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Cancer Research

Charakterisieren Sie krankheitsbedingte Mutanten der Kinases der RAF-Familie durch die Verwendung einer Reihe praktischer und machbarer Methoden

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59795
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

Summary

In diesem Artikel haben wir eine Reihe praktischer und praktikabler Methoden zur Charakterisierung krankheitsbedingter Mutanten von KI-Familienkinasen vorgestellt, die In-vitro-Kinase-Assay, RAF-Koaktivierungstest und komplementärer Split-Luziferase-Assay umfassen.

Abstract

Die schnell beschleunigten Fibrosarkom (RAF) Familie Kiinasen spielen eine zentrale Rolle in der Zellbiologie und ihre Dysfunktion führt zu Krebs und Entwicklungsstörungen. Eine Charakterisierung krankheitsbedingter RAF-Mutanten wird uns helfen, geeignete therapeutische Strategien zur Behandlung dieser Krankheiten auszuwählen. Jüngste Studien haben gezeigt, dass KI-Familienkiinasen sowohl katalytische als auch allosterische Aktivitäten haben, die durch Dimerisierung streng reguliert werden. Hier haben wir eine Reihe praktischer und praktikabler Methoden konstruiert, um die katalytischen und allosterischen Aktivitäten und die relative Dimeraffinität/Stabilität von RAF-Familienkiinasen und ihren Mutanten zu bestimmen. Erstens haben wir den klassischen In-vitro-Kinase-Assay geändert, indem wir die Waschmittelkonzentration in Puffern reduziert enden, ein sanftes Schnellwaschverfahren anwenden und eine Glutathion-S-Transferase-Fusion (GST) verwenden, um zu verhindern, dass sich RAF-Dimer während der reinigung. Dies ermöglicht es uns, die katalytische Aktivität konstitutiv aktiver RAF-Mutanten angemessen zu messen. Zweitens haben wir einen neuartigen RAF-Coaktivierungstest entwickelt, um die allosterische Aktivität von kinase-toten RAF-Mutationen zu bewerten, indem wir N-terminal abgeschnittene RAF-Proteine verwenden, die Anforderung von aktiven Ras in aktuellen Protokollen eliminieren und dadurch eine höhere sensibilität. Schließlich haben wir einen einzigartigen komplementären Split-Luziferase-Assay erstellt, um die relative Dimeraffinität/Stabilität verschiedener RAF-Mutationen quantitativ zu messen, was zuverlässiger und empfindlicher ist als der traditionelle Co-Immunoprecipitation-Assay. Zusammenfassend haben diese Methoden folgende Vorteile: (1) benutzerfreundlich; (2) in der Lage sind, ohne fortgeschrittene Ausrüstung effektiv durchzuführen; (3) kosteneffektiv; (4) hochempfindlich und reproduzierbar.

Introduction

Die Kinasen der RAF-Familie sind eine Schlüsselkomponente der RAS/RAF/MEK/ERK-Signalkaskade, die ein Signal von RAS zur Aktivierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MEK)1,2,3,4. Diese Familie von Kiinasen spielt eine entscheidende Rolle für Zellwachstum, Überleben und Differenzierung, und ihre Veränderungen induzieren viele Krankheiten, vor allem Krebs5,6,7,8. Kürzlich haben genomische Sequenzierungen viele krankheitsbedingte RAF-Mutationen identifiziert, die unterschiedliche Eigenschaften in der Signalübertragung von RAS/RAF/MEK/ERK-Kaskade9,10,11aufweisen. Eine sorgfältige Charakterisierung von RAF-Mutationen wird uns helfen, die molekularen Mechanismen zu verstehen, wie RAF-Mutanten die Signalleistung von RAS/RAF/MEK/ERK-Kaskade verändern, schließlich geeignete Ansätze zur Behandlung verschiedener RAF-mutierter Krankheiten auswählen.

Die Kiinasen der RAF-Familie umfassen drei Mitglieder, CRAF, BRAF und ARAF, die ähnliche molekulare Strukturen, aber unterschiedliche Fähigkeiten haben, um die nachgeschaltete Signalisierung1,2,3,4zu aktivieren. Unter diesen Paralogen hat BRAF die höchste Aktivität aufgrund seines konstitutiv phosphorylierten NtA- (N-terminal acidic) Motiv12,13,14, während ARAF das niedrigste Tätigkeit, die sich aus dem nicht-kanonischen APE-Motiv15ergibt. Dies kann die unterschiedlichen Mutationshäufigkeiten von RAF-Paralogen bei Krankheiten erklären: BRAF>CRAF>ARAF. Darüber hinaus können Mutationen an verschiedenen Standorten innerhalb desselben RAF-Paralogs auf unterschiedliche Weise nachgeschaltete Signalisierung auslösen, was der Regulierung von KI-Familienkinasen eine weitere Komplexitätsschicht hinzufügt. Jüngste Studien haben gezeigt, dass alle RAF-Kiinasen sowohl katalytische als auch allosterische Aktivitäten haben13,14,16,17,18. Konstitutiv aktive RAF-Mutationen schalten die nachgeschaltete Signalisierung direkt durch Phosphorylating MEK ein, während kinasetote RAF-Mutationen ihre wildtypisierten Gegenstücke durch Seiten-zu-Seite-Dimerisierung transaktivieren und die MEK-ERK-Signalisierung 16 aktivieren können. ,19,20. Die Dimer-Affinität/Stabilität ist ein wichtiger Parameter, der nicht nur die allosterische Aktivität von kinase-toten RAF-Mutanten bestimmt, sondern auch die katalytische Aktivität konstitutiv aktiver RAF-Mutanten15,21, 22. Die kinase-toten RAF-Mutationen mit hoher Dimer-Affinität/Stabilität können die endogenen Wildtyp-RAFs direkt15transaktivieren, während diejenigen mit mittlerer Dimeraffinität/Stabilität eine Koordination von aktiven Ras oder erhöhte Seebene von wildtypen RAF-Molekülen auf Funktion13,15,20,21,23. In ähnlicher Weise phosphorylieren konstitutiv aktive RAF-Mutationen MEK auf dimerabhängige Weise, und diejenigen mit geringer Dimer-Affinität/Stabilität verlieren ihre katalytische Aktivität in vitro nach Immunpräzipation, die die schwachen RAF-Dimerebricht 15, 21,22. Die Dimer-Affinität/Stabilität bestimmt auch die Empfindlichkeit von RAF-Mutanten gegenüber ihren Inhibitoren und korreliert positiv mit der Resistenz von RAF-Hemmern24. Daher ist es notwendig, ihre katalytischen und allosterischen Aktivitäten zu messen, um krankheitsbedingte RAF-Mutationen zu charakterisieren, und die Affinität/Stabilität zu verschleiern.

In den letzten Jahren haben unser Labor und andere verschiedene Methoden entwickelt, um die Kiinasen der RAF-Familie und ihre Mutanten zu charakterisieren. Nach der Erfahrung unseres Labors und der Erfahrung anderer denken wir, dass die folgenden drei Assays Vorteile bei der Definition krankheitsbedingter RAF-Mutanten haben: (1) der In-vitro-Kinase-Assay, der mit Leichtigkeit durchgeführt werden kann, um die katalytische Aktivität konstitutivzu zu erkennen aktive RAF-Mutanten15; (2) der RAF-Koaktivierungstest, der eine zuverlässige und bequeme Methode zur Messung der allosterischen Aktivität von kinase-toten RAF-Mutanten13,15,21,22,23ist, 25; (3) der komplementäre Split-Luziferase-Assay, der im Gegensatz zum herkömmlichen Co-Immuno-Präzipitationstest eine viel höhere Empfindlichkeit bei der Messung der relativen Dimeraffinität/-stabilität von RAF-Mutanten hat und ohne fortgeschrittene Ausrüstung in im Gegensatz zu den quantitativen analytischen Methoden wie SPR (Surface Plasmon Resonance) Analyse15,22. Durch die Kombination dieser drei Assays können wir leicht verstehen, wie ein krankheitsbedingter RAF-Mutant die nachgeschaltete Signalisierung verändert und dabei eine geeignete therapeutische Strategie zur Behandlung der durch diese RAF-Mutation verursachten Krankheit nutzt.

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Protocol

1. In Vitro Kinase Assay zur Messung der katalytischen Aktivität von RAF Mutanten

  1. Konstruieren Sie Vektoren, die RAF-Mutationen (Abbildung1A) mit FLAG(DYKDDDDK) Tag am C-terminus codieren, indem Sie Gibson Assembly oder traditionelle molekulare Klonmethoden verwenden.
    1. Führen Sie das FLAG-Tag und die Mutationen durch PCRs in die RAF-Codierungssequenzen ein, und fügen Sie dann ganze Sequenzen in den pCDNA3.1(+)-Vektor ein, indem Sie Gibson-Baugruppe oder T4-DNA-Ligation verwenden und den Protokollen der Herstellung folgen. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen für PCR-Reaktionen: (1) 95 °C, 2 min; (2) 95 °C, 30 s; (3) 59 °C, 30 s; (4) 68 °C, 3 min; (5) 20 Zyklen von (2 bis 4); (6) 4 °C halten.
      HINWEIS: Die PCR-Primer zum Klonen: 5- AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 und 5-CAGCGGGTTTAACGGGCCCTCTA-3.
    2. Fügen Sie die GST-Codierungssequenz vor DEN RAF-Mutanten-Codierungssequenzen ein, um Vektoren zu generieren, die GST-gebundene RAF-Mutationen kodieren, indem Sie dieselben Methoden verwenden, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben.
    3. Validieren Sie alle Vektoren durch DNA-Sequenzierungen vor der Transfektion.
  2. Platte 293T-Zellen in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5 x 105 Zellen/gut einen Tag vor der Transfektion. Wenn die Zelldichte am zweiten Tag 80 bis 90 % Zusammenfluss erreicht, transfekt man sich mit Vektoren über, die MIT FLAG-markierten RAF-Kiinasen oder deren Mutanten von Schritt 1.1 in Zellen kodieren, indem sie dem Herstellungsprotokoll von Transfektionsreagenzien folgen (Materialtabelle).
  3. Ersetzen Sie das Kulturmedium 24 h nach der Transfektion.
  4. Saugen Sie das Kulturmedium 48 h nach der Transfektion und fügen Sie 400 l/Well lysis Puffer (25 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren zu Lysezellen auf Eis.
    HINWEIS: Die Konzentration von NP-40 im Lysepuffer ist entscheidend für den Nachweis der katalytischen Aktivität von RAF-Mutanten mit moderater Dimer-Affinität/Stabilität in vitro. Eine hohe Konzentration von Waschmittel oder ein starkes Reinigungsmittel im Lysepuffer kann RAF-Dicher brechen und dadurch die katalytische Aktivität von RAF-Kiinasen oder deren Mutanten abtöten.
  5. Übertragen Sie die Zelle lysiert in ein 1,5 ml Rohr, und drehen Sie um 12.000 x g für 10 min bei 4 °C, um Zellablagerungen zu abbauen.
  6. Übertragen Sie 300 l pro Probe sauberer ganzer Zelllysate auf 1,5 ml-Rohre, fügen Sie 20 l pro Probe anti-FLAG-Affinitätsperlen hinzu und drehen Sie in einem kalten Raum (4 °C) für 1 h. Nehmen Sie auch 40 l pro Probe von sauberem vollzelligem Lysat beiseite, um die Expression und Aktivität (Phospho-ERK1/2) von RAF-Mutanten durch Immunoblots zu erkennen, wie unten beschrieben.
  7. Waschen Sie die Anti-FLAG-Perlen einmal mit Lysepuffer, dann einmal mit Kinase-Reaktionspuffer (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 mM Na3VO4, 0,5 mM DTT, pH 7,2), und fügen Sie 20 l Kinase-Reaktionsmischung (2 g MEK1(K97A) und 100 Aktionspuffer) pro Probe.
    HINWEIS: Die Perlenwäsche sollte schonend und schnell durchgeführt werden, der Restpuffer sollte vor dem Hinzufügen eines Kinase-Reaktionsgemisches vollständig angesaugt werden, und alle Operationen bei diesem Schritt sollten bei 4 °C in einem Kühlraum durchgeführt werden.
  8. Inkubieren Sie die Kinase-Reaktionen bei Raumtemperatur (25 °C) für 10 min, und kippen Sie die Röhren mit Kinase-Reaktionen mit Denfingern jede zweite Minute während der Inkubation.
  9. Fügen Sie 5 l 5x SDS-Probenpuffer hinzu (375 mM Tris HCl, 9% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50% Glycerin, 0,03% Bromophenol blau) pro Probe, um Kinase-Reaktionen zu stoppen, und erhitzen Sie dann die Proben bei 90 °C für 5 min.
  10. Führen Sie die Proben in 9 bis 12% Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) mit 0,1% SDS, übertragen Sie die Proteine auf die Nitrocellulosemembran und detektieren Sie die Konzentrationen von Phospho-MEK- und RAF-Mutanten in Proben durch Immunoblots.
    HINWEIS: Das Phospho-MEK kann auch mitder Verwendung von 32 P-ATP quantifiziert werden. Kurz gesagt, wirddem Kinase-Reaktionspuffer 10 'M'32 P-ATP zugesetzt, und die Menge an phosphoryliertem MEK wird dann nach der PAGE-Trennung mit Standard-Autoradiographie-, Phosphor-Imaging- oder Flüssigszintillationszähltechniken als angemessen.

2. RAF Co-Aktivierung Assay zur Bewertung der allosterischen Aktivität von Kinase-toten RAF Mutanten

  1. Konstruieren Sie Vektoren, die den RAF-Empfänger (CRAF-Kinase-Domäne mit nicht phosphorylierbarem NtA-Motiv, AAFF) oder die kinase-toten RAF-Aktivatoren (RAF-Kinase-Domäne mit phosphorylierungsmimicked NtA-Motiv, SSDD, DDEE oder DGEE) (Abbildung1A) als in Schritt 1.1 beschrieben.
  2. Transfekt 293T-Zellen mit zwei Vektoren, die sowohl den RAF-Empfänger als auch den kinase-toten RAF-Aktivator oder einen einzelnen Vektor kodieren, der eines der Proteine kodiert, wie in den Schritten 1.2 und 1.3 beschrieben.
  3. Ersetzen Sie das Kulturmedium bei 24 h nach der Transfektion, und ernten Sie 293T Transfektanten bei 48 h, um die gesamte Zelllysate vorzubereiten, wie in den Schritten 1.4 und 1.5 beschrieben.
  4. Mischen Sie das saubere ganzzellige Lysat schnell mit 5x SDS-Probenpuffer bei Raumtemperatur (25 °C) und kochen Sie dann bei 90 °C für 5 min.
  5. Führen Sie die gekochten Ganzzelllysatproben in 9 bis 12% PAGE mit 0,1% SDS durch, übertragen Sie die Proteine auf die Nitrozellulosemembran, und detektieren Sie die Phospho-ERK1/2-Spiegel und kontrollieren Sie Proteine durch Immunoblots.

3. Kostenloser Split Luciferase Assay zur Messung der relativen Dimer-Affinität/Stabilität von RAF-Mutanten

  1. Konstruieren Sie Vektoren, die FLAG-markierte RAF-Mutationen kodiert, die mit dem N-Terminus von Nluc (N-terminus of firefly luciferase, aa2-416) oder dem C-terminus von Cluc (C-terminus of firefly luciferase, aa398-550) verschmolzen sind, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
  2. Transfekt293T-Zellen mit einem Paar Vektoren, die verschiedene Nluc-RAF-Mutationen und Cluc-RAF-Mutationen kodieren, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
  3. Bei 24 h nach der Transfektion 293T Zelltransfektate in Krystal black Bildplatten mit der Zelldichte von 2x105 pro Brunnen mit farbfreiem Medium (d.h. DMEM ohne Phenolrot) replate.
  4. 24 h später D-Luciferin (0,2 mg/ml) zu 293T Zelltransfektaten hinzufügen, 30 min inkubieren und die Luziferasesignale mit Hilfe eines Multi-Detektionssystems (Materialtabelle )messen.
  5. Nach der Messung der Luziferasesignale, aspirieren Sie das Medium und Lyse 293T Transfektanten mit Lysepuffer, um die gesamte Zelle Lysate vorzubereiten, wie in den Schritten 1.4 und 1.5 beschrieben.
  6. Führen Sie die gesamte Zelllysat-Proben in 9-12% PAGE mit 0,1% SDS aus und detektieren Sie die Expressionswerte von Nluc-RAF-Mutationen und Cluc-RAF-Mutationen durch Anti-FLAG-Immunoblot, wie in Schritt 2.5 beschrieben. Die relativen Expressionsniveaus sowohl von Nluc-RAF-Mutation als auch von Cluc-RAF-Mutationen in 293T-Transfektanten werden anhand von Bild J aus ihren Immunoblots quantifiziert.
  7. Normalisieren Sie die Luziferase-Signale von 293T-Zelltransfekten entsprechend den Expressionsniveaus von Nluc-RAF-Mutanten und Cluc-RAF-Mutanten. Kurz gesagt, wird dies erreicht, indem das rohe Luziferasesignal durch die relativen Expressionsniveaus von Nluc-RAF-Mutationen und Cluc-RAF-Mutationen von Schritt 3.6 dividiert wird.

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Representative Results

Die Kiinasen der RAF-Familie haben sowohl katalytische als auch allosterische Aktivitäten, die es ihren krankheitsbedingten Mutanten ermöglichen, die nachgeschaltete Signalisierung durch verschiedene Mechanismen einzuschalten13,14,16,17 ,18. Die konstitutiv aktiven RAF-Mutationen phosphorylieren direkt ihre Substrate, während die kinase-toten RAF-Mutanten ihre Funktion durch die Transaktivierung wild-typischer Gegenstücke erfüllen. Wie in Abbildung 1Bdargestellt, sind sowohl konstitutiv aktive RAF-Mutationen (wie Regulatory spine (R-Spine) Mutanten (BRAF(L505M), CRAF(DDEE/L397M) und ARAF(DGEE/L358M))13,23,25 , 26, BRAF(V600E) und BRAF(NVTAP)) und kinase-tote RAF-Mutationen (wie katalytische Wirbelsäule (C-Spinne)-fused BRAF(-NVTAP/V471F)15) aktiviert ERK, wenn es in 293T-Zellen ausgedrückt wird. Daher kann die Fähigkeit von RAF-Mutanten, ERK-Signalisierung in Zellen zu aktivieren, nicht als Standard dienen, um einen konstitutiv aktiven Mutanten von einem kinase-toten Mutanten zu unterscheiden, obwohl einige kinase-tote Mutanten mit mäßiger Dimeraffinität/Stabilität eingeschaltet sind. downstream Signalisierung nur in Zusammenarbeit mit aktivem Ras. Drei Methoden, die wir hier vorgestellt haben, können uns helfen, alle krankheitsbedingten RAF-Mutanten effektiv zu charakterisieren. Die biologischen Eigenschaften aller RAF-Mutationen, die durch die Verwendung dieser Assays in unseren früheren Studien aufgedeckt wurden, sind in Tabelle 1zusammengefasst.

Die erste Methode, mit der wir die konstitutiv aktiven RAF-Mutanten von den kinase-toten RAF-Mutanten unterscheiden können, ist der In-vitro-Kinase-Assay. In diesem Test wurden die RAF-Mutanten durch Immunpräzipitation gereinigt und die katalytischen Reaktionen wurden in vitro mit kinase-totem MEK1 (K97A) und ATP als Substrate durchgeführt. Die katalytische Aktivität von RAF-Mutantenwurde als AL(A ctivation Loop)-Phosphorylierung von MEK1(K97A) in den Kinase-Reaktionsgemischen durch Immunoblot gemessen. Wie in Abbildung 1Cdargestellt, kann dieser Assay effektiv die katalytische Aktivität von R-Spine-Mutanten von BRAF, CRAF und ARAF13,15,23, BRAF(V600E)9und BRAF(NVTAP)15, aber nicht die von kinase-dead BRAF(V471F/ -NVTAP)15, die eine geschmolzene C-Spinne hat. Die katalytische Aktivität konstitutaktiver RAF-Mutanten mit schwacher Dimeraffinität/Stabilität wie ARAF R-Spine-Mutant (ARAF(DGEE/L358M)) (Abbildung 1C, Spur 4), CRAF und ARAF-Mutanten mit veränderter Dimer-Schnittstelle (CRAF(DDEE/ L397M/R401H), ARAF(DGEE/L358M/APE/R362H))15,22 (Abbildung 1D,E) könnten mit diesem Test nicht untersucht werden, da ihre Dimere während der Reinigung gebrochen wurden, insbesondere wenn die Reinigung mit Puffern durchgeführt werden, die starke oder hochkonzentrierte Reinigungsmittel enthalten. Um den Verlust der katalytischen Aktivität von RAF-Mutanten mit schwacher Dimeraffinität/Stabilität zu vermeiden, haben wir diese Mutanten in der Regel mit GST (glutathion S-transferase), einem dimerischen Protein mit starker Affinität/Stabilität vor Durchführung von In-vitro-Kinase-Assay, der die katalytische Aktivität dieser RAF-Mutanten retten kann15,22 (Abbildung 1E). Im Allgemeinen könnten die meisten RAF-Mutanten mit diesem Test als konstitutiv aktive oder kinasetote Mutanten eingestuft werden.

Die zweite Methode, die wir hier beschrieben haben, ist der RAF-Koaktivierungstest, der verwendet werden kann, um die allosterische Aktivität von kinase-toten RAF-Mutanten13,15,21,22,23 zu bewerten. , 25. Obwohl ein paar kinasetote RAF-Mutationen mit sehr hoher Dimeraffinität/Stabilität wie BRAF(V471F/-NVTAP)15, endogene RAF-Moleküle direkt aktivieren können, wenn sie in Zellen exprimiert werden (Abbildung 1B, Spur 7), Kinase-tote RAF-Mutanten erfordern die Zusammenarbeit aktiver Ras, um Wildtyp-RAFs zu transaktivieren. AktivRas ist jedoch ein direkter Aktivator der ERK-Signalisierung, deren Einführung das Basalniveau des aktiven ERK erhöhen wird. Um die Interferenz aktiver Ras zu vermeiden, haben wir in diesem Test N-terminus-abgeschnittene RAF-Mutationen verwendet (Abbildung 2A). Wie in Abbildung 2Bdargestellt, sind kinasetote Mutanten von BRAF, CRAF und RAF mit sauren NtA-Motiv und C-Spine-Fusion (BRAF(V471F, aa431-766), CRAF(DDEE/V363F, aa323-648) und ARAF(DGEE/V324F, aa284-606)) die katalytische Aktivität der CRAF mit nicht-phosphorylatisierbarem NtA-Motiv (CRAF-Empfänger, CRAF(AAFF, aa323-648)) auslösen, wenn sie in 293T-Zellen koexziert wird. Im Gegensatz dazu schaltete die kinase-tote BRAF-Mutation (V471F/-NVTAP, aa431-766), die eine sehr hohe Dimeraffinität/Stabilität aufweisen (siehe unten), die ERK-Signalisierung ein, indem sie endogene RAFs auslöst, auch ohne den Co-Ausdruck des CRAF-Empfängers. Insgesamt kann dieser Test verwendet werden, um die Transaktivierungsfähigkeit aller kinase-toten RAF-Mutanten zu bewerten.

Die Dimerisierung von KI-Familienkiinasen reguliert nicht nur deren Fähigkeit, nachgeschaltete MEK-ERK-Signalisierung zu aktivieren, sondern bestimmt auch deren Empfindlichkeit gegenüber RAF-Hemmern15,16,20,22,24,27,28,29,30,31,32. Im Gegensatz zu anderen Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen diesem33,34,35ist die Dimerisierung von KI-Familie-Kiinasen und deren Mutanten relativ schwach und schwer mit traditionellen biochemischen Assays wie Co-Immunpräzipitation zu bewerten. Um dieses Problem zu lösen, haben wir vor kurzem einen kostenlosen Split-Luziferase-Assay entwickelt, um die relative Dimer-Affinität/Stabilität von RAF-Familienkinasen und deren Mutanten zu messen.15,22,36. Wie inAbbildung 3prowurden die RAF-Kinase-Domänen (aa431-766 für BRAF, aa323-648 für CRAF und aa284-606 für ARAF) mit N-terminus(aa2-416) bzw. C-terminus(aa398-550) der Glöhwürife (Nluc und Cluc) verschmolzen, die zusammengeführt werden, um sich zusammenzusetzen, um sich zusammenzusetzen. Luziferase nach RAF-Dimerisierung. Die Aktivität der Luziferase in diesem Test korreliert direkt mit der Menge der RAF-Dimer. Dieser Test ist sehr empfindlich und kann sogar eine sehr schwache Dimerisierung von RAF-Mutanten erkennen. Wie wir bereits berichtet haben15, die onkogene BRAF(V600E) als Dimer funktioniert, und nur eine zusammengesetzte Mutation mit der Arg-to-His-Mutation (R509H) in der Dimer-Schnittstelle und die nicht-kanonische APE-Änderung (P622A im APE-Motiv) kann ihre Dimerisierung vollständig abschaffen und damit ihre katalytische Aktivität (Abbildung 3B). Durch die Verwendung von In-vitro-Kinase-Assay stellten wir ferner fest, dass die BRAF(V600E)-Variante mit dem veränderten APE-Motiv BRAF(V600E/AAE), aber nicht die mit der Arg-to-His-Mutation in der Dimer-Schnittstelle, BRAF(V600E/R509H), bei der Reinigung ihre katalytische Aktivität verlor (Abbildung 3c), was darauf hindeutet, dass die erste Variante viel weniger Dimer-Affinität/Stabilität hat als die letztere. Um die Neigung dieser BRAF(V600E)-Varianten zur Bildung von Dimern direkt zu messen, haben wir einen kostenlosen Split-Luziferase-Assay durchgeführt und bestätigt, dass diese Varianten eine ganz andere Dimeraffinität/Stabilität mit BRAF(V600E) höher als BRAF(V600E/ R509H) als BRAF(V600E/AAE) als BRAF(V600E/R509H/AAE) (Abbildung 3D). Das von monomeren BRAF(V600E/R509H/AAE) erzeugte Luziferasesignal war mit dem der nicht transfizierten 293T-Steuerung vergleichbar (Abbildung 3D, spur5 des linken Panels), was darauf hinweist, dass dieser Test einen sehr niedrigen Hintergrund hat. Um die Wirksamkeit des komplementären Split-Luziferase-Assays weiter zu bestimmen, haben wir als nächstes anhand dieses Assays die relative Dimeraffinität/Stabilität einer Gruppe onkogener BRAF-Mutationen mit In-Frame-Deletionen der von uns identifizierten 3-C-Schleife und anderer Gruppen15,37,38. Wie wir wissen, aktivierten alle diese Mutanten die ERK-Signalisierung, wenn sie in 293T-Zellen ausgedrückt wurden (Abbildung 3E), zeigten sie eine recht differenzierte katalytische Aktivität in vitro (Abbildung 3f). Die BRAF(MLN(aa484-486 del)) und BRAF(NVTAP(aa486-490 del)) waren bei der Reinigung durch Immunprezipitaion sehr aktiv, in der Erwägung, dass die BRAF(NVTAPT(aa486-491 del)) und BRAF(-QA(aa496-497 del)) ihre katalytische Aktivität unter demselben Zustand verloren haben, durch DIE GST-Fusion gerettet werden könnte. Darüber hinaus zeigte die kinase-tote Version von BRAF(NVTAP), BRAF(V471F/-NVTAP) eine starke Wirksamkeit, um endogene RAFs zu aktivieren, wenn sie in Zellen exprimiert werden (Abbildung 1BSpur 7). Diese Daten deuten darauf hin, dass diese Gruppe von BRAF-Mutanten eine ganz andere Dimer-Affinität/Stabilität mit BRAF(-NVTAP) hat, die höher ist als BRAF(-MLN) und BRAF(-QA). In der Tat, das Ergebnis der kostenlosen split luziferase Assay vollständig unterstützt unsere Schlussfolgerung (Abbildung 3g). Zusammengenommen deuten unsere Daten darauf hin, dass der komplementäre Split-Luziferase-Assay eine zuverlässige Methode ist, um die relative Dimeraffinität/Stabilität von RAF-Mutationen zu messen.

Figure 1
Abbildung 1 : Sondieren Sie die katalytische Aktivität von RAF-Mutanten mit In-vitro-Kinase-Assay. (A) Ein schematisches Diagramm für RAF-Mutationen, die in dieser Studie verwendet werden. (B) Sowohl konstitutiv aktive als auch kinasetote RAF-Mutationen können die ERK-Signalisierung aktivieren, wenn sie in Zellen ausgedrückt wird. 293T-Zellen wurden mit Vektoren transfiziert, die verschiedene RAF-Mutationen kodieren, und die Aktivität von ERK wurde durch Anti-Phospho-ERK1/2-Immunoblot nachgewiesen. (C) Konstitutive aktive RAF-Mutationen mit geringer Dimeraffinität/Stabilität sowie kinasetote RAF-Mutationen können MEK bei Deribilisierung durch Immunpräzipitation nicht in vitro phosphorylieren. RAF-Mutationen in B wurden mit Anti-FLAG-Perlen gereinigt, und ihre katalytische Aktivität wurde mit In-vitro-Kinase-Assay untersucht, wie im Protokoll beschrieben. (D-E) Die in vitro katalytische Aktivität konstitutiv aktiver RAF-Mutanten mit geringer Dimer-Affinität/Stabilität kann durch GST-Fusion gerettet werden. (D) Konstitutive aktive RAF-Mutanten und ihre GST-verschmolzenen Gegenstücke wurden in 293T-Zellen exprimiert und ihre Aktivität mit Anti-Phospho-ERK1-2-Immunoblot gemessen. (E) RAF-Mutanten in D wurden durch Immunpräzipitation gereinigt, und ihre in vitro katalytische Aktivität wurde mit In-vitro-Kinase-Assay, wie im Protokoll beschrieben, untersucht. RAF R-Spine Mutanten: BRAF(L505M), CRAF(DDEE/L397M) und ARAF(DGEE/L358M). "NVTAP" steht für die Löschung von aa486-490 in BRAF. Die APE-Mutation von ARAF bedeutet A475P, die ein kanonisches APE-Motiv in Der ARAF erzeugt. "KD" steht für "Kinase-Domäne" im Volltext. BRAF(KD) bezeichnet das aa431-766-Fragment von BRAF, während CRAF(KD) und ARAF(KD) für das aa323-648-Fragment von CRAF und das aa284-606-Fragment von ARAF stehen. Die Ergebnisse in dieser Zahl wurden zuvor berichtet15,22. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 : Bewerten Sie die Fähigkeit von RAF-Mutanten, Wildtyp-RAFs mithilfe des RAF-Koaktivierungs-Assays zu transaktivieren. (A) Ein Diagramm, das den RAF-Coaktivierungstest veranschaulicht. (B) Kinase-tote RAF-Mutanten mit saurem NtA-Motiv wurden mit katalysekompetentem CRAF-Empfänger in 293T-Zellen koexprimiert, und die Aktivität von ERK1/2 in 293T-Transfektanten wurde mit Anti-Phosho-ERK1/2 Immunoblot gemessen. Die meisten kinase-toten RAF-Mutationen außer BRAF(V471F/-NVTAP), die eine sehr hohe Dimer-Affinität/Stabilität hat, erforderten die Koexpression des exogenen RAF-Empfängers, um die ERK-Signalisierung einzuschalten. Die Ergebnisse in dieser Zahl wurden zuvor berichtet15,22. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 : Messen Sie die relative Dimer Affinität/Stabilität von RAF-Mutanten mit dem kostenlosen Split-Luziferase-Assay. (A) Ein Diagramm, das den kostenlosen Split-Luziferase-Assay veranschaulicht. (B-D) Die Dimerisierung von BRAF(V600E) Varianten ist für ihre katalytische Aktivität in vivo und in vitro erforderlich. (B) Die monomere BRAF(V600E)-Variante BRAF(V600E/R509H/AAE) hat keine katalytische Aktivität in vivo, die durch GST-Fusion wiederhergestellt werden kann. BRAF(V600E)-Varianten und ihre GST-fused Pendants wurden in 293T-Zellen exprimiert, und ihre Aktivität wurde mit Anti-Phospho-ERK1/2 gemessen. (C) Die BRAF(V600E) Variante mit geringer Dimeraffinität/Stabilität, BRAF(V600E/AAE) verlor bei der Reinigung ihre katalytische Aktivität in vitro, die durch GST-Fusion gerettet werden kann. BRAF(V600E)-Varianten aus B wurden durch Immunpräzipitation gereinigt und ihre katalytische Aktivität wurde durch In-vitro-Kinase-Assay, wie im Protokoll beschrieben, untersucht. (D) Die relative Dimeraffinität/Stabilität der BRAF(V600E)-Varianten wurde mit dem im Protokoll beschriebenen komplementären Luziferase-Assay gemessen. (E-G) BRAF-Mutanten mit In-Frame-Deletion der Schleife 3- C-Schleife fungieren als Dimer, um die ERK-Signalisierung zu aktivieren. (E) BRAF-Mutanten mit In-Frame-Deletion der Schleife 3- C aktivieren die ERK-Signalisierung, wenn sie in Zellen ausgedrückt wird. BRAF-Mutanten wurden in 293T-Zellen exprimiert und ihre Aktivität wurde wie in Bbeschrieben gemessen. (F) BRAF-Mutationen mit geringer Dimeraffinität/Stabilität von E verloren ihre katalytische Aktivität in vitro, die durch GST-Fusion gerettet werden kann. Die in vitro katalytische Aktivität von BRAF-Mutanten und ihren GST-verschmolzenen Gegenstücken aus E wurde wie in Cgemessen. (G) BRAF-Mutanten mit In-Frame-Deletion der Schleife 3- C haben eine ganz andere Dimer-Affinität/Stabilität. Die relative Dimeraffinität/Stabilität von BRAF-Mutationen mit In-Frame-Deletion der Schleife von 3- C wurde wie in Dgemessen. Fehlerbalken in D&G stellen s.d. dar, um die Varianz zwischen unabhängigen Experimenten anzuzeigen (n = 4). Die AAE-Mutation von BRAF bedeutet P622A im APE-Motiv, das ein nicht-kanonisches APE-Motiv erzeugt. Die Löscharbeiten von aa484-486, aa486-491, aa496-497 in der Schleife von BRAF sind die Sa484-486, aa496-497. Einige Ergebnisse in dieser Zahl wurden bereits berichtet15. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Table 1
Tabelle 1: Das biologische Eigentum verschiedener RAF-Mutanten. Die katalytische Aktivität, die allosterische Aktivität und die relative Dimeraffinität/Stabilität aller in dieser Studie verwendeten RAF-Mutationen wurden in dieser Tabelle zusammengefasst. "Y" bedeutet "Ja", während "N" für "Nein" steht. "N*" gibt an, dass diese Mutanten katalytische Aktivität haben, wenn sie mit GST verschmolzen sind. "++++", "+++", "++", "+" und "-" stehen jeweils für "sehr stark", "stark", "zwischengeschaltet", "schwach" und "keine".

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Discussion

In diesem Artikel haben wir drei Methoden zur Charakterisierung krankheitsbedingter RAF-Mutationen vorgestellt, darunter In-vitro-Kinase-Assay, RAF-Koaktivierungs-Assay und komplementärer Split-Luziferase-Assay. Da RAF-Kiinasen sowohl katalytische als auch allosterische Aktivität haben, können verschiedene RAF-Mutationen die nachgeschaltete Signalisierung durch zwei unterschiedliche Mechanismenaktivieren 13,14,16,17, 18. Die konstitutiv aktiven RAF-Mutationen phosphorylieren direkt den nachgeschalteten Effektor MEK, während die kinase-toten RAF-Mutationen die nachgeschaltete Signalisierung durch Transaktivierung ihrer Wildtyp-Gegenstücke auslösen. Allerdings erfordern sowohl konstitutiv aktive als auch kinasetote RAF-Mutanten die Dimerisierung, um ihre Funktion zu erfüllen15,16,17,19,20, und die Dimer Die Neigung von RAF-Mutanten bestimmt nicht nur die katalytische oder allosterische Aktivität von RAF-Mutanten, sondern auch ihre Empfindlichkeit gegenüber RAF-Hemmern15,24. Der In-vitro-Kinase-Assay, der RAF-Co-Aktivierungs-Assay und der komplementäre Split-Luziferase-Assay bieten uns eine Reihe einfacher, effektiver und zuverlässiger Methoden, um die konstitutiv aktiven Mutanten von den kinase-toten Mutanten zu unterscheiden und ihre Fähigkeit, die nachgeschaltete Signalisierung zu aktivieren.

Der In-vitro-Kinase-Assay ist eine klassische Methode, um die katalytische Aktivität von Proteinkinasen zu detektieren. Um diese Methode zur Messung der katalytischen Aktivität von RAF-Mutanten zu verwenden, haben wir einige signifikante Revisionen in Reagenzien und Verfahren15,21,22vorgenommen. Da die Kiinasen der RAF-Familie als Dimere fungieren, um ihr Substrat MEK zu phosphorylieren, und ihre Dimeraffinität/Stabilität relativ gering ist, haben wir die Konzentration von Waschmittel NP-40 in Puffern zur Reinigung von RAF-Proteinen von 1% auf 0,25 % reduziert, um RAF-Dicher aus der Dissoziation. Gleichzeitig haben wir auch ein schonendes Schnellwaschverfahren für die RAF-Proteinreinigung eingesetzt. Diese Veränderungen sind entscheidend für die Detektion der katalytischen Aktivität konstitutiv aktiver RAF-Mutationen mit sehr schwacher Dimer-Affinität/Stabilität, die durch den klassischen In-vitro-Kinase-Assay als "kinase-dead" RAF-Mutanten identifiziert werden könnte. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die GST-Fusion eine gute alternative Möglichkeit ist, RAF-Dimer während der Reinigung zu verhindern 15,21,22. Was die kinase-toten RAF-Mutanten betrifft, so zeigen sie, selbst wenn sie mit GST verschmolzen sind, keine katalytische Aktivität in diesem Test.

Der RAF-Co-Aktivierungstest wurde von uns entwickelt, um die Fähigkeit von kinase-toten RAF-Mutanten zu bewerten, ihre wilden Art-Gegenstücke13,15,21,22,23 zu transaktivieren. , 25. In diesem neuartigen Test verwenden wir die n-terminus abgeschnittenen RAF-Proteine und benötigen dabei nicht die Koexpression aktiver RAS-Mutanten oder der aktivierenden RAS, was diesen Assay sehr empfindlich macht. Darüber hinaus können der allosterische Aktivator (kinase-tote RAF-Mutante) und der Empfänger (katalysiskompetente RAF-Mutant) in diesem Assay leicht isoliert und gereinigt werden, um molekulare Ereignisse im Prozess der dimerisierungsgesteuerten Transaktivierung zu untersuchen. 13.

Wie bereits erwähnt, ist die Dimer Affinität/Stabilität ein Schlüsselfaktor, der die Funktion der RAF-Familienkiinasen und ihrer Mutanten reguliert und auch deren Empfindlichkeit gegenüber RAF-Hemmern13,14,15bestimmt. 16,17,18,24. Allerdings ist die Dimer-Affinität/Stabilität der KI-Familie Kiinasen und ihre am meisten krankheitsbedingten Mutanten sehr gering. Um diesen Parameter zu messen, erfordern die traditionellen Biochemie-Assays komplizierte experimentelle Verfahren und fortschrittliche Ausrüstung (wie SPR-Assay) oder produzieren kaum zuverlässige und reproduzierbare Daten (wie Z. B. Immunpräzipitationstest). Im Gegensatz dazu ist der kostenlose Split-Luziferase-Assay eine einfache, empfindliche, konsistente und kostengünstige Methode zur Messung der relativen Dimeraffinität/Stabilität von KI-Familienkinasen und deren Mutanten15,21, 22,36. Dieser Test kann den subtilen Unterschied der Dimer-Affinität/Stabilität zwischen verschiedenen RAF-Mutanten untersuchen. Wie bereits vor15berichtet, hat BRAF(V600E/AAE) eine sehr schwache Dimeraffinität/Stabilität und seine Dimer werden bei der Reinigung vollständig gebrochen, selbst wenn es ein sehr schonendes Verfahren verwendet. Mit diesem Test können wir die schwache Dimeraffinität/Stabilität von BRAF(V600E/AAE) von der von monomeren BRAF(V600E/AAE/R509H) (Abbildung 3) unterscheiden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Reihe praktischer und praktikabler Methoden die Anforderungen an die Definition aller krankheitsbedingten RAF-Mutanten erfüllen und uns dabei helfen können, geeignete Strategien zur Behandlung verschiedener RAF-mutantgetriebener Krankheiten auszuwählen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Die Autoren möchten das Hairy Cell Leukemia Fellowship für die Unterstützung von Yuan Jimin würdigen. Diese Arbeit wurde unterstützt von Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF Bridging Grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) und SHF Academic Medicine Forschungsstipendium (AM/TP011/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

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References

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Krebsforschung Ausgabe 149 RAF-Familienkinasen RAF-Mutation Ras/RAF/MEK/ERK-Signalisierung Dimerisierung Dimeraffinität/Stabilität katalytische Aktivität allosterische Aktivität In-vitro-Kinase-Assay RAF-Koaktivierungstest komplementär gespaltene Luziferase Assay Krebs
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Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

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