Summary
Método para avaliar o impacto do treinamento em habilidades motoras é uma ferramenta útil. Infelizmente, a maioria das avaliações comportamentais pode ser trabalhosa e/ou dispendiosa. Nós descrevemos aqui um método robótico de avaliar a habilidade do preensão (alcance-à-preensão) nos ratos.
Abstract
Nós descrevemos um método para introduzir ratos ingênuos a uma tarefa nova do preensão (alcance-à-preensão). Os ratos são alojados isoladamente em gaiolas com um slot frontal que permite que o mouse para alcançar fora de sua gaiola e recuperar pelotas de alimentos. Restrição alimentar mínima é empregada para incentivar os ratos a realizar a recuperação de alimentos a partir do slot. Como os ratos começam a associar vindo ao slot para o alimento, as pelotas são puxadas manualmente afastado para estimular a extensão e a pronação de sua pata para agarrar e recuperar a pelota através da ranhura frontal. Quando os ratos começam a chegar para as pelotas como eles chegam ao slot, o ensaio comportamental pode ser realizada através da medição da taxa em que eles agarram com sucesso e recuperar o pellet desejado. São introduzidos então a um auto-instrutor que automatiza o processo de fornecer pelotas do alimento para que o rato agarre, e a gravação de tentativas bem sucedidas e falhadas do alcance e do agarramento. Isso permite a coleta de dados de alcance para múltiplos camundongos com esforço mínimo, a ser utilizado na análise experimental, conforme apropriado.
Introduction
Métodos para testar experimentalmente uma habilidade motora pré e pós-lesão neurológica, bem como modulam o tempo, quantidade e tipo de treinamento motor são importantes para a pesquisa translacional. Ao longo da última década, os camundongos, por causa da facilidade de manipulação genética, tornaram-se um sistema de modelo popular para elucidar os mecanismos de aprendizagem motora pré e pós-lesão. No entanto, os ensaios comportamentais em camundongos não foram otimizados da mesma forma que tais ensaios foram para outros mamíferos (especialmente ratos). Além disso, há diferenças importantes entre o comportamento de um rato e um rato que sugerem fortemente treinar as duas espécies em diferentes maneiras1,2.
Os movimentos hábeis do preênsil usam uma mão/pata para coloc o alimento na boca, para manipular um objeto, ou para usar uma ferramenta. De fato, chegar a apreender vários objetos na vida cotidiana é uma função fundamental dos membros superiores e o ato de alcançar-comer é uma forma de prehensão que muitos mamíferos usam. Muitas das alterações genéticas, fisiológicas e anatômicas que sustentam a aquisição da habilidade preênsil têm sido bem definidas no campo3. Em traduzir resultados pré-clínicos aos resultados clínicos, um precisa um teste relevante que seja eficiente e reprodutível. Estudos de roedores e de alcance humano demonstram que o comportamento de prehensão é semelhante em humanos e em animais4. Conformemente, estas similaridades sugerem que o teste do preensão possa servir como um modelo translacional para investigar a aprendizagem do motor assim como os prejuízos e os tratamentos da doença humana. Portanto, avaliar a prehensão em camundongos pode oferecer uma ferramenta poderosa na pesquisa translacional estudando Estados de saúde e doença4.
Infelizmente, a tarefa do preensão nos ratos, mesmo para um ajuste de laboratório em pequena escala, pode ser trabalhoso e demorado. Para aliviar este problema, nós descrevemos aqui uma versão automatizada da tarefa do preensão. A tarefa descrita exige que os ratos estendam uma única pata através da ranhura frontal da gaiola do rato, pronação a pata estendida, agarre a recompensa da pelota do alimento, e puxe a pelota de volta ao interior da gaiola para o consumo. Os dados resultantes são apresentados como um sucesso ou uma falha do preensão. Essa automação registra com êxito os dados e reduz a carga e o tempo com que os pesquisadores devem engajar a tarefa.
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Protocol
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo ACUC (Comitê de cuidados e uso de animais) da Universidade Johns Hopkins.
1. preparando gaiolas do rato para o uso
- Criar uma abertura com fenda com dimensões de 0,8 cm de largura e 7 cm de altura a partir da base na extremidade dianteira de cada gaiola, como ilustrado na Figura 1. Este slot serve como a abertura através da qual o animal vai chegar.
Nota: o instrutor automático foi projetado para o uso com as dimensões padrão da gaiola do rato (como mostrado na Figura 1) fornecida pela maioria de vendedores da fonte da pesquisa animal. Mais, o auto-instrutor suportará facilmente outros gaiola-tipos. - Dentro de cada gaiola individual, adicione uma plataforma adjacente ao slot para permitir que os ratos fiquem de pé e alcancem as pelotas apresentadas. Certifique-se de que a plataforma está localizada acima do chão da maca da gaiola, aproximadamente 3 cm de altura. Use pratos de Petri afixados com super cola e tampado por uma folha de metal aproximadamente 10 cm x 15 cm, no entanto, qualquer superfície plana grande o suficiente para um mouse para ficar sobre a chegar a partir de será suficiente.
- Crie um entalhe vertical através do meio da parte dianteira da gaiola que mede 0,8 cm transversalmente e 7 cm de altura que permitirá que um rato alcangue sua pata fora da gaiola.
- A partir de uma fina folha de metal, (aproximadamente 2 mm de espessura) cortar uma porta gaiola em retângulos medindo 5 cm x 10 cm para servir como uma abertura uniforme através do qual o animal é para chegar.
Nota: os ratos podem mastigar em gaiolas plásticas que mudariam o tamanho da abertura. O rato alcançará através deste entalhe de 0,8 cm quando a porta metálica da gaiola é coloc sobre a abertura entalhado da gaiola durante o teste usando a fita, mantendo a largura eficaz da ranhura entre gaiolas. - Cubra o entalhe de cada gaiola com a fita quando seu rato não está sendo testado para impedir que a maca esteja expulsa da gaiola.
2. introdução de camundongos ao movimento de alcance
- Registre o peso inicial de cada mouse e calcule 85% desse valor para encontrar seu peso de meta, arredondando até 20 g se o resultado for menor. Dê-lhes um regime de alimentação para trazê-los e, em seguida, manter este peso objetivo.
- Dê a cada rato 2,5 g de Pelotas o primeiro dia e anote toda a mudança em seu peso 24 h mais tarde.
Nota: pesar os ratos uma vez por dia e esperar uma queda de peso de 0,25-1 g por dia. - Mude a alimentação diária de cada rato conforme necessário, com base nesta alteração inicial e nas alterações em curso no peso de cada rato, a fim de induzir a perda gradual de peso (menos de 0,8 g perdidos por dia) e, em seguida, manter o peso da meta resultante. Variar entre três a 6 500 mg pellets (1,5 a 3,0 g) por dia para ser eficaz.
Nota: os ratos permanecem nesta dieta para manter seu peso do objetivo durante todo o protocolo.
- Dê a cada rato 2,5 g de Pelotas o primeiro dia e anote toda a mudança em seu peso 24 h mais tarde.
- Quando um rato atingiu o seu peso objetivo, introduzir cada rato para o conceito de chegar até o slot fechado para uma pelota de alimentos complementares. Iniciar uma sessão de treinamento, colocando uma pelota 45 mg na superfície da pelota, diretamente na frente do slot, e permitir que cada mouse para recuperá-lo. A maioria de ratos tomarão a este arranjo de alimentação dentro de 1-2 dias.
- Uma vez que o rato associa um entalhe aberto com ser alimentado, incentive-os a alcangar com uma pata, um pouco do que a boca.
Nota: Este é o passo mais complexo, tendo 1-2 dias, e incutir comportamento contraproducente em camundongos por engano é muito fácil; consulte a secção de discussão para mais informações e aconselhamento.- Usando um par de pinças, segure um pellet na mesma posição que o mouse recuperou pelotas anteriormente. Como o rato começa a morder para a pelota, puxe-o afastado aproximadamente meio centímetro de tal forma que a pelota está fora do alcance de sua boca.
Observação: um mouse em seu peso objetivo tentará recuperar o pellet fora de alcance. Sempre que o mouse estende uma pata através do slot, reforçar esse comportamento, permitindo-lhe comer o pellet. Alguns camundongos podem apresentar uma preferência por uma pata sobre a outra quando se estende para o alimento. - Embora não seja instrumental para a experimentação, registre se a pata esquerda ou direita é preferida. Isso pode potencialmente permitir maiores taxas de sucesso global no ensaio comportamental; Alternativamente, elimine uma variável forçando cada rato a alcançar com a mesma pata.
Nota: melhores resultados são obtidos se os ratos usam sua pata preferida. - Como cada rato associa estendendo uma pata com comer uma pelota, reforça mais esse comportamento retendo a pelota em resposta às tentativas de recuperar a pelota com a boca e a lingüeta. Os ratos começarão a cumprir este arranjo sobre 2 a 3 dias.
- Finalize a introdução do comportamento de alcance da pata desejada, colocando o 45 mg pellet pouco menos de 1 cm da borda externa do portão da gaiola, de tal forma que o ponto mais à esquerda ou mais à direita da pelota (se é para a direita ou esquerda do slot gaiola do investigador , respectivamente) é tangente a uma linha que se estende diretamente da borda da ranhura do portão da gaiola. Permitir que o mouse para tentar recuperar o pellet, sendo vigilante para remover o pellet e evitar o seu consumo se o mouse deve tentar por algum outro método de extensão pata.
Nota: quando um rato estende consistentemente uma pata para agarrar e é capaz de tocar a pelota fornecida, está pronto para testar usando o auto-instrutor descrito abaixo e o ensaio comportamental associado. O tempo das introduções ingênuas a ser preparada variará entre ratos; Se houver retardatários que levam mais de duas semanas para entender, eles devem ser excluídos do conjunto de dados.
- Usando um par de pinças, segure um pellet na mesma posição que o mouse recuperou pelotas anteriormente. Como o rato começa a morder para a pelota, puxe-o afastado aproximadamente meio centímetro de tal forma que a pelota está fora do alcance de sua boca.
3. usando o instrutor automático
Observação: consulte a Figura 1-3 e a seção de discussão para obter uma descrição completa do hardware, do software e das ações físicas do instrutor automático.
- Prepare-se para a sessão de treinamento.
- Calibre o sensor da pelota da isca. Clique na seta Run na interface do LabVIEW e observe o sensor da pelota da isca lendo com e sem um pellet no lugar. Clique no botão parar para interromper essa execução de teste e alterar o alvo do sensor de pellet de isca para um valor entre essas duas leituras (Figura 3 e tabela 2). A maioria das condições de iluminação fornecem uma leitura entre 1 e 4.
- Coloque a gaiola do mouse modificada no instrutor automático (Figura 2). Fixe a porta da gaiola ( Figura 1) e alinhe a pelota à borda da ranhura como no procedimento manual.
- Execute a sessão de treinamento do mouse usando a interface do LabVIEW.
- Informações de entrada conforme necessário para registrar dados sobre a sessão de treinamento (Figura 3 e tabela 2).
- Clique no campo ID do mouse e digite o nome do arquivo de cada sessão de treinamento usando o teclado do computador.
- Clique no campo total de pelotas para dispensar durante a rotina para controlar quantas pelotas são dispensadas para um único experimento (geralmente 20-30). Para fazer isso, clique nas setas para cima e para baixo ou insira o número usando o teclado do computador.
- Clique no campo Pausar após o número da pelota para definir uma pausa de 5 s depois que a pelota indicada for removida da placa de mergulho. Para fazer isso, clique nas setas para cima e para baixo ou insira o número usando o teclado do computador.
- Clique no campo comprimento de pausa para definir uma pausa entre o momento em que um pellet é removido da placa de mergulho e o tempo que um novo pellet é dispensado. Para fazer isso, clique nas setas para cima e para baixo ou insira o número usando o teclado do computador
Nota: geralmente 1 s é um tempo de pausa apropriado. Se os ratos estão ansiosos após cada pellet é dispensado, é aconselhável aumentar o comprimento de pausa usando o campo de comprimento de pausa para 5 s. - Registre manualmente a distância na qual o pellet é colocado no campo distância do alcance . Para fazer isso, clique nas setas para cima e para baixo ou insira o número usando o teclado do computador
Observação: o tamanho das matrizes de aceleração e tempo é exposto para fins de depuração e pode ser ignorado. - Clique no campo pasta para conter logs para selecionar o local do arquivo para salvar os dados coletados.
- Depois que os campos de informações tiverem sido preenchidos, clique no botão executar para iniciar a sessão de treinamento. O instrutor automático distribuirá pelotas individuais e rastreará se eles caem através do funil até que o número total de pelotas tenha sido dispensado, e a última pelota tenha sido recuperada ou descartada pelo mouse. O programa irá parar automaticamente neste momento. Se necessário, ele também pode ser interrompido prematuramente clicando no botão parar .
- Uma vez que o software é configurado, coloque a casa-gaiola do mouse para ser testado no pedestal e observar o mouse para que você possa medir se o mouse tem realmente aprendeu a tentar o comportamento necessário romance atingindo. Depois de clicar no botão Run , permitir que o mouse para investigar o slot e seu novo, ambiente desconhecido.
Nota: semelhante ao quando a introdução de ratos para o conceito de alcançar, esperar alguns ratos para ser mais complacente do que outros. Camundongos que entenderam o conceito deve tentar chegar dentro de 5-10 min e irá associar o movimento do instrutor automático com o pellet apresentado, como quando eles associam um slot descoberto com alimentos nos estágios iniciais deste protocolo.
- Informações de entrada conforme necessário para registrar dados sobre a sessão de treinamento (Figura 3 e tabela 2).
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Representative Results
Em geral, é recomendável que cada sessão de treinamento consista em cerca de 20-30 tentativas, que podem ser definidas pelo usuário, executadas automaticamente pelo instrutor automático e salvas em um único arquivo de log por sessão e mouse. Cada teste pode ser executado consecutivamente, logo após o outro, com 2-5 s de pausa. Os ratos treinados no auto-instrutor exibem um aumento na habilidade sobre 10 sessões de treinamento.
Para comparar a utilidade do instrutor automático ao treinamento manual (considerado o ouro-padrão), nós treinamos os ratos masculinos adultos C57bl/6 envelhecidos 100 a 140 dias velhos manualmente e usando o auto-instrutor. Todos os manuseio e uso de animais foram realizados de acordo com e com a aprovação do Comitê de cuidados e uso de animais da Universidade Johns Hopkins. Os camundongos treinados com o instrutor automático aprenderam a tarefa de preensão e exibem um claro aumento na habilidade motora (Figura 4). Esse aumento de habilidade é semelhante ao observado quando o animal é treinado manualmente sem o uso do instrutor automático (Figura 4). Para estes dados, o preensão manual foi marcado como bem sucedido quando o rato alcançou seu membro torácico através da fenda, agarrou o pellet, e comeu-o sem derrubá-lo de seu espaço de descanso, soltando o, ou em toda a outra maneira que perde o controle. O percentual de tentativas bem-sucedidas de preensão foi determinado por pellet. Um bloco do treinamento consistiu em 30 pelotas em uma distância de 1 cm com cada pelota apresentou um de cada vez. Os ratos treinados no instrutor automático foram treinados pelo protocolo descrito acima. Cada ponto na Figura 4 representa um dia de treinamento durante o qual os animais chegaram para 30 pelotas e grafado como por cento correto. Não houve diferença estatística entre as duas linhagens por meio de teste t não paramétrico com correção para comparações múltiplas.
Figura 1: retratos do exemplar da gaiola Home. (A) aves-vista de uma gaiola de casa padrão modificada com a plataforma (laranja) e slot na frente da gaiola. (B) frente-vista de uma gaiola Home modificada com uma abertura entalhada com aproximadamente 0,8 cm x 7 cm. (C) portão de gaiola cortado a partir de uma fina folha de metal e envolto com fita para proteger as bordas. (D, E) gaiola portão colocado na frente do slot para servir como uma abertura uniforme através do qual o mouse está a chegar; vistas frontais (D) e oblíquas (e) fornecidas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Retratos do exemplar do auto-instrutor. (A, B) Na foto estão o instrutor automático sem (a) ou com (B) uma gaiola de rato modificada no lugar. (C-J) Vistas detalhadas do projeto do suporte da pelota do alimento da placa do mergulho visto da parte dianteira (c, D, H, I) ou do lado (e, f, G, J), com (D, e, f, I) ou sem (c, G, H, J) uma pelota do alimento. Note que a distância da pelota do animal pode facilmente ser modificada como a distância da gaiola da placa de mergulho é modificável. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Screenshot do software. Screenshot do programa usado para executar o auto-trainer. A imagem mostra os campos de entrada importantes descritos no protocolo. Consulte a tabela 2 para obter mais descrição. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Dados representativos. O preensão hábil aumenta a um nível plateaued similar usando o auto-instrutor e os paradigms manuais do treinamento. Plot mostra sucesso REACH-to-agarrar (média +/-SEM; manual: Gray, n = 14; auto-trainer: preto, n = 15). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Passo | Duração estimada (em dias) | Comentário |
| 2,1 perda de peso | 3 a 5 | Dependendo do peso inicial e, portanto, quanto peso perder até a meta |
| 2,2 treinamento de slot | 1 | Os ratos aprendem a sentir-se confortável aproximando-se do slot aberto para alimentos |
| 2,3 moldar | 4 a 8 | |
| 2.3.1 uso da pata | 1 | O sucesso aqui depende de fornecer rapidamente a pelota após o rato, negou seu alimento, paaws para o pellet. |
| 2.3.2 preferência de pata | 1 | Verificar se o mouse prefere esquerda ou direita pata. |
| 2.3.3 curtailing mau uso da pata | 2 a 3 | Como na etapa precedente, é crítico impedir a recuperação com a boca e a lingüeta. |
| 2.3.4 pinças | 1 | Alguns ratos vão tropeçar em tomar o pellet por si mesmos, em vez de a partir da pinça, alimentá-los um pouco menos |
| 3. auto treinamento | 10 a 15 | Dias até asumptote. |
Tabela 1: calendário do treinamento do mouse usando o instrutor automático.
| CAMPO DE ENTRADA | Usar |
| ID do mouse | Insira o nome do arquivo o qual os dados coletados serão salvos. |
| Pelotas totais a dispensar durante a rotina | Insira o número total de pelotas que serão dispensadas durante a sessão de treinamento. |
| Pausar após o número da pelota | Função preterida. Pode ser usado para pausar a sessão de treinamento depois que o pellet especificado é dispensado. |
| Comprimento (s) de pausa | Período de tempo a pausa dura. |
| Distância do alcance (milímetro) | Registre a distância acima do mínimo sobre a qual o mouse deve chegar para recuperar o pellet. Zero por padrão. |
| Tamanho do acelerômetro e matrizes de tempo | Função exposta para fins de depuração. Mantenha no valor padrão de 500. |
| Pasta para conter logs | Clique no ícone de pasta para escolher onde os dados coletados são salvos. |
| Nome do dispositivo | Função do LabVIEW que conecta hardware ao software. O padrão é dev1. Dependendo das conexões USB, o hardware pode aparecer no menu suspenso em outro número; escolha dispositivos até que um funcione. |
| Botão de seta, superior esquerdo | Clique para executar o programa, seja para uma sessão de treinamento ou para calibração. |
| Pare o botão do sinal, parte superior deixada | Pare o programa prematuramente. |
Tabela 2: interface de software.
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Discussion
Nosso auto-instrutor avalia o alcance-à-preensão do membro torácico (prehension) em uma maneira automatizada. Para atingir esse EndPoint, muitos dos parâmetros projetados para a tarefa de preensão do mouse, incluindo a colocação da pelota, o tamanho da pelota e os critérios de treinamento, foram iterados ao longo de vários anos e adaptados de protocolos anteriores2,5 ,6. O avanço aqui é a automação da tarefa usando um robô que permite habitação casa-gaiola. Habitação casa-gaiola permite que os ratos para manter a calma e executar a tarefa com menos ansiedade. O treinamento em gaiola não domiciliar está associado ao aumentodoestresse, oque pode levar ao aumento do tempo e à diminuição da precisão7,8,9. Demonstramos aqui precisão assemelhando-se nossos próprios resultados com o treinamento manual da Home-gaiola5,7,8. Embora o treinamento da Home-gaiola exista para o rato10, a nosso conhecimento, este é o primeiro auto-instrutor que se aproveita de ratos do treinamento em seu Home-Cage.
Nosso auto-instrutor inclui uma plataforma ajustável em que uma gaiola entalhado descansa e pode ser abaixada ou levantada à altura apropriada para o alinhamento com um suporte da pelota do alimento (igualmente referido como uma placa de mergulho). Um sistema de distribuição de pellets coloca a pelota do alimento no suporte da placa de mergulho. O suporte da pelota do alimento tem um conjunto do sensor da pelota da isca que consiste em um sensor reflexivo do objeto para detectar se um pellet do alimento está atual ou não no suporte da placa de mergulho. Devido às questões de sensibilidade à luz, o sensor de objeto reflexivo pode ser calibrado na instalação para se adequar ao ambiente de iluminação do laboratório. A gaiola de cada rato é coloc no auto-instrutor tal que a borda interna da pelota está na linha da borda exterior do entalhe da porta da gaiola, correspondendo à etapa 2.3.4 do procedimento manual detalhado acima. Dois sensores perdidos da pelota orientados em sentidos opostos em um funil abaixo do suporte da pelota da placa de mergulho detectam pelotas de queda. Um benefício de empregar dois sensores perdidos da pelota é que assegura a exatidão elevada da deteção para várias pelotas do alimento de tamanhos e de formas diferentes. Ambos os sensores perdidos da pelota consistem em um Photo-interrupter transmissivo padrão com um projeto do através-furo, para sentir o movimento de uma pelota de queda sem exigir o contato.
O software consiste em um programa que executa o instrutor automático e coleta dados sobre sucessos e falhas. A entrada do usuário consiste no local do arquivo no qual os dados são gravados, quantas pelotas são dispensadas em uma sessão de treinamento, uma opção para pausar a sessão de treinamento após dispensar um pellet específico, um campo para registrar a distância aumentada (se houver) em que o mouse deve atingir e um campo para controlar o tamanho da matriz usado nos cálculos do programa (que podem ser ignorados durante o uso normal). Além disso, o software permite ao usuário ajustar o sensor de objeto reflexivo da placa de mergulho, a fim de recalibrar a sensibilidade à luz, conforme necessário. Uma saída de cada teste é exibida ao usuário, bem como gravada e salva em um arquivo de log para recuperação posterior.
Uma única experimentação consiste em um único tempo da pelota do alimento gasto na placa de mergulho até que esteja removido pela ação do rato. Se uma pelota sae da placa de mergulho como determinado pelo sensor da pelota da isca e o pellet é detectado que cai através do funil logo depois por qualquer um dos sensores perdidos da pelota, é gravado como uma experimentação falhada pelo software. Se o sensor da pelota da isca determina que a pelota sae da placa de mergulho, mas nenhum objeto de queda é detectado por qualquer um dos sensores perdidos da pelota, supõe-se para ter sido puxado na gaiola pelo rato e é contado como um julgamento bem sucedido.
Esta formulação é usada porque é útil projetar um ensaio comportamental no qual a tarefa para executar diretamente, em vez de indiretamente, fornece a recompensa. Desta forma, não há ambigüidade sobre a parte do animal sobre o que a tarefa é (por exemplo, estar com fome, localizar alimentos, obter comida, comer alimentos). Entre as muitas tarefas que utilizam tal paradigma, a tarefa de preensão tornou-se bastante popular para tais avaliações. A tarefa exige meramente que um animal use um único membro para alcançar e agarrar um único alimento, que o animal traga subseqüentemente a sua boca para o consumo. A tarefa do preensão avalia um comportamento que seja muito similar a um comportamento diário usado por muitos mamíferos. O mais importante, a tarefa do preensão assemelha-se ao comportamento humano do motor4. Essa Generalizabilidade reforça a expectativa de que os princípios derivados da avaliação pré-clínica do comportamento sejam clinicamente aplicáveis nos Estados de doença. Por exemplo, os prejuízos no uso da mão e do membro torácico qualificados são observados no AVC, na doença de Huntington, na doença de Parkinson e na esclerose múltipla. Assim, a modelagem de déficits comportamentais e subsequente recuperação em camundongos é inestimável para a compreensão da recuperação humana e como ela pode ser incentivada2,11,12,13.
Muitos aspectos do instrutor de auto proposto neste documento beneficiam grandemente o processo de investigação. Primeiro, a maioria dos ensaios comportamentais exigem um experimentador para treinar de perto e monitorar sessões diárias, que podem ser dispendiosas, trabalhoso e proibitivamente demorado. Nosso instrutor automático permite que os dados comportamentais sejam coletados independentemente de um experimentador. Em segundo lugar, nosso auto-instrutor pode ser replicado para permitir que os ratos múltiplos sejam treinados e avaliados objetiva, eficientemente e simultaneamente, assim minimizando o tempo e o esforço. Em terceiro lugar, o baixo custo do instrutor automático permite a replicação e o uso de vários autoformadores simultaneamente para testes em grande escala e eficientes.
Deve-se notar que o ponto crítico que requer supervisão cuidadosa é durante a fase de modelagem do treinamento. Notavelmente, a fraqueza principal deste protocolo é o risco de mau uso tornando-se fixado em alguns ratos11. O protocolo visa imitar testes como o teste degrau escada em que sucedendo na tarefa fornece a recompensa. Entretanto, a tarefa própria ainda deve ser ensinada aos ratos na etapa 2,3 do protocolo, ao contrário do teste do degrau da escada. O conceito mais provável para fazer com que um mouse tropeçar em aprender esta tarefa é de estender uma pata para fora da gaiola para usar a pata para realmente agarrar o pellet. Na primeira sessão da etapa 2.3.1, os ratos devem ser recompensados simplesmente por estender uma pata para fora de sua gaiola. No entanto, ao longo dos dias seguintes, os investigadores devem tomar cuidado para premiar os ratos menos por apenas estender a pata, e mais para estender a pata e tocar o pellet, como descrevemos na etapa 2.3.3.
Por favor, note que cerca de 5% dos ratos vão deixar de progredir após esta fase, tipicamente por causa da extensão limitada de seus dígitos para puxar o pellet de alimentos. Tais camundongos falhará com uma ou ambas as patas com pouca consideração da localização real do pellet, fornecendo pouco ou nenhum dado útil. Para minimizar o potencial de um rato para a falha neste estágio, o cuidado é recomendado fortemente ao puxar afastado o pellet com os pinças durante o processo de aprendizagem. Em particular, o mouse deve ser recompensado com alimentos não só quando se estende uma pata, mas também quando essa pata apertos da pelota e aplica força suficiente suficiente para a satisfação do investigador. Um risco similar à falha potencial nesta fase é posed por ratos que usam sua lingüeta para lamber pelotas para eles. Quando os ratos do treinamento que tendem a lamber, coloc a pelota mais lateralmente longe da ranhura. Camundongos vai achar difícil de alcançar com a língua sobre uma distância maior lateralmente, mas a amplitude de movimento do braço e pata são mais capazes de fechar a distância.
Nosso protocolo descrito é prontamente estendido para diferentes ambientes de laboratório ou diferentes métodos de coleta de dados. O auto-trainer, por exemplo, é muito útil como um dispositivo de poupança de mão de obra, mas não é estritamente necessário para a coleta de dados, como pelotas podem ser fornecidos e sucessos/falhas podem ser gravadas à mão. Alcances individuais também podem ser categorizados com base em informações mais detalhadas do que simplesmente sucesso/fracasso, por exemplo, considerando o ângulo de aproximação de cada rato, o número de tentativas de alcance que não tocam o pellet, ou a mecânica da recuperação movimento, que tem recebido mais atenção nos últimos anos14. A capacidade do animal para recuperar uma pelota é apenas uma medida. Usando hardware adicional, também seremos capazes de medir a velocidade, o ângulo e a trajetória dos movimentos dos membros do animal. Esta cinemática é um aspecto importante da aprendizagem motora antes e depois de uma lesão neurológica. Para este fim, nós estamos incorporando atualmente vários meios novos de analisar a locomoção e a cinemática da ação agarrando do rato. Estamos explorando usando câmeras de alta velocidade para obter medições cinemáticas do aperto e anexar transdutores de pressão e acelerômetros para o suporte da pelota de alimentos para medir a força e os dados de massa associados com o aperto. Estes novos recursos irão melhorar a funcionalidade do instrutor automático para coletar dados significativos passados um simples passar ou falhar julgamento e ajudar a ilustrar a marcha do aperto do mouse através da progressão da doença. No futuro, nós estaremos usando a tarefa assistida robô do preensão como uma plataforma para avaliar o tipo, a dose, e o sincronismo da reabilitação após ferimento neurológico. Avançando, continuaremos a melhorar a tarefa, com refinamentos para ajudar a diminuir comportamentos incorretos e melhorar a taxa de aquisição de tarefas e o tempo de treinamento.
Em resumo, nós desenvolvemos um novo auto-instrutor para avaliar a habilidade superior do preensão do membro torácico nos ratos. A tarefa exige que os ratos alcancem sua pata através de uma fenda, agarram um pellet pequeno do alimento, e puxam o pellet na direção de seu corpo de modo que possam comer o pellet. A configuração da tarefa é restrita mecanicamente para garantir o uso de pata dominante. Os ratos podem ser treinados de forma rápida e simultânea, com apenas o processo de modelagem exigindo entrada manual. O teste pode ser administrado de forma eficiente e analisado automaticamente. Este ensaio comportamental de alta taxa de transferência quantifica a taxa de sucesso e é facilmente modificada para análise futura de cinemática e dinâmica de força.
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Disclosures
Dan Tasch e URI Tasch da etapa Analysis, LLC têm fabricado dispositivo de instrutor automático com o pagamento de Richard J. o ' Brien e Steven R. Zeiler.
Acknowledgments
O dispositivo de treinamento automático foi construído por Jason Dunthorn, URI Tasch e Dan Tasch na Step Analysis, LLC, com suporte de entrada de projeto e instruções fornecidas por Robert Hubbard, Richard o ' Brien e Steven Zeiler.
Teresa Duarte, do centro Champalimaud para o desconhecido, forneceu insights e ideias valiosas sobre como descrever e categorizar ações de alcance do mouse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABS Filament | Custom 3D Printed | N/A | utilized for pellet holder, frame, arm and funnel |
| ABS Sheet | McMaster-Carr | 8586K581 | 3/8" thickness; used for platform compononents, positioning stand guides and base |
| Adruino Mini | Adruino | A000087 | nano version also compatiable as well as other similar microcontrollers |
| Bench-Top Adjustable-Height Positioning Stand | McMaster-Carr | 9967T43 | 35 lbs. load capacity |
| Clear Acrylic Round Tube | McMaster-Carr | 8532K14 | ID 3/8" |
| Low-Carbon Steel Wire | McMaster-Carr | 8855K14 | 0.148" diameter |
| Pellet Dispenser | Lafayette Instrument: Neuroscience | 80209-45 | with 45 mg interchangeable pellet size wheel and optional stand |
| Photointerrupter Breakout Board | SparkFun | BOB-09322 ROHS | designed for Sharp GP1A57HRJ00F |
| Reflective Object Sensor | Fairchild Semiconductor | QRD1113 | phototransistor output |
| Servo Motor | SparkFun | S8213 | generic metal gear (micro size) |
| Transmissive Photointerrupter | Sharp | GP1A57HRJ00F | gap: 10 mm, slit: 1.8 mm |
References
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