Summary
Metodo per valutare l'impatto della formazione sulle capacità motorie è uno strumento utile. Sfortunatamente, la maggior parte delle valutazioni comportamentali può essere laboriosa e/o costosa. Descriviamo qui un metodo robotico per valutare la prensione (reach-to-grasp) abilità nei topi.
Abstract
Descriviamo un metodo per introdurre topi ingenui a un nuovo compito di prensione (reach-to-grasp). I topi sono alloggiati in gabbie con una fessura frontale che permette al mouse di uscire dalla sua gabbia e recuperare pellet di cibo. La restrizione alimentare minima viene utilizzata per incoraggiare i topi a eseguire il recupero del cibo dalla fessura. Quando i topi iniziano ad associarsi arrivando alla fessura per il cibo, i pellet vengono tirati via manualmente per stimolare l'estensione e la pronazione della zampa per afferrare e recuperare il pellet attraverso lo slot frontale. Quando i topi iniziano a raggiungere i pellet quando arrivano allo slot, il saggio comportamentale può essere eseguito misurando la velocità con cui riescono a cogliere e recuperare il pellet desiderato. Vengono poi introdotti in un auto-addestratore che automatizza sia il processo di fornitura di pellet alimentari per il mouse da afferrare, sia la registrazione di tentativi di raggiungere e afferrare riusciti e non riusciti. Ciò consente la raccolta di dati di raggiungimento per più topi con il minimo sforzo, da utilizzare nell'analisi sperimentale a seconda dei casi.
Introduction
I metodi per testare sperimentalmente un'abilità motoria lesioni pre e post-neurologiche, nonché modulare la tempistica, la quantità e il tipo di allenamento motorio sono importanti per la ricerca traslazionale. Nell'ultimo decennio, i topi, a causa della conseguente facilità di manipolazione genetica, sono diventati un sistema modello popolare in cui chiarire i meccanismi dell'apprendimento motorio pre e post-lesione. Tuttavia, i saggi comportamentali nei topi non sono stati ottimizzati nello stesso modo in cui tali saggi sono stati per altri mammiferi (soprattutto ratti). Inoltre, ci sono importanti differenze tra il comportamento di un topo e un ratto che suggeriscono fortemente l'addestramento delle due specie in modi diversi1,2.
Abili movimenti prensile utilizzano una mano / zampa per posizionare il cibo in bocca, per manipolare un oggetto, o per utilizzare uno strumento. Infatti, raggiungere a cogliere vari oggetti nella vita quotidiana è una funzione fondamentale degli arti superiori e l'atto reach-to-eat è una forma di prensione che molti mammiferi usano. Molti dei cambiamenti genetici, fisiologici e anatomici alla base dell'acquisizione delle abilità prensili sono stati ben definiti nel campo3. Nel tradurre i risultati preclinici in esiti clinici, è necessario un test pertinente che sia efficiente e riproducibile. Studi sui roditori e sulla portata umana dimostrano che il comportamento della prensione è simile negli esseri umani e negli animali4. Di conseguenza, queste somiglianze suggeriscono che i test di prehension possono servire come modello traslazionale per studiare l'apprendimento motorio, nonché i menomazioni e i trattamenti della malattia umana. Pertanto, la valutazione della prehension nei topi può offrire un potente strumento nella ricerca traslazionale che studia sia la salute che la malattiaafferma 4.
Purtroppo, il compito di prehension nei topi, anche per un ambiente di laboratorio su piccola scala, può essere laborioso e dispendioso in termini di tempo. Per risolvere questo problema, descriviamo qui una versione automatizzata dell'attività di prehension. Il compito descritto richiede ai topi di estendere una singola zampa attraverso la fessura frontale della gabbia di casa del topo, far promettere la zampa estesa, afferrare la ricompensa del pellet alimentare e tirare il pellet all'interno della gabbia per il consumo. I dati risultanti vengono presentati come un successo di prehension o un fallimento. Questa automazione registra con successo i dati e riduce l'onere e il tempo con cui i ricercatori devono impegnarsi il compito.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'ACUC (Animal Care and Use Committee) della Johns Hopkins University.
1. Preparazione delle gabbie per topi per l'uso
- Creare un'apertura scanalata con dimensioni di 0,8 cm di larghezza e 7 cm di altezza dalla base all'estremità anteriore di ogni gabbia, come illustrato nella Figura 1. Questa fessura serve come l'apertura attraverso la quale l'animale raggiungerà.
NOTA: l'auto-formatore è stato progettato per l'uso con le dimensioni standard della gabbia del mouse (come mostrato nella Figura 1) fornite dalla maggior parte dei fornitori di forniture di ricerca animale. Inoltre, l'auto-trainer sosterrà facilmente altri tipi di gabbie. - All'interno di ogni singola gabbia, aggiungere una piattaforma adiacente allo slot per consentire ai topi di stare in piedi e raggiungere i pellet presentati. Assicurarsi che la piattaforma si trovi sopra il pavimento della lettiera della gabbia, circa 3 cm di altezza. Utilizzare piatti Petri apposti con supercolla e concappucciato da una lamiera di circa 10 cm x 15 cm, tuttavia, qualsiasi superficie piana abbastanza grande per un mouse in piedi per raggiungere da sarà sufficiente.
- Creare una tacca verticale attraverso il centro della parte anteriore della gabbia misura 0,8 cm di diametro e 7 cm di altezza che permetterà al mouse di raggiungere la zampa fuori dalla gabbia.
- Da un sottile foglio di metallo, (spesso circa 2 mm) tagliare un cancello gabbia in rettangoli di misura 5 cm x 10 cm per servire come un'apertura uniforme attraverso la quale l'animale deve raggiungere.
NOTA: I topi possono masticare gabbie di plastica che cambierebbero le dimensioni dell'apertura. Il mouse raggiungerà questo slot di 0,8 cm quando il cancello della gabbia metallica viene posizionato sopra l'apertura scanalata della gabbia durante i test con nastro, mantenendo la larghezza effettiva dello slot tra le gabbie. - Coprire lo slot di ogni gabbia con del nastro adesivo quando il suo mouse non è in fase di test per evitare che la lettiera venga espulsa dalla gabbia.
2. Introdurre i topi al movimento di raggiungimento
- Registrare il peso iniziale di ogni mouse e calcolare l'85% di quel valore per trovare il peso obiettivo, arrotondando fino a 20 g se il risultato è inferiore. Dare loro un regime di alimentazione per portarli a e poi mantenere questo peso obiettivo.
- Dare a ogni topo 2,5 g di pellet il primo giorno e notare qualsiasi cambiamento nel loro peso 24 h più tardi.
NOTA: Pesare i topi una volta al giorno e aspettarsi un calo di peso di 0,25-1 g al giorno. - Modificare l'alimentazione giornaliera di ogni mouse come richiesto, in base a questa modifica iniziale e cambiamenti in corso nel peso di ogni mouse, al fine di indurre una perdita di peso graduale (meno di 0,8 g persi al giorno) e quindi mantenere il peso obiettivo risultante. Variare da tre a sei 500 pellet mg (1,5 a 3,0 g) al giorno per essere efficace.
NOTA: I topi rimangono su questa dieta per mantenere il loro peso obiettivo per tutto il protocollo.
- Dare a ogni topo 2,5 g di pellet il primo giorno e notare qualsiasi cambiamento nel loro peso 24 h più tardi.
- Quando un topo ha raggiunto il suo peso obiettivo, introdurre ogni mouse al concetto di venire fino alla fessura gated per un pellet alimentare supplementare. Avviare una sessione di allenamento posizionando un pellet da 45 mg sulla superficie del pellet, direttamente davanti allo slot, e consentire a ogni mouse di recuperarlo. La maggior parte dei topi prenderà a questa disposizione di alimentazione entro 1-2 giorni.
- Una volta che il mouse associa uno slot aperto con l'essere nutriti, incoraggiali a raggiungere con una zampa, piuttosto che con la bocca.
NOTA: Questo è il passo più complesso, prendendo 1-2 giorni, e instillare comportamento controproducente nei topi per errore è molto facile; si prega di fare riferimento alla sezione di discussione per ulteriori informazioni e consigli.- Utilizzando una coppia di pinzette, tenere un pellet nella stessa posizione in cui il mouse ha recuperato pellet in precedenza. Mentre il mouse inizia a mordere per il pellet, tirarlo via circa mezzo centimetro in modo che il pellet sia fuori dalla portata della sua bocca.
NOTA: Un mouse al suo peso obiettivo tenterà di recuperare il pellet fuori portata. Ogni volta che il mouse estende una zampa attraverso lo slot, rinforza quel comportamento permettendogli di mangiare il pellet. Alcuni topi possono presentare una preferenza per una zampa rispetto all'altra quando si estendono per il cibo. - Anche se non strumentale alla sperimentazione, registrare se la zampa sinistra o destra è preferito. Questo può potenzialmente consentire più alti tassi di successo complessivi nel saggio comportamentale; in alternativa, eliminare una variabile forzando ogni mouse a raggiungere con la stessa zampa.
NOTA: Si ottengono risultati migliori se i topi utilizzano la zampa preferita. - Mentre ogni topo associa l'estensione di una zampa con il mangiare un pellet, rafforza ulteriormente quel comportamento trattenendo il pellet in risposta ai tentativi di recuperare il pellet con la bocca e la lingua. I topi inizieranno a rispettare questa disposizione per oltre 2 o 3 giorni.
- Finalizzare l'introduzione del comportamento di raggiungimento della zampa desiderata posizionando il pellet da 45 mg poco meno di 1 cm dal bordo esterno del cancello della gabbia, in modo che il punto più a sinistra o a destra del pellet (sia a destra che a sinistra della fessura della gabbia dello sperimentatore 's prospettiva, rispettivamente) è tangente a una linea che si estende direttamente dal bordo dello slot del cancello gabbia. Consentire al mouse di tentare di recuperare il pellet, essendo vigile per rimuovere il pellet e impedirne il consumo se il mouse deve tentare con un altro metodo diverso dall'estensione della zampa.
NOTA: Quando un mouse estende costantemente una zampa per afferrare ed è in grado di toccare il pellet fornito, è pronto per il test utilizzando l'auto-trainer descritto di seguito e il test comportamentale associato. Il tempo che intersede inuneoso fino alla preparazione varia tra i topi; se ci sono sbandati che richiedono più di due settimane per capire, dovrebbero essere esclusi dal set di dati.
- Utilizzando una coppia di pinzette, tenere un pellet nella stessa posizione in cui il mouse ha recuperato pellet in precedenza. Mentre il mouse inizia a mordere per il pellet, tirarlo via circa mezzo centimetro in modo che il pellet sia fuori dalla portata della sua bocca.
3. Utilizzando l'auto-trainer
NOTA: Vedere la figura 1-3 e la sezione di discussione per una descrizione completa dell'hardware, del software e delle azioni fisiche del formatore automatico.
- Preparati per la sessione di allenamento.
- Calibrare il sensore di pellet esca. Fare clic sulla freccia Esegui nell'interfaccia LabVIEW e notare il sensore di pellet esca che legge sia con che senza pellet. Fare clic sul pulsante Interrompi per interrompere l'esecuzione del test e modificare la destinazione del sensore bait pellet su un valore tra queste due letture (Figura 3 e Tabella 2). La maggior parte delle condizioni di illuminazione fornisce una lettura compresa tra 1 e 4.
- Posizionare la gabbia del mouse modificata sull'auto-addestratore (Figura 2). Apporre il cancello della gabbia ( Figura 1) e allineare il pellet al bordo dello slot come nella procedura manuale.
- Eseguire la sessione di formazione del mouse utilizzando l'interfaccia LabVIEW.
- Immettere le informazioni necessarie per registrare i dati relativi alla sessione di formazione (Figura 3 e Tabella 2).
- Fare clic sul campo ID mouse e digitare il nome di file di ogni sessione di allenamento utilizzando la tastiera del computer.
- Fare clic sul campo Pellet totali da erogare durante la routine per controllare il numero di pellet erogati per un singolo esperimento (in genere 20 - 30). A tale scopo, fare clic sulle frecce su e giù o immettere il numero utilizzando la tastiera del computer.
- Fare clic sul campo Pausa dopo il numero di Pellet per impostare una pausa di 5 s dopo che il pellet indicato è stato rimosso dal diving board. A tale scopo, fare clic sulle frecce su e giù o immettere il numero utilizzando la tastiera del computer.
- Fare clic sul campo Lunghezza pausa per impostare una pausa tra il momento in cui un pellet viene rimosso dal diving board e il momento in cui viene erogato un nuovo pellet. A tale scopo, fare clic sulle frecce su e giù o immettere il numero utilizzando la tastiera del computer
NOTA: In genere 1 s è un tempo di pausa appropriato. Se i topi sono ansiosi dopo che ogni pellet è erogato, si consiglia di aumentare la lunghezza della pausa utilizzando il campo Lunghezza pausa a 5 s. - Registrare manualmente la distanza alla quale il pellet viene posizionato nel campo Distanza di raggiungimento. A tale scopo, fare clic sulle frecce su e giù o immettere il numero utilizzando la tastiera del computer
NOTA: la dimensione degli array di accelerazione e tempo viene esposta a scopo di debug e può essere ignorata. - Fare clic sul campo Cartella da contenere registri per selezionare il percorso del file in cui salvare i dati raccolti.
- Una volta compilati i campi delle informazioni, fare clic sul pulsante Esegui per avviare la sessione di formazione. L'auto-allenatore eroga singoli pellet e traccia se cadono attraverso l'imbuto fino a quando il numero totale di pellet è stato erogato, e l'ultimo pellet è stato recuperato o caduto dal mouse. Il programma si fermerà automaticamente a questo punto. Se necessario, può anche essere fermato prematuramente facendo clic sul pulsante Stop.
- Una volta che il software è impostato, posizionare la gabbia di casa del mouse da testare sul piedistallo e osservare il mouse in modo da poter valutare se il mouse ha effettivamente imparato a tentare il nuovo comportamento di raggiungimento richiesto nuovo raggiungimento. Dopo aver fatto clic sul pulsante Esegui, consentire al mouse di esaminare lo slot e il nuovo ambiente sconosciuto.
NOTA: Simile all'introduzione di topi al concetto di raggiungere, si aspettano che alcuni topi siano più conformi di altri. I topi che hanno afferrato il concetto dovrebbero cercare di raggiungere entro 5-10 min e associeranno il movimento dell'auto-allenatore con il pellet presentato, come quando associano una fessura scoperta con il cibo nelle fasi iniziali di questo protocollo.
- Immettere le informazioni necessarie per registrare i dati relativi alla sessione di formazione (Figura 3 e Tabella 2).
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Representative Results
In generale, si consiglia di che ogni sessione di formazione consista in circa 20-30 prove, che possono essere impostate dall'utente, eseguite automaticamente dal formatore automatico e salvate in un unico file di registro per sessione e mouse. Ogni prova può essere eseguita consecutivamente, subito dopo l'altra, con 2-5 s di pausa. I topi formati sull'auto-formatore mostrano un aumento delle abilità in 10 sessioni di allenamento.
Per confrontare manualmente l'utilità dell'auto-trainer con la formazione manuale (considerato il gold-standard), abbiamo addestrato i topi adulti C57bl/6 di età compresa tra 100 e 140 giorni e utilizzando l'auto-trainer. Tutte le manipolazioni e l'uso degli animali sono state eseguite secondo e con l'approvazione del Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. I topi addestrati con l'auto-allenatore hanno imparato il compito di prensione e mostrano un chiaro aumento delle abilità motorie (Figura 4). Questo aumento di abilità è simile a quello visto quando l'animale viene addestrato manualmente senza l'uso del formatore automatico (Figura 4). Per questi dati, la prehension manuale è stata valutata come un successo quando il topo ha raggiunto il suo artiglio anteriore attraverso la fessura, ha afferrato il pellet e l'ha mangiato senza buttarlo fuori dal suo spazio di riposo, facendolo cadere, o in qualsiasi altro modo perdendo il controllo. La percentuale di tentativi di prehension riusciti è stata determinata per pellet. Un blocco di allenamento consisteva di 30 pellet ad una distanza di 1 cm con ogni pellet presentato uno alla volta. I topi addestrati sull'auto-addestratore sono stati addestrati in base al protocollo sopra descritto. Ogni punto della Figura 4 rappresenta un giorno di formazione durante il quale gli animali hanno raggiunto 30 pellet e rappresentato graficamente come %corretto. Non vi era alcuna differenza statistica tra le due righe utilizzando un test t non parametrico con correzione per confronti multipli.
Figura 1: Immagini di esempio della gabbia di casa. (A) Vista a volo d'uccello di una gabbia domestica standard modificata con la piattaforma (arancione) e fessura sulla parte anteriore della gabbia. (B) Vista anteriore di una gabbia domestica modificata con un'apertura scanalata con circa 0,8 cm x 7cm. (D, )porta gabbia posto davanti alla fessura per servire come un'apertura uniforme attraverso la quale il mouse deve raggiungere; frontale (D) e oblique (E) viste fornite. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Immagini di Auto-Trainer. (A, B) Nella foto ci sono l'auto-formatore senza (A) o con (B) una gabbia di topo modificata sul posto. (C-J) Vedute dettagliate del design del portapelle alimentari della scheda subacquea viste dalla parte anteriore (C,D,H,I) o laterali (E,F,G,J), con (D,E,F,I) o senza (C,G,H,J) un pellet di cibo. Si noti che la distanza del pellet dall'animale può essere facilmente modificata in quanto la distanza della gabbia dal trampolino è modificabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : screenshot del software. Screenshot del programma utilizzato per eseguire il formatore automatico. L'immagine mostra i campi di input importanti descritti nel protocollo. Vedere la tabella 2 per ulteriori informazioni sulla descrizione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Dati dei rappresentanti. La prensione qualificata aumenta a un livello di livello plateauriato simile utilizzando sia paradigmi di auto-formatore che di addestramento manuale. La trama mostra il successo della reach-to-grasp (media : / - SEM; manuale: grigio, n - 14; auto-addestratore: nero, n - 15). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| passo | Durata stimata (in giorni) | commento |
| 2.1 Perdita di peso | Da 3 a 5 | A seconda del peso intial e, quindi, quanto peso perdere fino all'obiettivo |
| 2.2 Formazione con slot | 1 | I topi imparano a sentirsi accomunabili avvicinandosi alla fessura aperta per il cibo |
| 2.3 Shaping | Da 4 a 8 | |
| 2.3.1 Uso delle zampe | 1 | Il successo qui dipende dal fornire rapidamente il pellet dopo il topo, negato il suo cibo, zampe per il pellet. |
| 2.3.2 Preferenza zampa | 1 | Verificare se il mouse preferisce la zampa sinistra o destra. |
| 2.3.3 Riduzione dell'uso di zampa difettosa | Da 2 a 3 | Come nel passaggio precedente, è fondamentale impedire il recupero con la bocca e la lingua. |
| 2.3.4 Pinzette | 1 | Alcuni topi inciamperanno a prendere il pellet da soli piuttosto che dalle pinzette, dar loro da mangiare un po 'meno |
| 3. Formazione automatica | Da 10 a 15 anni | Giorni fino all'asontote. |
Tabella 1: Orario di formazione del mouse utilizzando l'auto-trainer.
| CAMPO DI IMMISSIONE | usare |
| ID mouse | Immettere il nome file con cui verranno salvati i dati raccolti. |
| Pellet totali da dispensare durante la routine | Immettere il numero totale di pellet che verranno erogati durante la sessione di allenamento. |
| Pausa dopo il numero pellet | Funzione deprecata. Può essere utilizzato per mettere in pausa la sessione di allenamento dopo l'erogazione del pellet specificato. |
| Lunghezza pausa (s) | Durata della pausa. |
| Distanza di raggiungimento (mm) | Registrare la distanza superiore al minimo su cui il mouse deve raggiungere per recuperare il pellet. per impostazione predefinita, zero. |
| Dimensioni degli accelerometri e delle matrici temporali | Funzione esposta a scopo di debug. Mantenere il valore predefinito 500. |
| Cartella in cui contenere i registri | Fare clic sull'icona della cartella per scegliere dove salvare i dati raccolti. |
| Nome del dispositivo | Funzione LabVIEW che collega l'hardware al software. Il valore predefinito è Dev1. A seconda delle connessioni USB, l'hardware potrebbe essere visualizzato nel menu a discesa sotto un altro numero; scegliere i dispositivi fino a quando uno funziona. |
| Pulsante freccia, in alto a sinistra | Fare clic per eseguire il programma, sia per una sessione di allenamento che per la calibrazione. |
| Pulsante Di scalo a segno, in alto a sinistra | Arrestare il programma prematuramente. |
Tabella 2: Interfaccia software.
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Discussion
Il nostro auto-trainer valuta la comprensione degli arti anteriori (prensioni) in modo automatizzato. Per raggiungere questo endpoint, molti dei parametri progettati per l'attività di prensione del mouse, tra cui il posizionamento del pellet, le dimensioni del pellet e i criteri di allenamento, sono stati iterati nel corso di diversi anni e adattati dai protocolli precedenti2,5 ,6. Il progresso qui è l'automazione del compito utilizzando un robot che permette alloggiamento gabbia domestica. L'alloggiamento in gabbia domestica consente ai topi di rimanere calmi ed eseguire il compito con meno ansia. L'allenamento non-gabbia domestica è associato a un aumento dello stress che può portare ad un aumento del tempo e alla diminuzione della precisione7,8,9. Dimostriamo qui precisione simile ai nostri risultati con addestramento manuale casa-gabbia5,7,8. Anche se la formazione casa-gabbia esiste per il ratto10, a nostra conoscenza, questo è il primo auto-addestratore che sfrutta l'allenamento dei topi nella loro gabbia di casa.
Il nostro auto-trainer include una piattaforma regolabile su cui poggia una gabbia scanalata e può essere abbassata o sollevata all'altezza appropriata per l'allineamento con un supporto di pellet alimentare (noto anche come una tavola da immersione). Un sistema di erogazione del pellet colloca il pellet sul supporto della tavola da immersione. Il supporto pellet alimentare ha un assemblaggio del sensore di pellet esca costituito da un sensore di oggetto riflettente per rilevare se un pellet alimentare è presente o meno sul supporto della scheda subacquea. A causa dei problemi di sensibilità alla luce, il sensore di oggetti riflettenti può essere calibrato durante l'installazione per adattarsi all'ambiente di illuminazione del laboratorio. La gabbia di ogni topo è posizionata sull'auto-addestratore in modo che il bordo interno del pellet sia in linea con il bordo esterno dello slot del cancello della gabbia, corrispondente al punto 2.3.4 della procedura manuale descritta sopra. Due sensori di pellet persi orientati in direzioni opposte in un imbuto sotto il portapelle tabellone del trampolino di immersione rilevano pellet che cadono. Uno dei vantaggi dell'impiego di due sensori di pellet persi è che garantisce un'elevata precisione di rilevamento per vari pellet alimentari di diverse dimensioni e forme. Entrambi i sensori di pellet persi sono costituiti da un foto-interrupter trasmissivo standard con un design attraverso foro, per rilevare il movimento di un pellet che cade senza richiedere il contatto.
Il software è costituito da un programma che esegue l'auto-formatore e raccoglie dati sui successi e fallimenti. L'input dell'utente è costituito dalla posizione del file in cui vengono registrati i dati, dal numero di pellet distribuiti in una sessione di allenamento, da un'opzione per sospendere la sessione di allenamento dopo l'erogazione di un particolare pellet, un campo per registrare la distanza aumentata (se presente) attraverso la quale il mouse deve raggiungere, e un campo per controllare la dimensione della matrice utilizzata nei calcoli del programma (che possono essere ignorati durante il normale utilizzo). Inoltre, il software consente all'utente di sintonizzare il sensore di oggetti riflettenti della scheda subacquea al fine di ricalibrare la sensibilità della luce in base alle esigenze. Un output di ogni prova viene visualizzato all'utente, nonché registrato e salvato in un file di registro per un successivo recupero.
Una singola prova consiste nel tempo trascorso in un singolo pellet alimentare sul trampolino fino a quando non viene rimosso dall'azione dal mouse. Se un pellet lascia il diving board come determinato dal sensore di pellet e il pellet viene rilevato cadendo attraverso l'imbuto poco dopo da uno dei sensori di pellet persi, viene registrato come una prova non riuscita dal software. Se il sensore di pellet esca determina che il pellet lascia il trampolino di immersione, ma nessun oggetto che cade viene rilevato da uno dei sensori di pellet persi, si presume che sia stato tirato nella gabbia dal mouse e venga conteggiato come una prova di successo.
Questa formulazione viene utilizzata perché è utile progettare un saggio comportamentale in cui l'attività da eseguire direttamente, anziché indirettamente, fornisce la ricompensa. In questo modo, non c'è ambiguità da parte dell'animale su quale sia il compito (ad esempio, essere affamati, individuare il cibo, prendere cibo, mangiare cibo). Tra i molti compiti che utilizzano un tale paradigma, il compito di prehension è diventato molto popolare per tali valutazioni. Il compito richiede semplicemente che un animale usi un singolo arto per raggiungere e afferrare un singolo alimento, che l'animale porta successivamente in bocca per il consumo. L'attività di prehension valuta un comportamento che è molto simile a un comportamento quotidiano utilizzato da molti mammiferi. Ancora più importante, il compito di prehension assomiglia al comportamento motorio umano4. Questa generalizzabilità aumenta l'aspettativa che i principi derivati dalla valutazione preclinica del comportamento siano clinicamente applicabili negli stati della malattia. Ad esempio, le compromissione nell'uso qualificato degli arti anteriori e delle mani sono riscontrate nell'ictus, nella Malattia di Huntington, nel morbo di Parkinson e nella sclerosi multipla. Così, modellando deficit comportamentali e recupero successivo nei topi è inestimabile per comprendere il recupero umano e come potrebbe essere incoraggiato2,11,12,13.
Molti aspetti dell'auto-formatore proposto qui beneficiano notevolmente il processo di ricerca. In primo luogo, la maggior parte dei saggi comportamentali richiedono uno sperimentatore per addestrare e monitorare da vicino le sessioni quotidiane, che possono essere costose, laboriose e proibitive e che richiedono molto tempo. Il nostro auto-trainer consente di raccogliere dati comportamentali indipendentemente da uno sperimentatore. In secondo luogo, il nostro auto-addestratore può essere replicato per consentire a più topi di essere addestrati e valutati in modo oggettivo, efficiente e simultaneo, riducendo così al minimo il tempo e lo sforzo. In terzo luogo, il basso costo del formatore automatico consente la replica e l'uso simultaneo di più auto-addestratori per test su larga scala ed efficienti.
Va notato che il punto critico che richiede un'attenta supervisione è durante la fase di modellazione della formazione. In particolare, la debolezza principale di questo protocollo è il rischio che un cattivo uso si fissi su alcuni topi11. Il protocollo mira a imitare i test come il test del gradino della scala in quanto il successo nel compito fornisce la ricompensa. Tuttavia, il compito stesso deve ancora essere insegnato ai topi nel passaggio 2.3 del protocollo, a differenza del test di gradino della scala. Il concetto più probabile che possa far inciampare un topo nell'apprendere questo compito è dall'estensione di una zampa fuori dalla gabbia all'uso della zampa per afferrare effettivamente il pellet. Nella prima sessione della fase 2.3.1, i topi dovrebbero essere ricompensati semplicemente per aver eseguito una zampa fuori dalla loro gabbia. Tuttavia, nei giorni successivi, gli investigatori dovrebbero fare attenzione a premiare i topi meno per estendere solo la zampa e più per estendere la zampa e toccare il pellet, come descriviamo al punto 2.3.3.
Si prega di notare che circa il 5% dei topi non riuscirà a progredire oltre questa fase, in genere a causa dell'estensione limitata delle loro cifre per tirare nel pellet alimentare. Tali topi falliranno con una o entrambe le zampe con poca considerazione della posizione effettiva del pellet, fornendo pochi o nessun dato utile. Per ridurre al minimo il potenziale di guasto di un mouse in questa fase, è fortemente consigliato quando si allontana il pellet con le pinzette durante il processo di apprendimento. In particolare, il topo dovrebbe essere ricompensato con il cibo non solo quando si estende una zampa, ma anche quando quella zampa afferra il pellet e applica abbastanza forza sufficiente per la soddisfazione dell'investigatore. Un rischio simile al potenziale fallimento in questa fase è rappresentato dai topi che usano la lingua per leccare i pellet verso di loro. Quando si allenano i topi che tendono a leccare, posizionare il pellet più lateralmente lontano dalla fessura. I topi avranno difficoltà a raggiungere con la lingua su una distanza laterale maggiore, ma la gamma di movimento del braccio e della zampa sono più in grado di chiudere la distanza.
Il protocollo descritto viene facilmente esteso a diversi ambienti lab o a diversi metodi di raccolta dei dati. L'auto-formatore, ad esempio, è molto utile come dispositivo di risparmio di manodopera, ma non è strettamente necessario per la raccolta dei dati, in quanto i pellet possono essere forniti e i successi/fallimenti possono essere registrati a mano. Le singole coperture possono anche essere classificate in base a informazioni più dettagliate rispetto al semplice successo/fallimento, ad esempio considerando l'angolo di avvicinamento di ogni topo, il numero di tentativi di raggiungimento che non toccano il pellet, o la meccanica del recupero che ha ricevuto maggiore attenzione negli ultimi anni14. La capacità dell'animale di recuperare un pellet è solo una misura. Utilizzando hardware aggiuntivo, saremo anche in grado di misurare la velocità, l'angolo e la traiettoria dei movimenti degli arti dell'animale. Questa cinematica è un aspetto importante dell'apprendimento motorio sia prima che dopo una lesione neurologica. A tal fine, stiamo attualmente incorporando vari nuovi mezzi per analizzare la locomozione e la cinematica dell'azione di presa del mouse. Stiamo esplorando l'utilizzo di telecamere ad alta velocità per ottenere misurazioni cinematiche della presa e l'attaccamento di trasduttori di pressione e accelerometri al supporto pellet alimentare per misurare i dati di forza e massa associati alla presa. Queste nuove funzionalità miglioreranno la funzionalità dell'auto-addestratore per raccogliere dati significativi superato un semplice passaggio o non riuscire prova e contribuire a illustrare l'andatura della presa del mouse attraverso la progressione della malattia. In futuro, utilizzeremo l'attività di prensione assistita robot come piattaforma per valutare il tipo, la dose e la tempistica della riabilitazione dopo un infortunio neurologico. Andando avanti, continueremo a migliorare il compito, con perfezionamenti per aiutare a ridurre i comportamenti errati e migliorare il tasso di acquisizione delle attività e il tempo di formazione.
In sintesi, abbiamo sviluppato un nuovo auto-addestratore per valutare l'abilità di prensioni superiori agli arti anteriori nei topi. Il compito richiede ai topi di raggiungere la zampa attraverso una scivolata, afferrare un piccolo pellet di cibo e tirare il pellet nella direzione del loro corpo in modo che possano mangiare il pellet. L'impostazione dell'attività è vincolata meccanicamente per garantire l'utilizzo dominante delle zampe. I mouse possono essere addestrati rapidamente e simultaneamente, con solo il processo di modellazione che richiede l'input manuale. Il test può essere somministrato in modo efficiente e analizzato automaticamente. Questo saggio comportamentale ad alta produttività quantifica il tasso di successo ed è facilmente modificabile per l'analisi futura della cinematica e delle dinamiche di forza.
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Disclosures
Dan Tasch e Uri Tasch di Step Analysis, LLC ha prodotto un dispositivo auto-trainer con il pagamento di Richard J. O'Brien e Steven R.
Acknowledgments
Il dispositivo di allenamento automatico è stato costruito da Jason Dunthorn, Uri Tasch e Dan Tasch presso Step Analysis, LLC, con il supporto di input di progettazione e le istruzioni fornite da Robert Hubbard, Richard O'Brien, e Steven .
Teresa Duarte del Centro Champalimaud per l'Ignoto ha fornito preziose informazioni e idee su come descrivere e classificare le azioni del topo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABS Filament | Custom 3D Printed | N/A | utilized for pellet holder, frame, arm and funnel |
| ABS Sheet | McMaster-Carr | 8586K581 | 3/8" thickness; used for platform compononents, positioning stand guides and base |
| Adruino Mini | Adruino | A000087 | nano version also compatiable as well as other similar microcontrollers |
| Bench-Top Adjustable-Height Positioning Stand | McMaster-Carr | 9967T43 | 35 lbs. load capacity |
| Clear Acrylic Round Tube | McMaster-Carr | 8532K14 | ID 3/8" |
| Low-Carbon Steel Wire | McMaster-Carr | 8855K14 | 0.148" diameter |
| Pellet Dispenser | Lafayette Instrument: Neuroscience | 80209-45 | with 45 mg interchangeable pellet size wheel and optional stand |
| Photointerrupter Breakout Board | SparkFun | BOB-09322 ROHS | designed for Sharp GP1A57HRJ00F |
| Reflective Object Sensor | Fairchild Semiconductor | QRD1113 | phototransistor output |
| Servo Motor | SparkFun | S8213 | generic metal gear (micro size) |
| Transmissive Photointerrupter | Sharp | GP1A57HRJ00F | gap: 10 mm, slit: 1.8 mm |
References
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