Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

Published: September 4, 2019 doi: 10.3791/59780
* These authors contributed equally

Summary

CRISPR-Cas9 הטכנולוגיה מספקת שיטה יעילה בדיוק לערוך את הגנום היונקים בסוג תא כלשהו ומייצג את האמצעים הרומן לבצע מסכי גנטי רחב הגנום. פרוטוקול מפורט לדון בצעדים הנדרשים עבור ביצועים מוצלחים של מסכי CRISPR-Cas9 הגנום הרחב מסופק כאן.

Abstract

עריכת הגנום באמצעות מערכת crispr-Cas יש מתקדם מאוד את היכולת לערוך בדיוק את גנום של אורגניזמים שונים. בהקשר של תאים מיונקים, טכנולוגיה זו מייצגת את האמצעים החדשניים לבצע הגנום-רחב מסכים גנטיים למחקרים גנומיקה תפקודית. ספריות של rnas מדריך (sgrna) מיקוד כל מסגרות הקריאה הפתוחה להתיר את הדור נתיישב של אלפי רטבאליות גנטית בבריכה אחת של תאים שניתן הוקרן עבור פנוטיפים ספציפיים כדי לסבך את הפונקציה גן ותהליכים סלולריים ב דרך לא משוחדת ושיטתית. CRISPR-Cas מסכי לספק לחוקרים עם שיטה פשוטה, יעילה, זולה לחשוף את התוכניות הגנטיות עבור פנוטיפים סלולריים. יתר על כן, ניתוח דיפרנציאלי של מסכי שבוצעו קווי תאים שונים מסוגים שונים של סרטן יכול לזהות גנים כי הם הכרחיים בתאי הגידול, חשיפת מטרות פוטנציאליות עבור טיפולים ספציפיים נגד סרטן. ביצוע מסכי הגנום כלל בתאים אנושיים יכול להיות מרתיע, כמו זה כרוך בטיפול של עשרות מיליוני תאים ודורש ניתוח של קבוצות גדולות של נתונים. הפרטים של המסכים האלה, כגון אפיון קו התא, שיקולי הספרייה של CRISPR, והבנת המגבלות והיכולות של טכנולוגיית CRISPR במהלך הניתוח, מתעלמים לעתים קרובות. בתנאי כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור ביצוע מוצלח של במאגר הגנום CRISPR-Cas9 מבוססי מסכי.

Introduction

Crispr-Cas, קיצור עבור מקובצים באופן קבוע במרווחים של palindromic קצר ולאחר מכן ו crispr הקשורים נוקלאז, מורכב חלבון נוקלאז יחיד (למשל, Cas9) מורכב עם מדריך סינתטי RNA (sgrna). זה מורכב ribonucleoprotein מטרות האנזים Cas9 כדי לגרום להפסקות DNA כפול שנתקע על לוקוס גנומית מסוימת1. כפול תקועים הפסקות ניתן לתקן דרך הומולוגיה תיקון מכוון (HDR) או, בדרך כלל, באמצעות שאינם הומוולוגיים הצטרפות (NHEJ), שגיאה מועדת תיקון מנגנון כי תוצאות ההוספה ו/או מחיקות (INDELS) כי לעתים קרובות לשבש את פונקציית הגן 1. היעילות והפשטות של CRISPR מאפשר רמה בעבר בלתי מושג של גנומית מיקוד כי הרבה עולה מעל הגנום הקודם לעריכת טכנולוגיות [i.e., האצבעות אבץ נוקלאוסיס (הזפה) או שעתוק activator כמו הנוקלאוסים ( TALENS), שניהם סובלים ממורכבות עיצוב מוגבר, יעילות החצייה הנמוכה יותר, ומגבלות בתוך מעגל העריכה של הקולנוע2].

היישום מחקר בסיסי של CRISPR בודד מדריך מבוסס RNA הגנום המבוסס על עריכת מדענים ביעילות ובזול לחקור את הפונקציות של גנים בודדים וטופולוגיה של רשתות אינטראקציה גנטית. היכולת לבצע מסכי הגנום הפונקציונלי היה משופר מאוד על ידי שימוש במערכת CRISPR-Cas, במיוחד כאשר בהשוואה לטכנולוגיות מוקדמות יותר גנטי כגון התערבות RNA (RNAi) ומוטזיס גנים מלכודת. בפרט, rnai סובל השפעות גבוהות מחוץ למטרה ואת הנוק-אין שלם, וכתוצאה מכך רגישות נמוכה יותר וספציפיות לעומת crispr3,4,5, בעוד שיטות מלכודות גנטי ניתן רק בהפלואיד תאים עבור מסכי אובדן-פונקציה, הגבלת היקף דגמי התא שניתן לחקור6. היכולת של CRISPR לייצר הגן המלא לנקוש לכבות מספק מערכת חזקה יותר ביולוגית לחקור פנוטיפים מוטנטים, עם רעש נמוך, השפעות מינימליות מחוץ ליעד ופעילות עקבית על פני ריאגנטים5. Crispr-Cas9 sgrna ספריות המטרה הגנום האנושי כולו זמינים כעת נרחב, המאפשר דור סימולטני של אלפי גנים להוריד בניסוי אחד3,7,8,9 .

פיתחנו מאוד CRISPR-Cas9 הגנום-wide sgRNA בספריות ויראליות בשם טורונטו לנקוש-out (TKO) ספריות (זמין דרך Addgene) כי הם קומפקטי רצף ממוטב כדי להקל על ברזולוציה גבוהה מסכי גנומיקה תפקודית. הספרייה העדכנית ביותר, TKOv3, מטרות ~ 18,000 האדם בקידוד הגנים עם מדריכים 71,090 ממוטב לעריכת יעילות באמצעות נתונים אמפיריים10. בנוסף, TKOv3 זמין כספרייה חד-קומפוננטי (LCV2:: TKOv3, מזהה Addgene #90294) המבטא Cas9 ו sgRNAs על וקטור יחיד, הקלה על הצורך ליצור תאים Cas9 ביטוי יציב, המאפשר הגנום רחב לנקוש על פני מגוון רחב של סוגי תאים ממיונקים. TKOv3 זמין גם בווקטור ללא Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene מזהה 125517) והוא יכול להיות מנוצל בתאים לבטא Cas911.

הגנום-wide CRISPR-Cas9 לערוך אוכלוסיית התאים ניתן לחשוף לתנאי גדילה שונים, עם שפע של sgRNAs לאורך זמן ככמת על ידי הדור הבא רצף, מתן הבדיקה כדי להעריך את הירידה או העשרה של תאים עם המעקב גנטי רטבאליות. הספריות של CRISPR מעלף ניתן לרתום כדי לזהות גנים כי, על פי הטורבציה, לגרום לפגמים בכושר הסלולר, רגישות מתונה תרופות (למשל, גנים רגישים או עמידים), להסדיר ביטוי חלבון (למשל, עיתונאי), או נדרשים עבור מסוים פונקציית מסלול ומדינה. סלולרית12,13,14 לדוגמה, מסכי כושר דיפרנציאלי בקו התאים של סרטן יכול לזהות גם דלדול או הפחתה של אונאוגנים והעשרה או גידול של דכאי הגידול גנים3,14,15. באופן דומה, שימוש במינונים בינוניים של תרופות טיפוליות יכול לחשוף הן עמידות לסמים והן גנים הרגישות16,17.

בתנאי כאן הוא פרוטוקול הקרנה מפורטת עבור CRISPR-בקנה מידה-Cas9 אובדן הפונקציה של ההקרנה באמצעות הספריות של טורונטו-out (TKOv1 או v3) בתאי היונקים מהדור הספרייה, הקרנת ביצועים לניתוח נתונים. למרות שפרוטוקול זה הותאם במיוחד להקרנה באמצעות הספריות לדפיקה בטורונטו, ניתן להחילם ולהפוך לניתן להרחבה לכל הספריות הנמצאות במאגר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים המפורטים להלן צריכים לפעול לפי ההנחיות של המכון לבריאות הסביבה ולמשרד הבטיחות.

1. הגברה במאגר הספרייה

  1. לדלל את ספריית ה-DNA המוכן מראש של הספרייה כדי 50 ng/μL ב TE (למשל, TKOv3).
  2. אלקטרופורף את הספרייה באמצעות תאים אלקטרומוסמכים. הגדר סכום כולל של ארבע תגובות אלקטרופורציה כמתואר להלן.
    1. הוסף 2 μL של 50 ng/μL של ספריית TKO כדי 25 μL של תאים מופשרים לכיוון מקורר (1.0 מ"מ) על קרח.
    2. אלקטרופורטה באמצעות הגדרות אופטימליות המוצעות על-ידי פרוטוקול היצרן. בתוך 10 s של הדופק, להוסיף 975 μL של שחזור בינונית (או SOC בינוני) קובט.
    3. העבר תאים electroporated לצינור תרבות ולהוסיף 1 מ ל של מדיום שחזור. מודטה צינורות באינקובטור רועד ב 250 סל ד עבור 1 h ב 37 ° c.
  3. הגדר לוחית דילול כדי לחבר את הספרייה ולהעריך את יעילות ההמרה.
    1. הבריכה כל 8 מ ל של תאים משוחזרים ומערבבים היטב. העברה 10 μL של תאים במאגר כדי 990 μL של מדיום השחזור עבור דילול מתקפל 800 ומערבבים היטב.
    2. צלחת 20 μL של הדילול אל מראש מחומם 10 ס"מ ליברות + carbenicillin (100 μg/L) לוחית אגר. התוצאה היא דילול 40,000 מתקפל של transformants שישמשו כדי לחשב את יעילות השינוי.
    3. צלחת 400 μL של תאים התאושש על כל לוח על פני סך של 20 טרום מחומם 15 ס"מ ליברות + carbenicillin אגר צלחות. מודאת הצלחות במשך 14 עד 16 h ב 30 ° c.
      הערה: הצמיחה בטמפרטורה נמוכה זו מקטינה את השילוב החוזר בין המסוף הארוך (משמאל לימין)18.
    4. כדי לחשב את היעילות שינוי, לספור את מספר המושבות על לוחית הדילול 40,000-קיפול (שלב 1.3.2). הכפל את מספר המושבות שנספרו על-ידי 40,000 כדי להשיג את המספר הכולל של מושבות בכל הלוחות. המשך אם המספר הכולל של המושבות מייצג כיסוי ספריה שווה ערך למינימום של מושבות 200x לפי sgRNA (האופטימלי ביותר הוא 500-1000x).
      1. לדוגמה, מספר המושבה המינימלית עבור ספריית TKOv3 (71,090 sgRNA) הוא 1.4 x 107, ששווה ל-200x מושבות לכל sgRNA. אם ייצוג המושבה אינה מספיקה, הגדילו את מספר האלקטרופורציות בשלב 1.2 על בסיס מספר המושבות על לוחית הדילול כדי להשיג את הכיסוי המינימלי לספרייה.
  4. לקצור את המושבות כמתואר להלן
    1. על כל 15 ס מ לוחית, להוסיף 7 מ ל LB + carbenicillin (100 μg/L) בינוני, ואז לגרד את המושבות עם שליטת התא. עם פיפטה בצורת 10 מ ל, העבירו את התאים המעוקרים לבקבוקון או בקבוק בצורת חרוט.
    2. שוב לשטוף את הצלחת עם 5 מ ל של LB + carbenicillin בינוני ולהעביר את הפתרון לבקבוק.
    3. חזור על כל הלוחות לתאי בריכה מ-20 צלחות לתוך בקבוק סטרילי.
  5. מערבבים תאים שנאספו עם בר מעורר עבור 1 h בטמפרטורת החדר (RT) כדי להפריד את הגושים הסלולריים. העבר תאים מראש בקבוקי צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 7,000 x g כדי חיידקים גלולה, ואז למחוק מדיה.
  6. שוקלים את הגלולה התא רטוב להפחית את המשקל של בקבוק הצנטריפוגה כדי לקבוע את המשקל הסופי של הגלולה רטוב. לטהר את ה-DNA באמצעות מקסי או מגה בקנה מידה ערכת טיהור הקיט בהתאם לכמות של גלולה חיידקים כל עמודה יכול לעבד.

2. הפקת וירוס בקנה מידה גדול של הספרייה

הערה: כל השלבים בסעיף זה של הפרוטוקול מתבצעים במתקן BSL2 + בתוך מחלקה II, הקלד A2 בטיחות ארון.

  1. לחשב את מספר 15 ס מ לוחות הדרושים עבור ייצור וירוסים מבוסס על ההערכה כי 18 מ ל של וירוס בדרך כלל נקצרו מ 1 15 ס"מ לוחית.
  2. הכנת תאים עבור העברה על ידי זריעת HEK-293T בתאי האריזה במדיה צמיחה אנטיביוטית נמוכה (Dמאמ + 10% FBS + אופציונלי: 0.1 x עט/דלקת) ב 8 x 106 תאים לכל 15 ס מ לוחית בגודל 20 מ ל של מדיה. התאים הדגירה הלילה ב 37 ° c, 5% CO2. ודא שהתאים המצופים הם 70%-80% שוטפת ומתפשטים באופן שווה ברגע החצייה.
  3. ביום שלמחרת, הכינו שלוש הצלחות פלסטיות כמתואר בלוח 1 עבור 15 ס מ לוחות. לחשב את כמות הפלסטיק הדרושה עבור העברה אחת ולעשות שילוב של פלמידים עבור מספר צלחות, ועוד אחד להיות מנוכר.
  4. הכינו מגיב מבוסס השומנים המבוסס על כל העברה כמתואר בטבלה 2. Aliquot מופחת סרום מדיה לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים 1.5 mL עבור מספר לוחות להיות מזוהמים. הוסף מגיב החוצה, מערבבים בעדינות, ו-דגירה עבור 5 דקות ב RT.
  5. לאחר 5 דקות דגירה, להוסיף את כמות ה-DNA הנדרש עבור מעבר אחד לזיהום החצייה מגיב עבור 3:1 יחס של העברה מגיב-ל-μg של קומפלקס DNA. מערבבים בעדינות ומודרכות עבור 30 דקות at RT.
    הערה: הפעולות הבאות ניתן להכין בקבוצות של חמישה או פחות, עם 5 מרווחי זמן כדי למטב לזמן ולהימנע הדגירה מעל.
  6. לאחר 30 דקות של דגירה, העבר בזהירות כל תערובת המעבר לכל צלחת של תאים אריזות. להוסיף את התמהיל כולו באמצעות 1 mL הטיפ הקצה dropwise בתנועה מעגלית, זיגזג בלי להפריע monolayer התא. מודטה תאים ב 37 ° צ' עבור 18 h ב 5% CO2.
  7. הכנת מדיה הקציר נגיפי: 500 mL של dmem דיום בינונית + 32 mL של bsa מלאי (20 גרם/100 mL, הומס dmem מסנן מעוקר עם 0.22 יקרומטר מסנן) + 5 מ ל של 100 מיל עט/דלקת.
  8. לאחר 18 h, להסיר את המדיה (להשתמש בטיפול נאות של פסולת וירוס כגון דגירה של 1% נתרן ההיפוכלניט עבור 30 דקות לפני הסילוק). החלף בעדינות עם 18 מ ל של מדיית קציר ויראלי לכל צלחת. מודטה תאים ב 37 ° צ' עבור 18 h ב 5% CO2.
  9. לאחר 24 שעות, בדוק את תאי האריזה עבור מורפולוגיה חריגים והתמזגו כאינדיקציה לייצור וירוסים טוב. לאחר מכן, לקצור את הנגיף על ידי איסוף כל supernatant והעברת לתוך צינור צנטריפוגה מעוקר חרוטי.
  10. ספין התקשורת המכילה וירוס ב 300 x g עבור 5 דקות ו הגלולה תאים האריזה. לתוך צינור פוליפרופילן סטרילי. מבלי להפריע לגלולה
  11. אחסן את הווירוס ב-4 ° צ' לתקופות קצרות (פחות משבוע אחד) או מיד ב-80 ° c לאחסון לטווח ארוך. מעבר וירוס בקנה מידה גדול שיטת ' לשימוש בודד אמצעי אחסון לטווח ארוך כדי למנוע הקפאה/הפשרה.

3. אפיון קו תאים להקרנה

  1. בחר את קו התא הרצוי.
    1. למדוד ולהקליט את זמן ההכפלה המשוער של התאים.
    2. קביעת צפיפות הציפוי התא אופטימלית עבור תאים culturing כל 3-4 תא טווח בכלי תרבות רקמה של בחירה (למשל, 15 ס מ רקמות הרקמה התרבותית).
  2. לקבוע את הריכוז puromycin להשתמש בשורה התא הרצוי לבחירה של ספריות TKO המכיל puromycin התנגדות סמן כדלקמן:
    1. תאים זרע בצלחת 12 היטב על הצפיפות הנדרשת כדי להגיע למפגש אחרי 72 h, ולאחר מכן דגירה לילה (37 ° צ', 5% CO2).
    2. ביום שלמחרת, שנה למדיה המכילה טווח דילול של ריכוזי puromycin מ -0 μg/mL ל-10 μg/mL, בהפרשים של 0.5 μg/mL. דגירה את התאים עבור 48 h.
    3. לאחר 48 h, למדוד את הכדאיות התא על ידי ספירת תאים או alamarBlue כתמים.
    4. לקבוע את הריכוז הנמוך ביותר שהורג 100% של תאים ב 48 h. השתמש בריכוז זה כדי לבחור עבור אוכלוסיות התאים של CRISPR בשלבים 4.6 ו 5.2.6.
      הערה: עבור קווי התא עם זמני הכפלה ארוכים יותר, incubations יותר עם puromycin יכול להיות נסבל. במצבים אלה, לקבוע את עקומת להרוג עבור זמן הדגירה הנדרש עבור < 3 תא טווח. מזער את הזמן לבחירה כדי למנוע נושרת של גנים חיוניים לפני תחילת ההקרנה.
  3. בדוק את התאים רגישות הקסאדימטרטין ברומיד (עד 8 μg/mL) על ידי ביצוע עקומת תגובה מינון באותה שיטה המשמשת למדידת רגישות puromycin (שלב 3.2). אם הרעילות היא נצפתה עם < 8 μg/mL של הקסאדימתוס ברומיד, אין להשתמש.

4. טיטור פונקציונלי של ספריית CRISPR במאגר וירוס לקביעת משרד המידע

  1. הפשרת מגוון טרי של ספריית הספרייה הגנומית במאגר הווירוסים (למשל, LCV2:: TKOv3) ולשמור על קרח.
  2. עיצוב סדרה של אמצעי אחסון וירוס כדי לבדוק בין טווח של 0-2 מ ל (כלומר, 0 מ"ל, 0.25 mL, 0.5 mL, 1 מ ל, ו 2 mL).
  3. הקציר תאים היעד ואת תאי הזרע ב 15 ס מ לוחות בצפיפות הדרושים כדי להגיע למפגש ב 72 h.
  4. כדי לבדוק כל אמצעי אחסון של וירוסים, הכינו צלחות כפולות. הוסף תאים, וירוס, הקסאדיme, ברומיד (8 μg/mL) ומדיה לנפח סופי של 20 מ ל. לערבב צלחות ביסודיות, לשבת ברמת לוחות בחממה ו דגירה עבור 24 h (37 ° צ', 5% CO2).
  5. לאחר 24 שעות, להסיר וירוס המכיל מדיה ולהיפטר (השתמש באמצעי זהירות אבטחה טיחות לטיפול בפסולת וירוס). באופן אופציונלי, לשטוף בעדינות את הצלחת עם PBS חם כדי להסיר וירוס חיצוני.
  6. עבור כל תנאי וירוס, להחליף עם 20 מ ל של מדיה המכילה puromycin באמצעות הריכוז נחוש להרוג תאים בסעיף 3, לצלחת אחת לשכפל. לצלחת השנייה, הוסיפו 20 מ ל של מדיה טרייה ללא puromycin. מודטה עבור 48 h (37 ° צ', 5% CO2).
  7. לאחר 48 h, לבדוק כי כל התאים נגוע (0 mL מצב וירוס) שטופלו עם puromycin מתים. לקצור את כל הצלחות בנפרד ולפזר תאים על ידי חוזר בעדינות.
  8. לספור תאים מכל הצלחות ולחשב את משרד המידע העצמי עבור כל נפח וירוס על-ידי השוואת ספירות תאים עם בחירה puromycin לספירות תאים ללא puromycin (כלומר, +/-puromycin).
  9. גרף תוצאות כדי לקבוע את עוצמת הקול שמובילה 30%-40% הישרדות התא עם puromycin בחירה לעומת ללא puromycin. השתמש באמצעי אחסון וירוס זה כדי להשיג משרד משנה של 0.3 – 0.4 במהלך המסך תחת אותם תנאים של תרבות הרקמה.

5. הדבקת מסך ראשי, בחירה והפסיית תא

  1. בחר בכיסוי הספריה של CRISPR sgRNA כדי להישמר בכל המסך (מומלץ מינימום של 200).
    1. בהתבסס על כיסוי הספרייה, לקבוע את מספר התאים הדרושים כדי לשמור על כיסוי זה לכל sgRNA ואת מספר התאים הדרושים לזיהום ב-מוי 0.3 (טבלה 3).
    2. קבע את מספר הלוחות הדרושים להגדרת הזיהום (טבלה 4).
  2. הדבקת התאים באמצעות ספריית CRISPR
    1. הקציר תאים וזרע את מספר התא הנדרש לכל 15 ס מ לוחית.
    2. הוסף את ההקמאפין ברומיד (8 μg/mL) לכל הצלחות.
    3. הוסף את הווירוס באמצעי האחסון הנדרש עבור מוי 0.3 להקרנה ולוחיות הבקרה 2. עבור הפקד 1, אל תוסיף וירוס והחלף את אמצעי האחסון במדיה.
    4. מערבבים את הצלחות ביסודיות על ידי הטיה. מניחים צלחות בחממה, ומוודאים שהם ברמה.
      הערה: זיהומים אצווה ניתן לעשות על ידי שילוב שילוב הורים של וירוס, מדיה, ו הקסאדיme, ברומיד לתאי ההשעיה לפני ציפוי.
    5. הסר מדיה והחלף עם מדיה טרייה המכילה puromycin בריכוז שנקבע בשלב 3.2.4 להקרנה ושליטה 1 צלחות 24 שעות לאחר זיהום וירוס. הוסף מדיה טרייה ללא puromycin ללוחית הבקרה 2. התאים הדגירה עבור 48 h (37 ° צ', 5% CO2).
    6. 48 h לאחר puromycin נוסף, להבטיח כי כל התאים נגוע מתים (שליטה 1) כדי לאשר את הפעילות puromycin, ואז לקצור את התאים הנגועים.
  3. איסוף אוכלוסיית תאים נגועים והפסיית תא
    1. הpuromycin את התאים הנבחרים מכל לוחיות ההקרנה במיכל סטרילי אחד. לאסוף את התאים מכל צלחת בקרה בנפרד. פזר את התאים על ידי ליטוף חוזר עדין.
    2. ספור תאים מתאי סינון, פקד 1, ובקרה 2 בנפרד וחשב את מספר התאים ל-1 mL.
    3. חישוב משרד התקשורת וכיסוי מתקפל שהושגו כדלקמן:
      Equation 1
      Equation 2
    4. לאסוף שלושה משכפל של כדורי תא מתוך התאים במאגר בסיקור הספרייה הנבחר להפקת DNA גנומית. צנטריפוגה את התאים ב 500 x g עבור 5 דקות לשטוף עם PBS. סמן את הצינורות והקפא את כדורי התא ב-80 ° צ' (אלה הם דגימות התייחסות T0).
    5. פצל את המאגר של תאים נגועים לשלוש קבוצות שכפול (למשל, שכפל A, שכפל B, שכפל C), תוך שמירה על כיסוי ספריה בתוך כל שכפול. תאי הזרע באותה צפיפות הזריעה כפי שבדרך כלל היו משמשים בעת הרחאתם. השתמש באותו מספר תאים עבור כל צלחת שכפול ומספר כולל של תאים בין שכפול.
    6. להמשיך לעבר תאים והקציר שלושה משכפל של כדורי תא מכל שכפול של תאים נגועים במאגר כאמור לעיל, כל 3 – 8 ימים בהתאם לקו התא, עד 15 – 20 תא טווח. בכל מעבר, לקצור את התאים מכל הצלחות בכל קבוצה שכפול אחד עם השני (כלומר, כל התאים משכפול לוחיות מחדש יחד, כל התאים מתוך שכפול לוחות B מעורבבים מחדש יחד, וכו ').
    7. סמן כל גלולה עם זמן (T) ולשכפל ייעוד. זה מתאים למספר הימים post-T0 הגלולה נאסף (למשל, T3_A, T3_B, T3_C, וכו ').
  4. עבור מסכי סמים בחירה שלילית, לאפשר לתאים להתאושש לפחות מעבר אחד לאחר T0 לפני הטיפול. ב-T3 או T6, פצל את התאים מכל קבוצה שכפול (A, B, C) לאוכלוסיות טיפול ושליטה בסמים, תוך שימוש באותה דחיסות זריעה המשמשת בשלב 5.3.5.
    1. בריכה נפרדת של מספר התאים הדרושים לכיסוי ספריה עבור כל שכפול בקבוצת הטיפול בסמים. הוסף את הסם בריכוזי ביניים (IC20-ic50). זרע את התאים ואת הדגירה (37 ° צ', 5% CO2) עד המעבר הבא.
    2. בריכה נפרדת של מספר התאים הדרושים לכיסוי ספריה עבור כל שכפול בקבוצת בקרת הרכב. הוסף את פקד הרכב באמצעות אותו אמצעי אחסון כמו התרופה (< 0.5% v/v). זרע את התאים ואת הדגירה (37 ° צ', 5% CO2) עד למעבר הבא.
    3. המשך לחלוף את התאים ולקצור את כדורי התא עבור דנ א גנומית כל 3 ימים כמתואר בשלב 5.3.5, תוך רענון התרופה או הרכב בכל מעבר.
  5. עבור מסכי הבחירה החיוביים או עמידות הסמים, פצל כל קבוצת שכפול בהתאם למספר התאים הדרושים לכיסוי הספריה. להוסיף IC90 התרופות ריכוזי כל שכפול. ב IC90, רוב התאים יהרגו. אפשר אוכלוסיות עמידות לגדול ולאסוף כדורי תא (1 – 2 x 107 תאים) עבור הפקת DNA גנומית.

6. הכנת ובדיקת מדגם CRISPR

  1. דנ א גנומי
    1. מודיית את כדורי תא קפוא עבור 5 – 10 דקות ב RT עבור הפשרה.
    2. הוסף 1.4 mL של PBS אל צינור צנטריפוגה מ ל 50 mL המכיל גלולה תא. מערבולת עבור 20 s להשעות מחדש את התאים ומנוחה 1 דקות. במקרה הצורך, פיפטה 15x עם P1000 לפרק את הגושים הנותרים בתאים. אם העברת תאים מצינור 15 מ"ל או 1.5 mL, להשעות מחדש את התאים עם 1 mL של PBS, ואז להעביר תאים לצינור 50 mL ולשטוף את הצינור המקורי עם 400 μL של PBS.
    3. הוסף 5 מ ל של פתרון לליזה גרעינים לתאים מושעה מחדש. באמצעות הפיפטה 10 מ"ל, לערבב את המדגם על ידי ליטוף למעלה ולמטה 5x.
    4. הוסף 32 μL של RNase A (20 מ"ג/mL; כדי לקבל ריכוז סופי של 100 μg/mL) כדי הגרעין הגרעיני לערבב את המדגם על ידי היפוך הצינור 5x. מודטה את התערובת ב 37 ° c עבור 15 דקות ולאפשר דגימה להתקרר עבור 10 דקות ב RT.
    5. הוסף 1.67 mL של הפתרון משקעים חלבון לליפוסט ומערבולת במרץ עבור 20 s. גושים בחלבון קטן עשוי להיות גלוי לאחר ערבוב.
    6. צנטריפוגה ב 4,500 x g עבור 10 דקות ב-RT.
    7. באמצעות מנקז 10 מ ל, להעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה 50 mL המכיל 5 מ ל של איזופנול. בעדינות לערבב את הפתרון 10x על ידי היפוך עד ה-DNA נצפתה.
      הערה: ה-DNA ניתן לראות כמו לבנים, חוט כמו חוטים היוצרים מסה נראה.
    8. צנטריפוגה ב 4,500 x g עבור 5 דקות ב RT כדי גלולה DNA.
    9. באמצעות שימוש בפיפטה 10 מ ל, הסר בזהירות את הסופרנטנט והימנע מפירוק הגלולה הגנטית. הוסף 5 מ ל של 70% אתנול ב-RT ל-DNA. לסובב בעדינות את הצינור כדי לשטוף את הגלולה ואת הצדדים של הצינורית צנטריפוגה.
    10. צנטריפוגה ב 4,500 x g עבור 5 דקות ב RT.
    11. באמצעות הצינורות 10 מ ל, להסיר בזהירות את האתנול 70% ולהימנע מפירוק הגלולה DNA. דנ א של גנומית אוויר במשך 10 דקות ב RT.
    12. הוסף 400 μL של הפתרון TE לצינור ולתת את ה-DNA מתמוסס ידי הדגירה ב 65 ° c עבור 1 h. לערבב את ה-DNA על ידי מצליף בעדינות את הצינור כל 15 דקות. אם ה-DNA אינו מתמוסס לחלוטין, שפופרת דגירה ב 65 ° c עבור תוספת 1 h תוך בעדינות מצליף הצינור כל 15 דקות, ולהשאיר אותו ב 4 ° c בלילה.
    13. צנטריפוגה ב 4,500 x g עבור 1 דקות בשעה RT והעבר דנ א גנומית לצינור 1.5 mL נמוך מחייב.
    14. לכמת ולמדוד את הטוהר של ה-DNA גנומית על שני ספקטרוסקופיה (עבור כולל חומצות גרעין תוכן) ו פלואורומטר (עבור תוכן ה-DNA כפול תקוע).
  2. באופן אופציונלי, מזרז DNA גנומית אם יש בעיות עם הגברה הזרם PCR של sgRNA כדלקמן.
    1. העברת 400 μL של DNA גנומית לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
    2. הוסף 18 μL של 5 M הנאל (ריכוז סופי של 0.2 M) ו 900 μL של 95% אתנול.
    3. היפוך צינור 10x עד ביסודיות מעורב, אז צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 10 דקות ב-RT.
    4. הסירו בזהירות את הסופרנטנט. והימנעו מפירוק הגלולה לשטוף את הגלולה DNA עם 500 μL של 70% אתנול. סובב בעדינות את השפופרת כדי לשטוף את הגלולה DNA.
    5. צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 5 דקות ב RT.
    6. הסירו בזהירות את הסופרנטנט. והימנעו מפירוק דנ א דנ א של גנומית אוויר במשך 10 דקות ב RT.
    7. הוסף 300 μL של TE כדי לפזר דנ א כפי שמתואר בשלבים 6.1.12.
    8. לכמת ולמדוד את הטוהר של דנ א גנומית כפי שמתואר בשלב 6.1.14.
  3. הכנה לספריות ברצף של CRISPR
    1. הגדר את ה-PCR 1 כמתואר בטבלה 5 באמצעות סך של 100 ΜG של דנ א גנומית. הוסף 3.5 μg של דנ א גנומית לתגובה μL 50 להגדיר זהים 50 μL תגובות כדי להשיג את הכיסוי הרצוי. טבלה 6 מפרטת דוגמאות של רצפים פריימר עבור הגברה של LCV2:: TKOv3 ספריות ברצף. טבלה 7 מפרטת דוגמאות של רצפים פריימר עבור הגברה של pLCKO2:: TKOv3 ספריות הרצף.
    2. להגביר את ה-PCR 1 תגובות באמצעות התוכנית המתוארים בטבלה 8.
    3. בדוק PCR 1 הגברה על ידי הפעלת 2 μL של מוצר ה-PCR על ג'ל 1% צמח. ה-PCR 1 מניב מוצר של 600 bp.
    4. בריכה כל התגובות מ50 μL בודדים עבור כל דגימת דנ א גנומית ולערבב ידי vortexing.
    5. כוונן תגובה אחת ל-PCR 2 (50 μL) עבור כל דוגמה כפי שמתואר בטבלה 9 באמצעות 5 μl של מוצר ה-pcr 1 במאגר כתבנית. השתמש בצירופי אינדקס ייחודיים עבור כל מדגם בודד כדי לאפשר צירוף של דגימות ספריה ברצף.
    6. הגבר את תגובת ה-PCR 2 באמצעות התוכנית המתוארים בטבלה 10.
    7. ניקוי ציוד ג'ל לטיהור מוצרים מוגבר עם 0.1 N HCl במשך 10 דקות לפני השלכת ג'ל. הכן 2% ג'ל agarose המכיל כתם DNA לטיהור PCR 2 מוצרים מוגבר.
    8. הפעל את מוצר ה-PCR 2 ב-2% הצמח במתח נמוך (1.0-1.5 h הפעלה). ה-PCR 2 מניב מוצר של 200 bp.
    9. המחש את מוצרי ה-PCR. באור כחול ממאיר בלו את הלהקה 200 bp ולטהר את ה-DNA מן הפרוסה ג'ל agarose באמצעות ערכת החילוץ ג'ל. לכמת ולמדוד את הטוהר של הספרייה ברצף בשני ספקטרוסקופיה ו פלואורומטר.
      הערה: ריכוז הספרייה האופיינית ג'ל מטוהרים רצף נע בין 5-10 ng/μL ותשואה כוללת של 150 – 300 ng.
  4. רצף תפוקה גבוהה
    1. רצף את ספריות רצפי הרצף של ה-CRISPR על הרצף של הדור הבא.
    2. הפניית רצף T0 דגימות בעומק קריאה גבוה יותר של 400-עד 500 כיסוי ספריה. רצף דוגמאות של נקודות זמן נסיוניות עבור מסכי נפתחות בעומק קריאה מינימלי של קיפול 200. למסכים בחירה חיוביים חזקים, מינימום של עומק קריאה של 50 כיסוי קיפול מספיק לזיהוי של sgRNAs מועשר.
      הערה: קריטי לרצף את הדוגמה T0 כדי לקבוע ייצוג ספריה עבור מסך מסוים ולשמש כהפניה לשינויי הקיפול של sgRNA במשך הזמן.

7. ניתוח נתונים

  1. יישר את הרצף תוך שימוש בתוכניות כגון Bowtie כדי למפות רצף קריאות לספריית ההפניות באמצעות הפרמטרים הבאים:-v2 (מתן אפשרות לשני אי-התאמות) ו-m1 (להשליך כל קריאה שממופה ליותר מרצף אחד בספריה).
  2. לנרמל את מספר הקריאות הממופות הייחודיות עבור כל sgRNA עבור מדגם נתון ל-10,000,000 קריאות לכל מדגם באופן הבא:
    Equation 3שבעה עשר
  3. לחשב את השינוי log2 קיפול של כל sgRNA עבור כל שכפול בכל timepoint (Tn) בהשוואה למדגם T0 (Tn/T0). הוסף ספירה מדומה של 0.5 קורא לכל ספירות הקריאה כדי למנוע הפסקת שיבושים מאפסים. כלילת sgRNAs עם < 30 קריאות raw ב-T0 מדגימה מחישוב שינוי קיפול וניתוח במורד הזרם.
  4. לנתח שינויים מקפלים עם ניתוח בייסיאנית של היסוד הגנטי (בייגל) אלגוריתם < https:/agfibs.pb בייגלה ב>, באמצעות מערכות אימונים חיוניות ולא חיוניות שהוגדרו בעבר19 עבור מסכי הגן המרכזי ( הטבלה המשלימה S1) או מסוממים < https:/Agfibsupplatt-b > עבור מסכי התרופות20.
  5. חשב את הדיוק והאחזור להערכת ביצועי המסך באמצעות תוצאות BF. השתמש בערכה החיונית משלב 7.4 כרשימה החיובית האמיתית עבור הפונקציה precision_recall_curve של Scikit-ללמוד בספרייה פיתון, יחד עם מערכת המשנה מעל BF ציון. לחילופין, בצע את אותו הדבר באמצעות חבילת PRROC ב-R.
  6. חשב את שינוי הקיפול הממוצע של כל המדריכים עבור כל אחד מהגנים. צור מגרשים צפיפות עבור גנים חיוניים לא חיוניים (ראה שלב 7.4) ב R או תוכנה שוות-ערך. ב-R, אם x. ess הוא וקטור המכיל את ערכי שינוי קיפול היומן של גנים חיוניים ו-x. nonEss מכילים גנים שאינם חיוניים, התוויה באמצעות הפקודה הבאה:
    מגרש (צפיפות x. ess), xlab = "מתכוון logFC", col = "אדום", lwd = 2)
    קווים (דחיסות x. nonEss), col = "כחול", lwd = 2)
    הערה: לפרטים של גרסת פיתון וחבילות בשימוש, ראה scikit-ללמוד v 0.19.1: (פורסם על ידי Pedregosa et al.21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מבט כולל על זרימת העבודה הקרנה CRISPR בקנה מידה של הגנום

איור 1 ממחיש סקירה של זרימת העבודה ההקרנה crispr במאגר, החל בזיהום של תאי היעד עם הספרייה crispr וירוס ב-משרד העניינים נמוך כדי להבטיח אירועים שילוב יחיד ייצוג ספריה נאותה (בדרך כלל 200-to 1000 קיפול). בעקבות זיהום, התאים מטופלים עם puromycin אנטיביוטי לבחור לתאי התמרה. לאחר הבחירה, כT0 תא בסיסית של התא נאסף כדי להעריך את התפלגות הספריה בתחילת ההקרנה. התאים הנותרים, מורכב האוכלוסייה הטרוגנית של רטבאליות גנטית, הם החוצה בייצוג הספריה הרצויה כל 3-4 ימים עבור 15-20 טווח כדי לאפשר עריכה גנטית ואת ההשפעות הנובעות למניפסט. מסכים עם טיפול תרופתי מתווספים בדרך כלל ב-T3 או T6 לאחר התאים התאושש מזיהום וירוס ובחירה puromycin. תאים נאספים בייצוג הספרייה הרצויה בכל מעבר עבור דנ א גנומית, כדי לקבוע את שפע המדריך על ידי רצפי הדור הבא על נקודות הזמן הרצויות.

מומלץ לאסוף דגימות מרובות במקרה של כישלונות כלשהם שעלולים להתרחש בשלבי ההכנה של ספריית רצף הזרם. מסכים הנמצאים במאגר הם בדרך כלל מבוססים על הכדאיות, המיועדים לבחירה חיובית או שלילית של sgRNAs חיוניים. מסכים חיוביים לזהות גנים הצגת התנגדות או להגביר את ההישרדות תחת לחץ בחירה ספציפית (למשל, תרופות או קו תא מוטציה). במקרה זה, רוב התאים ימותו מהבחירה, והתאים שיישארו יהיו מועשרים עבור sgRNAs המיקוד גנים עמידים בפני הסם או התנאי נבדק. מסכי בחירה שליליים או "drop-out" מסכי לזהות להוריד גנים עם רגישות מוגברת או אובדן של הישרדות תחת לחץ בחירת המסך. כדי לזהות רטבאליות בעלי השפעה פנוטימית כגון פגם גדילה, מדריך שפע בכל נקודת זמן מכמת על-ידי רצפי הדור הבא ולעומת T0 כדי להעריך את הירידה או העשרת המדריכים במהלך המסך. באמצעות פלטפורמות ניתוח, שינויים בקיפול היומן נמדדים עבור קווי עזר, וניתן להחיל אלגוריתמים כגון ' בייגל ' כדי לאפשר דירוג של כניסות גנים.

הגברה ותחזוקה של הספרייה ברשתות CRISPR במאגר

איור 2 ממחיש את ההתפלגות הצפויה של קווי עזר לאחר הגברה של ספריית הפלביניים. ספריית TKOv3 מורכב 71,090 sgRNAs עם ארבע sgRNAs לכל גנים, פילוח ~ 18,000 החלבון קידוד גנים10. ספריה אידיאלית צריכה להיות כל sgRNA יחיד מיוצגים בכמויות דומות. לכן, מומלץ לאשר את חלוקת קווי העזר בספריה מוגברת על-ידי רצף הדור הבא. המוצג כאן היא ספריה מוגברת עם התפלגות הדוקה מאוד של sgRNAs, המאשר כי > 95% של כל sgRNAs נמצאים בתוך טווח הפצה של 4 קיפול (איור 2). התפלגות רחבה יותר של sgRNAs עולה כי שפע של מדריכי הספרייה לא מיוצגים באותה מידה והוא יכול לתרום לרעש במסכים במאגר.

הערכת ביצועי מסך

איור 3 ממחיש כי איכות הביצועים של המסך ניתן להעריך על ידי הערכת התפלגות שינוי הקיפול של כל sgRNA נגד התייחסות בקנה מידה של זהב ברשימה של חיוני (684 גנים) ולא הכרחי גנים (926 גנים) ודמיינו כמו עקומות בדיוק בזיכרון10. באמצעות ערכות ההתייחסות בתקן הזהב, הציונים של Bayes פקטור (BF) מחושבים עבור נקודת הקצה של המסך, ועקומות אחזור בדיוק מותוות. ציוני BF מחושבים על-ידי ניתוח שינוי קיפול היומן עבור כל קווי העזר המכוונים לגנים באמצעות מסגרת בייסיאנית (אלגוריתם בייגל שתואר בעבר19) כדי להשוות הפצות של ערכות מדריך חיוניות ובלתי חיוניות ידועות. שיעורי גילוי שווא (רוזוולט) נגזרים באופן אמפירי באמצעות אותם ערכות התייחסות בתקן זהב. מסך ביצועים גבוהים צריך לשחזר מספר גבוה של גנים חיוניים לסף של BF > 6 ו-רוזוולט < 5%, כפי שמעידים על ידי "מרפק" חדה ביותר עקומות קו ישר לנקודת הטרמינל כפי שמוצג על ידי הקו הכחול באיור 3A. הנושרת של מדריכים המיקוד גנים חיוניים ולא חיוניים צריך גם להיבדק (איור 3B). מדריכים המכוונים להפניה גנים לא חיוניים צריכים להציג התפלגות סימטרית במידה רבה של שינויים בקיפול היומן הממורכז באפס, כפי שמוצג על-ידי הקו המקווקו באיור 3B. התפלגות השינוי הקיפול של מדריכים המכוונים לגנים חיוניים מראה משמרת שלילית חזקה ביחס להפצת קווי העזר המכוונים לגנים לא חיוניים, כפי שמוצג על-ידי הקו המלא באיור 3B.

גנים אתריים

אחד היישומים הבסיסיים של מסכי שחרור במאגר ברחבי הגנום הוא לזהות גנים חיוניים. גנים חיוניים, קטגוריית משקל של גנים כושר, הם גנים אשר הפרטורציה גורמת להאליות של התא, נחשב גם בצורה רופפת כגנים התפשטות. בהקשר של ביולוגיה של סרטן, ניתן לזהות יסודות ספציפיים להקשר כדי לזהות יחסי תלות עבור קו מסוים של תאים סרטניים. איור 4, מציג את דרגת הגנים של גנים חיוניים באמצעות ניקוד פקטור bayes, נגזר אלגוריתם בייגל. Bayes פקטור (BF) מייצג מידה ביטחון כי המהלך הגנטי החוצה תוצאות פגם כושר. ציונים חיוביים יותר מצביעים על ביטחון גבוה יותר כי הפרטורציה גורמת לירידה בכושר.

מסך בחירה חיובי

הגנום-בריכות לנקוש ברחבי יכול להיות תרבותי בנוכחות של סוכן סמים עודף לחפש גנים מדכא/התנגדות. המוצג כאן הוא דוגמה של תאים HCT116 הוקרן בנוכחות תימידין כדי לחפש דכאי של מעצר G1/S3. פרטים על מסך זה ניתן למצוא בפרסום הקודם3. בקצרה, 6 ימים לאחר הבחירה של התאים הנגועים CRISPR בספרייה, התאים התחלקו לתוך משכפל שמירה על כיסוי הספרייה מטופלים עם thymidine. תאים היו בגיל העמידה בנוכחות התרופה עד תאים עמידים בשפע התגלו עבור דגימת DNA גנומית. בחירות חיוביות יכולות להיות רצף (עומק קריאה) בכיסוי נמוך יותר ממסכים שליליים, שכן רק חלק קטן מקווי העזר יישאר עקב הלחץ הסלקטיבי החזק. בדוגמה זו, רצף הושג עם כמה מיליון קריאות, ו -11 של 12 sgrnas המיקוד תימידין קינאז (TK1) התגלו והעשירו כצפוי (איור 5).

הסכומים נקבעו על סמך היחס הטוחנת של 1:1:1
רכיב כמות לכל לוח 15 ס מ מהווה
LCV2::TKOv3 pLCKO2::TKOv3
psPAX2 4.8 μg 7.0 μg
pMD2. ג'י 3.8 μg 4.0 μg
TKOv3b 8.0 μg 5.0 μg
מהווה סכומים שנקבעו על בסיס השילוב הפרודוקטיבי ביותר של ספריית TKO ב-1:1:1 היחס הטוחנת
ב כמות TKO פלמיד בהתבסס על שדרה וקטורית של ספריית CRISPR. LCV2 all-in-one וקטור = 13 kb, non-Cas9 pLCKO2 וקטור = 7.6 kb

שולחן 1: כמות מומלצת של פלפמיד לTKOv3.

רכיב כמות לכל לוח 15 ס מ
אופטי-גברת 800 מיקרומטר
מגיב החצייה 48 מיקרומטר

שולחן 2: הגדרת מגיב מבוסס ליפיד.

כיסוי מתקפל מספר התאים עבור sgRNAb  מספר התאים הדרושים להידבקותב-b
(גודל הספריה sgRNAa כיסוי קיפול ×) (גודל הספריה sgRNA × 0.3 מע)
200 1.5 x 107 5 x 107
500 3.6 x 107 1.2 x 108
1000 7.1 x 107 2.4 x 108
מהווה מבוסס על גודל ספריית TKOv3 = 71,090 sgRNA
ב המספרים מעוגלים למעלה

שולחן 3: קביעת מספרי התאים הדרושים להידבקות בספריות TKOv3 CRISPR ולציפוי תאים בכיסוי מתקפל שונים.

טיפול מספר הלוחות הנדרשים להידבקות
לוחות סינון וירוס, + puromycin (גודל הספרייה sgRNA × 200-קיפול) ÷ 0.3 מאוניברסיטת מוי-קום בצפיפות בזיהום =מספר הצלחות הנדרשות ל
שליטה 1 אין וירוס, + puromycin (0% בקרת הישרדות) 1
שליטה 2 וירוס, + No puromycin (100% בקרת הישרדות) 1
כוללים צלחות נוספות המתאימות לתנודות ולקצבי הצמיחה של משרד החוץ

טבלה 4: חישוב עבור הגדרת זיהום.

ריאגנטים סכום לתגובה של 1 x
2x מיקס מאסטר 25 μL
10 מ"מ PCR 1 LCV2 קדימה פריימר 2.5 מיקרומטר
10 מ"מ PCR 1 LCV2 הפוכה פריימר 2.5 מיקרומטר
דנ א גנומית 3.5 μg
מים עד 50 μL
כולל 50 מיקרומטר

שולחן 5: הגדרת PCR 1.

טבלה 6: ה-PCR התחל לצורך הגברה של LCV2:: TKOv3 ספריות ברצף. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה 7: ה-PCR התחל לצורך הגברה של pLCKO2:: TKOv3 ספריות ברצף. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

צעד טמפרטורה זמן
1 98 ° c 30 שניות
2 98 ° c 10 שניות 25 מחזורים (שלב 2 – 4)
3 66 ° c 30 שניות
4 72 ° צ' 15 שניות
מיכל 5 72 ° צ' 2 דקות
6 10 ° c החזיק

שולחן 8: פרמטרים של מחזור PCR 1.

ריאגנטים סכום לתגובה של 1 x
2x מיקס מאסטר 25 μL
10 מילימטר i5 קדימה פריימר 2.5 מיקרומטר
10 מילימטר i7 הפוכה 2.5 מיקרומטר
PCR 1 מוצר 5 מיקרומטר
מים 15 μL
כולל 50 מיקרומטר

שולחן 9: הגדרת ה-PCR 2.

צעד טמפרטורה זמן
1 98 ° c 30 שניות
2 98 ° c 10 שניות 10 מחזורים (שלב 2 – 4)
3 55 ° c 30 שניות
4 65 ° c 15 שניות
מיכל 5 65 ° c 5 דקות
6 10 ° c החזיק

שולחן 10: פרמטרים של מחזור PCR 2.

טבלה משלימה S1. מערכות גן התייחסות TKO אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Figure 1
איור 1: סקירה סכימטית של זרימת עבודה של סינון במאגר. (A) האוכלוסייה תא היעד נגוע הספרייה CRISPR בספריית משרד הקליטה נמוך כדי להבטיח כי רוב התאים לקבל שילוב נגיפי אחד וייצוג ספריה נשמרת. הצבעים השונים מייצגים sgRNAs שונים בכל חלקיק נגיפי. בריכות תאים ששונו גנטית נבחרות. לאחר השלמת הבחירה, התאים שנדגמו עבור הפניה T0 ומעבר באופן סדרתי. (ב) במעבר הראשון לאחר T0, תאים התאושש זיהום וטיפול תרופתי ניתן להוסיף, במידת הצורך. לאחר הטיפול, אוכלוסיית התאים מהווה מספר שבועות באופן סדרתי. במהלך כל מעבר, תאים נאספים עבור DNA גנומית ו הזרע על כיסוי הקיפול הנדרש של הספרייה sgRNA. (ג) שני סוגי מסכים ניתנים לביצוע: 1) מסכי בחירה חיוביים, המזהים תאי מוטציה הרואים התנגדות או הישרדות מוגברת תחת לחץ הבחירה הספציפי (למשל, סמים או קו מוטציה), כפי שהם יהיו מועשרים במהלך ה מסך או 2) מסכי בחירה שליליים, אשר מזהים תאי מוטציה עם רגישות מוגברת או אובדן הישרדות תחת לחץ בחירת המסך, כפי שהם יאבדו במהלך המסך. (ד) דנ א גנומית הוא נקצרו ו-PCR-הוגדל כדי להעשיר עבור אזורי מדריך. (ה) מדריך שפע מכמת על ידי רצף הדור הבא ומועשר, או מדריכים מרוקנים נקבעים עבור "hit" זיהוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: האיכות של ספריית CRISPR sgRNA מוגברת. פלסטלינה של ספריות מוסדרות מנותח על-ידי רצף הדור הבא (קריאה מומלצת: 30,000,000 קורא, המתאים לייצוג 400 ~ מתקפל של הספריה). המוצג כאן היא ספריה עם התפלגות הדוקה של sgRNAs, עם > 95% של כל sgRNAs בתוך טווח הפצה של 4 מקפלים.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הערכה של איכות המסך לשחרר באמצעות זהב-תקן חיוני התייחסות ערכות גנים. (א) ניתוח החזרת דיוק של תוצאות ההקרנה בשחזור גנים חיוניים על הסף של BF > 6 ו-רוזוולט של 5%. מסך ביצועים גבוהים מיוצגים באמצעות קו כחול ומסכי ביצועים נמוכים מיוצגים באמצעות קו אדום. (ב) התפלגות שינוי מקפלים של sgRNA פילוח גנים חיוניים (קו מלא) וגנים לא חיוניים (קווים מנוקדים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: קביעת המואליות של הגנים. הדירוג bayes פקטור של גנים ביסודו במסך מסוים. Bayes פקטור (BF) מייצג מידה ביטחון כי המהלך הגנטי החוצה תוצאות פגם כושר. גורמי Bayes גבוהים מצביעים על ביטחון מוגבר כי התוצאות הגן החוצה ליקויים כושר, (נקודות אדומות). התחתונה Bayes פקטור הציונים מציע לנקוש החוצה מספק יתרון הצמיחה (נקודות כחולות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מסך בחירה חיובית עבור משתיק קול של בלוק תימידין בתאי HCT116. ספירות קריאה מנורמלות עבור כל sgrnas ב-T0 מותוות כנגד ספירות קריאה מנורמלת עבור דוגמאות מטופלות של תימידין. עבור מסכי בחירה חיוביים (כלומר, שימוש ב-IC90 בריכוז של התרופה), מספר הרטבאליות המקנים עמידות לתרופה צפוי להיות קטן. מסיבה זו, עומק הקריאה יכול להיות נמוך יותר מאשר הדרוש למסכים שליליים, אך רוב הספרייה צפויה להיות מיוצגת. TK1 sgrnas מוקפים בעיגול אדום. איור זה שונה מהפרסום הקודם3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשל הפשטות של השימוש שלה pliability גבוהה, הטכנולוגיה CRISPR כבר אומץ נרחב ככלי הבחירה עבור עריכת הגנום מדויק. ההקרנה CRISPR במאגר מספק שיטה לחקור אלפי רטבאליות גנטית בניסוי אחד. במסכים במאגר, ספריות sgRNA לשמש כברקודים מולקולריים, כמו כל רצף הוא ייחודי ממופה הגן המיועד. על ידי בידוד ה-DNA גנומית מאוכלוסיית התא, גנים הגורמים הפנוטיפ של עניין יכול להיקבע על ידי כימות השפע sgRNA על ידי רצף הדור הבא. שיטות רצף מקבילי בנפט מנוצל כדי לכמת sgRNAs בדגימות, כלומר מספר רב של אוכלוסיות תאים עצמאיות ניתן למאגר לנתיב רצף זהה כדי למזער את העלות.

לפני היציאה לפרויקט הקרנה בקנה מידה גדול, חשוב להיות דגם מותאם היטב ומיטבי מבחינה טכנית. הרקע הגנטי, קצב הגדילה ויעילות התמרה הם גורמים חשובים בעת בחירת קווי הטלפון להקרנה. לדוגמה, קצבי הצמיחה ויעילות העריכה יקבעו את המדרגיות וההתאמה הטכנית של המודל. על מנת לייצג כראוי ספריות sgRNA גדול, עשרות מיליוני תאים נדרשים, ולכן מספר התא יכול להיות גורם מגביל בהקרנה היתכנות עבור קווי תאים עם טווח איטי או אלה שאין להם יכולת ההתרבות טוב (למשל, תאים ראשיים). מבוסס על שיעורי צמיחה, מצבי תרבות תאים כגון צפיפות התאים וגודל הצלחת עבור ההקרנה יש לבחור בהתאם. מומלץ לתאי תרבות בכלי הגדול ביותר שהוא מעשי ומבחינה טכנית למסך.

היעילות של התמרה וירוס משתנה בין סוגי תאים, כאשר תאים שונים בנגועים. כתוצאה מכך, נפח הווירוס הדרוש להשגת זיהום מספיק בסוג תא אחד, לא יהיה בהכרח זהה באחר. לכן, זה קריטי כדי לוודא מבחינה פונקציונלית כל אצווה של ספריית וירוס המיוצר בקו התא כדי להיות מוקרן כדי להבטיח כיסוי מספיק של הספרייה ובעיקר אירועים התמרה בודדת לכל תא על ידי התמרה בתוך MOIs נמוך סביב 0.3 (סעיף 4). התמרה של יעילות המצב יכולה להיות מושפעת גם מתנאי תרבות התא; לכן, יש לקבוע את הטיטרים הפונקציונליים באמצעות אותם תנאי תא שישמשו במסך. כלומר, חשוב להשתמש באותם כלי התרבות רקמות, המרכיבים התקשורת ונפח, צפיפות תא הציפוי, וירוס שיטת ' ללא הטיה מראש. מדידות שבוצעו בתבניות או בתנאים שונים לא יעצבו באופן אמין לתבנית ההקרנה.

למרות היתרון של שימוש all-in-one המדריך CRISPR-Cas9 כגון LCV2:: TKOv3, קידוד הגן Cas9 הוא די גדול, מה שמקשה על האריזה ביעילות לתוך חלקיקים ויראלי (105-10 ו /mL). העברת הפתיתים הנמוכים יותר יכולה להיות מגבלה עבור קווי התאים שקשה לשנות אותם, מכיוון שיהיה להם קושי רב יותר עם הספריות של כל אחד-CRISPR. כדי להמתיק זאת, יש להתבטא ב-Cas9 בשורת התאים מראש, ולאחריה מסירה של ספריות crispr המכילה רק את sgrnas (לדוגמה, pLCKO2:: TKOv3), שניתן לעשות ב-מגדל גבוהים בהרבה (107-108 TU/mL). הפלויידי של קו התא חשוב גם, כפי שהוא קובע את מספר המקום היעד שצריך לשנות. היכולת ליצור החוצה מלאה להוריד בתאי פלואידי יעיל יותר מאשר בתאים עם עותקים מרובים של גן נתון. לכן, המסכים בתאי הפלואיד עשויים להיות רגישים יותר ולהניב נתונים באיכות גבוהה יותר מאשר מסכי המבוצעות בדיפלואיד או בקווי התאים האנאפואיד6. בדיקת גנים ידועים המקושרים לפנוטיפ יסייעו לקבוע את יכולת המסך של מודל קו התא. לדוגמה, עבור מסכי החיוניות, מדריכים המכוונים ליחידת משנה של ה-26Asome, PSMD1 (addgene: פלפרימיד #74180), גן חיוני לליבה, ניתן להשתמש כדי לבדוק את יעילות העריכה ואת infectibility של קווי התא, כמו הפרטורציה של PSMD1 יגרמו למוות התאים.

החוסן של מסכי ממאגר תלוי מאוד בייצוג sgRNA. זהו מדד חשוב הקובע את ביצועי הספריה במהלך המסך ואת היכולת לזהות כניסות. הגיוון בספרייה מוטה בייצוג של כל sgRNA; לכן, האוכלוסייה של תאים להיות מוקרן וניתח צריך להיות גדול מספיק כדי להבטיח את לכידת sgRNAs מתחת לייצוג6. 200-to 1000-מקפלים ייצוג של כל sgrna הוא כיסוי אופייני שנעשה שימוש במסכים שפורסמו (כלומר, 200-1000 תאים לכל sgrna)10,15. ייצוג זה צריך להישמר בעת הגברה של הספרייה הראשונה של הספריה (סעיף 1) ולאורך המסך על-ידי הדבקת מספר התא הנדרש (סעיף 5) כדי לייצג את כיסוי הספריה הרצוי ובמהלך ספריית רצף הכנה (פרוטוקול 6), כפי שמתואר לאורך הפרוטוקול. לדוגמה, כדי להשיג כיסוי מתקפל 200 של ספריית TKOv3 מחייב בחירה והפסבת של 15,000,000 תאים נגועים. במהלך רצף, בהנחה הגנום האנושי דיפלואידי מכיל ~ 7.2 pg של ה-dna ו 1 sgrna לכל הגנום, סך של 100 μg של דנ א גנומית נדרש כדי ליצור את ספריית רצף עבור 15,000,000 רצף קורא. החלטת הסיקור תהיה תלויה בגודל הספרייה, כאשר סיקור של ספריות גדולות ידרוש מספר גדול יותר של תאים שעלולים להיות קשים לתחזוקה ולא מעשיים מבחינה טכנית. מינימום של 200 כיסוי קיפול מומלץ עם ספריות TKOv3, כמו 200-קיפול מספק איזון אופטימלי בין הלוגיסטיקה של הקרנת מספר גדול של תאים ושמירה על טווח דינמי מספיק כדי לזהות שחרור ביולוגי sgRNA ביולוגיים אמיתי עם מוגבל . רעש מהתוספותהאקראיות 22,23 ייצוגים גבוהים יותר של הספרייה לקפל יגרום לשינוי משופר ולהבטיח חלון מספיק לאיתור שינויים sgRNA שפע, במיוחד עבור בחירות שליליות. תכונה מגבילה של מסכים שליליים היא כי הפרטורציה מרוקנת רק למידה שבה היה נוכח בספריית ההתחלה24. לעומת זאת, טווח דינמי של מסכי בחירה חיוביים הוא הרבה יותר גדול, כפי שהם סומכים על העשרת התאים, והוא יכול להעשיר עד 100% של האוכלוסייה הסופית23. לפיכך, עבור מסכי בחירה חיוביים (לדוגמה, מסכי עמידות לתרופות), ניתן להפחית את הכיסוי בספרייה ועומק הקריאה ל-50-ל-100-לייצוג מאחר שרק אוכלוסיית תאים קטנה צפויה לשרוד.

פרוטוקול הספריה ברצף המתואר כאן הוא PCR של שני שלבים הממוטב עבור ספריות TKOv3 CRISPR בשתי עצמות האחוריות וקטוריות ורצף של פלטפורמת האור ברצף. ספריות אלה ברצף יכול גם להיווצר באמצעות פרוטוקול PCR אחד, בדומה לזה המתואר הארט et al.3. עבור ספריות מוכנות אחרות, יש להתייעץ עם פרוטוקולי התחל והרצף שסופקו עבור ספריות אלה. בעת הכנת דגימות דנ א גנומית ו-PCR, זה חיוני להיות מתחשב של אמצעי זהירות זיהום. לדוגמה, אזור ייעודי עבור טיהור גנומית DNA מומלץ מאוד. זה צריך גם להיות ברורים פיזית מפני preps חיידקים, שהם מזהמים נפוצים למצוא דגימות DNA גנומית. התגובות ה-PCR צריכות להיות מוגדרות במכסה ה-PCR הייעודי, שכן הדבר יצמצם את הזיהום מהפלמידים ומספריות הרצף האחרות. לצורך תרגול טוב, ניתן לכלול פקד ללא תבנית שלילי כדי לסייע בניטור של זיהום ה-PCR.

ניתוח נתונים לתרגם את רצף קריאות ממסכים היא משימה לא טריוויאלי, בהתחשב בגודל וגיוון של אלה ערכות נתונים. לאחר שהרצף מיושר ומנורמל, מספר כלים ביולוגיים זמינים כדי לסייע בהערכת ביצועי מסך (איור 3) ובזיהוי כניסות (איור 4). בייגל מתואר בפרוטוקול זה ככלי המפתח לניתוח נתונים. בייגל משתמש במסגרת בייסיאנית כדי להשוות את ההפצות של מערכות גן חיוניות ומוכרות שאינן חיוניות לשינוי בקיפול היומן של כל המדריכים המכוונים לגנים. שיטה זו מתוארת בפירוט ב הארט et al3. בנוסף ל בייגל, אלגוריתמים אחרים שנועדו לזהות את sgRNAs המועשרת והמרודלים, כגון MAGeCK25 יכול לשמש גם כן. עבור מסכי התרופות, מומלץ להשתמש באלגוריתם סמים כדי לזהות הן אינטראקציות גנטיות כימיות וסינוריסטיות ומשתיק קול. מסוממים נועד להשוות את השפע היחסי של sgRNA באוכלוסיה מטופלת לשפע היחסי של sgRNA באוכלוסיה לא מטופלת באותה שעה20.

מגבלה של מסכי CRISPR הוא כי Cas9 לא תמיד להוביל החוצה, כמו תמיד יש אפשרות כי indels שנוצרו הם מוטציות במסגרת, עוזב את הפונקציה גנים שלמים13. התוצאה היא אוכלוסייה מעורבת, מה שהופך את המסך "רועש" ופרשנות של נתונים מאתגרת. שימוש ב-sgRNAs מרובים עצמאיים מיקוד יכול לבנות מספר יתירות, ולהקטין את ההשפעה של sgRNAs עם פעילות נמוכה. אזהרה נוספת למחקרים CRISPR היא ההשפעה של מעברי הגדיל כפול שנוצרו על ידי Cas9 nuclease, אשר יכול להוביל לתאי הסלולר עצמאית של הגן להיות ממוקד. זה אפקט נגד ההתרבות עולה עם מספר היעד העתק האתר, המוביל זיהוי חיובי שווא של גנים בתוך אזורים מוגבר מאוד26. שיטות חישוביות כמו קרס פותחו כדי לתקן את העתק מספר אפקטים27. זרימות עבודה אלה מראות את אפקט מספר ההעתקה כדי להעריך את רמות התלות של הגנים במסכים מסוימים המבוססים על המסך. בדיקה קפדנית של מיקומים גנומיים של גנים פגע באזורים מוגבר יכול לעזור לקבוע תוצאות חיוביות שווא כי הם עקב ריבוי של אפקטים חותכים13. מסכים ראשיים יכולים לזהות רק פגיעות פוטנציאליות. חשוב לעקוב אחר עם המסך או פרוטוקול משני כדי לאמת את הלהיטים ולהבחין על היעד מפני השפעות מחוץ ליעד, להוציא תוצאות חיוביות שווא ולהבטיח גנים הבקיע חלש עקב רטבאליות יעיל אינם מושאר מאחור כמו false . שלילי23

פרוטוקול זה מתמקד בגישות הקרנה מבוססות הכדאיות, בהן מצב הלימוד אמור להוביל לפגם בהתפשטות או למוות של תאים. עבור תהליכים שאינם מובילים לשינוי בכדאיות תאית, שיטת הסינון המבוססת על הכדאיות יכולה להיות מגבילה. חלופה היא לבצע מסכים באמצעות כתב או מבוססי סמן מבוסס והעשרה על ידי הפעלת מיון תאים פלואורסצנטית (FACS) המופעל. במסכי בחירה המבוססים על סמן, הפנוטיפים מבוססים על מוטציות שמווסת את ביטוי הגן של סמן במקום בריאות התא13,23. פורמטים של מסדר CRISPR זמינים גם עבור גן אחד לכל הקרנה. תבניות מערך מורכבות יותר להודעות קריאה מבוססות או מיקרוסקופית. עם זאת, פורמטים מסודר דורשים ציוד אוטומטי כמויות גדולות של ריאגנטים28.

פרוטוקול ההקרנה שנדונו כאן משתמש ב-S. pyogenes Cas9 נוקלאז כדי ליצור alleles שהוא הנפוץ ביותר עבור מסכי גנטיות ושעבורן ספריות רבות זמינות (addgene: ספריות במאגר). אפשרויות חלופיות לספריות להוריד זמינים גם, אשר להשתמש dCas9 מתים לזרז הקשור חלבונים משנה כרומטין כדי לעכב (CRISPRi) או להפעיל (Crispri) תמלול של גנים. בדומה RNAi, CRISPRi מציעה את היכולת לחקור תופעות פנוטימית במינונים גנים שונים וגנים חיוניים שאינם יכולים לסבול להשלים לנקוש, בעוד Crispri יכול לשמש כדי לבצע מסכי רווח. לכל אחת מטכנולוגיות אלה יש את היתרונות שלהם, אבל באופן כללי, הגישה להקיש CRISPR היא המפותחת ביותר. זה הוכח לבצע היטב עם רעש נמוך, השפעות מינימליות מחוץ ליעד, ועקביות ניסיוני, במיוחד באמצעות מסכי גנים חיוניים מבוססי מבוסס, כאשר בהשוואה לרדת למטה גישות באמצעות האלה CRISPRi ו מרין5. למרות הישימות הנרחבת שלה עד כה, טכנולוגיית ההקרנה CRISPR נשאר בשלבים המוקדמים שלה. כלים חדשים ממשיכים להיבנות מהרכיבים הבסיסיים של CRISPR. אלה כוללים קומבינטורית גנים לעריכת אסטרטגיות שיכולות למקד את הרוח גנומית מרובים, אופטימיזציה של אנזימי Cas אורתוגונאליות, ושינויים עם תחומים פונקציונליים כרומטין לגוון פעילויות Cas9. כמו טכנולוגיית CRISPR ממשיכה לצמוח, צימוד שלה גישות ההקרנה גנטית ישמש פלטפורמה רבת עוצמה לגילוי פונקציונלי בגנטיקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הגנום קנדה, קרן מחקר אונטריו, ואת המוסדות הקנדיים לחקר הבריאות (מגב-142375, PJT-148802).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 micron filter
30°C plate incubator
37°C shaking incubator
37°C, 5% CO2 incubator
5 M NaCl Promega V4221
50X TAE buffer BioShop TAE222.4
6 N Hydrochloric acid solution BioShop HCL666.500
95% Ethanol
Alamar blue ThermoFisher Scientific DAL1025
Blue-light transilluminator ThermoFisher Scientific G6600
Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade Bioshop ALB001.250
Dulbecco's Modification of Eagles Medium Life Technologies 11995-065 Cel culture media
Electroporation cuvettes BTX 45-0134
Electroporator BTX 45-0651
Endura electrocompetent cells Lucigen 90293
Fetal Bovine Serum GIBCO 12483-020
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216 recommend passage number <15
Hexadimethrine Bromide (Polybrene) Sigma H9268 Cationic polymer to enhance transduction efficiency
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)
LB agar plates with carbenicillin
LB medium with carbenicillin
Low molecular weight DNA ladder New England Biolabs N3233S
Nanodrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544L
Opti-MEM Life Technologies 31985-070 Reduced serum media
Plasmid maxi purification kit Qiagen 12963
pMD2.G (envelope plasmid) Addgene Plasmid #12259 lentiviral system
psPAX2 (packaging plasmid) Addgene Plasmid #12260 lentiviral system
Puromycin Wisent 400-160-UG
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
Qubit dsDNA BR assay ThermoFisher Scientific Q32853
Qubit fluorometer ThermoFisher Scientific Q33226
RNAse A Invitrogen 12091021
S.O.C recovery medium Invitrogen 15544034
SYRB Safe DNA gel stain ThermoFisher Scientific S33102
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included Addgene Addgene ID #90203 Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 Addgene Addgene ID #125517 Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA
Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0
UltraPure agarose ThermoFisher Scientific 16500500
Wizard genomic DNA purification kit Promega A1120
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 06 365 809 001 Lipid based transfection reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
  2. Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
  3. Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  4. Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
  5. Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  6. Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
  7. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  8. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  9. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  10. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  11. Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
  12. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
  15. Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
  16. Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
  17. Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
  18. Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
  19. Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
  20. Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , Available from: https://doi.org/10.1101/232736 (2017).
  21. Pedregosa, F. V., G,, et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
  22. Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
  23. Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
  24. Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
  25. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
  26. Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
  27. Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
  28. Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).

Tags

גנטיקה סוגיה 151 CRISPR-Cas9 ספריות sgRNA טורונטו-נוק אאוט הגנום CRISPR ההקרנה מסכי הנפתח במאגר גנומיקה תפקודית גנים חיוניים כושר תא התפשטות
מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K.More

Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (151), e59780, doi:10.3791/59780 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter