムに由来するベイズファクタースコアを用いて、必須遺伝子の遺伝子ランクを示す。ベイズファクター(BF)は、遺伝子ノックアウトがフィットネス欠陥をもたらすという信頼度尺度を表す。より多くの肯定的なスコアは、摂動がフィットネスの低下を引き起こすという高い信頼を示します。
正の選択画面
ゲノム全体のノックアウトプールは、過剰な薬剤の存在下で培養し、サプレッサー/耐性遺伝子を探すことができます。ここに示すのは、G1/S逮捕3のサプレッサーを探すためにチミジンの存在下でスクリーニングされたHCT116細胞の例である。この画面の詳細については、前のパブリケーション3を示します。簡単に言えば、CRISPRライブラリー感染細胞の選択後6日後、細胞をライブラリーカバレッジを維持する複製に分割し、チミジンで処理した。ゲノムDNAサンプリングのために十分な耐性細胞が回収されるまで、細胞は薬物の存在下で通過した。正の選択は、強い選択的圧力のためにガイドのほんの一部だけが残るので、負の画面よりも低いカバレッジでシーケンス(読み取り深度)を行うことができます。この例では、数百万の読み取りでシーケンシングを得て、チミジンキナーゼ(TK1)を標的とする12個のsgRNAのうち11個を回収し、期待どおりに濃縮した(図5)。
| 量は1:1:1のモル比に基づいて決定された | ||
| コンポーネント | 15 cm プレートあたりの量 a. | |
| LCV2::TKOv3 | pLCKO2::TKOv3 | |
| psPAX2 | 4.8 μg | 7.0 μg |
| pMD2.G | 3.8 μg | 4.0 μg |
| TKOv3b | 8.0 μg | 5.0 μg |
| a.TKOライブラリーの最も生産的なプラスミドの組み合わせに基づいて決定された量は、1:1:1モル比で | ||
| bCRISPRライブラリーベクトルバックボーンに基づくTKOプラスミドの量。LCV2 オールインワン ベクトル =13 kb、非 Cas9 pLCKO2 ベクトル = 7.6 kb | ||
表1:TKOv3トランスフェクションに推奨されるプラスミド量。
| コンポーネント | 15 cm プレートあたりの量 |
| オプティメム | 800 μL |
| トランスフェクション試薬 | 48 μL |
表2:脂質系トランスフェクション試薬のセットアップ。
| フォールドカバレッジ | sgRNAbあたりの細胞数 | 感染に必要な細胞数b |
| (sgRNAライブラリサイズa×フォールドカバレッジ) | (sgRNAライブラリサイズ×フォールドカバレッジ÷ 0.3 MOI) | |
| 200 | 1.5×107 | 5×107 |
| 500 | 3.6×107 | 1.2×108 |
| 1000 | 7.1×107 | 2.4×108 |
| a.TKOv3ライブラリサイズに基づく = 71,090 sgRNA | ||
| b数値が切り上げ | ||
表3:TKOv3 CRISPRライブラリー感染および細胞めっきに必要な細胞数の決定を、様々な折り畳みカバレッジで行う。
| 治療 | 感染に必要なプレートの数 | |
| スクリーニングプレート | ウイルス, + ピューロマイシン | (sgRNAライブラリーサイズ×200倍) ÷ 0.3 MOI ÷ 細胞播種密度感染時 =必要なプレート数 |
| コントロール 1 | ウイルスなし、+ピューロマイシン(0%生存制御) | 1 |
| コントロール 2 | ウイルス、+ピューロマイシンなし(100%生存制御) | 1 |
| MOIの変動および成長率に対応するために余分なプレートを含める | ||
表 4: 感染セットアップの計算。
| 試薬 | 1x反応当たりの量 |
| 2xマスターミックス | 25 μL |
| 10 mM PCR 1 LCV2 前方プライマー | 2.5 μL |
| 10 mM PCR 1 LCV2 リバースプライマー | 2.5 μL |
| ゲノムDNA | 3.5 μg |
| 水 | 50 μLまで |
| 合計 | 50 μL |
表 5: PCR 1 のセットアップ。
表 6: LCV2::TKOv3 シーケンシングライブラリの増幅用PCRプライマー。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 7: pLCKO2::TKOv3 シーケンシングライブラリの増幅用 PCR プライマー。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| ステップ | 温度 | 時間 | |
| 1 | 98°C | 30秒 | |
| 2 | 98°C | 10秒 | 25 サイクル (ステップ 2 – 4) |
| 3 | 66°C | 30秒 | |
| 4 | 72°C | 15秒 | |
| 5 | 72°C | 2 分 | |
| 6 | 10°C | 保持 |
表 8: PCR 1 サイクル パラメータ。
| 試薬 | 1x反応当たりの量 |
| 2xマスターミックス | 25 μL |
| 10 mM i5 フォワードプライマー | 2.5 μL |
| 10 mM i7 リバースプライマー | 2.5 μL |
| PCR 1 製品 | 5 μL |
| 水 | 15 μL |
| 合計 | 50 μL |
表 9: PCR 2 のセットアップ。
| ステップ | 温度 | 時間 | |
| 1 | 98°C | 30秒 | |
| 2 | 98°C | 10秒 | 10サイクル(ステップ2~4) |
| 3 | 55°C | 30秒 | |
| 4 | 65°C | 15秒 | |
| 5 | 65°C | 5 分 | |
| 6 | 10°C | 保持 |
表10:PCR2サイクルパラメータ。
補足テーブル S1.TKO参照遺伝子セットこのファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
図 1: プールされたスクリーニング ワークフローの概略図。(A)標的細胞集団は、ほとんどの細胞が1つのウイルス統合を受け、そのライブラリー表現が維持されることを保証するために、低MOIでCRISPRライブラリーレンチウイルスに感染している。異なる色は、各ウイルス粒子の異なるsgRNAを表します。遺伝子組み換え細胞プールが選択されます。選択が完了すると、セルは T0 参照用にサンプリングされ、連続的に通過します。(B)T0後の最初の経過時に、細胞は感染から回復し、必要に応じて薬物治療を加えることができる。治療後、細胞集団は数週間連続的に通過する。各通路の間に、細胞はゲノムDNAのために集められ、sgRNAライブラリーの必要な折り畳みカバレッジで再シードされる。(C)2種類のスクリーンを行うことができる:1)陽性選択スクリーンは、特定選択圧力下で抵抗性または生存の増加を示す変異細胞を同定する(例えば、薬物または変異細胞株)、その間に濃縮される。画面;または2)負の選択画面は、スクリーン選択圧力下での生存の感度の増加または損失を有する変異細胞を識別し、スクリーン中に失われる。(D)ゲノムDNAを採取し、PCR増幅してガイド領域を濃縮する。(E)ガイドの豊富さは、次世代のシーケンシングと濃縮によって定量化され、または枯渇したガイドは「ヒット」識別のために決定されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:増幅されたCRISPR sgRNAライブラリーの品質。増幅されたライブラリープラスミドは、次世代のシーケンシングによって分析されます(推奨読み取り:3,000万通り、ライブラリの約400倍の表現に対応)。ここに示すのは、sgRNA の厳密な分布を持つライブラリで、4 倍の分布範囲内にあるすべての sgRNA の 95% を示します。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ゴールドスタンダード必須遺伝子参照セットを用いての脱落画面品質の評価(A)スクリーニングの精密リコール分析は、BF>6およびFDRの閾値5%で必須遺伝子の回収を行う結果をもたらす。パフォーマンスの高い画面は青い線で表され、パフォーマンスの低い画面は赤い線で表されます。(B)必須遺伝子(実線)と必須でない遺伝子(点線)を標的とするsgRNAの折り目変化分布。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:遺伝子必須性の決定。ベイズファクターは、本質的に特定の画面における遺伝子のランキング。ベイズファクター(BF)は、遺伝子ノックアウトがフィットネス欠陥をもたらすという信頼度尺度を表す。ベイズファクターが高いほど、遺伝子ノックアウトがフィットネス欠陥(赤い点)をもたらすという自信が高まることを示しています。ベイズファクターの低いスコアは、ノックアウトが成長の利点を提供します (青い点).この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:HCT116細胞におけるチミジンブロックのサプレッサーに対する正の選択画面。T0でプロットされたすべてのsgRNAの正規化読み取りカウントは、チミジン処理サンプルの平均正規化読み取りカウントに対してプロットされた。陽性選択スクリーン(すなわち、IC90濃度の薬物を使用する)の場合、薬物に対する耐性を付与する摂動の数は小さいと予想される。このため、読み取り深度は負の画面に必要なものよりも低くすることができ、whchではライブラリのほとんどが表現される予定です。TK1 sgRNA は赤で囲まれた丸で囲まれている。この図は、以前のパブリケーション3から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
使用の簡易性および高い準備性のために、CRISPRの技術は精密なゲノム編集のための選択の用具として広く採用されている。プールされたCRISPRスクリーニングは、単一の実験で何千もの遺伝的摂動を尋問する方法を提供する。プールされたスクリーンでは、sgRNAライブラリは分子バーコードとして機能し、各配列は一意であり、標的遺伝子にマッピングされます。細胞集団からゲノムDNAを分離することにより、目的の表現型を引き起こす遺伝子は、次世代シーケンシングによりsgRNAの存在量を定量することによって決定することができる。サンプル中のsgRNAを定量化するために非常に並列シーケンシング法が利用されるため、複数の独立した細胞集団を同じシーケンシングレーンにプールしてコストを最小限に抑えることができます。
大規模なスクリーニングプロジェクトに着手する前に、適切に特徴付けられており、技術的に最適化されたモデルを持つことが重要です。遺伝的背景、成長速度、および経発効率は、スクリーニングのために細胞株を選択する際に重要な要因です。たとえば、成長率と編集効率によって、モデルのスケーラビリティと技術的適合性が決まります。大きなsgRNAライブラリーを適切に表すためには、数千万個の細胞が必要となるため、細胞数は、倍増が遅い細胞株や、増殖能力が低い細胞株のスクリーニング実現可能性の制限要因となる可能性があります(例えば、プライマリセル)。成長速度に基づいて、細胞播種密度やスクリーニング用プレートサイズなどの細胞培養条件を適宜選択する必要があります。スクリーンのために実用的で技術的に実現可能である最も大きい容器の細胞を培養することをお勧めします。
レンチウイルスの伝達効率は細胞の種類によって異なり、細胞は固有の感染性が異なるためである。その結果、ある細胞型で十分な感染を達成するために必要なウイルスの量は、必ずしも別の細胞型で同じであるとは限らない。したがって、0.3(セクション4)前後の低いMOIでトランスデュースすることにより、細胞株で産生されるレンチウイルスライブラリーの各バッチをスクリーニングして、ライブラリーの十分なカバレッジと、主に単一の透過イベントを細胞当たりに確実に行う必要があります。トランスダクション効率は、細胞培養条件の影響を受けることもできます。したがって、機能力中は、画面で使用されるのと同じセル条件を使用して決定する必要があります。すなわち、同じ組織培養容器、培体成分および体積、細胞めっき密度、およびウイルス準備を事前に解凍せずに使用することが重要である。異なる形式または条件で行われた測定は、スクリーニング形式に確実にスケーリングされません。
LCV2::TKOv3などのオールインワンCRISPR-Cas9ガイドライブラリを使用する利点にもかかわらず、Cas9をコードする遺伝子は非常に大きく、ウイルス粒子に効率的にパッケージ化することは困難です(105-106 TU/mL)。より低いレンチウイルス価価価価線を送製することは、オールワンCRISPRライブラリーでさらに困難を伴うため、トランスデュースが困難な細胞株に対する制限となる可能性があります。これを軽減するために、Cas9は事前にセルラインで表現し、その後にsgRNAのみを含むCRISPRライブラリ(例えば、pLCKO2::TKOv3)を送達し、はるかに高いタイター(107-108 TU/mL)で作ることができる。細胞株のプロイディは、修飾する必要がある標的遺伝子座の数を決定するので、重要です。ハプロイド細胞で完全なノックアウトを生成する能力は、特定の遺伝子の複数のコピーを持つ細胞よりも効率的です。したがって、ハプロイド細胞のスクリーンは、ジプロイドまたは無気球細胞株6で行われるスクリーンよりも高感度で、より高品質のデータを得ることができます。表現型にリンクされている既知の遺伝子をテストすることは、細胞株モデルの画面能力を決定するのに役立ちます。例えば、必須スクリーンの場合、26Sプロテアソームのサブユニットを標的とするガイド、PSMD1(アドジーン:プラスミド#74180)、コア必須遺伝子は、PSMD1の摂動として、細胞株の編集効率と感染性をテストするために使用することができます。細胞死をもたらすでしょう。
プールされたスクリーンの堅牢性は、sgRNA 表現に大きく依存します。これは、画面中のライブラリのパフォーマンスとヒットを識別する機能を決定する重要なメトリックです。ライブラリの多様性は、各sgRNAの表現に偏っています。したがって、スクリーニングおよび分析される細胞の集団は、表現不足のsgRNA6の捕捉を確実にするために十分に大きくすべきである。各sgRNAの200〜1000倍の表現は、公開されたスクリーン(すなわち、sgRNA当たり200〜1000細胞)10、15で使用されている典型的なカバレッジである。この表現は、ライブラリプラスミド(セクション1)を増幅する場合、および必要なライブラリカバレッジを表すために必要なセル番号(セクション5)に感染して通過し、スクリーン全体で、およびシーケンスライブラリ中に維持する必要があります。プロトコル全体で説明されているように、準備(プロトコル6)。例えば、TKOv3ライブラリの約200倍のカバレッジを達成するには、1500万個の感染細胞の選択と通過が必要です。シーケンシング中に、ジプロイドヒトゲノムが約7.2pgのDNAとゲノムあたり1sgRNAを含んでいると仮定すると、1500万シークリードのシーケンシングライブラリーを生成するために合計100 μgのゲノムDNAが必要です。カバレッジの決定は、より大きなライブラリのカバレッジは、維持が困難で技術的に実用的ではない可能性のあるより多くのセルを培養する必要がありますので、ライブラリのサイズに依存します。200倍のカバレッジはTKOv3ライブラリで推奨され、200倍は多数の細胞をスクリーニングし、限られた真の生物学的sgRNAドロップアウトを検出するのに十分なダイナミックレンジを維持するロジスティクス間の最適なバランスを提供します。ランダムな枯渇からのノイズ22,23.フォールドライブラリリプレゼンテーションが高いほど、再現性が向上し、特に負の選択に対してsgRNAの豊富さの変化を検出するための十分なウィンドウが確保されます。負の画面の制限機能は、摂動が開始ライブラリ24に存在していた程度にしか枯渇しなくことです。対照的に、正の選択画面の動的範囲は、細胞の濃縮に依存し、最終的な集団23の100%に富むことができるので、はるかに大きい。したがって、陽性選択スクリーン(例えば薬剤耐性スクリーン)の場合、小細胞集団のみが生存することが期待されるため、ライブラリーカバレッジと読み取り深度を50~100倍の表現に減らすことができます。
ここで説明するシーケンス ライブラリ プロトコルは、ベクトル バックボーンの両方で TKOv3 CRISPR ライブラリ用に最適化され、Illumina シーケンシング プラットフォーム上でシーケンス化された 2 ステップの PCR です。これらのシーケンシング ライブラリは、Hart et al.3で説明したのと同様に、単一の PCR プロトコルを使用して生成することもできます。その他の既製ライブラリの場合は、それらのライブラリに提供されるプライマーとシーケンスプロトコルを参照する必要があります。ゲノムDNAおよびPCRサンプルを調製する場合、汚染の予防措置に配慮することが不可欠です。例えば、ゲノムDNA精製専用の領域を強くお勧めします。また、ゲノムDNAサンプルに見られる一般的な汚染物質である細菌プラスミド準備とは物理的に区別する必要があります。これはプラスミドおよび他のシーケンシングライブラリからの汚染を最小にするので、PCR反応は専用のPCRフードで設定する必要があります。良い実践のために、PCR汚染を監視するのに役立つテンプレートなしの否定的な制御を含めることができる。
画面からのシーケンス読み取りを変換するデータ分析は、これらのデータセットのサイズと多様性を考えると、簡単な作業ではありません。シーケンスの読み取りが整列して正規化されると、いくつかのバイオインフォマティクスツールを使用して、画面のパフォーマンス (図 3)とヒット識別 (図 4)の評価に役立てることができます。BAGEL は、データ分析の主要なツールとして、このプロトコルで説明されています。BAGELはベイズフレームワークを使用して、既知の必須遺伝子セットと非必須遺伝子セットの分布を、遺伝子を標的とするすべてのガイドの対数折り変化と比較します。この方法はHart et al 3 で詳しく説明されています。BAGELに加えて、MAGeCK25などの濃縮sgRNAと枯渇したsgRNAの両方を識別するように設計された他のアルゴリズムも使用できます。薬物スクリーンの場合、DrugZアルゴリズムを使用して、相乗的および抑制的な化学的遺伝的相互作用の両方を同定することをお勧めします。DrugZは、治療された集団におけるsgRNAの相対的な存在量を、同時に未処置集団におけるsgRNAの相対的な存在量と同時に比較するように設計された。
CRISPRスクリーンの限界は、Cas9が常にノックアウトにつながるとは限らないということです, 作成されたインデルは、常にインフレーム変異である可能性があるので, 遺伝子機能をそのまま残す13.その結果、母集団が混在し、画面が「ノイズ」になり、データの解釈が困難になります。遺伝子を標的とする複数の独立したsgRNAを使用すると、冗長性が蓄積され、低活性のsgRNAの効果が低下します。CRISPR研究への追加の注意点は、Cas9ヌクレアーゼによって作成された二本鎖切断の効果であり、標的化される遺伝子とは無関係に細胞死性を引き起こす可能性がある。この抗増殖効果は、標的部位コピー数と共に増加し、高増幅領域26内の遺伝子の偽陽性同定につながる。CERES のような計算方法は、コピー番号の効果27を修正するために開発されました。これらのワークフローは、ノックアウトベースの必須性スクリーンで遺伝子依存レベルを推定するコピー番号効果を考慮します。増幅された領域におけるヒット遺伝子のゲノム位置を注意深く調べると、切断効果の多重性に起因する偽陽性の判定に役立つ13.プライマリ画面は、潜在的なヒットのみを識別できます。セカンダリスクリーンまたはプロトコルをフォローアップしてヒットを検証し、ターゲット外の効果からオンターゲットを区別し、偽陽性を排除し、効果のない摂動によって弱く得点された遺伝子が偽として取り残されないようにすることが重要です。ネガティブ23.
このプロトコルは、研究の条件が細胞の増殖欠陥または死に至るべきである生存率ベースのスクリーニングアプローチに焦点を当てています。細胞の生存率の変化を引き起こすものではないプロセスの場合、生存率ベースのプールスクリーニング方法は制限される可能性があります。別の方法として、レポーターまたはマーカーベースのアッセイを使用してスクリーンを実行し、蛍光活性化細胞選別(FACS)アプローチによる濃縮を行うことです。マーカーベースの選択画面では、表現型は、細胞の健康13,23ではなくマーカー遺伝子発現を調節する変異に基づいている。配列されたCRISPRフォーマットはウェルスクリーニングごとの1遺伝子のためにまた利用できる。配列形式は、複雑な読み取りまたは顕微鏡ベースの読み出しに適しています。しかし、アレイ形式では、自動化された機器と大量の試薬28が必要です。
ここで説明するスクリーニングプロトコルは、S.pyogenes Cas9ヌクレアーゼを使用して、遺伝的スクリーンに最も広く使用され、多くのライブラリが利用可能であるヌルアレンを作成します(Addgene: プールライブラリ)。ノックアウトライブラリーの代替オプションも利用可能で、触媒的に死んだdCas9をクロマチン修飾タンパク質につなぎ、遺伝子の転写(CRISPRi)を阻害または活性化する。.RNAiと同様に、CRISPRiは、完全なノックアウトを許容できない異なる遺伝子用量と必須遺伝子での方言的効果を研究する能力を提供し、CRISPRaは機能ゲインスクリーンを実行するために使用することができます。これらの各テクノロジには利点がありますが、一般的に CRISPR ノックアウト アプローチが最も開発されています。CRISPRiおよびshRNA5を使用するノックダウンアプローチと比較すると、低ノイズ、最小オフターゲット効果、および実験的な一貫性、特に致死性ベースの必須遺伝子スクリーンでうまく機能することが証明されています。これまでの広範な適用性にもかかわらず、CRISPRスクリーニング技術は初期段階に残っています。新しいツールは、CRISPR の基本コンポーネントから構築され続けています。これらには、複数のゲノム遺伝子座を標的にできる組み合わせ遺伝子編集戦略、直交Cas酵素の最適化、およびCas9活性を多様化するクロマチン機能ドメインによる修飾が含まれます。CRISPR技術が成長し続けるにつれて、遺伝子スクリーニングアプローチへの結合は、遺伝学における機能的発見のための強力なプラットフォームとして機能します。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、ゲノムカナダ、オンタリオ州研究基金、およびカナダ保健研究所(MOP-142375、PJT-148802)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
References
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