Summary
La tecnologia CRISPR-Cas9 fornisce un metodo efficiente per modificare con precisione il genoma dei mammiferi in qualsiasi tipo di cellula e rappresenta un nuovo mezzo per eseguire schermi genetici a livello di genoma. Qui viene fornito un protocollo dettagliato che illustra i passaggi necessari per il successo delle prestazioni degli schermi CRISPR-Cas9 a livello di genoma raggruppato.
Abstract
L'editing del genoma utilizzando il sistema CRISPR-Cas ha notevolmente avanzato la capacità di modificare con precisione i genomi di vari organismi. Nel contesto delle cellule dei mammiferi, questa tecnologia rappresenta un nuovo mezzo per eseguire schermi genetici a livello di genoma per studi di genomica funzionale. Le librerie di RNA guida (sgRNA) rivolti a tutti i frame di lettura aperti consentono la facile generazione di migliaia di perturbazioni genetiche in un singolo pool di cellule che possono essere sottoposte a screening per fenotipi specifici per implicare la funzione genica e i processi cellulari in un modo imparziale e sistematico. Gli schermi CRISPR-Cas forniscono ai ricercatori un metodo semplice, efficiente ed economico per scoprire i progetti genetici per i fenotipi cellulari. Inoltre, l'analisi differenziale degli schermi eseguiti in varie linee cellulari e da diversi tipi di cancro può identificare geni che sono contestualmente essenziali nelle cellule tumorali, rivelando potenziali bersagli per specifiche terapie anticancro. L'esecuzione di schermi a livello di genoma nelle cellule umane può essere scoraggiante, in quanto ciò comporta la gestione di decine di milioni di cellule e richiede l'analisi di grandi insiemi di dati. I dettagli di queste schermate, come la caratterizzazione della cella, le considerazioni sulla libreria CRISPR e la comprensione delle limitazioni e delle funzionalità della tecnologia CRISPR durante l'analisi, sono spesso trascurati. Qui è fornito un protocollo dettagliato per il successo delle prestazioni di successo di schermi basati su genomica in pool CRISPR-Cas9.
Introduction
CRISPR-Cas, abbreviazione per brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interspaziate e nuclease associate a CRISPR, è costituito da una singola proteina nucleasi (ad esempio Cas9) in complesso con una guida sintetica RNA (sgRNA). Questo complesso di ribonucleoproteina si rivolge all'enzima Cas9 per indurre rotture di DNA a doppio filamento in uno specifico locus genomico1. Le rotture a doppio filamento possono essere riparate tramite riparazione diretta homologia (HDR) o, più comunemente, attraverso l'unione finale non omologa (NHEJ), un meccanismo di riparazione soggetto a errori che si traduce in inserimento e/o delezioni (INDELS) che spesso interrompono la funzione genica 1. L'efficienza e la semplicità di CRISPR consentono un livello di target genomico precedentemente irraggiungibile che supera di gran lunga le precedenti tecnologie di editing del genoma [ad esempio, nucleasi di dita di zinco o trascrittiviere nuosi effettore simili a TALENS), entrambi affetti da una maggiore complessità progettuale, da una minore efficienza di trasfezione e da limitazioni nell'editing genico multiplex2].
L'applicazione di ricerca di base dell'editing del genoma basato sull'RNA CRISPR ha permesso agli scienziati di interrogare in modo efficiente ed economico le funzioni dei singoli geni e la topologia delle reti di interazione genetica. La capacità di eseguire schermi funzionali ad ampio raggio su genoma è stata notevolmente migliorata dall'uso del sistema CRISPR-Cas, in particolare se confrontato con le precedenti tecnologie di perturbazione genetica come l'interferenza dell'RNA (RNAi) e la mutagenesi della trappola genica. In particolare, l'RNAi soffre di elevati effetti fuori bersaglio e knockdown incompleto, con conseguente minore sensibilità e specificità rispetto al CRISPR3,4,5, mentre i metodi di trappola genica sono fattibili solo in aploide celle per le schermate di perdita della funzione, limitando l'ambito dei modelli cellulari che possono essere interrogati6. La capacità di CRISPR di generare un sistema completo di eliminazione genica fornisce un sistema più biologicamente robusto per interrogare i fenotipi mutanti, con basso rumore, effetti minimi fuori bersaglio e un'attività costante tra i reagenti5. Le librerie di sgRNA CRISPR-Cas9 che si rivolgono all'intero genoma umano sono ora ampiamente disponibili, consentendo la generazione simultanea di migliaia di eliminazioni geniche in un singolo esperimento3,7,8,9 .
Abbiamo sviluppato uniche librerie di lentivirali sgRNAvirale a livello genomico CRISPR-Cas9 chiamate le librerie di Toronto Knock-out (TKO) (disponibili tramite Addgene) compatte e ottimizzate per la sequenza per facilitare schermi genomici funzionali ad alta risoluzione. L'ultima libreria, TKOv3, si rivolge a 18.000 geni di codifica delle proteine umane con 71.090 guide ottimizzate per l'editing dell'efficienza utilizzando dati empirici10. Inoltre, TKOv3 è disponibile come libreria a un componente (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) che esprime Cas9 e sgRNA su un singolo vettore, alleviando la necessità di generare celle stabili e che esprimono Cas9, consentendo l'eliminazione a livello di genoma in un'ampia gamma di tipi di cellule dei mammiferi. TKOv3 è disponibile anche in un vettore senza Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID 125517) e può essere utilizzato in celle che esprimono Cas911.
Una popolazione cellulare modificata CRISPR-Cas9 a livello di genoma può essere esposta a diverse condizioni di crescita, con l'abbondanza di sgRNA nel tempo quantificati dal sequenziamento di prossima generazione, fornendo una lettura per valutare l'abbandono o l'arricchimento delle cellule con genetica tracciabile Perturbazioni. Le librerie knock-out CRISPR possono essere sfruttate per identificare i geni che, dopo la perturbazione, causano difetti di forma fisica cellulare, sensibilità moderata ai farmaci (ad esempio, geni sensibili o resistenti), regolano l'espressione proteica (ad esempio, reporter) o sono necessari per un certo funzione del percorso e lo stato cellulare12,13,14. Ad esempio, schermi di fitness differenziale in una linea cellulare del cancro in grado di identificare sia l'esaurimento o la riduzione di oncogeni e arricchimento o un aumento dei geni soppressori tumorali3,14,15. Allo stesso modo, l'uso di dosi intermedie di farmaci terapeutici può rivelare sia la resistenza ai farmaci che i geni di sensibilizzazione16,17.
Fornito qui è un protocollo di screening dettagliato per lo screening della perdita di perdita CRISPR-Cas9 su scala genomica utilizzando le librerie Knock-out di Toronto (TKOv1 o v3) nelle cellule dei mammiferi dalla generazione di librerie, dalle prestazioni di screening all'analisi dei dati. Anche se questo protocollo è stato ottimizzato per lo screening utilizzando le librerie Knock-out di Toronto, può essere applicato e diventare scalabile a tutte le librerie in pool di sgRNA CRISPR.
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Protocol
Gli esperimenti descritti di seguito devono seguire le linee guida dell'Ufficio per la salute e la sicurezza ambientale dell'istituto.
1. Amplificazione plasmid della libreria lentivirale CRISPR in pool
- Diluire la libreria di DNA plasmid di sgRNA CRISPR ready-made a 50 ng/L in TE (ad esempio, TKOv3).
- Elettroporare la libreria utilizzando cellule elettrocompetenti. Impostare un totale di quattro reazioni di elettroporazione come descritto di seguito.
- Aggiungete su ghiaccio 2 -L di 50 ng/-L nella libreria TKO a 25 -L di cellule elettrocompetenti scongelate.
- Elettroporate utilizzando le impostazioni ottimali suggerite dal protocollo del produttore. Entro 10 s dell'impulso, aggiungere 975 l di Recovery Medium (o SOC medium) alla cuvette.
- Trasferire le cellule elettroporate in un tubo di coltura e aggiungere 1 mL di Recovery Medium. Incubare i tubi in un'incubatrice acquosa a 250 giri per 1 h a 37 gradi centigradi.
- Impostare una piastra di diluizione per il titer della libreria e stimare l'efficienza della trasformazione.
- Piscina tutti 8 mL di cellule recuperate e mescolare bene. Trasferire 10 l delle celle raggruppate a 990 o L di Recovery Medium per una diluizione di 800 volte e mescolare bene.
- Piastra 20 -L della diluizione su una piastra di agar preriscaldata di 10 cm LB e carbenicillin (100 g/L). Ciò si traduce in una diluizione di 40.000 volte dei trasformatori che verranno utilizzati per calcolare l'efficienza di trasformazione.
- Piastra di 400 litri di cellule recuperate su ogni piastra su un totale di 20 piastre di agar da 15 cm preriscaldate e piastre di agar carbenicillin. Incubare le piastre per 14-16 h a 30 gradi centigradi.
NOTA: la crescita a questa temperatura più bassa riduce al minimo la ricombinazione tra ripetizioni a terminale lungo (LTR)18. - Per calcolare l'efficienza della trasformazione, contare il numero di colonie sulla piastra di diluizione di 40.000 volte (passaggio 1.3.2). Moltiplicare il numero di colonie contate per 40.000 per ottenere il numero totale di colonie su tutte le piastre. Procedere se il numero totale di colonie rappresenta una copertura biblioteca equivalente al minimo di 200 colonie x per sgRNA (la più ottimale è 500-1000x).
- Ad esempio, il numero minimo di colonia per la libreria TKOv3 (71.090 sgRNA) è 1,4 x 107, che equivale a 200 colonie x per sgRNA. Se la rappresentazione della colonia è insufficiente, aumentare il numero di elettroporazioni nel passaggio 1.2 in base al numero di colonie sulla piastra di diluizione per ottenere la copertura minima della biblioteca.
- Raccogliere le colonie come descritto di seguito
- Ad ogni lastra da 15 cm, aggiungete 7 mL di lbecillano (100 g/L), quindi raschiete le colonie con uno spalmatore di cellule. Con una pipetta da 10 mL, trasferire le cellule raschiate in una bottiglia o una bottiglia conica sterile da 1 L.
- Ancora una volta risciacquare la piastra con 5 mL di LB - mezzi carbenicillin e trasferire la soluzione alla bottiglia.
- Ripetere per tutti i piatti di mettere in comune le celle da 20 piatti in una bottiglia sterile.
- Mescolare le celle raccolte con una barra di agitazione per 1 h a temperatura ambiente (RT) per rompere i grumi delle cellule. Trasferire le cellule in bottiglie di centrifuga pre-pesate e centrifugare a 7.000 x g ai batteri pellet, quindi scartare i media.
- Pesare il pellet a cellule bagnate e sottrarre il peso della bottiglia di centrifuga per determinare il peso finale del pellet bagnato. Purificare il DNA plasmide utilizzando un kit di purificazione plasmida maxi o mega a seconda della quantità di pellet batterico che ogni colonna può elaborare.
2. Produzione di lentivirus della libreria di sgRNA CRISPR su larga scala
NOTA: tutti i passaggi in questa sezione del protocollo vengono eseguiti in una struttura BSL2 in un mobile di biosicurezza di classe II di tipo A2.
- Calcolare il numero di piastre da 15 cm necessarie per la produzione di virus sulla base della stima che 18 mL di virus viene in genere raccolto da una piastra di 15 cm.
- Preparare le cellule per la trasfezione seminando cellule di imballaggio HEK-293T in supporti a bassa crescita antibiotica (DMEM - 10% FBS - opzionale: 0,1x penna / strep) a 8 x 106 cellule per 15 cm piastra in 20 mL di supporti. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2. Assicurarsi che le cellule placcate siano 70-80% confluenti e si diffondano uniformemente al momento della trasfezione.
- Il giorno successivo, preparare tre plasmidi trasfezione come descritto nella tabella 1 per piastre da 15 cm. Calcolare la quantità di plasmide necessaria per una trasfezione e fare un mix di plasmidi per il numero di piastre, più uno da trasfetare.
- Preparare un reagente di trasfezione a base di lipidi per ogni trasfezione, come descritto nella tabella 2. È stato ridotto il supporto del siero in singoli tubi di microcentrifuga da 1,5 ml per il numero di piastre da trafetare. Aggiungere il reagente di trasfezione, mescolare delicatamente e incubare per 5 min a RT.
- Dopo l'incubazione di 5 min, aggiungere la quantità di DNA necessaria per una trasfezione al reagente di trasfezione per un rapporto 3:1 di reagente di trasfezione-g di complesso di DNA. Mescolare delicatamente e incubare per 30 min a RT.
NOTA: Le trasfetazioni successive possono essere preparate in serie di cinque o meno, con intervalli di 5 minuti per ottimizzare il tempo ed evitare un'eccessiva incubazione. - Dopo 30 min di incubazione, trasferire attentamente ogni miscela di trasfezione ad ogni piatto di cellule di imballaggio. Aggiungere l'intero mix utilizzando una punta di pipette da 1 mL dropwise in un movimento circolare a zig-zag senza disturbare il monostrato cellulare. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi per 18 h al 5% di CO2.
- Preparare i mezzi di raccolta virale: 500 mL di mezzo DMEM , 32 mL di brodo BSA (20 g/100 mL, disciolto nel DMEM, filtro sterilizzato con filtro da 0,22 m) - 5 mL di penna/strep.
- Dopo 18 h, rimuovere i supporti (utilizzare una corretta gestione dei rifiuti di lentivirus come l'incubazione in ipocloreto di sodio 1% per 30 min prima dello smaltimento). Sostituire delicatamente con 18 mL di supporti di raccolta virale per ogni piatto. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi per 18 h al 5% di CO2.
- Dopo 24 h, controllare le cellule di imballaggio per morfologia anormale e fusa come indicazione di buona produzione di virus. Quindi, raccogliere il lentivirus raccogliendo tutti i supernatali e trasferendosi in uno sterile tubo di centrifuga conico.
- Girare il supporto contenente virus a 300 x g per 5 min e pellet le cellule di imballaggio. Aliquota del supernatante in un tubo sterile di polipropilene senza disturbare il pellet.
- Conservare il virus a 4 gradi centigradi per brevi periodi (meno di 1 settimana) o immediatamente a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine. Aliquota virus prep a volumi monouso per l'archiviazione a lungo termine per evitare il congelamento / scongelamento.
3. Caratterizzazione della riga di cella per lo screening
- Selezionare la linea di celle desiderata.
- Misurare e registrare il tempo approssimativo di raddoppio delle cellule.
- Determinare la densità di placcatura cellulare ottimale per la coltura delle cellule ogni 3-4 raddoppi cellulari in un recipiente di coltura dei tessuti di scelta (ad esempio, piastre di coltura tissutale di 15 cm).
- Determinare la concentrazione di puromycina da utilizzare nella linea cellulare desiderata per la selezione di librerie TKO contenenti marcatore di resistenza pari alla formacina come segue:
- Le cellule di semi in una piastra di 12 pozzi alla densità necessaria per raggiungere la confluenza dopo 72 h, poi incubano durante la notte (37 gradi centigradi, 5% di CO2).
- Il giorno successivo, passare a un supporto contenente un intervallo di diluizione di concentrazioni di puromicina da 0 g/mL a 10 g/mL, in incrementi di 0,5 g/mL. Incubare le cellule per 48 h.
- Dopo 48 h, misurare la vitalità cellulare mediante il conteggio cellulare o la colorazione alamarBlue.
- Determinare la concentrazione più bassa che uccide il 100% delle cellule in 48 h. Utilizzare questa concentrazione per selezionare per le popolazioni di cellule trasdotte della libreria CRISPR nei passaggi 4.6 e 5.2.6.
NOTA: Per le linee cellulari con tempi di raddoppio più lunghi, possono essere tollerate incubazioni più lunghe con puromycin. In queste situazioni, determinare la curva di uccisione per il tempo di incubazione richiesto per i raddoppi delle cellule <3. Ridurre al minimo il tempo di selezione per evitare l'abbandono dei geni essenziali prima dell'inizio dello screening.
- Controllare le cellule per la sensibilità al bromuro di esadimethrine (fino a 8 g/mL) eseguendo una curva di risposta alla dose nello stesso metodo utilizzato per misurare la sensibilità della mastracina (passaggio 3.2). Se si osserva tossicità con <8 g/mL di bromuro di esadimettoria, non utilizzare.
4. Titore funzionale della libreria di lentivirus CRISPR in pool per la determinazione di MOI
- Scongelare una nuova aliquota di lentivirus della libreria di sgRNA CRISPR in pool (ad esempio, LCV2::TKOv3) e continuare a pattinare.
- Progettare una serie di volumi di virus da testare tra l'intervallo di 0-2 mL (ad esempio, 0 mL, 0,25 mL, 0,5 mL, 1 mL e 2 mL).
- Raccogliere cellule bersaglio e cellule di semi in piastre da 15 cm alla densità necessaria per raggiungere la confluenza in 72 h.
- Per ogni volume di virus da testare, preparare piastre duplicate. Aggiungere cellule, virus, bromuro di esadimethrine (8 g/mL) e supporti ad un volume finale di 20 mL. Mescolare accuratamente le piastre, sedersi a livello di piastre in incubatrice e incubare per 24 h (37 gradi centigradi, 5% CO2).
- Dopo 24 h, rimuovere il virus contenente i supporti e smaltire (utilizzare precauzioni di biosicurezza per la manipolazione dei rifiuti di lentivirus). Facoltativamente, lavare delicatamente la piastra con PBS caldo per rimuovere il virus estraneo.
- Per ogni condizione di virus, sostituire con 20 mL di supporti contenenti puromycina utilizzando la concentrazione determinata a uccidere le cellule nella sezione 3, in una piastra di replica. All'altra piastra, aggiungere 20 mL di supporti freschi senza puromycina. Incubare per 48 h (37 gradi centigradi, 5% CO2).
- Dopo 48 h, verificare che tutte le cellule non infette (condizione del virus 0 mL) trattate con panminacina siano morte. Raccogliere tutte le piastre singolarmente e disperdere le cellule da ripetuti pipettaggio delicato.
- Contare le cellule di tutte le piastre e calcolare il MOI per ogni volume di virus confrontando i conteggi delle cellule con la selezione di puromicina con i conteggi delle cellule senza puromycina (ad es.
- Risultati del grafico per determinare il volume del virus che porta al 30%-40% di sopravvivenza cellulare con selezione della pancina contro senza puromicina. Utilizzare questo volume di virus per ottenere un MOI di 0.3–0.4 durante lo schermo nelle stesse condizioni di coltura dei tessuti.
5. Infezione dello schermo primario, selezione e passaggio cellulare
- Selezionare la copertura della libreria di sgRNA CRISPR da mantenere in tutto lo schermo (minimo consigliato di 200 volte).
- In base alla copertura della biblioteca, determinare il numero di cellule necessarie per mantenere questa copertura per sgRNA e il numero di cellule necessarie per l'infezione al MOI 0.3(Tabella 3).
- Determinare il numero di piastre necessarie per impostare l'infezione (Tabella 4).
- Infettare le cellule con la libreria CRISPR
- Raccogliere le cellule e sedare il numero di cella richiesto per ogni piastra di 15 cm.
- Aggiungere il bromuro di esadimethrine (8 g/mL) a tutte le piastre.
- Aggiungere il virus al volume richiesto per MOI 0.3 per lo screening e le piastre Control 2. Per il controllo 1, non aggiungere virus e sostituire tale volume con i supporti.
- Mescolare accuratamente le piastre inclinando. Mettere le piastre in incubatrice, assicurandosi che siano livellate.
NOTA: Le infezioni da lotti possono essere eseguite combinando un mix master di virus, supporti ed esadimetofine bromuro alle cellule in sospensione prima della placcatura. - Rimuovere i supporti e sostituirli con supporti freschi contenenti la puromicina alla concentrazione determinata al punto 3.2.4 allo screening e controllare 1 piastre 24 h dopo l'infezione da virus. Aggiungere supporti freschi senza puromycin alla piastra di controllo 2. Incubare le cellule per 48 h (37 oC, 5% CO2).
- 48 h dopo puromycin aggiungere, assicurarsi che tutte le cellule non infette sono morti (controllo 1) per confermare l'attività puromycina, quindi raccogliere le cellule infette.
- Raccolta della popolazione cellulare infetta e passaggio cellulare
- Raccogliere le cellule selezionate da puromycina da tutte le piastre di screening in un contenitore sterile. Raccogliere le celle da ogni piastra di controllo separatamente. Disperdere le cellule con una leggera pipettatura ripetuta.
- Contare le celle da celle di screening in pool, controllare 1 e controllare 2 separatamente e calcolare il numero di celle per 1 mL.
- Calcolare la copertura MOI e piegatura ottenuta come segue:
- Raccogli tre repliche di pellet cellulari dalle cellule raggruppate alla copertura della libreria selezionata per l'estrazione genomica del DNA. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min. Lavare con PBS. Etichettare i tubi e asciugare a secco i pellet delle cellule a -80 gradi centigradi (questi sono campioni di riferimento T0).
- Suddividere il pool di celle infette in tre gruppi di replica (ad esempio, replicare A, replicare B, replicare C), mantenendo la copertura della libreria all'interno di ogni replica. Cellule di semi alla stessa densità di semina normalmente utilizzate per l'espansione. Utilizzare lo stesso numero di celle per ogni piastra di replica e lo stesso numero totale di celle tra le repliche.
- Continuare a passare le cellule e raccogliere tre repliche di pellet cellulari da ogni replica di cellule infettate in pool come sopra, ogni 3-8 giorni a seconda della linea cellulare, per un massimo di 15-20 raddoppi cellulari. Ad ogni passaggio, raccogliere le cellule da tutte le piastre in ogni gruppo di replica tra loro (cioè, tutte le cellule da piastre di replica Vengono rimescolate insieme, tutte le cellule da piastre di replica B vengono ri-mescolate insieme, ecc.).
- Etichettare ogni pellet con un tempo (T) e replicare la designazione. Corrisponde al numero di giorni dopo la raccolta del pellet (ad esempio, T3_A, T3_B, T3_C e così via).
- Per gli schermi di farmaci a selezione negativa, consentire alle cellule di recuperare per almeno un passaggio dopo T0 prima del trattamento. A T3 o T6, dividere le cellule da ciascun gruppo di replica (A, B, C) in popolazioni di trattamento e controllo farmacologiche, utilizzando la stessa densità di semina utilizzata nel passaggio 5.3.5.
- Raggruppare separatamente il numero di cellule necessarie per la copertura della biblioteca per ogni replica nel gruppo di trattamento farmacologico. Aggiungere il farmaco a concentrazioni intermedie (IC20-IC50). Semina le cellule e incubano (37 gradi centigradi, 5% CO2) fino al passaggio successivo.
- Raggruppare separatamente il numero di celle necessarie per la copertura della libreria per ogni replica nel gruppo di controllo del veicolo. Aggiungere il controllo del veicolo utilizzando lo stesso volume del farmaco (<0.5% v/v). Semina le cellule e incubano (37 gradi centigradi, 5% CO2) fino al passaggio successivo.
- Continuare a passare le cellule e raccogliere i pellet cellulari per il DNA genomico ogni 3 giorni, come descritto al passaggio 5.3.5, rinfrescando il farmaco o il veicolo ad ogni passaggio.
- Per gli schermi di selezione positiva o resistenza ai farmaci, dividere ogni gruppo di replica in base al numero di cellule necessarie per la copertura della biblioteca. Aggiungere le concentrazioni di droga IC90 a ogni replica. All'IC90,la maggior parte delle cellule sarà uccisa. Consentire alle popolazioni resistenti di crescere e raccogliere pellet cellulari (1-2 x 107 cellule) per l'estrazione genomica del DNA.
6. Preparazione e sequenziamento dei campioni CRISPR
- Purificazione genomica del DNA
- Incubare i pellet a celle congelate per 5-10 min a RT per lo scongelamento.
- Aggiungere 1,4 mL di PBS a un tubo di centrifuga da 50 mL contenente un pellet cellulare. Vortice per 20 s per risospendere le cellule e riposare per 1 min. Se necessario, pipetta 15x con P1000 per rompere i grumi di cellule rimanenti. Se si trasferiscono le cellule da un tubo da 15 mL o da 1,5 mL, sospendere le celle con 1 mL di PBS, quindi trasferire le celle a un tubo da 50 mL e risciacquare il tubo originale con 400 .
- Aggiungere 5 mL di Nuclei Lysis Solution alle cellule risospese. Utilizzando una pipetta da 10 mL, mescolare il campione pipetting su e giù 5x.
- Aggiungete al lisate nucleare 32 gradi di RNase A (20 mg/mL; per ottenere una concentrazione finale di 100 g/mL) al lisato nucleare e mescolate il campione invertendo il tubo 5x. Incubare la miscela a 37oC per 15 min e lasciare raffreddare il campione per 10 min a RT.
- Aggiungere 1,67 mL di Protein Precipitation Solution al lisato e vortice vigorosamente per 20 s. Piccoli grumi proteici possono essere visibili dopo la miscelazione.
- Centrifuga a 4.500 x g per 10 min a RT.
- Utilizzando una pipetta da 10 mL, trasferire il supernatante in un tubo centrifuga di 50 mL contenente 5 mL di isopropanolo. Mescolare delicatamente la soluzione 10x per inversione fino a quando non viene osservato il DNA.
NOTA: Il DNA può essere osservato come fili bianchi simili a fili che formano una massa visibile. - Centrifuga a 4.500 x g per 5 min a RT per pellet il DNA.
- Utilizzando una pipetta da 10 mL, rimuovere con cura il supernatante ed evitare di slocare il pellet di DNA. Aggiungere al DNA 5 mL di 70% di etanolo al DNA. Ruotare delicatamente il tubo per lavare il pellet del DNA e i lati del tubo di centrifuga.
- Centrifuga a 4.500 x g per 5 min a RT.
- Utilizzando una pipetta da 10 mL, rimuovere con cura il 70% di etanolo ed evitare di slocare il pellet di DNA. DNA genomico asciutto per 10 min alla RT.
- Aggiungere al tubo 400 l di TE e lasciare sciogliere il DNA incubando a 65 gradi centigradi per 1 h. Mescolare il DNA facendo scorrere delicatamente il tubo ogni 15 min. Se il DNA non si scioglie completamente, incubano il tubo a 65 gradi centigradi per un ulteriore 1 h mentre si snoda delicatamente il tubo ogni 15 min, e lasciarlo a 4 gradi durante la notte.
- Centrifuga a 4.500 x g per 1 min a RT e trasferimento del DNA genomico a un tubo a bassa legatura da 1,5 mL.
- Quantificare e misurare la purezza del DNA genomico sia sullo spettrofotometro (per il contenuto totale di acido nucleico) che sul fluorometro (per il contenuto di DNA a doppio filamento).
- Facoltativamente, precipitare il DNA genomico se ci sono problemi con l'amplificazione PCR a valle dello sgRNA come segue.
- Trasferire il DNA genomico di 400 .L in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungere 18 luna di 5 M NaCl (concentrazione finale di 0,2 M) e 900 -L del 95% di etanolo.
- Invertire il tubo 10x fino a quando accuratamente mescolato, quindi centrifugare a 16.000 x g per 10 min a RT.
- Rimuovere con cura il supernatante ed evitare di dislocare il pellet di DNA. Lavare il pellet di DNA con 500 lun del 70% di etanolo. Ruotare delicatamente il tubo per lavare il pellet di DNA.
- Centrifuga a 16.000 x g per 5 min a RT.
- Rimuovere con attenzione il supernatante ed evitare di dislocare il pellet di DNA. DNA genomico asciutto per 10 min alla RT.
- Aggiungere 300 l di TE per sciogliere il DNA come descritto nei passaggi 6.1.12.
- Quantificare e misurare la purezza del DNA genomico come descritto al punto 6.1.14.
- Preparazione della libreria di sequenziamento CRISPR
- Impostare la PCR 1 come indicato nella tabella 5 utilizzando un totale di 100 g di DNA genomico. Aggiungere 3,5 g di DNA genomico per una reazione 50 a Ello e impostare reazioni identiche di 50 ll per ottenere la copertura desiderata. Nella tabella 6 sono elencati esempi di sequenze di primer per l'amplificazione delle librerie di sequenziamento LCV2::TKOv3. Nella tabella 7 sono elencati esempi di sequenze di primer per l'amplificazione delle librerie di sequenziamento pLCKO2::TKOv3.
- Amplificare le reazioni PCR 1 in un termociclore utilizzando il programma descritto nella tabella 8.
- Controllare l'amplificazione PCR 1 eseguendo 2 ll l del prodotto PCR su un gel di agarose dell'1%. PCR 1 produce un prodotto di 600 bp.
- Mettere in comune tutte le singole 50 reazioni di 50 -L per ogni campione genomico di DNA e mescolare mediante vortice.
- Impostare una reazione PCR 2 (50 gradi centigradi) per ogni campione, come descritto nella tabella 9 utilizzando come modello 5 L del prodotto PCR 1 in pool. Usare combinazioni di primer dell'indice univoche per ogni singolo campione per consentire il pooling di esempi di libreria di sequenziamento.
- Amplificare la reazione PCR 2 in un termociclore utilizzando il programma descritto nella tabella 10.
- Pulire l'attrezzatura gel ad agarose per purificare i prodotti amplificati con 0,1 N HCl per 10 minuti prima di lanciare un gel. Preparare un gel di agarose del 2% contenente macchie di DNA per purificare i prodotti amplificati PCR 2.
- Eseguire il prodotto PCR 2 sul gel di agarose 2% a bassa tensione (1.0–1.5 h run). PCR 2 produce un prodotto di 200 bp.
- Visualizza i prodotti PCR su un transilluminatore a luce blu. Accise la fascia di 200 bp e purificano il DNA dalla fetta di gel di agarose utilizzando un kit di estrazione gel. Quantificare e misurare la purezza della libreria di sequenziamento sia sullo spettrofotometro che sul fluorometro.
NOTA: una tipica concentrazione della libreria di sequenziamento ad esempio in gel varia da 5 a 10 ng/L e una resa totale di 150-300 ng.
- Sequenza ad alta velocità effettiva
- Sequenziare le librerie di sequenziamento CRISPR nei sequencer di nuova generazione.
- Riferimento sequenza T0 campioni ad una maggiore profondità di lettura di 400-500 volte la copertura della libreria. Sequenziare campioni sperimentali di timepoint per schermi drop-out ad una profondità di lettura minima di 200 volte. Per schermi di selezione positivi forti, una profondità minima di lettura di 50 volte la copertura è sufficiente per l'identificazione di sgRNA arricchiti.
NOTA: È fondamentale sequenziare il campione T0 per determinare la rappresentazione della libreria per un particolare schermo e fungere da riferimento per le modifiche di piegatura dello sgRNA determinante nel tempo.
7. Analisi dei dati
- Allineare la sequenza utilizzando programmi come Bowtie per mappare le letture di sequenza nella libreria di riferimento utilizzando i seguenti parametri: -v2 (consentendo due mancate corrispondenze) e -m1 (ignorando qualsiasi lettura mappata a più di una sequenza nella libreria).
- Normalizzare il numero di letture mappate in modo univoco per ogni sgRNA per un dato campione a 10 milioni di letture per campione come segue:
107 del sistema
- Calcolare la modifica della piega log2 di ogni sgRNA per ogni replica in ogni punto temporale (Tn) rispetto al campione T0 (Tn/T0). Aggiungere uno pseudo conteggio di 0,5 letture a tutti i conteggi di lettura per evitare discontinuità da zeri. Escludere gli sgRNA con <30 letture non elaborate nel campione T0 dal calcolo della modifica di piegatura e dall'analisi a valle.
- Analizzare i cambiamenti di piegatura con l'algoritmo Bayesian Analysis of Gene Essentiality (BAGEL)
- Calcolare la precisione e il richiamo per la valutazione delle prestazioni dello schermo utilizzando i punteggi BF. Utilizzare il set essenziale del passaggio 7.4 come vero elenco positivo per la funzione precision_recall_curve della libreria Scikit-learn per Python, insieme al sottoinsieme di punteggiBF sopra riportato. In alternativa, eseguire la stessa operazione utilizzando il pacchetto PRROC in R.
- Calcolare il cambio media di tutte le guide per ogni gene. Generare grafici di densità per i geni essenziali e non essenziali (vedere il passaggio 7.4) in R o in software equivalente. In R, se x.ess è un vettore contenente i valori di modifica della piega del tronco dei geni essenziali e x.nonEscontengono geni non essenziali, tracciare usando il seguente comando:
plot( densità( x.ess ), xlab , "medio logFC",col , "rosso", lwd , 2 )
lines( densità( x.nonEss ), col
NOTA: per i dettagli della versione Python e i pacchetti utilizzati, vedere scikit-learn v0.19.1: (pubblicato da Pedregosa et al.21).
107 del sistema
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Representative Results
Panoramica del flusso di lavoro di screening CRISPR su scala genomica
La figura 1 illustra una panoramica del flusso di lavoro di screening CRISPR in pool, a partire dall'infezione delle cellule bersaglio con lentivirus della libreria CRISPR con un basso MOI per garantire singoli eventi di integrazione e un'adeguata rappresentazione della libreria (in genere da 200 a 1000 -fold). Dopo l'infezione, le cellule vengono trattate con l'antibiotico puromycina per selezionare per le cellule trasdotte. Dopo la selezione, viene raccolto un pellet di base T0 per valutare la distribuzione della libreria all'inizio dello screening. Le cellule rimanenti, costituite da una popolazione eterogenea di perturbazioni genetiche, vengono accompagnate alla rappresentazione bibliotecaria desiderata ogni 3-4 giorni per 15-20 raddoppi per consentire la modifica genica e gli effetti risultanti a manifestarsi. Gli schermi con trattamenti farmacologici vengono in genere aggiunti a T3 o T6 dopo che le cellule si sono recuperate dall'infezione da virus e dalla selezione della puromicina. Le cellule vengono raccolte nella rappresentazione bibliotecaria desiderata in ogni passaggio del DNA genomico, per determinare l'abbondanza guida dal sequenziamento di prossima generazione nei punti di tempo desiderati.
Si consiglia di raccogliere più campioni in caso di errori che possono verificarsi nei passaggi di preparazione della libreria di sequenza downstream. Gli schermi in pool sono in genere saggi basati sulla fattibilità progettati per la selezione positiva o negativa di sgRNA essenziali. Gli schermi positivi identificano i geni che mostrano resistenza o aumentano la sopravvivenza sotto una specifica pressione di selezione (ad esempio, farmaci o linea cellulare mutante). In questo caso, la maggior parte delle cellule morirà a causa della selezione e le cellule che rimangono saranno arricchite per i geni bersaglio di sgRNA che sono resistenti al farmaco o alla condizione testata. Le schermate di selezione negative o gli schermi "drop-out" identificano i knock-out genici con una maggiore sensibilità o perdita di sopravvivenza sotto la pressione di selezione dello schermo. Per identificare le perturbazioni che hanno un effetto fenotipica come un difetto di crescita, l'abbondanza di guida in ogni momento viene quantificata dal sequenziamento di prossima generazione e confrontata con T0 per valutare l'abbandono o l'arricchimento delle guide nel corso dello schermo. Utilizzando piattaforme di analisi, i cambiamenti di piegatura del log vengono misurati per le guide e algoritmi come il BAGEL possono essere applicati per consentire la classificazione dei colpi genici.
Amplificazione della biblioteca e manutenzione della rappresentazione della libreria in schermi CRISPR in pool
Figura 2 illustra la distribuzione prevista delle guide dopo l'amplificazione della libreria plasmide. La libreria TKOv3 è composta da 71.090 sgRNA con quattro sgRNA per gene, mirando a 18.000 geni di codifica delle proteine10. Una libreria ideale dovrebbe avere ogni singolo sgRNA rappresentato a quantità simili. Pertanto, si consiglia di confermare la distribuzione delle guide nella libreria amplificata mediante la sequenza di nuova generazione. Di seguito è riportata una libreria amplificata con una distribuzione molto stretta degli sgRNA, che conferma che >95% di tutti gli sgRNA sono all'interno di un intervallo di distribuzione di 4 volte (Figura 2). Una distribuzione più ampia degli sgRNA indicherà che l'abbondanza di guide di libreria non sono equamente rappresentate e possono contribuire al rumore negli schermi in pool.
Valutazione delle prestazioni dello schermo
La figura 3 illustra che la qualità delle prestazioni di uno schermo può essere valutata valutando la distribuzione della modifica di piegatura di tutto lo sgRNA rispetto a un elenco di riferimento standard gold di geni essenziali (684 geni) e non essenziali (926 geni) e visualizzato come curve di richiamo di precisione10. Utilizzando i set di riferimento standard oro, i punteggi BF (Bayes Factor) vengono calcolati per il punto finale dello schermo e le curve di richiamo di precisione vengono tracciate. I punteggi BF vengono calcolati analizzando la modifica di piegatura log per tutte le guide destinate a un gene utilizzando un framework bayesiano (l'algoritmo BAGEL descritto in precedenza19) per confrontare le distribuzioni di insiemi di guide essenziali e non essenziali noti. I falsi tassi di individuazione (FDR) derivano empiricamente utilizzando gli stessi set di riferimento gold standard. Uno schermo ad alte prestazioni dovrebbe recuperare un numero elevato di geni essenziali a una soglia di BF >6 e FDR <5%, come dimostra un "gomito" tagliente nella maggior parte delle curve e una linea retta al punto terminale, come mostrato dalla linea blu nella Figura 3A. Occorre inoltre esaminare l'abbandono delle guide destinate ai geni essenziali e non essenziali(Figura 3B). Le guide che prendono di mira i geni di riferimento non essenziali dovrebbero mostrare una distribuzione in gran parte simmetrica delle modifiche di piegatura del tronco centrate su zero, come mostrato dalla linea tratteggiata nella Figura 3B. La distribuzione della modifica delle pieghe delle guide destinate ai geni essenziali mostra un forte spostamento negativo rispetto alla distribuzione di guide destinate ai geni non essenziali, come dimostra la linea continua nella figura 3B.
Geni essenziali
Una delle applicazioni di base degli schermi di abbandono a livello di genoma raggruppati consiste nell'identificare i geni essenziali. I geni essenziali, una sottocategoria di geni di fitness, sono geni la cui perturbazione causa la letalità cellulare, considerata anche vagamente come geni di proliferazione. Nel contesto della biologia del cancro, è possibile identificare elementi essenziali specifici del contesto al fine di identificare le dipendenze per una particolare linea cellulare tumorale. Figura 4, mostra il grado gene dei geni essenziali utilizzando i punteggi del fattore di Bayes, derivati dall'algoritmo BAGEL. Bayes Factor (BF) rappresenta una misura di fiducia che il gene knock-out si traduce in un difetto di fitness. Punteggi più positivi indicano una maggiore fiducia che la perturbazione provoca una diminuzione della forma fisica.
Schermata di selezione positiva
Le piscine knock-out a livello di genoma possono essere coltivate in presenza di un agente farmacologico in eccesso per cercare geni soppressori/resistenza. Di seguito è mostrato un esempio di cellule HCT116 esaminate in presenza di timinane per cercare i soppressori dell'arresto G1/S3. I dettagli di questa schermata sono disponibili in una precedente pubblicazione3. In breve, 6 giorni dopo la selezione delle cellule infette della libreria CRISPR, le cellule sono state divise in repliche mantenendo la copertura della biblioteca e trattate con la timofina. Le cellule sono state accompagnate in presenza di farmaci fino a quando non sono state recuperate ampie cellule resistenti per il campionamento genomico del DNA. Le selezioni positive possono essere sequenziate (profondità di lettura) a una copertura inferiore rispetto agli schermi negativi poiché solo una piccola frazione di guide rimarrà a causa della forte pressione selettiva. In questo esempio, il sequenziamento è stato ottenuto con alcuni milioni di letture e 11 sgRNA mirati alla tiofina chinasi (TK1) sono stati recuperati e arricchiti come previsto (Figura 5).
| Gli importi sono stati determinati in base al rapporto molare di 1:1:1 | ||
| componente | Quantità per piastra da 15 cm un | |
| LCV2::TKOv3 | pLCKO2::TKOv3 | |
| psPAX2 (in base al sistema psPAX2) | 4,8 g di g | 7,0 g di g |
| pMD2.G | 3,8 g di g | 4,0 g di g |
| TKOv3b | 8,0 g di g | 5,0 g di g |
| un Importi determinati in base alla combinazione di plasmide più produttiva per la libreria TKO a 1:1:1 rapporto molare | ||
| b Importo TKO plasmide basato sulla backbone del vettore della libreria CRISPR. Vettore all-in-one LCV2: 13 kb, vettore pLCKO2 non Cas9 : 7,6 kb | ||
Tabella 1: Quantità raccomandata di plasmide per la trasfezione TKOv3.
| componente | Quantità per piastra da 15 cm |
| Opti-MEM | 800 ll |
| Reagente di trasfezione | 48 ll |
Tabella 2: Configurazione del reagente di trasfezione basata su lipidi.
| Copertura pieghevole | Numero di cellule per sgRNAb | Numero di cellule necessarie per l'infezioneb |
| (sgRNA dimensioni della libreriaa una copertura pieghevole) | (dimensioni della libreria sgRNA : copertura di piegatura - 0,3 MOI) | |
| 200 | 1,5 x 107 | 5 x 107 |
| 500 | 3,6 x 107 | 1,2 x 108 |
| 1000 | 7.1 x 107 | 2,4 x 108 |
| un In base alle dimensioni della libreria TKOv3: 71.090 sgRNA | ||
| b I numeri vengono arrotondati per elisto per elis | ||
Tabella 3: Determinazione dei numeri di cellulare necessari per l'infezione della libreria TKOv3 CRISPR e la placcatura cellulare a varie coperture di piegatura.
| cura | Numero di piastre necessarie per l'infezione | |
| Piastre di screening | Virus, puromycin | (dimensioni della libreria di sgRNA 200 volte) : 0,3 MOI , densità di semina cellulare all'infezione, numero di piastre |
| Controllo 1 | Nessun virus, puromycin (controllo di sopravvivenza dello 0%) | 1 |
| Controllo 2 | Virus, - No puromycin (controllo di sopravvivenza al 100%) | 1 |
| a Includere piastre aggiuntive per adattarsi alle fluttuazioni MOI e ai tassi di crescita | ||
Tabella 4: Calcolo dell'impostazione delle infezioni.
| Reagenti | Importo per reazione 1x |
| 2x Master Mix | 25 ll |
| 10 mM PCR 1 LCV2 primer in avanti | 2,5 l l |
| 10 mM PCR 1 LCV2 inverso primer | 2,5 l l |
| DNA genomico | 3,5 g di g |
| acqua | fino a 50 l |
| totale | 50 ll |
Tabella 5: configurazione PCR 1.
Tabella 6: primer PCR per amplificazione delle librerie di sequenziamento LCV2::TKOv3. Fare clic qui per scaricare questo file.
Tabella 7: primer PCR per amplificazione delle librerie di sequenziamento pLCKO2::TKOv3. Fare clic qui per scaricare questo file.
| passo | temperatura | ora | |
| 1 | 98 gradi centigradi | 30 sec | |
| 2 | 98 gradi centigradi | 10 sec | 25 cicli (passaggio 2 – 4) |
| 3 | 66 gradi centigradi | 30 sec | |
| 4 | 72 gradi centigradi | 15 sec | |
| 5 | 72 gradi centigradi | 2 min | |
| 6 | 10 gradi centigradi | tenere |
Tabella 8: parametri del ciclo PCR 1.
| Reagenti | Importo per reazione 1x |
| 2x Master Mix | 25 ll |
| 10 mM i5 primer in avanti | 2,5 l l |
| 10 mM i7 inverso primer | 2,5 l l |
| Prodotto PCR 1 | 5 ll |
| acqua | 15 ll |
| totale | 50 ll |
Tabella 9: configurazione PCR 2.
| passo | temperatura | ora | |
| 1 | 98 gradi centigradi | 30 sec | |
| 2 | 98 gradi centigradi | 10 sec | 10 cicli (passaggio 2 – 4) |
| 3 | 55gradi centigradi | 30 sec | |
| 4 | 65gradi centigradi | 15 sec | |
| 5 | 65gradi centigradi | 5 min | |
| 6 | 10 gradi centigradi | tenere |
Tabella 10: Parametri del ciclo PCR 2.
Tavolo supplementare S1. Set di geni di riferimento TKO Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura 1: Panoramica schematica del flusso di lavoro di screening in pool. (A) La popolazione cellulare bersaglio è infettata dal lentivirus della biblioteca CRISPR a basso MOI per garantire che la maggior parte delle cellule riceva un'integrazione virale e che la rappresentazione della biblioteca sia mantenuta. I diversi colori rappresentano sgRNA diversi in ogni particella virale. Vengono selezionate piscine cellulari geneticamente modificate. Una volta completata la selezione, le celle vengono campionate per il riferimento T0 e le celle con passaggi o serie. (B) Al primo passaggio dopo T0, le cellule si sono riprese dall'infezione e possono essere aggiunti trattamenti farmacologici, se necessario. Dopo il trattamento, le popolazioni cellulari sono accompagnate in serie per diverse settimane. Durante ogni passaggio, le cellule vengono raccolte per il DNA genomico e reseeded attese alla copertura di piegatura richiesta della libreria sgRNA. (C) Possono essere eseguiti due tipi di schermi: 1) schermi di selezione positivi, che identificano le cellule mutanti che mostrano resistenza o aumento della sopravvivenza sotto la pressione di selezione specifica (ad esempio, farmaci o linea cellulare mutante), in quanto saranno arricchite durante il schermo; o 2) schermi di selezione negativi, che identificano le cellule mutanti con una maggiore sensibilità o perdita di sopravvivenza sotto la pressione di selezione dello schermo, in quanto andranno perse durante lo schermo. (D) Il DNA genomico viene raccolto e amplificato dalla PCR per arricchirsi delle regioni guida. (E) L'abbondanza della guida è quantificata dal sequenziamento di nuova generazione e arricchito, o le guide esaurite sono determinate per l'identificazione "hit". Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Qualità della libreria sgRNA CRISPR amplificata. I plasmidi di libreria amplificati vengono analizzati mediante sequenziamento di nuova generazione (letture consigliate: 30 milioni di letture, corrispondenti alla rappresentazione della libreria di 400 gradi). Di seguito è mostrata una libreria con una distribuzione rigorosa degli sgRNA, con >95% di tutti gli sgRNA all'interno di un intervallo di distribuzione di 4 volte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Valutazione della qualità dello schermo di abbandono utilizzando gruppi di riferimento genetico essenziali standard gold. (A) L'analisi di richiamo di precisione dello screening comporta il recupero di geni essenziali a una soglia di BF >6 e FDR del 5%. Lo schermo ad alte prestazioni è rappresentato da una linea blu e gli schermi a basso rendimento sono rappresentati da una linea rossa. (B) Distribuzione del cambiamento di piegatura dello sgRNA mirato ai geni essenziali (linea solida) e ai geni non essenziali (linee tratteggiate). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Determinazione dell'essenzialità genica. Bayes Factor classificazione del gene essenzialmente in una schermata particolare. Bayes Factor (BF) rappresenta una misura di fiducia che il gene knock-out si traduce in un difetto di fitness. I fattori più alti di Bayes indicano una maggiore fiducia nel fatto che il gene knock-out si traduce in un difetto di fitness, (punti rossi). I punteggi Lower Bayes Factor suggeriscono che il knock-out fornisce un vantaggio di crescita (punti blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Schermata di selezione positiva per il soppressore del blocco di timinanelle nelle cellule HCT116. I conteggi di lettura normalizzati per tutti gli sgRNA a T0 tracciati rispetto ai conteggi medi di lettura normalizzati per i campioni trattati con timmidina. Per schermi di selezione positivi (ad esempio, utilizzando una concentrazione di IC90 di farmaco), il numero di perturbazioni che conferiranno resistenza al farmaco dovrebbe essere piccolo. Per questo motivo, la profondità di lettura può essere inferiore a quella necessaria per gli schermi negativi, in modo che la maggior parte della libreria sia rappresentata. Gli sgRNA TK1 sono cerchiati in rosso. Questa cifra è stata modificata da una precedente pubblicazione3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Grazie alla sua semplicità d'uso e all'elevata flessibilità, la tecnologia CRISPR è stata ampiamente adottata come strumento di scelta per un montaggio preciso del genoma. Lo screening CRISPR in pool fornisce un metodo per interrogare migliaia di perturbazioni genetiche in un singolo esperimento. Negli schermi in pool, le librerie di sgRNA fungono da codici a barre molecolari, poiché ogni sequenza è unica ed è mappata al gene mirato. Isolando il DNA genomico della popolazione cellulare, i geni che causano il fenotipo di interesse possono essere determinati quantificando l'abbondanza di sgRNA mediante il sequenziamento di nuova generazione. I metodi di sequenziamento massicciamente paralleli vengono utilizzati per quantificare gli sgRNA nei campioni, il che significa che più popolazioni di cellule indipendenti possono essere raggruppate nella stessa corsia di sequenziamento per ridurre al minimo i costi.
Prima di intraprendere un progetto di screening su larga scala, è importante avere un modello ben caratterizzato e tecnicamente ottimizzato. Il background genetico, il tasso di crescita e l'efficienza della trasduzione sono fattori importanti nella scelta delle linee cellulari per lo screening. Ad esempio, i tassi di crescita e l'efficienza di modifica determineranno la scalabilità e l'idoneità tecnica del modello. Al fine di rappresentare adeguatamente grandi librerie di sgRNA, sono necessarie decine di milioni di cellule, quindi il numero di cellule potrebbe essere un fattore limitante nella fattibilità dello screening per le linee cellulari con doti più lenti o quelli che non hanno una buona capacità proliferale (ad esempio, cellule primarie). In base ai tassi di crescita, le condizioni di coltura cellulare come la densità di semina cellulare e la dimensione della piastra per lo screening devono essere selezionate di conseguenza. Si raccomanda di colturare le cellule nella nave più grande che è pratica e tecnicamente fattibile per lo schermo.
L'efficienza della traduzione di lentivirus varia tra i tipi di cellule, poiché le cellule differiscono nell'infettività intrinseca. Di conseguenza, il volume di virus necessario per ottenere un'infezione sufficiente in un tipo di cellula non sarà necessariamente lo stesso in un altro. Pertanto, è fondamentale titer funzionalmente ogni lotto di libreria di lentivirus prodotta nella linea cellulare da vagliare per garantire una copertura sufficiente della libreria e per lo più singoli eventi di trasduzione per cellula trasducono a MOI inferiori intorno a 0,3 (sezione 4). L'efficienza della trasduzione può anche essere influenzata dalle condizioni di coltura cellulare; pertanto, i titer funzionali devono essere determinati utilizzando le stesse condizioni cellulari che verranno utilizzate sullo schermo. Cioè, è importante utilizzare gli stessi vasi di coltura dei tessuti, costituenti dei media e volume, densità di placcatura cellulare, e prep virus senza scongelare preventivamente. Le misurazioni effettuate in diversi formati o condizioni non verranno ridimensionate in modo affidabile in base al formato di screening.
Nonostante il vantaggio di utilizzare librerie guida ALL-in-one CRISPR-Cas9 come LCV2::TKOv3, la codifica genica Cas9 è piuttosto grande, rendendo difficile il confezionamento efficiente in particelle virali (105-106 TU/mL). Fornire titer lentivirali inferiori può essere una limitazione per le linee cellulari difficili da trasdure, in quanto avranno ancora più difficoltà con le librerie all-one-CRISPR. Per attenuare questo problema, Cas9 deve essere espresso nella riga cellulare in anticipo, seguito dalla consegna di librerie CRISPR contenenti solo sgRNA (ad esempio, pLCKO2::TKOv3), che può essere fatto a livelli molto più alti (107-108 TU/mL). Anche la ploidia di una linea cellulare è importante, in quanto determina il numero di loci di destinazione che devono essere modificati. La capacità di generare eliminazioni complete nelle cellule aploidi è più efficiente rispetto alle cellule con più copie di un determinato gene. Pertanto, le schermate nelle celle aploidi possono essere più sensibili e produrre dati di qualità superiore rispetto alle schermate eseguite nelle linee cellulari diploidi o aneuploidi6. Il test di geni noti collegati al fenotipo aiuterà a determinare la capacità di screening di un modello di linea cellulare. Ad esempio, per gli schermi di essentiality, le guide che prendono di mira una sottounità del proteasome 26S, PSMD1 (Addgene: plasmid #74180), un gene essenziale di base, possono essere utilizzate per testare l'efficienza di editing e l'infettività delle linee cellulari, come perturbazione del PSMD1 porterà alla morte delle cellule.
La robustezza degli schermi in pool dipende fortemente dalla rappresentazione dello sgRNA. Si tratta di una metrica importante che determina le prestazioni della libreria durante una schermata e la possibilità di identificare gli hit. La diversità della biblioteca è distorta nella rappresentazione di ogni sgRNA; pertanto, la popolazione di cellule da vagliare e analizzare dovrebbe essere sufficientemente grande da garantire la cattura di sgRNAsottorappresentati 6. La rappresentazione da 200 a 1000 volte di ogni sgRNA è la copertura tipica che è stata utilizzata negli schermi pubblicati (cioè 200-1000 cellule per sgRNA)10,15. Questa rappresentazione deve essere mantenuta quando si amplifica il plasmide della libreria (sezione 1) e per tutto lo schermo infettando e passando il numero di cella richiesto (sezione 5) per rappresentare la copertura della libreria desiderata e durante la libreria di sequenziamento preparazione (protocollo 6), come descritto in tutto il protocollo. Ad esempio, per ottenere una copertura di 200 volte la libreria TKOv3 è necessario selezionare e passare di 15 milioni di cellule infette. Durante il sequenziamento, supponendo che un genoma umano diploide contenga 7,2 punzz di DNA e 1 sgRNA per genoma, è necessario un totale di 100 g di DNA genomico per generare la libreria di sequenziamento per 15 milioni di letture di sequenze. La decisione di copertura dipenderà dalle dimensioni della biblioteca, in quanto la copertura di librerie più grandi richiederà la coltura di un maggior numero di cellule che possono essere difficili da mantenere e non tecnicamente pratiche. Un minimo di 200 volte la copertura è consigliata con le librerie TKOv3, in quanto 200 volte fornisce un equilibrio ottimale tra la logistica di screening di un gran numero di cellule e il mantenimento di un intervallo dinamico sufficiente per rilevare veri e propri drop-out di sgRNA biologici con rumore da deplezioni casuali22,23. Rappresentazioni più elevate della libreria di pieghe si tradurrà in una migliore riproducibilità e garantirà una finestra sufficiente per il rilevamento dei cambiamenti nell'abbondanza di sgRNA, specialmente per le selezioni negative. Una caratteristica limitante delle schermate negative è che la perturbazione si esaurisce solo nella misura in cui era presente nella libreria iniziale24. In confronto, la gamma dinamica di schermi di selezione positivi è molto più ampia, in quanto si basano sull'arricchimento delle cellule e potrebbe arricchire al 100% della popolazione finale23. Pertanto, per schermi di selezione positivi (ad esempio schermi di resistenza ai farmaci), la copertura della biblioteca e la profondità di lettura possono essere ridotte a rappresentazione da 50 a 100 volte, poiché si prevede che solo una piccola popolazione di cellule sopravviverà.
Il protocollo della libreria di sequenziamento descritto di seguito è una PCR in due passaggi ottimizzata per le librerie TKOv3 CRISPR sia nelle backbone vettoriali che in sequenza sulla piattaforma di sequenziamento Di Illumina. Queste librerie di sequenziamento possono essere generate anche utilizzando un unico protocollo PCR, simile a quello descritto in Hart et al.3. Per le altre librerie già pronte, i primer e i protocolli di sequenziamento forniti per tali librerie dovrebbero essere consultati. Quando si preparano campioni di DNA genomico e PCR, è essenziale essere premurosi delle precauzioni di contaminazione. Ad esempio, è altamente raccomandata un'area dedicata alla purificazione genomica del DNA. Dovrebbe anche essere fisicamente distinto dai prep del plasmide batterico, che sono contaminanti comuni trovati in campioni di DNA genomico. Le reazioni PCR devono essere impostate in una cappa PCR dedicata, in quanto ciò ridurrà al minimo la contaminazione da plasmidi e altre librerie di sequenziamento. Per le buone pratiche, è possibile includere un controllo negativo senza modello per monitorare la contaminazione da PCR.
L'analisi dei dati per tradurre le letture di sequenziamento dalle schermate è un'attività non banale, date le dimensioni e la diversità di questi set di dati. Una volta che le letture della sequenza sono state allineate e normalizzate, sono disponibili diversi strumenti bioinformatici per facilitare la valutazione delle prestazioni dello schermo (Figura 3) e l'identificazione dei risultati (Figura 4). BAGEL è descritto in questo protocollo come lo strumento chiave per l'analisi dei dati. BAGEL utilizza un quadro bayesiano per confrontare le distribuzioni di set di geni essenziali e non essenziali noti con il cambiamento di piegatura delle guide che prendono di mira un gene. Questo metodo è descritto in dettaglio in Hart et al3. Oltre a BAGEL, possono essere utilizzati anche altri algoritmi progettati per identificare gli sgRNA arricchiti e impoveriti, come MAGeCK25. Per gli schermi di farmaci, si consiglia di utilizzare l'algoritmo Drug per identificare sia le interazioni genetiche chimiche sinergiche che soppressori. Il farmaco è stato progettato per confrontare l'abbondanza relativa di sgRNA in una popolazione trattata con l'abbondanza relativa di sgRNA in una popolazione non trattata allo stesso tempopunto 20.
Una limitazione degli schermi CRISPR è che Cas9 non sempre porta ad un knock-out, in quanto c'è sempre la possibilità che gli indel creati siano mutazioni in-frame, lasciando intatta la funzione genica13. Ciò si traduce in una popolazione mista, rendendo lo schermo "rumoroso" e l'interpretazione dei dati impegnativi. L'utilizzo di più sgRNA indipendenti mirati a un gene può costruire ridondanza, riducendo l'effetto degli sgRNA a bassa attività. Un ulteriore avvertimento agli studi CRISPR è l'effetto delle rotture doppie filamenti create dalla nucleasi Di Cas9, che può portare a letalità cellulare indipendente dal gene preso di mira. Questo effetto anti-proliferativo aumenta con il numero di copia del sito di destinazione, portando a false identificazioni positive dei geni all'interno di regioni altamente amplificate26. Sono stati sviluppati metodi computazionali come CERES per correggere gli effetti del numero di copia27. Questi flussi di lavoro considerano l'effetto del numero di copie per stimare i livelli di dipendenza genica nelle schermate di essentialità basate su knock-out. Un attento esame delle posizioni genomiche dei geni colpiti nelle regioni amplificate può aiutare a determinare i falsi positivi dovuti alla molteplicità degli effetti di taglio13. Le schermate principali possono identificare solo potenziali hit. È importante seguire con uno schermo secondario o un protocollo per convalidare i colpi e distinguere sul bersaglio dagli effetti fuori bersaglio, diserbando i falsi positivi e assicurando che i geni che hanno ottenuto un punteggio debolmente a causa di perturbazioni inefficaci non siano lasciati indietro come falsi negativi23.
Questo protocollo si concentra su approcci di screening basati sulla vitalità, in cui la condizione di studio dovrebbe portare a un difetto di proliferazione o alla morte delle cellule. Per i processi che non portano a un cambiamento nella vitalità cellulare, il metodo di screening in pool basato sulla vitalità può essere restrittivo. Un'alternativa consiste nell'eseguire schermi utilizzando i saggi dei reporter o dei marcatori e l'arricchimento mediante approcci FACS (Active Cell Sorting) a fluorescenza. Nelle schermate di selezione basate su marcatori, il fenotipo si basa su mutazioni che regolano l'espressione genica del marcatore piuttosto che sulla salute cellulare13,23. Formati di GAMMA RIN sono disponibili anche per uno gene per lo screening di pozzi. I formati disposti sono più suscettibili alle letture complesse o basate su microscopia. Tuttavia, i formati disposti richiedono apparecchiature automatizzate e grandi quantità di reagenti28.
Il protocollo di screening qui discusso utilizza S. pyogenes Cas9 nuclease per creare alleli nulli, che è il più utilizzato per gli schermi genetici e per i quali sono disponibili molte librerie (Addgene: Pooled Libraries). Sono disponibili anche opzioni alternative alle librerie knock-out, che utilizzano una dCas9 cataliticamente morta con proteine modificatori di cromatina per inibire (CRISPRi) o attivare la trascrizione (CRISPRa) dei geni. Simile all'RNAi, CRISPRi offre la capacità di studiare gli effetti fenotipici a diverse dosi geniche e geni essenziali che non possono tollerare l'eliminazione completa, mentre CRISPRa può essere utilizzato per eseguire schermi di guadagno di funzione. Ognuna di queste tecnologie ha i loro vantaggi, ma in generale, l'approccio knock-out CRISPR è il più sviluppato. È stato dimostrato che funziona bene con basso rumore, effetti minimi fuori bersaglio e consistenza sperimentale, in particolare negli schermi genici essenziali basati sulla letalità, rispetto agli approcci knock-down che utilizzano sia CRISPRi che shRNA5. Nonostante la sua ampia applicabilità fino ad oggi, la tecnologia di screening CRISPR rimane nelle sue fasi iniziali. Nuovi utensili continuano ad essere costruiti con i componenti di base di CRISPR. Queste includono strategie combinatorie di editing genico che possono colpire più loci genomici, ottimizzazione degli enzimi cas ortogonali e modifiche con domini funzionali della cromatina per diversificare le attività di Cas9. Mentre la tecnologia CRISPR continua a crescere, il suo accoppiamento agli approcci di screening genetico servirà come una potente piattaforma per la scoperta funzionale nella genetica.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da Genome Canada, Ontario Research Fund e Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
References
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