Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Karakteriseren ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen met behulp van een set van praktische en haalbare methoden

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59795
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

Summary

In dit artikel presenteerden we een reeks praktische en haalbare methoden voor het karakteriseren van ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen, waaronder in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en complementaire Split plaats assay.

Abstract

De snel versnelde fibrosarcoma (RAF) familie kinasen spelen een centrale rol in de celbiologie en hun disfunctie leidt tot kankers en ontwikkelingsstoornissen. Een karakterisering van ziekte-gerelateerde RAF mutanten zal ons helpen bij het selecteren van passende therapeutische strategieën voor de behandeling van deze ziekten. Recente studies hebben uitgewezen dat de kinasen van de RAF-familie zowel katalytische als allosterische activiteiten hebben, die strak gereguleerd worden door dimerisatie. Hier bouwden we een reeks praktische en haalbare methoden om de katalytische en allosterische activiteiten en de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van RAF familie kinasen en hun mutanten te bepalen. Ten eerste hebben we de klassieke in-vitro kinase assay aangepast door de detergens concentratie in buffers te verminderen, gebruikmakend van een zachte Quick Wash procedure, en het gebruik van een glutathion S-transferase (GST) fusie om te voorkomen dat RAF Dimeren van dissociatie tijdens Zuivering. Dit stelt ons in staat om de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten adequaat te meten. Ten tweede ontwikkelden we een roman RAF co-Activation assay om de allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten te evalueren door gebruik te maken van N-terminale afgeknotte RAF-eiwitten, waardoor de eis van actieve RAS in huidige protocollen wordt geëlimineerd en daardoor een hogere Gevoeligheid. Ten slotte genereerden we een unieke complementaire Split plaats-test om de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van verschillende RAF-mutanten te kwantificeren, wat betrouwbaarder en gevoeliger is in vergelijking met de traditionele Co-Immunoprecipitation-assay. Kortom, deze methoden hebben de volgende voordelen: (1) gebruiksvriendelijk; (2) in staat zijn om effectief te kunnen uitvoeren zonder geavanceerde apparatuur; (3) kosteneffectief; (4) zeer gevoelig en reproduceerbaar.

Introduction

De RAF familie kinases zijn een belangrijk onderdeel van RAS/RAF/MEK/ERK signalering Cascade, die een signaal van RAS te activeren mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MEK)1,2,3,4. Deze familie van kinasen speelt een cruciale rol in celgroei, overleving en differentiatie, en hun veranderingen induceren vele ziekten, met name kanker5,6,7,8. Onlangs hebben genomische sequencings veel ziektegerelateerde RAF-mutanten geïdentificeerd die verschillende eigenschappen vertonen in de signaaloverdracht van RAS/RAF/MEK/ERK Cascade9,10,11. Een zorgvuldige karakterisering van de mutanten van de RAF zal ons helpen de moleculaire mechanismen te begrijpen van hoe de mutanten van de RAF de signaal output van RAS/RAF/MEK/ERK Cascade veranderen, en uiteindelijk passende benaderingen selecteren voor de behandeling van verschillende door de RAF gemuteerde ziekten.

De familie van de RAF kinases omvatten drie leden, CRAF, braf, en Araf, die vergelijkbare moleculaire structuren, maar verschillende capaciteiten te activeren downstream signalering1,2,3,4. Onder deze paralogs heeft braf de hoogste activiteit op grond van zijn constitutief gefosforyleerde NTA (N-terminal acidic) motief12,13,14, terwijl Araf de laagste activiteit die voortvloeit uit het niet-canonieke APE motief15. Dit kan verklaren de verschillende mutatie frequenties van RAF paralogs in ziekten: BRAF > CRAF > ARAF. Bovendien, binnen dezelfde RAF Paralog, mutaties in verschillende locaties kunnen leiden tot downstream signalering in verschillende manieren, die voegt een extra laag van complexiteit aan de regulering van de RAF familie kinases. Recente studies hebben aangetoond dat alle RAF kinases zowel de katalytische als de allosterische activiteiten13,14,16,17,18hebben. Constitutief actieve RAF-mutanten zetten de stroomafwaartse signalering rechtstreeks door fosforylating MEK, terwijl kinase-dode RAF-mutanten hun wild type tegenhangers kunnen transactiveren door middel van Side-to-side door dimerisatie en MEK-ERK-signalering16 activeren ,19,20. De dimeer-affiniteit/-stabiliteit is een belangrijke parameter die niet alleen de allosterische activiteit van kinase-dode RAF-mutanten bepaalt, maar ook de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten beïnvloedt,15,21, 22. de kinase-dode RAF mutanten met een hoge dimeer affiniteit/stabiliteit kunnen de endogene wild-type RAFs rechtstreeks transactiveren15, terwijl die met intermediaire dimeer affiniteit/stabiliteit vereist een coördinatie van actieve RAS of een verhoogde niveau van wild-type RAF moleculen om te functioneren13,15,20,21,23. Evenzo, grondwettelijk actieve RAF mutanten fosforylaat MEK in een dimeer-afhankelijke manier, en degenen met een lage dimeer affiniteit/stabiliteit verliezen hun katalytische activiteit in vitro op immunoprecipitatie die de zwakke RAF Dimeren breekt15, 21,22. De dimeer affiniteit/stabiliteit bepaalt ook de gevoeligheid van de RAF mutanten aan hun remmers, en positief correleert met de weerstand van de RAF-remmers24. Om ziekte-gerelateerde RAF-mutanten te karakteriseren, is het daarom noodzakelijk om hun katalytische en allosterische activiteiten te meten, en dimeer affiniteit/stabiliteit.

In de afgelopen jaren hebben ons laboratorium en anderen verschillende methoden ontwikkeld om RAF familie kinasen en hun mutanten te karakteriseren. Volgens ons laboratorium en de ervaring van anderen, denken we dat de volgende drie assays voordelen hebben bij het bepalen van ziekte-gerelateerde RAF-mutanten: (1) de in vitro kinase assay die gemakkelijk kan worden uitgevoerd om de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF mutanten15; (2) de RAF co-Activation assay is een betrouwbare en handige methode om de allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten13,15,21,22,23, 25; (3) de gratis gesplitste plaats test die een veel hogere gevoeligheid heeft bij het meten van de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van de mutanten van de RAF in tegenstelling tot de traditionele Co-Immunoprecipitation Assay, en is in staat om uit te voeren zonder geavanceerde apparatuur in contrast met de kwantitatieve analytische methoden zoals SPR (Sppervlakte Plasmon Resonance) analyse15,22. Door deze drie testen te combineren, kunnen we gemakkelijk begrijpen hoe een ziektegerelateerde RAF Mutant de downstream signalering verandert en zo een geschikte therapeutische strategie gebruiken om de ziekte te behandelen die wordt veroorzaakt door deze RAF-mutatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. in vitro kinase test voor het meten van de katalytische werking van de mutanten van de

  1. Construct vectoren coderen RAF mutanten (afbeelding 1A) met vlag (DYKDDDDK) tag bij C-Terminus met behulp van Gibson assembly of traditionele moleculaire klonen methoden.
    1. Introduceer de vlag tag en mutaties in de RAF-coderings sequenties door PCRs, en voeg vervolgens hele sequenties in pcdna 3.1 (+) vector met behulp van Gibson assembly of T4 DNA ligatie en volgens de protocollen van de fabricage. Gebruik de volgende voorwaarden voor PCR-reacties: (1) 95 °C, 2 min; (2) 95 °C, 30 s; (3) 59 °C, 30 s; (4) 68 °C, 3 min; (5) 20 cycli van (2 tot 4); (6) 4 °C vasthouden.
      Opmerking: De PCR-primers voor het klonen: 5-AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 en 5-CAGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTA-3.
    2. Voeg de GST-coderings volgorde stroomopwaarts van de RAF Mutant codering sequenties voor het genereren van vectoren codering GST-gesmolten RAF mutanten met behulp van dezelfde methoden zoals beschreven in stap 1.1.1.
    3. Valideer alle vectoren door DNA sequencings voor Transfectie.
  2. Plaat 293T cellen in 6-goed platen met een dichtheid van 5 x 105 cellen/goed één dag voor de trans-fectie. Wanneer de celdichtheid bereikt 80 ~ 90% samenloop op de tweede dag, transfect met vectoren coderen vlag-Tagged RAF kinases of hun mutanten uit stap 1,1 in cellen door het volgen van het Protocol van de vervaardiging van transfectie reagentia (tabel van materialen).
  3. Vervang het kweekmedium 24 uur na transfectie.
  4. Aspirate het kweekmedium 48 h na transfectie en Voeg 400 μL/goed van de lysisbuffer toe (25 mM tris · HCl, 150 mM NaCl, 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) aangevuld met protease-en fosfatase remmers op lyse cellen op ijs.
    Opmerking: De concentratie van NP-40 in de lysisbuffer is van cruciaal belang voor het opsporen van de katalytische werking van mutanten van de RAF met matige dimeer affiniteit/stabiliteit in vitro. Een hoge concentratie van detergens of een sterk wasmiddel in lysisbuffer kan RAF Dimeren breken en daarmee de katalytische activiteit van RAF kinases of hun mutanten doden.
  5. Breng de cellysaten over in een buis van 1,5 mL en draai het met 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c om celresten af te breken.
  6. Breng 300 μL per monster van schone gehele cellijnen naar 1,5 mL buizen, Voeg 20 μL per steekproef van anti-FLAG-affiniteits kralen toe en draai in een koude ruimte (4 °C) voor 1 uur. Neem ook 40 μL per monster van schoon hele celllysaat opzij voor het detecteren van de expressie en de activiteit (phospho-ERK1/2) van de RAF mutanten door immunoblots zoals hieronder beschreven.
  7. Was de anti-FLAG kralen één keer met lysisbuffer, dan eenmaal met kinase reactiebuffer (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 mm na3vo4, 0,5 mm DTT, pH 7,2) en Voeg 20 μl kinase reactiemengsel toe (2 μg MEK1 (K97A) en 100 μM ATP in 20 μL kinase re actie buffer) per sample.
    Opmerking: De kraal wassen moet voorzichtig en snel worden voltooid, de residuele buffer moet volledig worden opgezuigen voordat het kinase reactiemengsel toe te voegen, en alle operaties bij deze stap moeten worden uitgevoerd bij 4 ° c in een koude ruimte.
  8. Inbroed de kinase reacties bij kamertemperatuur (25 °C) gedurende 10 minuten, en draai de buisjes met kinase reacties met de vingers om de andere minuut tijdens de incubatie.
  9. Voeg 5 μL van 5x SDS sample buffer (375 mM tris · HCl, 9% natriumdodecylsulfaat (SDS), 50% glycerol, 0,03% Bromophenol blauw) per monster om kinase reacties te stoppen, en verwarm vervolgens de monsters bij 90 °C gedurende 5 minuten.
  10. Voer de monsters uit in 9 ~ 12% polyacrylamidegel elektroforese (pagina) met 0,1% SDS, breng de eiwitten over naar nitrocellulose membraan en Detecteer de niveaus van fosho-MEK en RAF mutanten in monsters door immunoblots.
    Opmerking: De fosho-MEK kan ook worden gekwantificeerd met behulp van γ32P-ATP-integratie. Kort, 10 μM γ32P-ATP wordt toegevoegd aan de kinase reactiebuffer, en de hoeveelheid fosforyleerd MEK wordt vervolgens gekwantificeerd na pagina scheiding met behulp van standaard autoradiografie, phosphorimaging, of vloeibare Scintillatie tellings technieken als Passende.

2. RAF co-activatie assay voor de evaluatie van de Allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten

  1. Construct vectoren coderen van de RAF-ontvanger (CRAF kinase domein met unfosforylatable NtA motief, AAFF) of de kinase-Dead RAF Activators (RAF kinase domein met fosforylation-mimicked NtA motief, SSDD, DDEE of DGEE) (Figuur 1A) als beschreven in stap 1,1.
  2. Transfect 293T cellen met twee vectoren coderen zowel de RAF-ontvanger en de kinase-Dead RAF Activator of een enkele vector codering een van eiwitten zoals beschreven in de stappen 1,2 en 1,3.
  3. Vervang het kweekmedium om 24 uur na de transfectie en oogst 293T transfectanten op 48 h om de hele celllysates voor te bereiden zoals beschreven in stappen 1,4 en 1,5.
  4. Meng het schone hele cellysaat met 5x SDS sample buffer snel bij kamertemperatuur (25 °C) en kook vervolgens gedurende 5 minuten bij 90 °C.
  5. Voer de gekookte whole Cell lysaat samples uit in 9 ~ 12% pagina met 0,1% SDS, breng de eiwitten over naar nitrocellulose membraan en Detecteer de niveaus van phospho-ERK1/2 en controle eiwitten door immunoblots.

3. gratis Split Luciferase assay voor het meten van de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van de RAF mutanten

  1. Construct vectoren codering vlag-Tagged RAF mutanten versmolten met het N-eindpunt van Nluc (N-Terminus van Firefly Luciferase, Aa2-416) of het C-eindpunt van Cluc (C-Terminus van Firefly Luciferase, aa398-550) zoals beschreven in stap 1,1.
  2. Transfect 293T cellen met een paar vectoren coderen verschillende Nluc-RAF mutanten en Cluc-RAF mutanten zoals beschreven in stap 1,2.
  3. Bij 24 h na transfectie, replate 293T celtransfectants in Krystal Black beeld platen bij de celdichtheid van 2x105 per goed met kleur vrij medium (dat wil zeggen, DMEM zonder fenolrood).
  4. 24 h later, Voeg D-Luciferin (0,2 mg/ml) aan 293t celtransfectants, inbroed gedurende 30 min, en meet de plaats signalen met behulp van een multi-detectiesysteem (tabel van de materialen).
  5. Na het meten van de plaats-signalen, aspireren de medium en lyse 293t transfectants met lysis buffer om de hele celllysates voor te bereiden zoals beschreven in de stappen 1,4 en 1,5.
  6. Voer de hele cel lysaat samples uit in 9 ~ 12% pagina met 0,1% SDS en Detecteer de uitdrukkings niveaus van nluc-RAF mutanten en cluc-RAF mutanten door Anti-Flag immunoblot zoals beschreven in stap 2,5. De relatieve uitdrukkings niveaus van zowel Nluc-RAF Mutant als Cluc-RAF mutant in 293T transfectants worden gekwantificeerd met behulp van afbeelding J van hun immunoblots.
  7. Normaliseer de plaats-signalen van 293t celtransfectanten volgens de uitdrukkings niveaus van nluc-RAF mutanten en cluc-RAF mutanten. In het kort wordt dit bereikt door het ruwe plaats-signaal te delen door de relatieve uitdrukkings niveaus van nluc-RAF mutanten en cluc-RAF mutanten uit stap 3,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De familie kinasen van de RAF hebben zowel katalytische als allosterische activiteiten, waardoor hun ziektegerelateerde mutanten de stroomafwaartse signalering kunnen inschakelen via verschillende mechanismen13,14,16,17 ,18. De constitutief actieve RAF mutanten direct fosforylaathun substraten, terwijl de kinase-dode RAF mutanten hun functie vervullen door het transactiverende wild-type tegenhangers. Zoals weergegeven in Figuur 1B, beide constitutief actieve RAF mutanten (zoals regulatoire wervelkolom (R-wervelkolom) mutanten (braf (L505M), CRAF (ddee/L397M) en Araf (DGEE/L358M))13,23,25 , 26, BRAF (V600E) en braf (∆ nvtap)) en kinase-dode RAF mutanten (zoals katalytische wervelkolom (C-wervelkolom)-gesmolten braf (∆ nvtap/V471F)15) activeert ERK wanneer uitgedrukt in 293t cellen. Daarom kan het vermogen van de RAF-mutanten om ERK-signalering in cellen te activeren niet als een standaard dienen om een constitutief actieve Mutant van een kinase-dode Mutant te onderscheiden, hoewel sommige kinase-dode mutanten met matige dimeer affiniteit/stabiliteit aan downstream signalering alleen met de medewerking van actieve RAS. Drie methoden die we hier hebben gepresenteerd, kunnen ons helpen om alle ziektegerelateerde RAF-mutanten effectief te karakteriseren. De biologische eigenschappen van alle RAF mutanten onthuld door het gebruik van deze testen in onze vorige studies zijn samengevat in tabel 1.

De eerste methode die we kunnen gebruiken om de constitutief actieve RAF mutanten te onderscheiden van de kinase-dode RAF mutanten is de in-vitro kinase assay. In deze test werden de RAF-mutanten gezuiverd door immunoprecipitatie en werden de katalytische reacties in vitro uitgevoerd met kinase-Dead MEK1 (K97A) en ATP als substraten. De katalytische activiteit van de mutanten van de RAF werd gemeten als het AL (eenctivation LOOP)-FOSFORYLERING van MEK1 (K97A) in de kinase reactie mengsels door immunoblot. Zoals weergegeven in Figuur 1C, kan deze test de katalytische activiteit van mutanten van R-wervelkolom van braf, CRAF en Araf13,15,23, braf (V600E)9en braf (∆ nvtap)15, maar niet die van kinase-Dead BRAF (V471F/∆ NVTAP)15 die een gesmolten C-wervelkolom heeft. Echter, de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF mutanten met zwakke dimeer affiniteit/stabiliteit zoals Araf R-wervelkolom Mutant (Araf (DGEE/L358M)) (Figuur 1C, Lane 4), CRAF en Araf mutanten met veranderde dimeer interface (CRAF (ddee/ L397M/R401H), Araf (DGEE/L358M/Ape/R362H))15,22 (Figuur 1D, E) mag niet door middel van deze test worden geproefd, omdat hun Dimeren tijdens de zuivering zijn gebroken, vooral wanneer de zuivering uitgevoerd met buffers die sterke of hoge-concentratie detergenten bevatten. Om te voorkomen dat het verlies van de katalytische activiteit van de mutanten van de RAF met zwakke dimeer affiniteit/stabiliteit, we meestal gesmolten deze mutanten met gst (glutathion S-transferase), een dimeer eiwit met sterke affiniteit/stabiliteit voordat het uitvoeren van in vitro kinase Assay, die de katalytische werking van deze RAF mutanten kan redden15,22 (Figuur 1E). In het algemeen, de meeste RAF mutanten kunnen worden geclassificeerd als constitutief actieve of kinase-dode mutanten met behulp van deze test.

De tweede methode die we hier beschreven is de RAF co-Activation assay die kan worden gebruikt voor het evalueren van de allosteric activiteit van kinase-Dead RAF mutanten13,15,21,22,23 , 25. Hoewel een paar kinase-dode RAF mutanten met een zeer hoge dimeer affiniteit/stabiliteit zoals braf (V471F/∆ nvtap)15, kan direct endogene RAF moleculen activeren wanneer uitgedrukt in cellen (Figuur 1B, Lane 7), de meeste kinase-Dead RAF mutanten vereisen de samenwerking van actieve RAS om wild-type RAFs te transactiveren. Actieve RAS is echter een directe activator van ERK-signalering, wiens inleiding het basale niveau van de actieve ERK zal verhogen. Om de interferentie van actieve RAS te voorkomen, gebruikten we N-Terminus-afgeknotte RAF-mutanten in deze assay (Figuur 2A). Zoals weergegeven in Figuur 2B, kinase-dode mutanten van BRAF, CRAF en RAF met zure NTA motief en C-WERVELKOLOM fusie (braf (V471F, aa431-766), CRAF (ddee/V363F, aa323-648), en ARAF (DGEE/V324F, aa284-606)) functioneerde als allosteric activatoren om trigger de katalytische activiteit van CRAF met niet-fosforylatable NtA motief (CRAF ontvanger, CRAF (AAFF, aa323-648)) wanneer mede uitgedrukt in 293T cellen. De kinase-Dead BRAF Mutant (V471F/∆ NVTAP, aa431-766) met een zeer hoge dimeer affiniteit/stabiliteit (zie hieronder) draaide ERK-signalering in door endogene Raf's te triggeren, zelfs zonder de co-expressie van CRAF receiver. Over het algemeen kan deze test worden gebruikt om het transactiveringsvermogen van alle kinase-dode RAF mutanten te evalueren.

De door dimerisatie van RAF familie kinases regelt niet alleen hun vermogen om downstream MEK-ERK-signalering te activeren, maar bepaalt ook hun gevoeligheid voor RAF-remmers15,16,20,22,24,27,28,29,30,31,32. In tegenstelling tot andere eiwit-eiwit interacties onder dit traject33,34,35, de door dimerisatie van RAF familie kinases en hun mutanten is relatief zwak en moeilijk te beoordelen met behulp van traditionele biochemie testen zoals co-immunoprecipitatie. Om dit probleem op te lossen, hebben we onlangs een gratis Split plaats assay ontwikkeld voor het meten van de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van RAF familie kinasen en hun mutanten15,22,36. Zoals weergegeven inFiguur 3A, de RAF kinase domeinen (aa431-766 voor braf, aa323-648 voor CRAF, en aa284-606 voor Araf) werden respectievelijk gesmolten met N-Terminus (Aa2-416) of C-Terminus (aa398-550) van Firefly plaats (nluc en cluc), die zal worden samengebracht om intact te monteren plaats op RAF dimerization. De activiteit van plaats in deze assay correleert rechtstreeks met de hoeveelheid RAF dimers. Deze test is zeer gevoelig en kan zelfs een zeer zwakke door dimerisatie van RAF mutanten detecteren. Zoals we eerder gemeld15fungeert de oncogene BRAF (V600E) als een dimeer en alleen een samengestelde mutatie met de ARG-to-his-Mutatie (R509H) in de dimeer-interface en de wijziging van de niet-canonische APE (P622A in APE motief) kan zijn dimerisatie volledig afschaffen en zo zijn katalytische activiteitFiguur 3B). Door gebruik te maken van in vitro kinase Assay, ontdekten we verder dat BRAF (V600E) variant met het veranderde APE motief, BRAF (V600E/AAE), maar niet dat met de ARG-naar-zijn mutatie in dimeer interface, BRAF (V600E/R509H), zijn katalytische activiteit verloor bij zuivering (Figuur 3C), wat suggereert dat de vroegere variant veel minder dimeer affiniteit/stabiliteit heeft dan laatstgenoemde. Om direct de neiging van deze braf (V600E) varianten te meten om dimers te vormen, voerden we een gratis Split plaats assay uit, en bevestigden dat deze varianten heel verschillend dimeer affiniteit/stabiliteit hadden met braf (V600E) hoger dan braf (V600E/ R509H) dan BRAF (V600E/AAE) dan BRAF (V600E/R509H/AAE) (Figuur 3D). Het plaats-signaal geproduceerd door monomere braf (V600E/R509H/AAE) was vergelijkbaar met dat van niet-getranssinfecteerde 293t-controle (Figuur 3D, linker paneel Lane 5), wat aangeeft dat deze test een zeer lage achtergrond heeft. Om verder te bepalen de effectiviteit van gratis Split plaats Assay, we volgende gemeten met behulp van deze assay de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van een groep van oncogene braf mutanten met in-frame deleties van β3-αc lus die werd geïdentificeerd door ons en andere Groepen15,37,38. Zoals we weten, hoewel al deze mutanten geactiveerd ERK signalering wanneer uitgedrukt in 293T cellen (Figuur 3E) vertoonden zij een vrij differentiële katalytische activiteit in vitro (Figuur 3F). De BRAF (∆ MLN (aa484-486 del)) en BRAF (∆ NVTAP (aa486-490 del)) waren zeer actief na zuivering door immunoprecipitaion, terwijl de BRAF (∆ NVTAPT (aa486-491 del)) en BRAF (∆ QA (aa496-497 del)) hun katalytische activiteit onder dezelfde voorwaarde verloren kan worden gered door GST Fusion. Bovendien vertoonde de kinase-dode versie van BRAF (∆ NVTAP), BRAF (V471F/∆ NVTAP) een sterke potentie om endogene Raf's te activeren wanneer uitgedrukt in cellen (Figuur 1BLane 7). Deze gegevens suggereren dat deze groep van BRAF mutanten een heel andere dimeer affiniteit/stabiliteit heeft met BRAF (∆ NVTAP) hoger dan BRAF (∆ MLN) dan BRAF (∆ NVTAPT) en BRAF (∆ QA). Inderdaad, het resultaat van de gratis Split plaats assay volledig ondersteund onze deductie (Figuur 3G). Samen, onze gegevens geven aan dat de gratis Split plaats assay is een betrouwbare methode voor het meten van de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van de RAF mutanten.

Figure 1
Figuur 1 : Sonde de katalytische werking van de mutanten van de RAF met behulp van in vitro kinase assay. A) een schematisch diagram voor in deze studie gebruikte RAF-mutaties. B) zowel constitutief actieve als kinase-dode RAF-mutanten kunnen ERK-signalering activeren wanneer ze in cellen worden uitgedrukt. 293T cellen werden getransffecteerd met vectoren die verschillende RAF mutanten coderen, en de activiteit van ERK werd gedetecteerd door anti-fosho-ERK1/2 immunoblot. C) constitutief actieve RAF-mutanten met een lage affiniteit/stabiliteit en kinase-dode RAF mutanten kunnen in vitro MEK niet fosforysaat worden bij zuivering door immunoprecipitatie. De mutanten van de RAF in B werden gezuiverd met behulp van anti-FLAG kralen, en hun katalytische activiteit werd gepropapuleerd met behulp van in vitro kinase assay zoals beschreven in het protocol. (D-E) De in vitro katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten met een lage dimeer affiniteit/stabiliteit kan worden gered door GST Fusion. (D) constitutief actieve RAF-mutanten en hun gst-gefuseerde tegenhangers werden uitgedrukt in 293t cellen en hun activiteit werd gemeten door anti-fosho-ERK1/2 immunoblot. (E) RAF-mutanten in D werden gezuiverd door immunoprecipitatie, en hun in vitro katalytische activiteit werd gepropapuleerd met behulp van in vitro kinase assay zoals beschreven in het protocol. RAF R-spine Mutants: BRAF (L505M), CRAF (DDEE/L397M) en ARAF (DGEE/L358M). "∆ NVTAP" staat voor het verwijderen van aa486-490 in BRAF. De APE mutatie van ARAF betekent A475P dat een canonieke APE motief genereert in ARAF. "KD" staat voor "kinase Domain" in de volledige tekst. BRAF (KD) betekent het aa431-766 fragment van BRAF, terwijl CRAF (KD) en ARAF (KD) respectievelijk voor het aa323-648 fragment van CRAF en het aa284-606 fragment van ARAF vertegenwoordigen. De resultaten in dit cijfer zijn eerder15,22gerapporteerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 : Evalueer het vermogen van de RAF mutanten om wild type Raf's te transactiveren met behulp van de RAF co-Activation assay. A) een diagram ter illustratie van de RAF-coactiveringstest. B) kinase-dode RAF-mutanten met een zuur NTA-motief werden co-uitgedrukt met katalyse-bevoegde CRAF-ontvanger in 293t-cellen, en de activiteit van ERK1/2 in 293t transfectants werd gemeten door anti-PHOSHO-ERK1/2 immunoblot. De meeste kinase-dode RAF mutanten behalve BRAF (V471F/∆ NVTAP) met een zeer hoge dimeer affiniteit/stabiliteit vereist de co-expressie van exogene RAF ontvanger om ERK signalering in te schakelen. De resultaten in dit cijfer zijn eerder15,22gerapporteerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 : Meet de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van de RAF mutanten met behulp van de gratis Split plaats assay. A) een diagram ter illustratie van de kosteloze bepaling van de gesplitste plaats. (B-D) De door dimerisatie van braf (V600E) varianten is nodig voor hun katalytische activiteit in vivo en in vitro. B) de monomerische BRAF (V600E) variant, BRAF (V600E/R509H/AAE) heeft geen katalytische activiteit in vivo, die kan worden TERUGGEWONNEN door gst Fusion. BRAF (V600E) varianten en hun GST-gesmolten tegenhangers werden uitgedrukt in 293T cellen, en hun activiteit werd gemeten door anti-fosho-ERK1/2. C) de BRAF (V600E) variant met een lage dimeer affiniteit/stabiliteit, BRAF (V600E/AAE) verloor zijn katalytische activiteit in vitro bij zuivering, die kan worden gered door gst Fusion. BRAF (V600E) varianten van B werden gezuiverd door immunoprecipitatie en hun katalytische activiteit werd door de in vitro kinase assay gepropapuleerd zoals beschreven in het protocol. D) de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van braf (V600E) varianten werd gemeten met behulp van de gratis gesplitste plaats test zoals beschreven in het protocol. (E-G) Braf mutanten met in-frame deletie van β3-αc loop functie als Dimeren om ERK signalering te activeren. E) braf mutanten met in-frame deletie van β3-αc-lus Activeer ERK-signalering wanneer uitgedrukt in cellen. BRAF mutanten werden uitgedrukt in 293T cellen en hun activiteit werd gemeten zoals beschreven in B. F) braf mutanten met een lage dimeer affiniteit/stabiliteit van E verloren hun katalytische activiteit in vitro, die kan worden gered door gst Fusion. De in vitro katalytische werking van BRAF mutanten en hun GST-gefuseerde tegenhangers van E werden gemeten als in C. G) braf mutanten met in-frame deletie van β3-αc loop hebben een heel andere dimeer affiniteit/stabiliteit. De relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van BRAF mutanten met in-frame deletie van β3-αC lus werd gemeten als in D. Foutbalken in D & G vertegenwoordigen s.d. om de variantie tussen onafhankelijke experimenten weer te geven (n = 4). De AAE-mutatie van BRAF betekent P622A in APE motief dat een niet-canonieke APE motief genereert. "∆ MLN", "∆ NVTAPT", en "∆ QA" vertegenwoordigen respectievelijk voor de verwijderingen van aa484-486, aa486-491, aa496-497 in de β3-αC-lus van BRAF. Sommige resultaten in dit cijfer zijn eerder gemeld15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Table 1
Tabel 1: De biologische eigendom van verschillende RAF mutanten. De katalytische activiteit, allosterische activiteit en relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van alle in deze studie gebruikte RAF-mutanten zijn samengevat in deze tabel. "Y" betekent "ja", terwijl "N" staat voor "nee". "N*" geeft aan dat die mutanten katalytische activiteit hebben als ze worden samengesmolten met gst. "+ + + +", "+ + +", "+ +", "+" en "-" vertegenwoordigen respectievelijk voor "zeer sterk", "sterk", "intermediair", "zwak" en "geen".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel presenteerden we drie methoden voor het karakteriseren van de ziekte-gerelateerde RAF mutanten, waaronder in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en gratis Split plaats assay. Aangezien RAF kinases zowel katalytische activiteit als allosterische activiteit hebben, kunnen verschillende RAF-mutanten de stroomafwaartse signalering activeren via twee verschillende mechanismen13,14,16,17, 18. de constitutief actieve RAF mutanten direct fosforysaat de stroomafwaartse EFFECTOR MEK, terwijl de kinase-dode RAF mutanten de stroomafwaartse signalering triggeren door hun wild type tegenhangers te transactiveren. Echter, zowel constitutief actieve en kinase-dode RAF mutanten vereisen de door dimerisatie om hun functie te vervullen15,16,17,19,20, en de dimeer de neiging van de mutanten van de RAF bepaalt niet alleen de katalytische of allosterische activiteit van de mutanten van de RAF, maar ook hun gevoeligheid voor de RAF-remmers15,24. De in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en gratis Split plaats assay bieden ons een reeks eenvoudige, effectieve en betrouwbare methoden voor het onderscheiden van de constitutief actieve mutanten van de kinase-dode mutanten, evenals het evalueren van hun mogelijkheid om downstream signalering te activeren.

De in vitro kinase assay is een klassieke methode om de katalytische activiteit van eiwit kinasen te detecteren. Om deze methode voor het meten van de katalytische werking van de mutanten van de RAF aan te nemen, hebben we een aantal belangrijke herzieningen doorgevoerd in reagentia en procedures15,21,22. Aangezien de RAF familie kinases fungeren als Dimeren om hun substraat, MEK, en hun dimeer affiniteit/stabiliteit is relatief laag, hebben we de concentratie van afwasmiddel NP-40 verlaagd van 1% naar 0,25% in buffers voor het zuiveren van RAF-eiwitten om te voorkomen dat RAF Dimeren van dissociatie. Door hetzelfde token, we hebben ook gebruikt een zachte Quick Wash procedure voor RAF eiwit zuivering. Deze veranderingen zijn van cruciaal belang voor het opsporen van de katalytische werking van constitutief actieve RAF mutanten met een zeer zwakke dimeer affiniteit/stabiliteit, die kunnen worden geïdentificeerd als "kinase-Dead" RAF mutanten door de klassieke in vitro kinase assay. Daarnaast hebben we aangetoond dat de gst-fusie een goede alternatieve manier is om te voorkomen dat RAF-Dimeren van dissociatie tijdens zuivering in deze assay15,21,22. Met betrekking tot de kinase-dode RAF mutanten, zelfs als ze zijn gefuseerd met GST, vertonen ze geen katalytische activiteit in deze test.

De RAF co-Activation assay is door ons ontwikkeld om het vermogen van kinase-Dead RAF mutanten te evalueren om hun wild type tegenhangers te transactiveren13,15,21,22,23 , 25. in deze nieuwe assay gebruiken we het N-Terminus afgeknotte RAF-eiwitten en hebben daardoor geen co-expressie nodig van actieve RAS-mutanten of het activeren van ras, wat deze assay zeer gevoelig maakt. Daarnaast kan de allosteric Activator (kinase-Dead RAF Mutant) en de ontvanger (katalyse-competente RAF Mutant) in deze test gemakkelijk worden geïsoleerd en gezuiverd voor het onderzoeken van moleculaire gebeurtenissen in het proces van dimerization-gedreven trans activatie 13.

Zoals hierboven vermeld, de dimeer affiniteit/stabiliteit is een belangrijke factor die de functie van de RAF familie kinasen en hun mutanten regelt, en ook bepaalt hun gevoeligheid voor de RAF-remmers13,14,15, 16,17,18,24. Echter, de dimeer affiniteit/stabiliteit van RAF familie kinasen en hun meest ziekte-gerelateerde mutanten is zeer laag. Voor het meten van deze parameter, de traditionele biochemie assays vereisen compliceren experimentele procedures en geavanceerde apparatuur (zoals SPR assay), of nauwelijks produceren betrouwbare en reproduceerbaar gegevens (zoals immunoprecipitatie assay). De gratis Split plaats assay daarentegen is een eenvoudige, gevoelige, consistente en kosteneffectieve methode voor het meten van de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van de RAF familie kinasen en hun mutanten15,21, 22,36. Deze test kan het subtiele verschil van dimeer affiniteit/stabiliteit tussen verschillende RAF mutanten. Zoals we gemeld vóór15, braf (V600E/AAE) heeft een zeer zwakke dimeer affiniteit/stabiliteit en de Dimeren zal volledig worden gebroken na zuivering, zelfs als met behulp van een zeer zachte procedure. Met behulp van deze test kunnen we de zwakke dimeer-affiniteit/stabiliteit van BRAF (V600E/AAE) onderscheiden van die van monomerische BRAF (V600E/AAE/R509H) (Figuur 3).

Samengevat, deze set van praktische en haalbare methoden kan voldoen aan de vereisten van het definiëren van alle ziekte-gerelateerde RAF mutanten, en zo helpen ons te selecteren passende strategieën voor de behandeling van verschillende door de RAF Mutant gedreven ziekten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

De auteurs willen graag de Hairy Cell Leukemia Fellowship voor steun van Yuan Jimin erkennen. Dit werk werd gesteund door Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), hertog-NUS Khoo Bridge funding Award (hertog-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging subsidie (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), en SHF academische geneeskunde Onderzoeksbeurs (AM/TP011/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
  2. Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
  3. Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase". FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
  4. Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
  5. Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
  6. Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
  7. McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
  8. Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
  9. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
  10. Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
  11. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
  12. Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
  13. Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
  14. Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
  15. Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
  16. Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
  17. Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
  18. Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
  19. Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
  20. Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
  21. Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).
  22. Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
  23. Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
  24. Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
  25. Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
  26. Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
  27. Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  28. Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
  29. Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).
  30. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
  31. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
  32. Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
  33. Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).
  34. Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. "RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
  35. García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
  36. Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  37. Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
  38. Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).

Tags

Kankeronderzoek uitgave 149 RAF familie kinasen RAF-mutatie ras/RAF/MEK/ERK-signalering dimerisatie dimeer affiniteit/stabiliteit katalytische activiteit allosterische activiteit in vitro kinase Assay RAF co-activatie Assay complementaire Split plaats assay kanker
Karakteriseren ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen met behulp van een set van praktische en haalbare methoden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H.,… More

Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter