Summary
Este protocolo muestra un enfoque simple y flexible para la evaluación de nuevos agentes acondicionadores o estrategias para aumentar la viabilidad de la donación cardíaca después de la muerte circulatoria.
Abstract
La demanda de trasplantes cardíacos está en aumento; sin embargo, la disponibilidad de órganos es limitada debido a la escasez de donantes adecuados. La donación de órganos después de la muerte circulatoria (DCD) es una solución para abordar esta disponibilidad limitada, pero debido a un período de isquemia cálida prolongada y el riesgo de lesión tisular, su uso rutinario en trasplante cardíaco rara vez se ve. En este manuscrito proporcionamos un protocolo detallado que imita estrechamente las prácticas clínicas actuales en el contexto de la DCD con monitoreo continuo de la función cardíaca, lo que permite la evaluación de nuevas estrategias e intervenciones cardioprotectoras para disminuir lesión por reperfusión de isquemia.
En este modelo, el protocolo DCD se inicia en ratas Lewis anestesiadas deteniendo la ventilación para inducir la muerte circulatoria. Cuando la presión arterial sistólica cae por debajo de 30 mmHg, se inicia el tiempo isquémico cálido. Después de un período isquémico cálido preconfigurado, los corazones se enjuadean con una solución cardiopléjica normotérmica, se obtienen y se montan en un sistema de perfusión cardíaca ex vivo de Langendorff. Después de 10 minutos de reperfusión inicial y estabilización, el reacondicionamiento cardíaco se evalúa continuamente durante 60 minutos utilizando la monitorización de la presión intraventricular. Una lesión cardíaca se evalúa midiendo la troponina T cardíaca y el tamaño del infarto se cuantifica mediante tinción histológica. El tiempo isquémico cálido se puede modular y adaptar para desarrollar la cantidad deseada de daño estructural y funcional. Este sencillo protocolo permite la evaluación de diferentes estrategias de acondicionamiento cardioprotectores introducidas en el momento de cardioplejia, reperfusión inicial y/o durante la perfusión ex vivo. Los hallazgos obtenidos de este protocolo se pueden reproducir en grandes modelos, facilitando la traducción clínica.
Introduction
El trasplante de órganos sólidos en general y el trasplante cardíaco, en particular, van en aumento en todo el mundo1,2. El método estándar de adquisición de órganos es la donación después de la muerte cerebral (DBD). Dados los estrictos criterios de inclusión de DBD,se aceptan menos del 40% de los corazones ofrecidos 3, limitando así la oferta frente al aumento de la demanda y ampliando la lista de espera de órganos. Para abordar este problema, el uso de órganos donados despuésde la muerte circulatoria (DCD) se considera una posible solución 4.
En los donantes de DCD, sin embargo, una fase agonal después de la retirada de la atención y un período de isquemia cálida sin protección antes de la reanimación son inevitables5. La posible lesión de órganos después de la muerte circulatoria puede conducir a la disfunción del órgano, lo que explica la renuencia a adoptar rutinariamente trasplantes cardíacos DCD. Se informa que sólo 4 centros utilizan los corazones DCD clínicamente, con criterios estrictos que incluyentiempos de isquemia cálida muy cortos y jóvenes donantes sin patologías crónicas 6,7. Por razones éticas y legales, se pueden aplicar intervenciones cardioprotectoras limitadas o sin cardioprotectores en donantes antes de la muerte circulatoria5,8,9. Por lo tanto, cualquier mitigación para aliviar la lesión isquemia-reperfusión (IR) se limita a las terapias cardioprotectoras iniciadas durante la reperfusión temprana con soluciones cardiopléjicos, y no permiten una evaluación funcional adecuada. La perfusión cardíaca ex vivo (EVHP) y el reacondicionamiento del corazón DCD utilizando plataformas dedicadas han sido propuestos como una solución alternativa y estudiado por varios estudiosos10,11,12,13 . EVHP ofrece una oportunidad única para entregar agentes post-acondicionado a los corazones de DCD para mejorar la recuperación funcional. Sin embargo, para una traducción clínica eficiente, quedan muchas cuestiones técnicas y prácticas por abordar, y esto se agrava aún más por la falta de consenso sobre una serie de criterios de perfusión y funcionales para determinar la trasplantabilidad6, 8.
Aquí informamos del desarrollo de un protocolo preclínico de DCD preclínico preclínico de DCD combinado con un sistema de perfusión cardíaca ex vivo que se puede utilizar para investigar el postcondicionamiento de órganos iniciado en el momento de la adquisición, durante la reperfusión inicial, y /o a través de EVHP.
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Protocol
Todos los protocolos de cuidado de animales y experimentales se ajustaban a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales del Centro Hospitalario de investigación de la Universidad de Montreal.
1. Preparativos preliminares
- Encienda el baño de agua para calentar el sistema de administración de cardioplejia (Figura1A)y el sistema de perfusión Langendorff ex vivo (Figura 1B). Establezca la temperatura del agua en 38,5 oC para una temperatura de solución de 37 oC. Las fotografías de configuración se pueden ver en la Figura suplementaria 1A,B.
- Preparar 1 L de solución cardiopléjica. Añadir 1 mL de 2% de clorhidrato de lidocaína y 10 mL de 2 mM de KCl (concentración final 20 mM) a 1 L de Plasma-Lyte A (140 mM Na, 5 mM K, 1,5 mM Mg, 98 mM ClM, acetato de 27 mM, gluconato de 23 mM). Corrija el pH a 7.4 usando 6 N HCl.
PRECAUCION: Este modelo es muy sensible al pH. Una corrección de pH incorrecta (fuera del rango fisiológico 7.3-7.4) o soluciones inestables de pH pueden comprometer el experimento o proporcionar datos poco fiables. - Preparar 4 L de solución Krebs (113 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,6 mM NaH2PO4, 1,25 mM CaCl2, 1 mM MgCl2x 6H2O, 5,5 mM D-Glucosa, 25 mM NaHCO3). Las masas de sustrato por 1 L de solución deben ser las siguientes: 6,1 g de NaCl, 0,3355 g de KCl, 0,2035 g de MgCl2x 6H2O, 0,192 g de NaH2PO4, 0,1387 g de CaCl2,0,99 g de D-Glucosa, 2,1 g de NaHCO3 , volumen final de 1 L en agua ultrapura desionizada. Añadir la NaHCO 3 para evitar precipitaciones. Filtre la solución con un filtro de 0,22 m y guárdela durante la noche. Corrija el pH a 7,4 cuando la solución esté a 37 oC y burbuja con 5% co2/95% O2.
- Llene el circuito Langendorff con la solución Krebs e inicie la bomba del sistema. Asegúrese de que no queden burbujas dentro deltubo. Ajuste la velocidad de la bomba peristáltica a 80 rpm (equivalente a 1 L/min). Usando la polla de parada de dos vías, ajuste el flujo para mantener un goteo lento a través de la cánula aórtica hasta que el corazón esté unido (Figura 1B). Mantenga una muestra de solución de Krebs (15 ml) en un tubo cónico de 50 ml sobre hielo para el transporte cardíaco.
- Llene el sistema de administración de cardioplejia con la solución cardiopléjica. Una vez que se quitan las burbujas, cambie el circuito a salina usando una polla de parada de 3 vías (Figura1A). Ajuste la velocidad de goteo. La salina debe estar goteando lentamente desde la punta del catéter para asegurar que no se inyecta solución cardiopléjica antes de la muerte del animal.
2. Preparación animal
- Usando una cámara de inhalación, inducir anestesia con 3% de isoflurano. Una vez que el animal no responde, realizar una inyección intraperitoneal de ketamina (75 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg) o anestesia igualmente adecuada, siguiendo las regulaciones locales, para mantener la anestesia para el resto del procedimiento. Asegurar la profundidad de la anestesia sin reacción al pellizco del dedo del dedo del día y al reflejo palpebral.
- Intubar al animal usando un catéter Inviderso de 14 G y 2 pulgadas. Comience la ventilación a 50 respiraciones por minuto, con presión de las vías respiratorias limitada a 20 cmH2O.
- Coloque el animal en una almohadilla calefactora establecida en "medio" y cubra con una almohadilla absorbente para mantener la temperatura corporal. Inserte una sonda de temperatura rectal y conecte un sensor de oxímetro de pulso transdérmico a uno de los pies. Mantener la temperatura rectal a 37oC durante todo el procedimiento.
-
Acceso vascular
- Haga una incisión de piel de línea media de 3 a 4 cm en el cuello usando tijeras. Usando tijeras curvadas de punta contundente, diseccionar con teliza el tejido subcutáneo y exponer el músculo estuomiidederecho derecho. Usando fórceps no traumáticos, mueva el músculo lateralmente hasta que la arteria carótida derecha (pulsando), la vena yugular (no pulsante) y el nervio vago (blanco) se identifiquen visualmente (FiguraSuplementaria 2A). Separe cuidadosamente el nervio vago de la arteria carótida usando tijeras curvadas de punta contundente.
- Inyecte heparina (2.000 UI/kg) a través de la vena yugular derecha. Aplique presión en el lugar de inyección después de la retracción de la aguja para evitar fugas de sangre.
- Usando fórceps curvos, pasa dos suturas de seda 5-0 alrededor de la arteria carótida. Fije firmemente una sutura distal para ocluir la arteria carótida en el aspecto superior de la arteria expuesta. Mantenga la sutura proximal desatada. La extracción de la sutura proximal se utilizará para el control del sangrado en el siguiente paso (Figurasuplementaria 2B). La distancia entre suturas debe ser de aproximadamente 2cm.
- Usando un estereomicroscopio para una mejor visualización, realice cuidadosamente una incisión de 1 mm con tijeras de microcirugía sobre la pared anterior de la arteria carótida. Inserte un catéter I.V. cerrado de 22 G y 1 pulgada hacia el arco aórtico. El catéter está conectado a un grifo de parada de 2 vías, lo que permite la conexión a un transductor de presión para un monitoreo constante, con la posibilidad de inyectar salina o cardioplejia a través del sistema de administración de cardioplejia (Figura1A).
3. Inicio de la donación cardíaca después de la muerte circulatoria (DCD) Protocolo
NOTA: Una línea de tiempo completa del protocolo se puede ver en la Figura2.
- Reasve la profundidad anestésica realizando un pellizco del dedo del pie y evaluando el reflejo palpebraal. Si se observa una reacción, realice una inyección intraperitoneal de ketamina (37,5 mg/Kg) y xilazina (2,5 mg/Kg). Reevaluar después de 5 minutos. Si no se observa ninguna respuesta, continúe el procedimiento. La abrazadera traqueal sólo debe realizarse en animales adecuadamente anestesiados.
- Apague el respirador y extube al animal. Con los mosquitos fórceps, sujeta la tráquea. Este momento se considera como el inicio de la fase agonal. Comience a contar el tiempo isquémico cálido funcional (WIT) cuando la presión arterial sistólica máxima cae por debajo de 30 mmHg, o si aparece asistolia o fibrilación ventricular, lo que ocurra primero (Figura3).
NOTA: La extensión de los daños debe ser proporcional a WIT. Los experimentos son necesarios para optimizar el tiempo de wiT de acuerdo con el anestésico utilizado, la cepa animal, el sexo y el peso elegido. En los animales controlados, inmediatamente después de asegurar el acceso vascular carótido, se inyecta cardioplejia y se adquiere el corazón como se describe en el siguiente paso (Figura2). El inicio de la perfusión con cardioplejia se considera como el final del WIT. - Al final del WIT, realice una estenotomía medial. Mantenga el tórax abierto usando un retractor de alm. Con tijeras, abra la vena cava inferior y ambas aurículas para evitar la distensión miocárdica o la recirculación cardioplejia (Figura suplementaria 3). Sujete la aorta por encima del diafragma. A través de la arteria carótida previamente catetela, infundir la solución cardiopléjica a una presión constante de 60 mmHg durante 5 min utilizando el sistema de administración de cardioplejia. La presión de perfusión se puede modificar alterando la altura de la columna de agua.
- Al final de la perfusión cardiopléjica, diseccionar la aorta proximal ascendente de la arteria pulmonar utilizando fórceps curvos (FiguraSuplementaria 4A). Cortar la aorta distal a la arteria subclavia izquierda. Asegurar una longitud aórtica de al menos 0,5 cm para la cánula para el aparato Langendorff.
- Sosteniendo el corazón de la aorta, completar la cardiectomía separando el corazón de las venas pulmonares y otras estructuras torácicas (FiguraSuplementaria 4B). Rápidamente, sumerja el corazón en una solución Krebs helada para un transporte rápido al sistema ex vivo. Mantenga la disección y los tiempos de transporte lo más cortos posible (5 min).
4. Ex Vivo Sistema de Perfusión Cardiaca (EVHP) y Evaluación Funcional Cardíaca
- Abra el lumen aórtico usando fórceps. Desate la aorta llenando el lumen con la solución de Krebs que gotea para evitar forzar burbujas a los vasos coronarios. Baje la cánula hacia la aorta, teniendo cuidado de no pasar la raíz aórtica ni dañar los foliolos de la válvula aórtica. Fije la configuración con una pequeña abrazadera.
- Usando el tapón de 2 vías, aumente el flujo para buscar posibles fugas en la aorta. Si no se detecta ninguno, fije firmemente la aorta a la cánula usando una sutura de seda 2-0. Abra completamente el flujo a la cánula. Mantener la presión aórtica a una presión fisiológica de 60-70 mmHg (ajustada cambiando la altura del sistema). En este momento se inicia el tiempo inicial de reperfusión y estabilización. La presión aórtica se puede modificar de acuerdo con el plan experimental del investigador.
- Gire el corazón para que la base del corazón (arículas) esté frente al sensor de presión. Amplía la abertura auricular ventricular izquierda disecting las venas pulmonares. Inserte el globo de látex conectado a un sensor de presión. Asegúrese de que el globo esté completamente colocado dentro del ventrículo mediante inspección visual. Llene lentamente el globo con salina hasta que la presión diastólica final (EDP) se ajuste a 15 mmHg. Ajuste según sea necesario para mantener el EDP constante (EDP fisiológico predeterminado). El EDP se puede ajustar de acuerdo con los objetivos experimentales de cada investigador.
- Inserte el electrodo de ritmo en la cara anterior del corazón (tracto de salida ventricular derecho). Evite puntuar los vasos coronarios. Una vez que se observa un golpe espontáneo, inicie el ritmo a 300 latidos por minuto.
- Después de 10 minutos de estabilización, inicie el registro continuo de la medición de la presión intraventricular. Este momento se considera el comienzo de la fase de reacondicionamiento y evaluación (tiempo 0) que durará 1 h (Figura2). El reacondicionamiento puede ser prolongado, pero se espera una disminución de la contractilidad dependiente del tiempo en todos los corazones.
- Al comienzo del reacondicionamiento, recoger efluentes cardíacos que caen de las venas cardíacas durante 5 minutos para la evaluación basal del flujo coronario y análisis bioquímicos. Para la troponina T repetir cada 15 min (tiempos 0, 15, 30, 45 y 60 min). Para otros análisis es necesaria la individualización de los tiempos de recogida (Figura 2).
5. Fin de la experiencia
- Retire el corazón del aparato Langendorff.
- Usando una hoja recta de acero al carbono alto (hoja de microtome o similar), retire la base del corazón (incluyendo aorta y arteria pulmonar).
- Con el ventrículo derecho hacia abajo, corte los portaobjetos ventriculares transversales de 1-2 mm de espesor. En una sección representativa (normalmente la tercera) eximulice el ventrículo derecho y congele el ventrículo izquierdo. Esta muestra se puede utilizar para análisis bioquímicos.
- Sumerja las secciones restantes en cloruro de 5%2,3,5-trifenilo-tetrazolium recién preparado en fosfato comercial tampón de solución salina pH 7,4 durante 10 min a 37 oC. Los tejidos viables son de ladrillo rojo de color.
- Lavar dos veces con el pH salino tampón de fosfato 7.4 y fijar con 10% de formalina a 4 oC durante la noche. Lavar dos veces con el pH salino tamponado fosfato 7.4 y mantener cada rebanada sumergida.
- Retire el exceso de líquido y el peso de cada diapositiva. Tome imágenes digitales en color de ambos lados. Utilice análisis planimétricos para calcular el tamaño del porcentaje de infarto y corregir el peso de la rebanada y el peso ventricular total. La coloración se desvanece con el tiempo. Las fotos deben tomarse lo antes posible.
6. Análisis de datos
- Guarde todos los datos de presión en un nuevo archivo por animal.
- Para los análisis de presión, seleccione al menos 200 ciclos de presión por puntos de tiempo. Los análisis se pueden realizar fuera de línea (después de la finalización del experimento) utilizando software dedicado (es decir, LabChart). Los parámetros cardiovasculares comunes disponibles incluyen: Presión máxima generada, presión diastólica final, +dP/dt (pendiente más pronunciada durante la curva de presión, un indicador de capacidad contráctil ventricular), -dP/dt (pendiente más pronunciada durante el bajada de la curva de presión, un indicador de la capacidad de relajación ventricular) entre otros.
NOTA: Para los análisis de troponina, se espera un aumento en la liberación de troponina en la reperfusión. Después de 1 h de reperfusión en el sistema EVHP, los niveles de troponina pueden disminuir a la línea de base, haciendo hincapié en la necesidad de una sincronización cuidadosa en la recolección y manipulación de estas muestras.
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Representative Results
Después de la extubación, la presión arterial disminuye rápidamente en un patrón predecible (Figura 3). El tiempo esperado hasta la muerte es de menos de 5 min.
La Figura 4 muestra una curva de presión/tiempo promedio al inicio del reacondicionamiento después de 0, 10 y 15 min de WIT. La función contractile mejorará con el tiempo. El uso de períodos cortos de WIT permitirá que la contractilidad vuelva a la normalidad, y el daño morfológico no será detectable (Figura5 y Figura 6).
El uso de prueba de concepto de un agente acondicionador añadido con la cardioplejia y en la fase de estabilización muestran queel daño generado por 15 minutos de WIT en este modelo es susceptible de modulación por agentes cardioprotectores (Figura 4, Figura 5 y Figura 6).
Figura 1: Esquemas de equipo necesarios. Requisitos mínimos para un sistema de administraciónde cardioplejia (A) y un sistema de perfusión cardíaca ex vivo de Langendorff ex vivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cronología del protocolo. Cronología desde el momento de la extubación hasta el final del protocolo. En los animales controlados, la cardioplejia se inicia sin DCD ni tiempo isquémico cálido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Gráfico de presión arterial/tiempo intracarotíta. Evolución típica de la presión arterial incarótida después de la extubación. El tiempo de isquemia cálida protagoniza cuando la presión arterial sistólica máxima cae por debajo de 30 mmHg, o si aparece asistolia o fibrilación ventricular, lo que ocurra primero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Curva de tiempo de presión ventricular media de latido a latido ex vivo. Imagen derivada de análisis de datos tomados después de 10 min de estabilización y perfusión (tiempo 0 en la figura 2) con o sin el uso de un agente de acondicionamiento cardioprotector farmacológico experimental. El tiempo isquémico se refiere a los tiempos isquémicos cálidos (WIT). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Recuperación ex vivo y análisis funcionales. (A) Curva de tiempo de presión ventricular continua después de 10 minutos de estabilización y perfusión con o sin el uso de un agente de acondicionamiento cardioprotector farmacológico experimental. Las flechas muestran los artefactos debido a la modificación manual del EDP. (B) Tasa máxima (+dP/dt) y mínima (-dP/dt) de cambio de presión en la gráfica de tiempo LV frente a la gráfica de tiempo derivada de (A) que muestra una mejora dependiente del tiempo en contractilidad sin tratamiento (línea verde). Los corazones cortos WIT (línea roja) o tratados (amarillos) muestran un patrón similar al grupo de control (línea azul). Los puntos de datos son la media de al menos 200 latidos individuales. Las barras muestran el error estándar de la media de cada punto de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: coloración del cloruro de 2,3,5-Trifenilo-tetrazolium al final de los experimentos. Zona infarto observada después de diversos tiempos isquémicos cálidos (WIT) y el uso de un agente de acondicionamiento cardioprotector farmacológico. Rojo ladrillo: tejido viable. Amarillo claro: tejido no viable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Fotografía de configuración. (A) Fotografía que muestra la configuración del sistema de administración de cardioplejia. El equipo numerado corresponde a: contenedor de cardioplejia (1), trampa de burbujas (2), sensor de presión y catéter (3), bomba peristáltica (4), polígrafo conectado al sensor de presión (5) y ventilador de animales pequeños (6). (B) Fotografía que muestra la configuración del sistema de perfusión cardíaca Langendorff ex vivo. El equipo numerado corresponde a: contenedor Perusodo (1), contenedor de agente de acondicionamiento (2) y cámara cardíaca (3). Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 2: Disección del cuello. (A) Fotografía que muestre la vena yugular expuesta (flecha) antes de la inyección de heparina. (B) muestra la arteria carótida diseccionada (flecha) con las suturas colocadas para el control del sangrado. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 3: Apertura de las arículas para evitar la recirculación. (A) Fotografía que muestra la apertura del apéndice auricular izquierdo (1). En el fondo, la aorta (2) se sujeta por encima del diafragma (3). (B) Muestra la apertura del apéndice auricular derecho (1). Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 4: Adquisición del corazón. (A) Fotografía que muestra el uso de fórceps curvos para separar la aorta (flecha) y la arteria pulmonar. (B) Fotografía que muestra disección cardiaca y adquisición. El corazón es reténporte por la aorta usando fórceps. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
El protocolo presentado aquí introduce un modelo simple, conveniente y versátil de DCD cardíaco, que ofrece la oportunidad de evaluar la recuperación funcional cardíaca, el daño tisular y el uso de agentes cardioprotectores post-acondicionadopara mejorar la recuperación del donante corazones de lo contrario desechados para el trasplante. Los sistemas de perfusión cardíaca ex vivo (EVHP) se han optimizado para proporcionar una plataforma para evaluar la función cardíaca y ofrecer una oportunidad única para ofrecer y probar soluciones modificadas suplementadas con agentes farmacológicos post-acondicionamiento para preservar y reparar corazones de DCD en pequeños15 y animales grandes16,17 modelos de DCD cardíaco. Sin embargo, los protocolos a menudo son insuficientemente detallados y no siempre clínicamente relevantes, lo que dificulta la traducción clínica.
En el ámbito de los modelos DCD, los modelos dCD ex vivo, como el descrito por Sanz18,carecen de una fase agonal. Al inducir un paro cardíaco al detener la ventilación mecánica, el sistema nervioso simpático se sobreactiva, lo que conduce a una "tormenta de catecolaminas"19. Este aumento de las catecolaminas modifica las características de los órganos donantes, y se ha relacionado con un estado funcional reducido de los órganos experimentales de DCD19. Además, la disminución progresiva de la función antes de la asistolia conduce a la distensión ventricular derecha y la consiguiente lesión. En nuestro protocolo, hemos inducido la muerte circulatoria utilizando un modelo de asfixia clínicamente relevante, que mantiene estas respuestas.
En la literatura se describen dos modelos principales de DCD cardiaco: los modelos de pecho abierto15 y los 20 modelos cerrados de pecho. La fisiología cardíaca se ve alterada por el enfoque de pecho abierto al reducir la interacción mecánica pulmón/corazón y la precarga. Además, en los procedimientos de pecho abierto, la pérdida de calor corporal se acelera, afectando aún más los resultados funcionales21. Por lo tanto, es preferible mantener un enfoque de pecho cerrado evitando la pérdida de calor. Otro refinamiento es minimizar la variabilidad del tiempo a la muerte circulatoria. Kearns et al. informaron que el tiempo hasta la muerte (tiempo hasta la presión arterial no pulsante o media de menos de 30 mmHg) era de entre 3 y 11 min. En el WIT de 10 y 20 min, el 40% y el 60% de los corazones no recuperaron la función, respectivamente, en un aparato cardíaco de trabajo ex vivo, haciendo más difícil la interpretación de datos15. Una alternativa para reducir el tiempo de muerte circulatoria es utilizar agentes paralíticos20; sin embargo, algunas pruebas apuntan hacia efectos cardíacos directos del vecuronio, debido a sus efectos sobre la inervación simpática y parasimpática22. Para aumentar la reproducibilidad, elegimos la sujeción traqueal, combinada con una monitorización precisa de la presión arterial, permitiendo un tiempo agonal más homogéneo (<5 min). Se sabe que el daño a los órganos comienza antes del momento de la muerte circulatoria; con algunos autores considerando una presión arterial sistólica de corte por debajo de 50 mmHg como el comienzo del WIT6funcional, explicando la renuencia a los órganos de trasplante después de una forma de largo período de retirar las medidas de sostenimiento de la vida hasta la reperfusión. En este protocolo, la definición WIT utilizada sigue la norma experimental actual15,sin embargo, se necesitan más estudios para aclarar el conjunto exacto de parámetros hemodinámicos que marcan la inducción del daño de los órganos con el fin de mejorar el WIT cálculo, ofreciendo así una mejor información para la práctica clínica.
La infusión de solución cardiopléjica a presión y temperatura fisiológicas constantes ofrece una oportunidad única para iniciar el acondicionamiento del corazón y la protección de los tejidos con cualquier agente farmacológico o por otros medios. Los refinamientos técnicos incluyen sujetar la aorta torácica, limitar la perfusión al corazón y reducir así la cantidad de solución necesaria para cada ensayo. Una vez que el corazón está en el sistema EVHP, es necesaria una evaluación funcional estandarizada. Se ha demostrado que el uso de un sistema EVHP tiene el potencial de mejorar la reanimación de corazones previamente considerados no trasplantables23,24. Curiosamente, el sistema EVHP clínicamente disponible evalúa la viabilidad cardíaca sólo mediante el uso de mediciones de lactato en serie8,23. Las mediciones de lactato no están relacionadas con el rendimiento cardíaco de los corazones de DCD24,25,por lo que son necesarias mediciones adicionales para evaluar la trasplantabilidad. Esta configuración experimental permite una evaluación funcional completa, incluyendo presiones generadas y mediciones de contractilidad miocárdica incluyendo +dP/dT y –dP/dT, lo que permite una evaluación más exhaustiva de la función cardíaca antes del trasplante final decisión. Además, las mediciones de troponina cardíaca, un marcador de daño miocárdico directamente correlacionados con el tamaño de infarto isquémico26y la cinética de liberación están relacionadas con la extensión de la isquemia cardíaca en un sistema de isquemia/reperfusión de Langendorff. En particular, con largos tiempos isquémicos (60 min), los niveles de troponina se mantienen después de 1 h de reperfusión, mientras que la LDH y la creatinina quinasa disminuyen significativamente, y no están relacionadas con la extensión del daño cardíaco27,28, el uso de medidas de troponina en serie aseguran una evaluación completa de la viabilidad de los órganos antes del trasplante. Una variable de confunción importante en la evaluación funcional cardíaca es la frecuencia cardíaca. La frecuencia cardíaca espontánea está inversamente relacionada con la longitud de la isquemia29,y la frecuencia cardíaca se correlaciona directamente con +dP/dt en corazones de rata aislados30 y en modelos animales31. Curiosamente, en los trabajos recientemente publicados sobre modelos de roedores de corazones DCD y acondicionamiento EVHP, el ritmo no se utilizó y las tasas cardíacas fueron variables y registradas en sus protocolos15,18,20. Para mantener la frecuencia cardíaca fisiológica, se utilizó el ritmo una vez que el corazón se recuperó la contracción rítmica. La frecuencia de 300 bpm elegida es similar a la de ratas sanas y no estresadas32.
Las limitaciones de este protocolo incluyen el uso de anestesia volátil para la inducción. Se ha demostrado que estos agentes confieren preacondicionamiento isquémico33. Sin embargo, el corto tiempo de uso anestésico inhalado no tuvo ningún efecto observable en este protocolo y la disfunción miocárdica progresiva todavía se observó con el aumento de WIT. El uso de cardioplejia normotérmica también se puede ver como una limitación. El uso de cardioplejia normotérmica permite una traducción óptima de las condiciones in vitro utilizadas para el desarrollo de agentes de acondicionamiento farmacológico, ya que las células se mantienen generalmente a 37 oC. Sin embargo, en esta configuración la temperatura cardioplejia se puede regular fácilmente de acuerdo con los requisitos del investigador. Por otro lado, el uso de una preparación de Langendorff frente a una preparación del corazón en funcionamiento para el reacondicionamiento también podría verse como una limitación. La preparación del corazón de trabajo permite el registro continuo de un bucle de presión/volumen12,15, con pre y después de la carga controlados, lo que permite una evaluación funcional completa. La principal ventaja de una preparación de Langendorff es que mantiene una presión aórtica y de perfusión constante, especialmente durante la reperfusión inicial, cuando la presión generada es mínima. Además, la configuración de evaluación es más sencilla para el corazón de Langendorff en comparación con una preparación del corazón en funcionamiento. Sin embargo, esta configuración se puede convertir en una preparación del corazón de trabajo si lo considera necesario. Alternativamente, la reanimación cardíaca se puede realizar in situ utilizando perfusión regional normotérmica, midiendo el rendimiento cardíaco directamente mediante el uso de un catéter Millar34,lo que permite una completa hemodinámica y miocárdica funcional evaluación antes de la adquisición de órganos. En humanos, tanto in situ como ex vivo se han descrito estrategias de reacondicionamiento6, por lo tanto, el desarrollo de ambos modelos permite comparaciones experimentales que pueden traducirse en la optimización de la práctica clínica. Por último, el pequeño tamaño y la alta frecuencia cardíaca de este modelo animal pueden considerarse como una limitación debido a las posibles dificultades técnicas observadas durante la realización de estos experimentos, y las inevitables diferencias fisiológicas entre los corazones de rata y humanos. Si la evaluación de EVHP ya está estandarizada, un investigador puede familiarizarse con esta técnica realizando tan solo 3 experimentos. Por otro lado, el uso de este pequeño modelo animal permite un cribado conveniente a un costo razonable, reservando modelos animales más grandes y más costosos como el modelo porcino, a terapias con alto potencial traslacional humano.
En conclusión, el protocolo descrito aquí tiene en cuenta las mejores prácticas que emanan de varios grupos que investigan los corazones de La DCD. Este protocolo otorga un control total del WIT, permitiendo una evaluación estructural y funcional integral de las estrategias de tratamiento de acondicionamiento cardioprotector en ratas. Este protocolo puede ser ampliado y transferido a grandes modelos animales, lo que permite traducir los resultados de la investigación a la realidad clínica y, en última instancia, permitir el desarrollo de nuevas terapias aumentando la calidad y disponibilidad de los órganos que salvan vidas muy necesitados por Pacientes.
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Disclosures
Los autores no informan de ningún interés de propiedad o comercial en ningún producto mencionado o concepto discutido en este artículo.
Acknowledgments
Algunas partes de este trabajo fueron apoyadas por una generosa contribución de la Fundación Marcel et Rolande Gosselin y la Fundación Sr. Stefane Foumy. Nicolas Noiseux es estudioso del FRQ-S.
Los autores desean agradecer a Josh Zhuo Le Huang, Gabrielle Gascon, Sophia Ghiassi y Catherine Scalabrini por su apoyo en la recopilación de datos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride. 1 L bag | Baxter | Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system. | |
| 14 G 2" I.V catheter | Jelco | 4098 | To act as endotracheal tube. |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Milipore-Sigma | T8877 | Vital coloration |
| 22 G 1" I.V catheter | BD | 383532 | I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization |
| Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr | Skalar | 50-3147 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4" | Skalar | 22-9027 | Tissue retractor used to maintain the chest open. |
| Bridge amp | ADinstruments | FE221 | Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement |
| Calcium chloride | Milipore-Sigma | C1016 | CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution |
| D-(+)-Glucose | Milipore-Sigma | G8270 | D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| DIN(8) to Disposable BP Transducer | ADinstruments | MLAC06 | Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer |
| Disposable BP Transducer (stopcock) | ADinstruments | MLT0670 | Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement |
| dPBS | Gibco | 14190-144 | Electrolyte solution without calcium or magnesium. |
| Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" | Skalar | 66-2740 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Milipore-Sigma | HT501128 | Fixative solution |
| Heating Pad | Sunbean | 756-CN | |
| Heparin sodium 1,000 UI/mL | Sandoz | For systemic anticoagulation | |
| Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% | Fisher scientific | A144-500 | Diluted 1:1 for pH correction |
| Ketamine | Bimeda | Anesthetic. 100 mg/mL | |
| LabChart | ADinstruments | Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled | |
| Left ventricle pressure balloon | Radnoti | 170404 | In latex. Size 4. |
| Lidocaine HCl 2% solution | AstraZeneca | Antiarrhythmic for the cardioplegic solution | |
| Magnesium Chloride ACS | ACP Chemicals | M-0460 | MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Micro pressure sensor | Radnoti | 159905 | Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon |
| Pacemaker | Biotronik | Reliaty | Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm. |
| pH bench top meter | Fisher scientific | AE150 | |
| Physiological monitor | Kent Scientific | Physiosuite | For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure |
| Plasma-Lyte A | Baxter | Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia | |
| Potassium Chloride | Milipore-Sigma | P4504 | KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Potassium Chloride 2 meq/ml | Hospira | Part of the cardioplegic solution | |
| PowerLab 8/30 Polygraph | ADinstruments | Electronic polygraph | |
| Silk 2-0 | Ethicon | A305H | Suture material for Langendorff apparatus |
| Silk 5-0 | Ethicon | A302H | Suture material for carotid |
| Small animal anesthesia workstation | Hallowell EMC | 000A2770 | Small animal ventilator |
| Sodium bicarbonate | Milipore-Sigma | S5761 | NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Chloride | Milipore-Sigma | S7653 | NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Hydroxide pellets | ACP chemicals | S3700 | Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction |
| Sodium phosphate monobasic | Milipore-Sigma | S0751 | NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" | Skalar | 22-1240 | Small scisors for atria and cava vein opening |
| Tissue slicer blades | Thomas scientific | 6727C18 | Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol |
| Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8" | CardinalHealth | 8881511235 | For heparin injection |
| Veterinary General Surgery Set | Skalar | 98-1275 | Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps |
| Veterinary Micro Set | Skalar | 98-1311 | Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening |
| Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system | Radnoti | 120101BEZ | Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock |
| Xylazine | Bayer | Sedative. 20 mg/mL |
References
- Gass, A. L., et al. Cardiac Transplantation in the New Era. Cardiology in Review. 23 (4), 182-188 (2015).
- von Dossow, V., Costa, J., D'Ovidio, F., Marczin, N. Worldwide trends in heart and lung transplantation: Guarding the most precious gift ever. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 31 (2), 141-152 (2017).
- Hornby, K., Ross, H., Keshavjee, S., Rao, V., Shemie, S. D. Non-utilization of hearts and lungs after consent for donation: a Canadian multicentre study. Canadian Journal Of Anaesthesia. 53 (8), 831-837 (2006).
- Manyalich, M., Nelson, H., Delmonico, F. L. The need and opportunity for donation after circulatory death worldwide. Current Opinion In Organ Transplantation. 23 (1), 136-141 (2018).
- Shemie, S. D., et al. National recommendations for donation after cardiocirculatory death in Canada: Donation after cardiocirculatory death in Canada. CMAJ : Canadian Medical Association Journal. 175 (8), S1 (2006).
- Page, A., Messer, S., Large, S. R. Heart transplantation from donation after circulatory determined death. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 75-81 (2018).
- Monteagudo Vela, M., Garcia Saez, D., Simon, A. R. Current approaches in retrieval and heart preservation. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 67-74 (2018).
- Dhital, K. K., Chew, H. C., Macdonald, P. S. Donation after circulatory death heart transplantation. Current Opinion In Organ Transplantation. 22 (3), 189-197 (2017).
- McNally, S. J., Harrison, E. M., Wigmore, S. J. Ethical considerations in the application of preconditioning to solid organ transplantation. Journal of Medical Ethics. 31 (11), 631-634 (2005).
- Rao, V., Feindel, C. M., Weisel, R. D., Boylen, P., Cohen, G. Donor blood perfusion improves myocardial recovery after heart transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 16 (6), 667-673 (1997).
- Ramzy, D., et al. Cardiac allograft preservation using donor-shed blood supplemented with L-arginine. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (10), 1665-1672 (2005).
- Xin, L., et al. A New Multi-Mode Perfusion System for Ex vivo Heart Perfusion Study. Journal of Medical Systems. 42 (2), 25 (2017).
- Messer, S., Ardehali, A., Tsui, S. Normothermic donor heart perfusion: current clinical experience and the future. Transplant International. 28 (6), 634-642 (2015).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). , Academic Press. 77-108 (2016).
- Kearns, M. J., et al. A Rodent Model of Cardiac Donation After Circulatory Death and Novel Biomarkers of Cardiac Viability During Ex vivo Heart Perfusion. Transplantation. 101 (8), e231-e239 (2017).
- Sandha, J. K., et al. Steroids Limit Myocardial Edema During Ex vivo Perfusion of Hearts Donated After Circulatory Death. The Annals of Thoracic Surgery. 105 (6), 1763-1770 (2018).
- Iyer, A., et al. Increasing the tolerance of DCD hearts to warm ischemia by pharmacological postconditioning. American Journal of Transplantation. 14 (8), 1744-1752 (2014).
- Sanz, M. N., et al. Cardioprotective reperfusion strategies differentially affect mitochondria:studies in an isolated rat heart model of donation after circulatory death (DCD). American Journal of Transplantation. , (2018).
- Van de Wauwer, C., et al. The mode of death in the non-heart-beating donor has an impact on lung graft quality. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 36 (5), 919-926 (2009).
- Quader, M., et al. Determination of Optimal Coronary Flow for the Preservation of "Donation after Circulatory Death" in Murine Heart Model. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs : 1992). 64 (2), 225-231 (2018).
- Priebe, H. J. The acute open-chest model. British Journal Of Anaesthesia. 60 (8 Suppl 1), 38-41 (1988).
- Narita, M., et al. Cardiac effects of vecuronium and its interaction with autonomic nervous system in isolated perfused canine hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 19 (6), 1000-1008 (1992).
- Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet (London, England). 385 (9987), 2585-2591 (2015).
- Messer, S. J., et al. Functional assessment and transplantation of the donor heart after circulatory death. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (12), 1443-1452 (2016).
- White, C. W., et al. Assessment of donor heart viability during ex vivo heart perfusion. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93 (10), 893-901 (2015).
- Mayr, A., et al. Cardiac troponin T and creatine kinase predict mid-term infarct size and left ventricular function after acute myocardial infarction: a cardiac MR study. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 33 (4), 847-854 (2011).
- Remppis, A., et al. Intracellular compartmentation of troponin T: release kinetics after global ischemia and calcium paradox in the isolated perfused rat heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (2), 793-803 (1995).
- Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff Perfused Isolated Mouse Heart Model of Global Ischemia-Reperfusion Injury: Impact of Ischemia and Reperfusion Length on Infarct Size and LDH Release. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).
- Dornbierer, M., et al. Early reperfusion hemodynamics predict recovery in rat hearts: a potential approach towards evaluating cardiac grafts from non-heart-beating donors. PloS One. 7 (8), e43642 (2012).
- Henry, P. D. Positive staircase effect in the rat heart. The American Journal of Physiology. 228 (2), 360-364 (1975).
- Markert, M., et al. Evaluation of a method to correct the contractility index LVdP/dt(max) for changes in heart rate. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 98-105 (2012).
- Azar, T., Sharp, J., Lawson, D. Heart rates of male and female Sprague-Dawley and spontaneously hypertensive rats housed singly or in groups. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (2), 175-184 (2011).
- Bonney, S., Hughes, K., Eckle, T. Anesthetic cardioprotection: the role of adenosine. Current Pharmaceutical Design. 20 (36), 5690-5695 (2014).
- Ali, A. A., et al. Rat model of veno-arterial extracorporeal membrane oxygenation. Journal of Translational Medicine. 12, 37 (2014).
