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Genetics

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Published: September 4, 2019 doi: 10.3791/59780
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2,3
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Abstract

Die Genombearbeitung mit dem CRISPR-Cas-System hat die Fähigkeit, die Genome verschiedener Organismen präzise zu bearbeiten, erheblich erweitert. Im Kontext von Säugetierzellen stellt diese Technologie ein neuartiges Mittel dar, um genomweite genetische Screens für funktionelle Genomstudien durchzuführen. Bibliotheken von Guide RNAs (sgRNA), die auf alle offenen Leserahmen abzielen, ermöglichen die einfache Generierung von Tausenden von genetischen Störungen in einem einzigen Pool von Zellen, die auf bestimmte Phänotypen untersucht werden können, um Genfunktion und zelluläre Prozesse in einem unvoreingenommenund systematisch. CRISPR-Cas-Bildschirme bieten Forschern eine einfache, effiziente und kostengünstige Methode, um die genetischen Blaupausen für zelluläre Phänotypen aufzudecken. Darüber hinaus kann die Differentialanalyse von Bildschirmen, die in verschiedenen Zelllinien und aus verschiedenen Krebsarten durchgeführt werden, Gene identifizieren, die kontextuell in Tumorzellen wichtig sind, und potenzielle Ziele für spezifische Krebstherapien aufzeigen. Die Durchführung genomweiter Bildschirme in menschlichen Zellen kann entmutigend sein, da dies den Umgang mit zig Millionen Zellen beinhaltet und eine Analyse großer Datenmengen erfordert. Die Details dieser Bildschirme, wie z. B. die Charakterisierung von Zellenlinien, Überlegungen zur CRISPR-Bibliothek und das Verständnis der Einschränkungen und Fähigkeiten der CRISPR-Technologie während der Analyse, werden häufig übersehen. Hier ist ein detailliertes Protokoll für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-basierten Bildschirmen vorgesehen.

Introduction

CRISPR-Cas, kurz für gruppierte, regelmäßig interspaceierte kurze palindromische Wiederholungen und CRISPR-assoziierte Nuklease, besteht aus einem einzigen Nukleaseprotein (z.B. Cas9) in Komplex mit einer synthetischen Guide RNA (sgRNA). Dieser Ribonukleoprotein-Komplex zielt auf das Cas9-Enzym ab, um doppelsträngige DNA-Brüche an einem bestimmten genomischen Ort1zu induzieren. Doppelsträngige Brüche können durch homology directed repair (HDR) oder, häufiger, durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) repariert werden, ein fehleranfälliger Reparaturmechanismus, der zum Einfügen und/oder Löschen (INDELS) führt, das häufig die Genfunktion stört. 1. Die Effizienz und Einfachheit von CRISPR ermöglicht ein bisher unerreichbares Niveau der genomischen Ausrichtung, das die bisherigen Genom-Editing-Technologien [d.h. Zinkfingernukleasen (ZNF) oder Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen ( weit übertrifft ( TALENS), die beide unter erhöhter Designkomplexität, geringerer Transfektionseffizienz und Einschränkungen bei der Multiplex-Genbearbeitung2] leiden.

Die Grundlagenforschung der CRISPR-Single-Guide-RNA-basierten Genombearbeitung hat es Wissenschaftlern ermöglicht, die Funktionen einzelner Gene und die Topologie genetischer Interaktionsnetzwerke effizient und kostengünstig zu hinterfragt. Die Fähigkeit, funktionelle genomweite Bildschirme durchzuführen, wurde durch den Einsatz des CRISPR-Cas-Systems erheblich verbessert, insbesondere im Vergleich zu früheren genetischen Störtechnologien wie RNA-Interferenz (RNAi) und Gentrap-Mutagenese. Insbesondere leidet RNAi unter hohen Off-Target-Effekten und unvollständigem Knockdown, was zu einer geringeren Empfindlichkeit und Spezifität im Vergleich zu CRISPR3,4,5führt, während Gentrap-Methoden nur bei haploiden Zellen für Funktionsverlustbildschirme, die den Umfang von Zellmodellen einschränken, die abgefragt werden können6. Die Fähigkeit von CRISPR, einen vollständigen Gen-Knock-out zu erzeugen, bietet ein biologisch robusteres System zur Abhörung mutierter Phänotypen mit geringem Rauschen, minimalen Off-Target-Effekten und konsistenter Aktivität über Reagenzien5. CRISPR-Cas9 sgRNA-Bibliotheken, die auf das gesamte menschliche Genom abzielen, sind jetzt weit verbreitet und ermöglichen die gleichzeitige Generierung von Tausenden von Gen-Knock-outs in einem einzigen Experiment3,7,8,9 .

Wir haben einzigartige CRISPR-Cas9 genomweite sgRNA lentivirale Bibliotheken entwickelt, die Toronto Knock-out (TKO) Bibliotheken (verfügbar über Addgene) genannt werden, die kompakt und sequenzoptimiert sind, um hochauflösende funktionelle Genomik-Bildschirme zu ermöglichen. Die neueste Bibliothek, TKOv3, zielt auf 18.000 menschliche Protein-kodierende Gene mit 71.090 Leitfäden, die für die Bearbeitungseffizienz mit empirischen Daten optimiert sind10. Darüber hinaus ist TKOv3 als Einkomponenten-Bibliothek (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) verfügbar, die Cas9 und sgRNAs auf einem einzigen Vektor ausdrückt, wodurch die Notwendigkeit entsprochen wird, stabile Cas9-expressions-Zellen zu generieren, was genomweite Knock-out in einer breiten Palette von Säugetierzelltypen. TKOv3 ist auch in einem Vektor ohne Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID-Nr. 125517) erhältlich und kann in Zellen verwendet werden, die Cas911ausdrücken.

Eine genomweite CRISPR-Cas9-bearbeitete Zellpopulation kann unterschiedlichen Wachstumsbedingungen ausgesetzt werden, wobei die Fülle von sgRNAs im Laufe der Zeit durch Sequenzierung der nächsten Generation quantifiziert wird, was eine Auslesung zur Beurteilung von Aussteigern oder Anreicherung von Zellen mit rückverfolgbaren genetischen Störungen. CRISPR-Knock-out-Bibliotheken können genutzt werden, um Gene zu identifizieren, die bei Störungen zelluläre Fitnessdefekte, eine moderate Arzneimittelempfindlichkeit (z. B. empfindliche oder resistente Gene) verursachen, die Proteinexpression regulieren (z. B. Reporter) oder für eine bestimmte Signalwegfunktion und Zellzustand12,13,14. Zum Beispiel können Differential-Fitness-Bildschirme in einer Krebszelllinie sowohl Erschöpfung oder Reduktion von Onkogenen und Anreicherung oder eine Zunahme der Tumorsuppressoren Gene3,14,15identifizieren. In ähnlicher Weise kann die Verwendung von Zwischendosen von therapeutischen Medikamenten sowohl Arzneimittelresistenz als auch Sensibilisierungsgene16,17zeigen.

Hier ist ein detailliertes Screening-Protokoll für das genom-skala CRISPR-Cas9 Verlust-von-Funktions-Screening mit den Toronto Knock-out Bibliotheken (TKOv1 oder v3) in Säugetierzellen von der Bibliotheksgenerierung, Screening-Performance bis zur Datenanalyse. Obwohl dieses Protokoll für das Screening mit den Toronto Knock-out-Bibliotheken optimiert wurde, kann es angewendet werden und auf alle gepoolten CRISPR sgRNA-Bibliotheken skalierbar werden.

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Protocol

Die nachstehend beschriebenen Experimente sollten den Richtlinien des Amtes für Umweltgesundheit und -sicherheit des Instituts entsprechen.

1. Gepoolte CRISPR sgRNA lentivirale Bibliothek Plasmid-Amplifikation

  1. Verdünnen Sie die vorgefertigte CRISPR sgRNA Plasmid-DNA-Bibliothek in TE auf 50 ng/l (z. B. TKOv3).
  2. Elektroporate die Bibliothek mit elektrokompetenten Zellen. Richten Sie insgesamt vier Elektroporationsreaktionen ein, wie unten beschrieben.
    1. Fügen Sie 2 l von 50 ng/L TKO-Bibliothek zu 25 l aufgetauten elektrokompetenten Zellen zu vorgekühlten Küvetten (1,0 mm) auf Eis hinzu.
    2. Elektroporate unter optimalen Einstellungen, die vom Herstellerprotokoll vorgeschlagen werden. Innerhalb von 10 s des Pulses 975 L Des Recovery Medium (oder SOC Medium) zur Küvette hinzufügen.
    3. Übertragen Sie elektropoierte Zellen in ein Kulturrohr und fügen Sie 1 ml Erholungsmedium hinzu. Röhren in einem Schüttelinkubator bei 250 U/min für 1 h bei 37 °C inkubieren.
  3. Richten Sie eine Verdünnungsplatte ein, um die Bibliothek zu titern und die Transformationseffizienz zu schätzen.
    1. Alle 8 ml der zurückgewonnenen Zellen bündeln und gut mischen. Übertragen Sie 10 l der gepoolten Zellen auf 990 l Erholungsmedium für eine 800-fache Verdünnung und mischen Sie gut.
    2. Platte 20 l der Verdünnung auf eine vorgewärmte 10 cm LB + Carbenicillin (100 g/l) Agarplatte. Dies führt zu einer 40.000-fachen Verdünnung der Transformationsmittel, die zur Berechnung der Transformationseffizienz verwendet wird.
    3. Platte 400 l der wiedergewonnenen Zellen auf jeder Platte über insgesamt 20 vorgewärmte 15 cm LB + Carbenicillin Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten für 14–16 h bei 30 °C.
      HINWEIS: Das Wachstum bei dieser niedrigeren Temperatur minimiert die Rekombination zwischen Long-Terminal-Wiederholungen (LTR)18.
    4. Um die Transformationseffizienz zu berechnen, zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf der 40.000-fachen Verdünnungsplatte (Schritt 1.3.2). Multiplizieren Sie die Anzahl der gezählten Kolonien mit 40.000, um die Gesamtzahl der Kolonien auf allen Platten zu erhalten. Fahren Sie fort, wenn die Gesamtzahl der Kolonien eine Bibliotheksabdeckung darstellt, die mindestens 200x Kolonien pro sgRNA entspricht (am besten ist 500-1000x).
      1. Beispielsweise beträgt die minimale Koloniezahl für die TKOv3-Bibliothek (71.090 sgRNA) 1,4 x 107, was 200x Kolonien pro sgRNA entspricht. Wenn die Koloniedarstellung nicht ausreicht, erhöhen Sie die Anzahl der Elektroporationen in Schritt 1.2 basierend auf der Anzahl der Kolonien auf der Verdünnungsplatte, um die minimale Bibliotheksabdeckung zu erreichen.
  4. Ernte der Kolonien wie unten beschrieben
    1. Zu jeder 15 cm Platte 7 ml LB + Carbenicillin (100 g/L) medium hinzufügen und dann die Kolonien mit einem Zellstreuer abkratzen. Mit einer 10 ml Pipette die abgekratzten Zellen in einen sterilen 1 L Konuskolben oder eine Flasche übertragen.
    2. Spülen Sie die Platte erneut mit 5 ml LB + Carbenicillin-Medium ab und übertragen Sie die Lösung auf die Flasche.
    3. Wiederholen Sie dies für alle Platten, um Zellen von 20 Platten in eine sterile Flasche zu bündeln.
  5. Mischen Sie gesammelte Zellen mit einer Rührstange für 1 h bei Raumtemperatur (RT), um Zellklumpen aufzubrechen. Übertragen Sie Zellen auf vorgewogene Zentrifugenflaschen und Zentrifuge mit 7.000 x g auf Pelletbakterien und entsorgen Sie dann Medien.
  6. Wiegen Sie das Nasszellpellet und subtrahieren Sie das Gewicht der Zentrifugenflasche, um das Endgewicht des nassen Pellets zu bestimmen. Reinigen Sie Plasmid-DNA mit einem Maxi- oder Mega-Plasmid-Reinigungskit, abhängig von der Menge an bakteriellem Pellet, das jede Säule verarbeiten kann.

2. Großangelegte CRISPR sgRNA Bibliothek Lentivirus-Produktion

HINWEIS: Alle Schritte in diesem Abschnitt des Protokolls werden in einer BSL2+-Anlage in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II, Typ A2, ausgeführt.

  1. Berechnen Sie die Anzahl der 15 cm Platten, die für die Virusproduktion erforderlich sind, basierend auf der Schätzung, dass 18 ml Virus in der Regel von einer 15 cm Platte geerntet werden.
  2. Bereiten Sie Zellen für die Transfektion vor, indem Sie HEK-293T-Verpackungszellen in kohlenstoffarmen Wachstumsmedien (DMEM + 10% FBS + optional: 0,1x Pen/Strep) bei 8 x 106 Zellen pro 15 cm Platte in 20 ml Medien aussäen. Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 °C, 5%CO2. Stellen Sie sicher, dass die vergoldeten Zellen zu 70 % bis zu 80 % konfluent sind und sich im Moment der Transfektion gleichmäßig ausbreiten.
  3. Am nächsten Tag drei Transfektionsplasmide mischung enzuden, wie in Tabelle 1 für 15 cm Platten beschrieben. Berechnen Sie die Menge an Plasmid, die für eine Transfektion benötigt wird, und erstellen Sie eine Mischung von Plasmiden für die Anzahl der Platten, plus eines, das transfiziert werden soll.
  4. Bereiten Sie ein lipidbasiertes Transfektionsreagenz für jede Transfektion vor, wie in Tabelle 2 beschrieben. Aliquot reduzierte Serummedien in einzelne 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre für die Anzahl der zu transfizierenden Platten. Transfektionsreagenz hinzufügen, sanft mischen und 5 min bei RT inkubieren.
  5. Fügen Sie nach 5 min Inkubation die für eine Transfektion erforderliche DNA-Menge dem Transfektionsreagenz für ein 3:1-Verhältnis des Transfektionsreagenz-zu-g des DNA-Komplexes hinzu. Mischen Sie sanft und inkubieren für 30 min bei RT.
    HINWEIS: Nachfolgende Transfektionen können in Sätzen von fünf oder weniger hergestellt werden, mit 5 min Intervallen, um die Zeit zu optimieren und eine Überinkubation zu vermeiden.
  6. Nach 30 min Inkubation jede Transfektionsmischung sorgfältig auf jede Teller der Verpackungszellen übertragen. Fügen Sie die gesamte Mischung mit einer 1 ml Pipettenspitze tropfenweise in einer kreisförmigen Zickzackbewegung hinzu, ohne die Zellmonoschicht zu stören. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C für 18 h bei 5%CO2.
  7. Herstellung viraler Erntemedien: 500 ml DMEM-Medium + 32 ml BSA-Bestand (20 g/100 ml, gelöst in DMEM, Filter sterilisiert mit 0,22 m Filter) + 5 ml 100x Stift/Strep.
  8. Nach 18 h Medien entfernen (die ordnungsgemäße Handhabung von Lentivirus-Abfällen wie Inkubation in 1% Natriumhypochlorit für 30 min vor der Entsorgung verwenden). Ersetzen Sie vorsichtig mit 18 ml viralen Erntemedien auf jeder Platte. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C für 18 h bei 5%CO2.
  9. Nach 24 h, überprüfen Sie Verpackungszellen auf abnormale und verschmolzene Morphologie als Hinweis auf eine gute Virusproduktion. Dann ernten Sie das Lentivirus, indem Sie alle Überstand eimperan und in ein steriles konisches Zentrifugenrohr übertragen.
  10. Drehen Sie das Virusenthaltende Mit300 x g 5 min und pellet die Verpackungszellen. Aliquot den Überstand in ein steriles Polypropylenrohr, ohne das Pellet zu stören.
  11. Lagern Sie das Virus bei 4 °C für kurze Zeiträume (weniger als 1 Woche) oder sofort bei -80 °C für die Langzeitlagerung. Aliquot groß angelegte Viren bereiten sich auf Single-Use-Volumes für langfristige Speicherung vor, um Einfrieren/Auftauen zu vermeiden.

3. Zellliniencharakterisierung zum Screening

  1. Wählen Sie die gewünschte Zelllinie aus.
    1. Messen und erfassen Sie die ungefähre Verdoppelungszeit der Zellen.
    2. Bestimmen Sie die optimale Zellbeschichtungsdichte für die Kultivierung von Zellen, die sich alle 3–4 Zellen verdoppeln, in einem Gewebekulturgefäß ihrer Wahl (z. B. 15 cm Gewebekulturplatten).
  2. Bestimmen Sie die Puromycin-Konzentration, die in der gewünschten Zelllinie für die Auswahl von TKO-Bibliotheken verwendet werden soll, die puromycin-Resistenzmarker wie folgt enthalten:
    1. Samenzellen in einer 12-Well-Platte mit der Dichte, die erforderlich ist, um den Zusammenfluss nach 72 h zu erreichen, dann über Nacht inkubieren (37 °C, 5%CO2).
    2. Wechseln Sie am nächsten Tag zu einem Medium, das einen Verdünnungsbereich von Puromycin-Konzentrationen von 0 g/ml bis 10 g/ml in Schritten von 0,5 g/ml enthält. Inkubieren Sie die Zellen für 48 h.
    3. Messen Sie nach 48 h die Zelllebensfähigkeit durch Zellzählung oder alamarBlue Färbung.
    4. Bestimmen Sie die niedrigste Konzentration, die 100% der Zellen in 48 h abtötet. Verwenden Sie diese Konzentration, um für CRISPR-Bibliothek transduzierte Zellpopulationen in den Schritten 4.6 und 5.2.6 auszuwählen.
      HINWEIS: Bei Zelllinien mit längeren Verdoppelungszeiten können längere Inkubationen mit Puromycin toleriert werden. Bestimmen Sie in diesen Situationen die Kill-Kurve für die Inkubationszeit, die für <3-Zellverdoppelungen erforderlich ist. Minimieren Sie die Zeit für die Auswahl, um das Aussetzen wesentlicher Gene vor Beginn des Screenings zu vermeiden.
  3. Überprüfen Sie die Zellen auf Empfindlichkeit gegenüber Hexadimethrinbromid (bis zu 8 g/ml), indem Sie eine Dosis-Antwort-Kurve nach dem gleichen Verfahren durchführen, das zur Messung der Puromycin-Empfindlichkeit verwendet wird (Schritt 3.2). Wenn eine Toxizität mit <8 g/ml Hexadimethrinbromid beobachtet wird, nicht anwenden.

4. Funktionelle Titration der gepoolten CRISPR lentivirus Bibliothek zur Bestimmung von MOI

  1. Thaw ein frisches Aliquot von gepoolten CRISPR sgRNA Bibliothek lentivirus (z.B. LCV2::TKOv3) und auf Eis zu halten.
  2. Entwerfen Sie eine Reihe von Virusvolumina, um zwischen 0–2 ml (d. h. 0 ml, 0,25 ml, 0,5 ml, 1 ml und 2 ml) zu testen.
  3. Ernte zielzellen und Samenzellen in 15 cm Platten mit der Dichte, die erforderlich ist, um den Zusammenfluss in 72 h zu erreichen.
  4. Bereiten Sie für jedes zu prüfende Virusvolumen doppelte Platten vor. Fügen Sie Zellen, Virus, Hexadimethrinbromid (8 g/ml) und Medien zu einem Endvolumen von 20 ml hinzu. Platten gründlich mischen, Platten im Inkubator auflegen und 24 h (37 °C, 5%CO2)brüten.
  5. Nach 24 h virushaltige Medien entfernen und entsorgen (Biosicherheitsvorkehrungen für den Umgang mit Lentivirus-Abfällen verwenden). Optional, waschen Sie die Platte vorsichtig mit warmen PBS, um fremde Viren zu entfernen.
  6. Ersetzen Sie für jede Viruserkrankung 20 ml Medien, die Puromycin enthalten, mit der Konzentration, die zum Abtöten von Zellen in Abschnitt 3 bestimmt wurde, auf eine Replizierungsplatte. Auf die andere Platte, fügen Sie 20 ml frische Medien ohne Puromycin. Inkubieren für 48 h (37 °C, 5% CO2).
  7. Nach 48 h überprüfen Sie, ob alle nicht infizierten Zellen (0 ml Viruszustand), die mit Puromycin behandelt werden, tot sind. Ernten Sie alle Platten einzeln und dispergieren Sie die Zellen durch wiederholtes sanftes Pipettieren.
  8. Zählen Sie Zellen aus allen Platten und berechnen Sie den MOI für jedes Virusvolumen, indem Sie die Zellzahl mit der Puromycinauswahl mit der Zellzahl ohne Puromycin (d. h. +/- Puromycin) vergleichen.
  9. Graph Ergebnisse, um das Virusvolumen zu bestimmen, das zu 30% –40% Zellüberleben mit Puromycin-Auswahl im Vergleich zu ohne Puromycin führt. Verwenden Sie dieses Virusvolumen, um einen MOI von 0,3–0,4 während des Bildschirms unter den gleichen Gewebekulturbedingungen zu erreichen.

5. Primäre Bildschirminfektion, Auswahl und Zellpassaging

  1. Wählen Sie die CRISPR sgRNA-Bibliotheksabdeckung aus, die auf dem gesamten Bildschirm beibehalten werden soll (empfohlen mindestens 200-fach).
    1. Bestimmen Sie anhand der Abdeckung der Bibliothek die Anzahl der Zellen, die erforderlich sind, um diese Abdeckung pro sgRNA aufrechtzuerhalten, und die Anzahl der Zellen, die für eine Infektion bei MOI 0,3 erforderlich sind (Tabelle 3).
    2. Bestimmen Sie die Anzahl der Platten, die zum Einrichten der Infektion erforderlich sind (Tabelle 4).
  2. Infizieren der Zellen mit CRISPR-Bibliothek
    1. Erntezellen und Samen der erforderlichen Zellzahl auf jeder 15 cm Platte.
    2. Hexadimethrinbromid (8 g/ml) zu allen Platten hinzufügen.
    3. Fügen Sie das Virus in der für MOI 0.3 erforderlichen Menge zum Screening und zu den Control 2-Platten hinzu. Fügen Sie für Control 1 keinen Virus hinzu, und ersetzen Sie dieses Volume durch Medien.
    4. Mischen Sie Platten gründlich durch Kippen. Legen Sie Platten in den Inkubator, um sicherzustellen, dass sie eben sind.
      HINWEIS: Batch-Infektionen können durch die Kombination einer Master-Mischung aus Virus, Medien und Hexadimethrinbromid zu Zellen in Suspension vor der Beschichtung durchgeführt werden.
    5. Entfernen Sie die Medien und ersetzen Sie sie durch frische Medien, die Puromycin in der in Schritt 3.2.4 ermittelten Konzentration zum Screening enthalten, und kontrollieren Sie 1 Platten 24 h nach einer Virusinfektion. Fügen Sie frische Medien ohne Puromycin auf die Steuer 2 Platte. Inkubationszellen für 48 h (37 °C, 5% CO2).
    6. 48 h nach Puromycin-Zugabe, stellen Sie sicher, dass alle nicht infizierten Zellen tot sind (Kontrolle 1), um die Puromycin-Aktivität zu bestätigen, und ernten Sie dann die infizierten Zellen.
  3. Ernte infizierter Zellpopulation und Zellpassaging
    1. Die aus Puromycin ausgewählten Zellen aus allen Siebplatten in einem sterilen Behälter ernten. Sammeln Sie die Zellen von jeder Steuerplatte separat. Zerstreuen Sie Zellen durch sanfte sandende Pipettierung.
    2. Zählen Sie Zellen aus gepoolten Screening-Zellen, steuern Sie 1 und steuern Sie 2 separat, und berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro 1 ml.
    3. Berechnen Sie DIE MOI- und Faltabdeckung wie folgt:
      Equation 1
      Equation 2
    4. Sammeln Sie drei Replikationen von Zellpellets aus den gepoolten Zellen in der ausgewählten Bibliothek Abdeckung für die genomische DNA-Extraktion. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min. Mit PBS waschen. Beschriften Sie die Rohre und trocknen Sie die Zellpellets bei -80 °C (dies sind T0-Referenzproben).
    5. Teilen Sie den Pool infizierter Zellen in drei Replikationsgruppen auf (z. B. Replizieren von A, Replizieren von B, Replikation C), während die Bibliotheksabdeckung innerhalb jeder Replikation beibehalten wird. Samenzellen mit der gleichen Saatdichte, wie sie normalerweise bei der Erweiterung verwendet würden. Verwenden Sie die gleiche Anzahl von Zellen für jede Replikationsplatte und die gleiche Gesamtzahl von Zellen zwischen Replikationen.
    6. Fahren Sie mit den Zellen fort und ernten Sie drei Wiederholungen von Zellpellets aus jeder Replikation von gepoolten infizierten Zellen wie oben, alle 3 bis 8 Tage, je nach Zelllinie, für bis zu 15 bis 20 Zellverdoppelungen. Ernten Sie bei jedem Durchgang die Zellen von allen Platten in jeder Replikationsgruppe miteinander (d. h. alle Zellen aus Replizierten A-Platten werden neu gemischt, alle Zellen aus Replizierten B-Platten werden neu gemischt usw.).
    7. Beschriften Sie jedes Pellet mit einer Zeit (T) und replizieren Sie die Bezeichnung. Dies entspricht der Anzahl der Tage nach T0, in denen das Pellet gesammelt wird (z.B. T3_A, T3_B, T3_C usw.).
  4. Für die negativen Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion sekmittelieren, lassen Sie Zellen für mindestens eine Passage nach T0 vor der Behandlung erholen. Teilen Sie bei T3 oder T6 die Zellen aus jeder Replikationsgruppe (A, B, C) in die Populationen zur medikamentösen Behandlung und Kontrolle auf, wobei die gleiche Sädichte verwendet wird, die in Schritt 5.3.5 verwendet wird.
    1. Bündeln Sie separat die Anzahl der Zellen, die für die Bibliotheksabdeckung für jede Replikation in der Drogenbehandlungsgruppe erforderlich sind. Fügen Sie das Medikament in Zwischenkonzentrationen (IC20-IC50). Samen sie die Zellen und inkubieren (37 °C, 5%CO2) bis zum nächsten Durchgang.
    2. Poolieren Sie separat die Anzahl der Zellen, die für die Bibliotheksabdeckung für jede Replikation in der Fahrzeugsteuerungsgruppe erforderlich sind. Fügen Sie die Fahrzeugsteuerung mit dem gleichen Volumen wie das Medikament hinzu (<0.5% v/v). Säen Sie die Zellen und brüten (37 °C, 5%CO2) bis zum nächsten Durchgang.
    3. Fahren Sie fort, die Zellen zu durchforsten und die Zellpellets für genomische DNA alle 3 Tage zu ernten, wie in Schritt 5.3.5 beschrieben, während Sie das Medikament oder Fahrzeug an jeder Passage erfrischen.
  5. Für die positive Auswahl oder Arzneimittelresistenz Bildschirme, teilen Sie jede Replikationsgruppe nach der Anzahl der Zellen für die Bibliothek Abdeckung erforderlich. Fügen Sie IC90 Medikamentenkonzentrationen zu jeder Replikation hinzu. Bei IC90wird ein Großteil der Zellen getötet. Lassen Sie resistente Populationen wachsen und sammeln Sie Zellpellets (1–2 x 107 Zellen) für die genomische DNA-Extraktion.

6. CRISPR Probenvorbereitung und -sequenzierung

  1. Genomische DNA-Reinigung
    1. Inkubieren Sie die gefrorenen Zellpellets für 5–10 min bei RT zum Auftauen.
    2. 1,4 ml PBS zu einem 50 ml Zentrifugenrohr hinzufügen, das ein Zellpellet enthält. Wirbel für 20 s, um die Zellen wieder auszusetzen und für 1 min ruhen. Bei Bedarf Pipette 15x mit P1000, um die verbleibenden Zellklumpen aufzubrechen. Wenn Sie Zellen aus einem 15 ml oder 1,5 ml-Rohr übertragen, setzen Sie die Zellen mit 1 ml PBS wieder auf, übertragen Sie dann zellen in ein 50 ml-Rohr und spülen Sie das Originalrohr mit 400 l PBS ab.
    3. Fügen Sie den resuspendierten Zellen 5 ml Nuclei Lysis Solution hinzu. Mischen Sie die Probe mit einer 10 ml Pipette, indem Sie die Probe 5x nach oben und unten pfeifen.
    4. Fügen Sie dem Kernlysat 32 l RNase A (20 mg/ml; um eine Endkonzentration von 100 g/ml) zu erhalten, und mischen Sie die Probe, indem Sie das Rohr 5x invertieren. Inkubieren Sie die Mischung bei 37°C für 15 min und lassen Sie die Probe für 10 min bei RT abkühlen.
    5. 1,67 ml Protein precipitation Solution zum Lysat und Wirbel kräftig für 20 s hinzufügen. Kleine Proteinklumpen können nach dem Mischen sichtbar sein.
    6. Zentrifuge bei 4.500 x g für 10 min bei RT.
    7. Mit einer 10 ml Pipette den Überstand in ein 50 ml Zentrifugenrohr mit 5 ml Isopropanol übertragen. Mischen Sie die Lösung 10x durch Inversion, bis die DNA beobachtet wird.
      HINWEIS: DNA kann als weiße, fadenartige Stränge beobachtet werden, die eine sichtbare Masse bilden.
    8. Zentrifuge bei 4.500 x g für 5 min bei RT, um die DNA zu pellet.
    9. Entfernen Sie mit einer 10 ml Pipette vorsichtig den Überstand und vermeiden Sie das Ablösen des DNA-Pellets. Fügen Sie der DNA 5 ml 70% Ethanol bei RT hinzu. Drehen Sie das Rohr vorsichtig, um das DNA-Pellet und die Seiten des Zentrifugenrohrs zu waschen.
    10. Zentrifuge bei 4.500 x g für 5 min bei RT.
    11. Mit einer 10 ml Pipette, entfernen Sie vorsichtig die 70% Ethanol und vermeiden, das DNA-Pellet zu vertreiben. Lufttrockene genomische DNA für 10 min bei RT.
    12. Fügen Sie der Tube 400 l TE-Lösung hinzu und lassen Sie die DNA durch Inkubation bei 65 °C für 1 h auflösen. Mischen Sie die DNA, indem Sie die Röhre alle 15 min sanft streichen. Wenn sich die DNA nicht vollständig auflöst, brüten Sie das Rohr bei 65 °C für weitere 1 h, während Sie das Rohr alle 15 min sanft flicken, und lassen Sie es über Nacht bei 4 °C.
    13. Zentrifugieren Bei 4.500 x g für 1 min bei RT und übertragen Sie genomische DNA in ein 1,5 ml niedrig bindendes Rohr.
    14. Quantifizieren und messen Sie die Reinheit der genomischen DNA sowohl auf dem Spektralphotometer (für den Gesamtnukleinsäuregehalt) als auch auf dem Fluorometer (für doppelsträngigen DNA-Gehalt).
  2. Optional, niederschlagse genomische DNA, wenn es Probleme mit nachgeschalteter PCR-Verstärkung der sgRNA wie folgt gibt.
    1. Übertragen Sie 400 l genomische DNA in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
    2. Fügen Sie 18 l von 5 M NaCl (Endkonzentration von 0,2 m) und 900 l mit 95 % Ethanol hinzu.
    3. Invertieren Rohr 10x bis gründlich gemischt, dann Zentrifuge bei 16.000 x g für 10 min bei RT.
    4. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und vermeiden Sie das Ablösen des DNA-Pellets. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 500 l 70% Ethanol. Drehen Sie das Rohr vorsichtig, um das DNA-Pellet zu waschen.
    5. Zentrifuge bei 16.000 x g für 5 min bei RT.
    6. Entfernen Sie vorsichtig Überstand und vermeiden Sie das Lösen von DNA-Pellets. Lufttrockene genomische DNA für 10 min bei RT.
    7. Fügen Sie 300 L VON TE hinzu, um die DNA aufzulösen, wie in den Schritten 6.1.12 beschrieben.
    8. Quantifizieren und messen Sie die Reinheit der genomischen DNA, wie in Schritt 6.1.14 beschrieben.
  3. Vorbereitung der CRISPR-Sequenzierungsbibliothek
    1. Einrichten von PCR 1, wie in Tabelle 5 beschrieben, mit insgesamt 100 g genomischer DNA. Fügen Sie 3,5 g genomische DNA pro 50-L-Reaktion hinzu und richten Sie identische 50-L-Reaktionen ein, um die gewünschte Abdeckung zu erreichen. In Tabelle 6 sind Beispiele für Primersequenzen zur Verstärkung von LCV2::TKOv3-Sequenzierungsbibliotheken aufgeführt. Tabelle 7 listet Beispiele für Primersequenzen zur Verstärkung von pLCKO2::TKOv3-Sequenzierungsbibliotheken auf.
    2. PCR 1-Reaktionen in einem Thermocycler mit dem in Tabelle 8beschriebenen Programm verstärken.
    3. Überprüfen Sie die PCR 1-Amplifikation, indem Sie 2 l des PCR-Produkts auf einem 1% Agarose-Gel ausführen. PCR 1 liefert ein Produkt von 600 bp.
    4. Bündeln Sie alle einzelnen 50-L-Reaktionen für jede genomische DNA-Probe und mischen Sie sie durch Wirbeln.
    5. Richten Sie für jede Probe eine PCR 2-Reaktion (50 l) ein, wie in Tabelle 9 beschrieben, wobei 5 l des gepoolten PCR 1-Produkts als Vorlage verwendet werden. Verwenden Sie eindeutige Indexprimerkombinationen für jedes einzelne Beispiel, um das Pooling von Sequenzierungsbibliotheksbeispielen zu ermöglichen.
    6. Verstärken Sie die PCR 2-Reaktion in einem Thermocycler mit dem in Tabelle 10beschriebenen Programm.
    7. Saubere Agarose-Gel-Ausrüstung zur Reinigung verstärkter Produkte mit 0,1 N HCl für 10 min vor dem Gießen eines Gels. Bereiten Sie ein 2% Agarose-Gel vor, das DNA-Färbung enthält, um PCR 2-verstärkte Produkte zu reinigen.
    8. Führen Sie das PCR 2-Produkt auf dem 2% Agarose-Gel bei niedriger Spannung (1,0–1,5 h Lauf) aus. PCR 2 liefert ein Produkt von 200 bp.
    9. Visualisieren Sie die PCR-Produkte auf einem Blaulichttransilluminator. Verbrauchen Sie das 200 bp-Band und reinigen Sie die DNA aus der Agarose-Gelscheibe mit einem Gel-Extraktionskit. Quantifizieren und messen Sie die Reinheit der Sequenzierungsbibliothek sowohl auf dem Spektralphotometer als auch auf dem Fluorometer.
      HINWEIS: Eine typische gelgereinigte Sequenzierungsbibliothekskonzentration reicht von 5–10 ng/l und eine Gesamtausbeute von 150–300 ng.
  4. Hochdurchsatz-Sequenzierung
    1. Sequenzieren Sie die CRISPR-Sequenzierungsbibliotheken auf Sequenzern der nächsten Generation.
    2. Sequenzreferenz T0-Samples mit einer höheren Lesetiefe von 400- bis 500-facher Bibliotheksabdeckung. Sequenzexperimentelle Zeitpunktproben für Aussetzermiten mit einer Mindestlesetiefe von 200-fach. Für starke positive Selektionsbildschirme reicht eine Mindestlesetiefe von 50-facher Abdeckung für die Identifizierung angereicherter sgRNAs aus.
      HINWEIS: Es ist wichtig, das T0-Beispiel zu sequenzieren, um die Bibliotheksdarstellung für einen bestimmten Bildschirm zu bestimmen und als Referenz für die Bestimmung von sgRNA-Faltenänderungen im Laufe der Zeit zu dienen.

7. Datenanalyse

  1. Richten Sie die Sequenz mithilfe von Programmen wie Bowtie aus, um Sequenzlesevorgänge mit den folgenden Parametern der Referenzbibliothek zuzuordnen: -v2 (erlaubt zwei Nichtübereinstimmungen) und -m1 (Verwerfen von gelesenen Lesevorgängen, die mehr als einer Sequenz in der Bibliothek zugeordnet sind).
  2. Normalisieren Sie die Anzahl der eindeutig zugeordneten Lesevorgänge für jede sgRNA für eine bestimmte Probe auf 10 Millionen Lesevorgänge pro Probe wie folgt:
    Equation 3107
  3. Berechnen Sie die log2-Faltenänderung jeder sgRNA für jede Replikation zu jedem Zeitpunkt (Tn) im Vergleich zur T0-Probe (Tn/T0). Fügen Sie allen Lesezählern eine Pseudoanzahl von 0,5 Lesevorgängen hinzu, um Diskontinuitäten von Nullen zu verhindern. SgRNAs mit <30 Rohleseinlesungen in der T0-Stichprobe von der Falzänderungsberechnung und der nachgelagerten Analyse ausschließen.
  4. Analysieren Sie Faltenänderungen mit dem Bayesschen Analyse-Analyse-System für Diegeneessentialität (BAGEL) , wobei die wesentlichen und nicht-essentiellen Trainingssätze verwendet werden, die zuvor19 für Gen-Essentialitäts-Screens definiert wurden ( Zusatztabelle S1) oder DrugZ für Drogenbildschirme20.
  5. Berechnen Sie die Genauigkeit und den Rückruf für die Bildschirmleistungsbewertung mithilfe von BF-Scores. Verwenden Sie den wesentlichen Satz aus Schritt 7.4 als wahre Positivliste für die precision_recall_curve-Funktion der Scikit-learn-Bibliothek für Python, zusammen mit der obigen BF-Score-Teilmenge. Alternativ können Sie diegleiche auch mit dem PRROC-Paket in R ausführen.
  6. Berechnen Sie die mittlere Faltenänderung aller Führungslinien für jedes Gen. Generieren Sie Dichtediagramme für die wesentlichen und nicht-essentiellen Gene (siehe Schritt 7.4) in R oder gleichwertiger Software. Wenn x.ess in R ein Vektor ist, der die Logfold-Änderungswerte wesentlicher Gene und x.nonEss enthält, enthalten sie nicht-essentielle Gene, plot mit dem folgenden Befehl:
    plot( dichte( x.ess ), xlab="mean logFC",col="red",lwd=2 )
    lines( density( x.nonEss ), col="blue",lwd=2 )
    HINWEIS: Für Python-Versionsdetails und verwendete Pakete siehe scikit-learn v0.19.1: (veröffentlicht von Pedregosa et al.21).

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Representative Results

Überblick über den CRISPR-Screening-Workflow im Genommaßstab

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über den gepoolten CRISPR-Screening-Arbeitsablauf, beginnend mit der Infektion von Zielzellen mit CRISPR-Bibliotheklentivirus bei niedrigem MOI, um einzelne Integrationsereignisse und eine angemessene Bibliotheksdarstellung zu gewährleisten (in der Regel 200 bis 1000 -falte). Nach der Infektion werden Die Zellen mit dem Antibiotikum Puromycin behandelt, um für transduzierte Zellen auszuwählen. Nach der Auswahl wird ein Basis-T0-Zellpellet gesammelt, um die Bibliotheksverteilung zu Beginn des Screenings zu bewerten. Die verbleibenden Zellen, die aus einer heterogenen Population genetischer Störungen bestehen, werden alle 3-4 Tage bei der gewünschten Bibliotheksdarstellung für 15-20 Verdoppelungen durchdrungen, damit sich die Genbearbeitung und die daraus resultierenden Effekte manifestieren können. Bildschirme mit medikamentösen Behandlungen werden in der Regel bei T3 oder T6 hinzugefügt, nachdem sich die Zellen von einer Virusinfektion und Puromycin-Auswahl erholt haben. Die Zellen werden an jeder Stelle für genomische DNA an der gewünschten Bibliotheksdarstellung geerntet, um die Führungsfülle durch Sequenzierung der nächsten Generation zu den gewünschten Zeitpunkten zu bestimmen.

Es wird empfohlen, mehrere Stichproben im Falle von Fehlern zu sammeln, die in den Vorbereitungsschritten für die nachgeschaltete Sequenzierungsbibliothek auftreten können. Gepoolte Bildschirme sind in der Regel lebensfähigkeitsbasierte Assays, die entweder für eine positive oder negative Auswahl wesentlicher sgRNAs entwickelt wurden. Positivbildschirme identifizieren Gene, die Resistenzen zeigen oder das Überleben unter spezifischem Selektionsdruck erhöhen (z. B. Medikamente oder mutierte Zelllinie). In diesem Fall sterben die meisten Zellen aus der Selektion, und die verbleibenden Zellen werden für sgRNAs angereichert, die auf Gene abzielen, die gegen das getestete Medikament oder den getesteten Zustand resistent sind. Negative Selektionsbildschirme oder "Drop-out"-Bildschirme identifizieren Gen-Knock-outs mit erhöhter Empfindlichkeit gegenüber oder Überlebensverlust unter dem Bildschirmauswahldruck. Um Störungen zu identifizieren, die einen phänotypischen Effekt haben, wie z. B. einen Wachstumsfehler, wird die Führungsfülle zu jedem Zeitpunkt durch Sequenzierung der nächsten Generation quantifiziert und mit T0 verglichen, um das Aussetzen oder die Anreicherung von Leitfäden im Verlauf des Bildschirms zu bewerten. Mithilfe von Analyseplattformen werden Protokollwechsel für Leitfäden gemessen, und Algorithmen wie der BAGEL können angewendet werden, um die Rangfolge von Gentreffern zu ermöglichen.

Bibliotheksverstärkung und -pflege der Bibliotheksdarstellung in gepoolten CRISPR-Bildschirmen

Abbildung 2 zeigt die erwartete Verteilung der Hilfslinien nach der Verstärkung der Plasmidbibliothek. Die TKOv3-Bibliothek besteht aus 71.090 sgRNAs mit vier sgRNAs pro Gen, die auf 18.000 Protein-Codierungsgene10abzielen. Eine ideale Bibliothek sollte jede einzelne sgRNA in ähnlichen Mengen vertreten haben. Daher wird empfohlen, die Verteilung von Hilfslinien in der verstärkten Bibliothek durch Sequenzierung der nächsten Generation zu bestätigen. Hier ist eine verstärkte Bibliothek mit sehr enger Verteilung von sgRNAs zu sehen, die bestätigt, dass >95% aller sgRNAs innerhalb des 4-fachen Verteilungsbereichs liegen (Abbildung 2). Eine breitere Verteilung von sgRNAs wird darauf hinweisen, dass die Fülle von Bibliotheksführern nicht gleichmäßig dargestellt ist und zum Rauschen in gepoolten Bildschirmen beitragen kann.

Bewertung der Bildschirmleistung

Abbildung 3 zeigt, dass die Leistungsqualität eines Bildschirms bewertet werden kann, indem die Verteilung aller sgRNA durch Faltenwechsel anhand einer Goldstandard-Referenzliste von essentiellen (684 Genen) und nicht essentiellen Genen (926 Genen) bewertet und als Präzisions-Rückrufkurven10. Mithilfe der Goldstandard-Referenzsätze werden Bayes Factor (BF)-Scores für den Bildschirmendpunkt berechnet und Präzisions-Rückrufkurven geplottet. BF-Scores werden berechnet, indem die Log-Fold-Änderung für alle Leitfäden analysiert wird, die auf ein Gen abzielen, indem ein Bayesian-Framework (der zuvor beschriebene BAGEL-Algorithmus19) verwendet wird, um Die Verteilungen bekannter wesentlicher und nicht-wesentlicher Führungssätze zu vergleichen. Falsche Ermittlungsraten (FDR) werden empirisch mit den gleichen Goldstandard-Referenzsätzen abgeleitet. Ein leistungsstarker Bildschirm sollte eine hohe Anzahl von essentiellen Genen bei einem Schwellenwert von BF >6 und FDR <5% wiederherstellen, wie ein scharfer "Bogen" in den meisten Kurven und eine gerade Linie zum Endpunkt belegen, wie die blaue Linie in Abbildung 3A zeigt. Der Ausfall von Leitfäden, die auf wesentliche und nicht wesentliche Gene abzielen, sollte ebenfalls untersucht werden (Abbildung 3B). Leitfäden, die auf die Referenz nicht-essentielle Gene abzielen, sollten eine weitgehend symmetrische Verteilung der Log-Fold-Änderungen zeigen, die bei Null zentriert sind, wie die gestrichelte Linie in Abbildung 3Bzeigt. Die Verteilung der Faltenwechselvon Leitfäden, die auf essentielle Gene abzielen, zeigt eine starke negative Verschiebung im Verhältnis zur Verteilung von Leitfäden, die auf nicht essentielle Gene abzielen, wie die feste Linie in Abbildung 3Bzeigt.

Essentielle Gene

Eine der grundlegenden Anwendungen von gepoolten genomweiten Drop-out-Screens ist die Identifizierung wesentlicher Gene. Wesentliche Gene, eine Unterkategorie von Fitnessgenen, sind Gene, deren Störung Zelltodizität verursacht, die auch lose als Proliferationsgene betrachtet werden. Im Kontext der Krebsbiologie ist es möglich, kontextspezifische Essentials zu identifizieren, um Abhängigkeiten für eine bestimmte Tumorzelllinie zu identifizieren. Abbildung 4zeigt den Genrang wesentlicher Gene anhand von Bayes Factor-Scores, die aus dem BAGEL-Algorithmus abgeleitet wurden. Bayes Factor (BF) stellt ein Vertrauensmaß dar, dass der Gen-Knock-out zu einem Fitnessfehler führt. Positivere Werte deuten auf eine höhere Zuversicht hin, dass die Störung zu einer Abnahme der Fitness führt.

Positiver Auswahlbildschirm

Genomweite Knock-out-Pools können in Gegenwart von überschüssigem Wirkstoff kultiviert werden, um nach Suppressor-/Resistenzgenen zu suchen. Hier ist ein Beispiel für HCT116-Zellen zu sehen, die in Gegenwart von Thymidin gescreent werden, um nach Unterdrückern von G1/S-Arrest3zu suchen. Einzelheiten zu diesem Bildschirm finden Sie in einer früheren Publikation3. Kurz gesagt, 6 Tage nach der Auswahl der VON der CRISPR-Bibliothek infizierten Zellen wurden die Zellen in Repliken aufgeteilt, die die Abdeckung der Bibliothek aufrechterhielten, und mit Thymidin behandelt. Die Zellen wurden in Gegenwart von Medikamenten durchdroniert, bis reichlich resistente Zellen für die genomische DNA-Probenahme geborgen wurden. Positive Auswahlen können bei niedrigerer Abdeckung (Lesetiefe) sequenziert werden als Negativbildschirme, da aufgrund des starken selektiven Drucks nur ein kleiner Bruchteil der Führungen erhalten bleibt. In diesem Beispiel wurde die Sequenzierung mit einigen Millionen Lesevorgängen erreicht, und 11 von 12 sgRNAs, die auf Thymidinkinase (TK1) abzielen, wurden wie erwartet zurückgewonnen und angereichert(Abbildung 5).

Die Beträge wurden anhand des Molverhältnises von 1:1:1 ermittelt.
teil Betrag pro 15-cm-Platte a
LCV2::TKOv3 pLCKO2::TKOv3
psPAX2 4,8 g 7,0 g
pMD2.G 3,8 g 4,0 g
TKOv3b 8,0 g 5,0 g
a Auf der Grundlage der produktivsten Plasmidkombination für die TKO-Bibliothek ermittelte Beträge mit 1:1:1-Molarenverhältnis
b Menge TKO Plasmid basierend auf CRISPR Bibliothek Vektor Backbone. LCV2 All-in-One-Vektor =13 kb, nicht Cas9 pLCKO2 Vektor = 7,6 kb

Tabelle 1: Empfohlene Menge an Plasmid für TKOv3-Transfektion.

teil Betrag pro 15-cm-Platte
Opti-MEM 800 l
Transfektionsreagenz 48 l

Tabelle 2: Lipidbasierte Transfektionsreagenz-Einrichtung.

Faltenabdeckung Anzahl der Zellen pro sgRNAb  Anzahl der für die Infektion erforderlichen Zellenb
(sgRNA-Bibliotheksgrößea - Faltabdeckung) (sgRNA-Bibliotheksgröße bei Faltenabdeckung bei 0,3 MOI)
200 1,5 x 107 5 x 107
500 3,6 x 107 1,2 x 108
1000 7,1 x 107 2,4 x 108
a Basierend auf TKOv3 Bibliotheksgröße = 71.090 sgRNA
b Zahlen werden aufgerundet

Tabelle 3: Bestimmung der Zellennummern, die für die Infektion der TKOv3 CRISPR-Bibliothek und die Zellbeschichtung bei unterschiedlicher Faltabdeckung erforderlich sind.

behandlung Anzahl der für eine Infektion erforderlichen Platten
Siebplatten Virus, + Puromycin (sgRNA-Bibliotheksgröße: 200-fach)
Steuerung 1 Kein Virus, + Puromycin (0% Überlebenskontrolle) 1
Steuerung 2 Virus, + Kein Puromycin (100% Überlebenskontrolle) 1
a Zusätzliche Platten einschließen, um MOI-Schwankungen und Wachstumsraten zu berücksichtigen

Tabelle 4: Berechnung der Infektionseinrichtung.

Reagenzien Betrag pro 1x Reaktion
2x Master Mix 25 l
10 mM PCR 1 LCV2 Vorwärtsgrundierung 2,5 l
10 mM PCR 1 LCV2 Reverse Primer 2,5 l
Genomische DNA 3,5 g
wasser bis zu 50 l
gesamt 50 l

Tabelle 5: PCR 1-Einrichtung.

Tabelle 6: PCR-Primer zur Verstärkung von LCV2::TKOv3-Sequenzierungsbibliotheken. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Tabelle 7: PCR-Primer zur Verstärkung von pLCKO2::TKOv3-Sequenzierungsbibliotheken. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

schritt temperatur zeit
1 98°C 30 Sek.
2 98°C 10 Sek. 25 Zyklen (Schritt 2 – 4)
3 66°C 30 Sek.
4 72°C 15 Sek.
5 72°C 2 Min.
6 10°C halten

Tabelle 8: PCR 1-Zyklusparameter.

Reagenzien Betrag pro 1x Reaktion
2x Master Mix 25 l
10 mM i5 Vorwärtsgrundierung 2,5 l
10 mM i7 Reverse Primer 2,5 l
PCR 1 Produkt 5 l
wasser 15 l
gesamt 50 l

Tabelle 9: PCR 2-Einrichtung.

schritt temperatur zeit
1 98°C 30 Sek.
2 98°C 10 Sek. 10 Zyklen (Schritt 2 – 4)
3 55°C 30 Sek.
4 65°C 15 Sek.
5 65°C 5 Min.
6 10°C halten

Tabelle 10: PCR 2-Zyklusparameter.

Zusatztabelle S1. TKO Referenz-Gen-Sets Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Übersicht über den gepoolten Screening-Workflow. (A) Die Zielzellpopulation ist mit dem CRISPR-Bibliotheks-Lentivirus bei niedrigem MOI infiziert, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen eine virale Integration erhalten und die Bibliotheksdarstellung erhalten bleibt. Die verschiedenen Farben stellen verschiedene sgRNAs in jedem viralen Teilchen dar. Genetisch veränderte Zellpools werden ausgewählt. Sobald die Auswahl abgeschlossen ist, werden Zellen für T0-Referenz abgetastet und seriell durchgehend. (B) Beim ersten Durchgang nach T0 haben sich Zellen von Infektionen erholt und bei Bedarf können medikamentöse Behandlungen hinzugefügt werden. Nach der Behandlung werden die Zellpopulationen für mehrere Wochen seriell durchgesiedelt. Während jeder Passage werden Zellen für genomische DNA gesammelt und bei der erforderlichen Faltenabdeckung der sgRNA-Bibliothek neu gesät. (C) Es können zwei Arten von Bildschirmen durchgeführt werden: 1) positive Selektionssiebe, die mutierte Zellen identifizieren, die Resistenzen oder ein erhöhtes Überleben unter dem spezifischen Selektionsdruck zeigen (z. B. Medikamente oder mutierte Zelllinie), da sie während der Bildschirm; oder 2) negative Selektionsbildschirme, die mutierte Zellen mit erhöhter Empfindlichkeit gegenüber oder Überlebensverlust unter dem Bildschirmauswahldruck identifizieren, da sie während des Bildschirms verloren gehen. (D) Genomische DNA wird geerntet und PCR-verstärkt, um sie für Führungsregionen anzureichern. (E) Die Häufigkeit der Leitfäden wird durch Sequenzierung der nächsten Generation quantifiziert und angereichert, oder erschöpfte Leitfäden werden für die "Treffer"-Identifikation bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Qualität der verstärkten CRISPR sgRNA-Bibliothek. Verstärkte Bibliotheksplasmide werden durch Sequenzierung der nächsten Generation analysiert (empfohlene Lesevorgänge: 30 Millionen Lesevorgänge, was einer 400-fachen Darstellung der Bibliothek entspricht). Hier ist eine Bibliothek mit enger Verteilung von sgRNAs, mit >95% aller sgRNAs innerhalb eines 4-fachen Verteilungsbereichs.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Bewertung der Drop-out-Bildschirmqualität mit gold-Standard essentiellen Genreferenzsätzen. (A) Präzisionsrückrufanalyse der Screening-Ergebnisse bei der Wiederherstellung wesentlicher Gene bei einem Schwellenwert von BF >6 und FDR von 5 %. Leistungsstarke Bildschirme werden durch blaue Linie und low performing Screens durch rote Linie dargestellt. (B) Falten ändern Verteilung von sgRNA auf essentielle Gene (feste Linie) und nicht-essentielle Gene (gepunktete Linien). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Bestimmung der Gen-Essentialität. Bayes Factor Ranking des Gens im Wesentlichen in einem bestimmten Bildschirm. Bayes Factor (BF) stellt ein Vertrauensmaß dar, dass der Gen-Knock-out zu einem Fitnessfehler führt. Höhere Bayes-Faktoren deuten auf eine erhöhte Zuversicht hin, dass Gen-Knock-out zu Fitnessfehlern führt (rote Punkte). Lower Bayes Factor-Werte deuten darauf hin, dass Knock-out Wachstumsvorteil bietet (blaue Punkte). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Positiver Selektionsbildschirm für den Suppressor des Thymidinblocks in HCT116-Zellen. Normalisierte Leseanzahl für alle sgRNAs bei T0, die gegen die durchschnittliche normalisierte Leseanzahl für Thymidin-behandelte Proben geplottet werden. Bei positiven Selektionsbildschirmen (d. h. mit einer IC90-Konzentration von Medikamenten) wird erwartet, dass die Anzahl der Störungen, die Resistenz gegen das Medikament verleihen, gering sein wird. Aus diesem Grund kann die Lesetiefe niedriger sein als das, was für Negativbildschirme benötigt wird, da der größte Teil der Bibliothek dargestellt werden soll. TK1 sgRNAs sind rot eingekreist. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichunggeändert 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Aufgrund seiner Einfachheit und hohen Geschmeidigkeit wurde die CRISPR-Technologie weithin als Werkzeug der Wahl für die präzise Genombearbeitung angenommen. Das gepoolte CRISPR-Screening bietet eine Methode, um Tausende von genetischen Störungen in einem einzigen Experiment zu hinterfragt. In gepoolten Bildschirmen dienen sgRNA-Bibliotheken als molekulare Barcodes, da jede Sequenz einzigartig ist und dem Zielgen zugeordnet ist. Durch die Isolierung der genomischen DNA aus der Zellpopulation können Gene, die den Phänotyp von Interesse verursachen, durch Quantifizierung der sgRNA-Fülle durch Sequenzierung der nächsten Generation bestimmt werden. Massiv parallele Sequenzierungsmethoden werden verwendet, um sgRNAs in Stichproben zu quantifizieren, was bedeutet, dass mehrere unabhängige Zellpopulationen in dieselbe Sequenzierungsspur gepoolt werden können, um die Kosten zu minimieren.

Bevor sie mit einem groß angelegten Screening-Projekt beginnen, ist es wichtig, ein gut charakterisiertes und technisch optimiertes Modell zu haben. Genetischer Hintergrund, Wachstumsrate und Transduktionseffizienz sind wichtige Faktoren bei der Auswahl Ihrer Zelllinien für das Screening. Beispielsweise bestimmen Wachstumsraten und Bearbeitungseffizienz die Skalierbarkeit und technische Eignung des Modells. Um große sgRNA-Bibliotheken angemessen darzustellen, sind zig Millionen Zellen erforderlich, daher könnte die Zellnummer ein begrenzender Faktor bei der Screening-Machbarkeit für Zelllinien mit langsameren Verdoppelungen oder von Zellen sein, die keine gute proliferative Kapazität haben (z. B. Primärzellen). Basierend auf Wachstumsraten sollten Zellkulturbedingungen wie Zellsädichte und Plattengröße für das Screening entsprechend ausgewählt werden. Es wird empfohlen, Zellen in dem größten Gefäß zu kultiieren, das für den Bildschirm praktisch und technisch machbar ist.

Die Transduktionseffizienz enden je nach Zelltyp, da sich die Zellen in der inhärenten Infektiosität unterscheiden. Infolgedessen wird das Virusvolumen, das erforderlich ist, um eine ausreichende Infektion in einem Zelltyp zu erreichen, in einem anderen nicht unbedingt gleich sein. Daher ist es wichtig, jede in der zu prüfende Linsenbibliothek funktionell zu titern, um eine ausreichende Abdeckung der Bibliothek und meist einzelne Transduktionsereignisse pro Zelle zu gewährleisten, indem bei niedrigeren MOIs etwa 0,3 (Abschnitt 4) transduziert wird. Transduktionseffizienzen können auch durch Zellkulturbedingungen beeinflusst werden; Daher sollten funktionstüchchende Titer unter Verwendung der gleichen Zellbedingungen bestimmt werden, die auf dem Bildschirm verwendet werden. Das heißt, es ist wichtig, die gleichen Gewebekulturgefäße, Medienbestandteile und Volumen, Zellbeschichtungsdichte und Virus-Preps ohne vorheriges Tauwetter zu verwenden. Messungen in verschiedenen Formaten oder Bedingungen werden nicht zuverlässig auf das Screening-Format skaliert.

Trotz des Vorteils der Verwendung von All-in-One CRISPR-Cas9-Führungsbibliotheken wie LCV2::TKOv3 ist das Gen, das Cas9 kodiert, recht groß, was es schwierig macht, effizient in virale Partikel (105-106 TU/ml) zu verpacken. Die Bereitstellung niedrigerer lentiviraler Titer kann eine Einschränkung für Zelllinien sein, die schwer zu transducieren sind, da sie noch größere Schwierigkeiten mit den All-One-CRISPR-Bibliotheken haben werden. Um dies zu mildern, sollte Cas9 im Voraus in der Zellzeile ausgedrückt werden, gefolgt von der Bereitstellung von CRISPR-Bibliotheken, die nur sgRNAs enthalten (z.B. pLCKO2::TKOv3), die bei viel höheren Tittern (107-108 TU/ml) hergestellt werden können. Die Ploidie einer Zelllinie ist ebenfalls wichtig, da sie die Anzahl der Ziel-Loci bestimmt, die geändert werden müssen. Die Fähigkeit, vollständige Knock-outs in haploiden Zellen zu erzeugen, ist effizienter als in Zellen mit mehreren Kopien eines bestimmten Gens. Daher können Bildschirme in haploiden Zellen empfindlicher sein und qualitativ hochwertigere Daten liefern als Bildschirme, die in diploiden oder aneuploiden Zelllinien durchgeführt werden6. Das Testen bekannter Gene, die mit dem Phänotyp verknüpft sind, hilft dabei, die Bildschirmfähigkeit eines Zelllinienmodells zu bestimmen. Für Essentialitätsbildschirme können beispielsweise Leitfäden verwendet werden, die auf eine Untereinheit des 26S-Proteasom abzielen, PSMD1 (Addgene: plasmid #74180), ein wesentliches Kerngen, um die Bearbeitungseffizienz und Infektibilität von Zelllinien zu testen, als Störung von PSMD1 wird zum Zelltod führen.

Die Robustheit von gepoolten Bildschirmen hängt stark von der sgRNA-Darstellung ab. Dies ist eine wichtige Metrik, die die Bibliotheksleistung während eines Bildschirms und die Fähigkeit, Treffer zu identifizieren, bestimmt. Die Bibliotheksvielfalt ist in der Darstellung jeder sgRNA verzerrt; Daher sollte die Population der zu untersuchenden und zu analysierenden Zellen ausreichend groß sein, um die Erfassung von unterrepräsentierten sgRNAs zu gewährleisten6. 200- bis 1000-fache Darstellung jeder sgRNA ist die typische Abdeckung, die in veröffentlichten Bildschirmen verwendet wurde (d.h. 200-1000 Zellen pro sgRNA)10,15. Diese Darstellung sollte bei der Verstärkung des Bibliotheksplasmids (Abschnitt 1) und auf dem gesamten Bildschirm beibehalten werden, indem die erforderliche Zellnummer (Abschnitt 5) infiziert und übergeben wird, um die gewünschte Bibliotheksabdeckung darzustellen, und während der Sequenzierungsbibliothek Vorbereitung (Protokoll 6), wie im gesamten Protokoll beschrieben. Um beispielsweise die 200-fache Abdeckung der TKOv3-Bibliothek zu erreichen, ist die Auswahl und Passierung von 15 Millionen infizierten Zellen erforderlich. Bei der Sequenzierung ist unter der Annahme, dass ein diploides menschliches Genom 7,2 pg DNA und 1 sgRNA pro Genom enthält, insgesamt 100 g genomische DNA erforderlich, um die Sequenzierungsbibliothek für 15 Millionen Sequenzlesungen zu erzeugen. Die Entscheidung über die Abdeckung hängt von der Größe der Bibliothek ab, da die Abdeckung größerer Bibliotheken eine größere Anzahl von Zellen erfordern wird, die schwierig zu warten und technisch nicht praktikabel sind. Mit TKOv3-Bibliotheken wird eine Mindestabdeckung von 200- empfohlen, da das 200-fache eine optimale Balance zwischen der Logistik des Screenings einer großen Anzahl von Zellen und der Aufrechterhaltung eines ausreichenden Dynamikbereichs bietet, um echte biologische sgRNA-Aussetzer mit begrenzten Geräusche durch zufälligeErschöpfungen 22,23. Höhere Bibliotheksdarstellungen führen zu einer verbesserten Reproduzierbarkeit und sorgen für ein ausreichendes Zeitfenster zur Erkennung von Veränderungen in der sgRNA-Fülle, insbesondere bei negativen Auswahlen. Ein einschränkendes Merkmal von Negativbildschirmen ist, dass die Störung nur in dem Maße erschöpft ist, wie sie in der Startbibliothek24vorhanden war. Im Vergleich dazu ist der dynamische Bereich der positiven Selektionsbildschirme viel größer, da sie auf der Anreicherung von Zellen beruhen und sich auf 100% der Endpopulation anreichern könnten23. Daher können bei positiven Selektionsbildschirmen (z.B. Drogenresistenzbildschirmen) die Abdeckung der Bibliothek und die Lesetiefe auf die 50- bis 100-fache Darstellung reduziert werden, da nur eine kleine Zellpopulation überleben soll.

Das hier beschriebene Sequenzierungsbibliotheksprotokoll ist eine zweistufige PCR, die für TKOv3 CRISPR-Bibliotheken in beiden Vektor-Backbones optimiert und auf der Illumina-Sequenzierungsplattform sequenziert wird. Diese Sequenzierungsbibliotheken können auch mit einem einzigen PCR-Protokoll generiert werden, ähnlich dem in Hart et al.3beschriebenen . Bei anderen vorgefertigten Bibliotheken sollten die für diese Bibliotheken bereitgestellten Primer und Sequenzierungsprotokolle konsultiert werden. Bei der Herstellung von genomischen DNA- und PCR-Proben ist es wichtig, kontaminationswilliger Vorsichtsmaßnahmen zu berücksichtigen. Beispielsweise wird ein spezieller Bereich für die genomische DNA-Reinigung dringend empfohlen. Es sollte auch physisch von bakteriellen Plasmid-Präparaten unterschieden werden, die häufige Verunreinigungen in genomischen DNA-Proben gefunden werden. PCR-Reaktionen sollten in einer speziellen PCR-Haube eingerichtet werden, da dies die Kontamination durch Plasmide und andere Sequenzierungsbibliotheken minimiert. Für bewährte Verfahren kann eine negative Kontrolle ohne Vorlage enthalten sein, um die Überwachung von PCR-Kontaminationen zu unterstützen.

Die Datenanalyse zum Übersetzen von Sequenzierungslesevorgängen von Bildschirmen ist angesichts der Größe und Vielfalt dieser Datasets eine nicht triviale Aufgabe. Sobald die Sequenzlesevorgänge ausgerichtet und normalisiert wurden, stehen mehrere bioinfordische Werkzeuge zur Verfügung, um die Bildschirmleistung (Abbildung 3) und die Trefferidentifikation (Abbildung 4) zu verbessern. BAGEL wird in diesem Protokoll als Schlüsselwerkzeug für die Datenanalyse beschrieben. BAGEL verwendet ein bayesisches Framework, um die Verteilungen bekannter wesentlicher und nicht-wesentlicher Gensätze mit der Log-Fold-Änderung aller Leitfäden zu vergleichen, die auf ein Gen abzielen. Diese Methode wird ausführlich in Hart et al3beschrieben. Neben BAGEL können auch andere Algorithmen verwendet werden, die sowohl angereicherte als auch erschöpfte sgRNAs identifizieren, wie z. B. MAGeCK25. Für Arzneimittel-Screens, Es wird empfohlen, den DrugZ-Algorithmus zu verwenden, um sowohl synergistische und suppressor chemische genetische Wechselwirkungen zu identifizieren. DrugZ wurde entwickelt, um die relative Häufigkeit von sgRNA in einer behandelten Population mit der relativen Häufigkeit von sgRNA in einer unbehandelten Population zum gleichen Zeitpunkt20zu vergleichen.

Eine Einschränkung der CRISPR-Bildschirme ist, dass Cas9 nicht immer zu einem Knock-out führt, da es immer die Möglichkeit gibt, dass die erzeugten Indels Inframe-Mutationen sind, wodurch die Genfunktion intakt bleibt13. Dies führt zu einer gemischten Bevölkerung, was den Bildschirm "laut" macht und die Interpretation von Daten herausfordernd macht. Die Verwendung mehrerer unabhängiger sgRNAs, die auf ein Gen abzielen, kann Redundanz aufbauen und die Wirkung von sgRNAs mit geringer Aktivität reduzieren. Ein weiterer Vorbehalt der CRISPR-Studien ist die Wirkung der Doppelstrangbrüche, die durch Cas9-Nuklease entstehen, was zu zellulärer Letalität unabhängig vom zielgerichteten Gen führen kann. Dieser antiproliferative Effekt nimmt mit der Kopiernummer der Zielseite zu, was zu einer falsch positiven Identifizierung von Genen in stark verstärkten Regionen führt26. Berechnungsmethoden wie CERES wurden entwickelt, um Kopierzahleneffekte zu korrigieren27. Diese Workflows berücksichtigen den Kopiernummerneffekt, um die Genabhängigkeitsniveaus in Knock-out-basierten Essentialitätsbildschirmen zu schätzen. Eine sorgfältige Untersuchung der genomischen Standorte von Treffergenen in verstärkten Regionen kann helfen, falsche Positivwerte zu bestimmen, die auf die Vielzahl von Schnitteffekten zurückzuführen sind13. Primäre Bildschirme können nur potenzielle Treffer identifizieren. Es ist wichtig, mit einem sekundären Bildschirm oder Protokoll nachzuverfolgen, um die Treffer zu validieren und on-target von Off-Target-Effekten zu unterscheiden, falsche Positivmeldungen auszusondern und sicherzustellen, dass Gene, die aufgrund ineffektiver Störungen schwach bewertet wurden, nicht als falsch zurückgelassen werden. Negative23.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf lebensfähigkeitsbasierte Screening-Ansätze, bei denen der Untersuchungszustand zu einem Proliferationsfehler oder zum Tod von Zellen führen sollte. Bei Prozessen, die nicht zu einer Änderung der zellulären Lebensfähigkeit führen, kann die lebensfähigkeitsbasierte poolierte Screening-Methode restriktiv sein. Eine Alternative besteht darin, Bildschirme mit Reporter- oder Marker-basierten Assays und Anreicherung durch fluoreszenaktivierte Zellsortierungsansätze (FACS) durchzuführen. In markerbasierten Selektionsbildnern basiert der Phänotyp auf Mutationen, die die Markergenexpression regulieren, anstatt die Zellgesundheit13,23. Arrayed CRISPR-Formate sind auch für ein Gen pro Well Screening verfügbar. Arrayed-Formate sind für komplexe oder mikroskopische Auslesungen zugänglicher. Arrayed-Formate erfordern jedoch automatisierte Geräte und große Mengen an Reagenzien28.

Das hier diskutierte Screening-Protokoll verwendet S. pyogenes Cas9 Nuklease, um Nullallele zu erstellen, die am häufigsten für genetische Bildschirme verwendet werden und für die viele Bibliotheken verfügbar sind (Addgene: Pooled Libraries). Es gibt auch alternative Optionen für Knock-out-Bibliotheken, die eine katalytisch tote dCas9 verwenden, die an Chromatin-Modifikatorproteine gebunden ist, um die Metaperion von Genen zu hemmen (CRISPRi) oder (CRISPRa) zu aktivieren. Ähnlich wie RNAi bietet CRISPRi die Möglichkeit, phänotyptische Effekte bei verschiedenen Gendosen und essentiellen Genen zu untersuchen, die einen vollständigen Knock-out nicht tolerieren können, während CRISPRa zur Durchführung von Funktionsverstärkungsbildschirmen verwendet werden kann. Jede dieser Technologien hat ihre Vorteile, aber im Allgemeinen ist der CRISPR-Knock-out-Ansatz der am weitesten entwickelte. Es hat sich bewährt, gut mit geringem Rauschen, minimalen Off-Target-Effekten und experimenteller Konsistenz, vor allem in tödlichen essentiellen Gen-Screens, im Vergleich zu Knock-down-Ansätzen mit entweder CRISPRi und shRNAs5. Trotz ihrer bisher umfangreichen Anwendbarkeit befindet sich die CRISPR-Screening-Technologie noch in den Anfängen. Aus den Grundkomponenten von CRISPR werden weiterhin neue Werkzeuge gebaut. Dazu gehören kombinatorische Gen-Editing-Strategien, die auf mehrere genomische Loci abzielen können, die Optimierung orthogonaler Cas-Enzyme und Modifikationen mit chromatin-funktionsiellen Domänen zur Diversifizierung der Cas9-Aktivitäten. Da die CRISPR-Technologie weiter wächst, wird ihre Kopplung an genetische Screening-Ansätze als leistungsstarke Plattform für die funktionelle Entdeckung in der Genetik dienen.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von Genome Canada, dem Ontario Research Fund und den Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 micron filter
30°C plate incubator
37°C shaking incubator
37°C, 5% CO2 incubator
5 M NaCl Promega V4221
50X TAE buffer BioShop TAE222.4
6 N Hydrochloric acid solution BioShop HCL666.500
95% Ethanol
Alamar blue ThermoFisher Scientific DAL1025
Blue-light transilluminator ThermoFisher Scientific G6600
Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade Bioshop ALB001.250
Dulbecco's Modification of Eagles Medium Life Technologies 11995-065 Cel culture media
Electroporation cuvettes BTX 45-0134
Electroporator BTX 45-0651
Endura electrocompetent cells Lucigen 90293
Fetal Bovine Serum GIBCO 12483-020
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216 recommend passage number <15
Hexadimethrine Bromide (Polybrene) Sigma H9268 Cationic polymer to enhance transduction efficiency
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)
LB agar plates with carbenicillin
LB medium with carbenicillin
Low molecular weight DNA ladder New England Biolabs N3233S
Nanodrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544L
Opti-MEM Life Technologies 31985-070 Reduced serum media
Plasmid maxi purification kit Qiagen 12963
pMD2.G (envelope plasmid) Addgene Plasmid #12259 lentiviral system
psPAX2 (packaging plasmid) Addgene Plasmid #12260 lentiviral system
Puromycin Wisent 400-160-UG
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
Qubit dsDNA BR assay ThermoFisher Scientific Q32853
Qubit fluorometer ThermoFisher Scientific Q33226
RNAse A Invitrogen 12091021
S.O.C recovery medium Invitrogen 15544034
SYRB Safe DNA gel stain ThermoFisher Scientific S33102
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included Addgene Addgene ID #90203 Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 Addgene Addgene ID #125517 Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA
Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0
UltraPure agarose ThermoFisher Scientific 16500500
Wizard genomic DNA purification kit Promega A1120
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 06 365 809 001 Lipid based transfection reagent

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References

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Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (151), e59780, doi:10.3791/59780 (2019).

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