Cancer Research

אפיון מוטציות הקשורות למחלות של חיל המשפחה באמצעות קבוצה של שיטות מעשיות ושימושיות

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59795

Jiajun Yap¹, Jimin Yuan¹, Zi Heng Tee¹, Xuchao Huang¹, Wan Hwa Ng¹, Jiancheng Hu^1,2

¹The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, ²The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

Summary

במאמר זה, הצגנו מערכת של שיטות מעשיות ושימושיות לאפיון מוטציות הקשורות למחלות של משפחת חיל-החוץ, הכוללים בתוך שיטת ההפעלה המבחנה, שיתוף הפעולה של החיל המלכותי הבריטי, ובחינה משלימה של פיצול לוציפראז.

Abstract

במהירות מואצת פיברוסרקומה (חיל הים) המשפחה משחק תפקיד מרכזי בביולוגיה התא ותפקוד שלהם מוביל סרטן הפרעות התפתחותיות. אפיון של מוטציות הקשורות למחלות, יסייעו לנו לבחור אסטרטגיות טיפוליות מתאימות לטיפול במחלות אלה. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי משפחת החיל המלכותי מקיימים פעילויות קטליטי ו אלוסטריה, אשר מוסדרים באופן הדוק על ידי דימרזציה. כאן, בנינו קבוצה של שיטות מעשיות ובעלות הבנה כדי לקבוע את הפעילויות הקטליטיות והאלוסטרואיות והאהדה היחסית/יציבות של משפחת חיל-החוץ והמוטציות שלהם. ראשית, תוקנו הקלאסי בתוך שיטת החוץ מבחנה על ידי הפחתת הריכוז של חומרי ניקוי במאגרים, ניצול הליך שטיפה עדין מהיר, ושימוש בפיוז של גלוטתיון S-transferase (GT) כדי למנוע מהחיל המלכותי לנתק במהלך טיהור. הדבר מאפשר לנו למדוד את הפעילות הקטליטית של מוטציות באופן מכונן, הפועלים כראוי. שנית, פיתחנו רומן הפעלה שיתוף הספר של חיל הם כדי להעריך את הפעילות אלוסטריה של המוטציות המלח מתים של קינאז באמצעות N-terminal החלבונים מעוגלים, ביטול הדרישה של ראס פעיל בפרוטוקולים הנוכחיים ובכך להשיג גבוה יותר רגישות. לבסוף, יצרנו ייחודי מפוצל לוציפראז המשלים למדוד את היחס היחסי דיימר/יציבות של המוטציות השונות של חיל ההים, אשר אמין יותר ורגיש לעומת הimmunoprecipitation המסורתית שיתוף. לסיכום, לשיטות אלה יש את היתרונות הבאים: (1) ידידותי למשתמש; (2) מסוגל לבצע ביעילות ללא ציוד מתקדם; (3) חסכוני; (4) מאוד רגיש ומלא הבחנה.

Introduction

משפחת חיל-ההים הבריטי מהווה רכיב מרכזי בדירוג של ras/מק מ, אשר משדרים אות מראס כדי להפעיל את מיאוגן-פרוטאין קינאז (מק ג)¹^,²^,³^,⁴. משפחה זו של קינסים משחק תפקיד מכריע צמיחת תאים, הישרדות ובידול, ושינויים שלהם לגרום למחלות רבות, בעיקר סרטן⁵^,⁶^,⁷^,⁸. לאחרונה, הסקוויה גנומית זיהה מוטציות רבות הקשורות למחלות חיל הים המוצג מאפיינים שונים בשידורי האות של ראס/מט/מק/שמונה מדורגת⁹^,¹⁰^,¹¹. אפיון קפדני של מוטציות החיל הרחב יעזור לנו להבין את המנגנונים המולקולריים של כיצד מוטציות חיל הדרכים לשנות את תפוקת האות של RAS/הפלא/מק/לבין המפל, בסופו של דבר לבחור גישות מתאימות לטיפול במחלות שונות בעלי מוטציות של חיל הים.

כולל שלושה חברים, craf, braf, ו araf, אשר יש מבנים מולקולריים דומים אבל יכולות שונות כדי להפעיל את הזרם איתות¹^,²^,³^,⁴. בקרב הפראלוגים הללו, בראב יש את הפעילות הגבוהה ביותר בזכות המוסריות החוקתית של נ. ת. ע. (N-tמ acidic)¹²^,¹³,¹⁴, בעוד araf יש את הנמוך ביותר פעילות הנובעת מוטיב APE לא קאנוני¹⁵. זה עשוי להסביר את תדרי מוטציה שונים של חיל הים paralogs במחלות: BRAF > CRAF > ARAF. יתר על כן, בתוך אותו paralog החיל המלכותי הבריטי, מוטציות באתרים שונים עלולים לעורר אותות במורד הזרם באופן מובהק, אשר מוסיף שכבת מורכבות נוספת לוויסות משפחת חיל-החוץ. מחקרים שנעשו לאחרונה הוכיחו כי כל מדעי החיל יש הן קטליטי ו אלוסטריה פעילויות¹³^,¹⁴^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. מוטציות של חיל-הקצה הפעיל מבחינה חוקתית מפעילים את המטה איתות ישירות על-ידי מק זרחנית, בעוד שמוטציות מסוג קינאז-מתים מסוגלים להפעיל את עמיתיהם הפראיים באמצעות הדימריזציה מצד לצד ולהפעיל איתות של מק-טיפשה באורך¹⁶ ^,¹⁹^,²⁰. האהדה והיציבות של דימר הוא פרמטר מפתח שלא רק קובע את הפעילות האלומית של המוטציות המתות-מוות של קינאז, אלא גם משפיע על הפעילות הקטליטית של מוטציות מוטאיות באופן קונסטיטואליות¹⁵^,²¹^, ²². המוטנטים בעלי החיים המתים בקינאז עם זיקה דימר גבוהה/יציבות יכולים להפעיל את הרדוגני בעלי סוג פראי באופן ישיר¹⁵, בעוד אלה עם זיקה דיימר ביניים/יציבות דורש תיאום של ראס פעיל או מ רמה גבוהה של מולקולות חיל הפרא מסוג פראי לתפקד¹³^,¹⁵^,²⁰^,²¹^,²³. באופן דומה, המוטנטים הפעילים ביותר של חיל-החוץ הינם בעלי התלות העצמית של המאה התשעים, ואלה עם אהדה מזיקה נמוכה/יציבות מאבדים את פעילות הקטליטית שלהם בimmunoprecipitation שוברת את החלשים של חיל הה14^, ²¹^,²². הזיקה הדימאר/יציבות קובעת גם את רגישות המוטציות של חיל ה, המוטאנטים, ומהווה באופן חיובי את העמידות של מעכבי החיל המלכותי²⁴. לכן, כדי לאפיין את המוטציות הקשורות במחלות, יש למדוד את פעילותם הקטליטית והאלוסטרואית, ואהדה ויציבות.

בשנים האחרונות, המעבדה שלנו ואחרים פיתחו שיטות שונות כדי לאפיין את הקינטיות של משפחת חיל הו ואת המוטציות שלהם. על-פי המעבדה שלנו והניסיון של אחרים, אנו סבורים ששלושת הנושאים הבאים מחייבים יתרונות בהגדרת מוטציות של חיל-החוץ הבריטי: (1) בשיטת הספז שניתן לבצע בקלות כדי לזהות את הפעילות הקטליטית של החוקה המוטנטים הפעילים בחיל המלכותי¹⁵; (2) הפעלה משותפת שיתוף הפעולה הינה שיטה אמינה ונוחה כדי למדוד את הפעילות אלוסטריה של המוטנטים המתים של קינאז,¹³^,¹⁵^,²¹^,²²^,²³^, ^{עשרים וחמש}; (3) מפוצל לוציפראז מפוצלת שהוא בעל רגישות גבוהה הרבה יותר במדידת אהדה דיימר יחסי/יציבות של מוטציות חיל ההים הבריטי בניגוד לimmunoprecipitation המסורתית שיתוף, והוא מסוגל לבצע ללא ציוד מתקדם ב בניגוד לשיטות אנליטיות כמותיים כגון spr (Surface Pלזניה Resonance) ניתוח¹⁵^,²². שילוב שלושת הנושאים האלה, אנו יכולים להבין בקלות כיצד מוטציה הקשורות במחלות חיל הזרם משנה את איתות במורד ובכך לנצל את האסטרטגיה הטיפולית המתאימה לטיפול במחלה הנגרמת על ידי המוטציה הזאת חיל הים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מתוך שיטת חוץ גופית קינאז למדידת הפעילות הקטליטית של מוטציות חיל הים

בניית וקטורים קידוד מוטציות חיל הו (איור 1א) עם דגל (DYKDDDDK) תג ב C-טרמינוס על ידי שימוש בעצרת גיבסון או שיבוט המולקולרי המסורתי שיטות.
1. הציגו את תג הדגל והמוטציות לתוך רצפי הקידוד של חיל הבדיקות, ולאחר מכן הכניסו רצפים שלמים לתוך pCDNA 3.1 (+) וקטור באמצעות הרכבת גיבסון או ליטל ה-DNA של T4 ובעקבות פרוטוקולי הייצור. השתמש בתנאים הבאים לתגובות ה-PCR: (1) 95 ° c, 2 דקות; (2) 95 ° c, 30 ס מ; (3) 59 ° c, 30 ס מ; (4) 68 ° c, 3 דקות; (5) 20 מחזורים של (2 עד 4); (6) החזקת 4 ° c.
  הערה: ה-PCR התחל לשכפול: 5-העתק של מרכז המידע-3 ו-5-4-שלושה מתוך שלוש שלוש.
2. הכנס את רצף הקידוד של GT במעלה רצפים של קוד מוטציה של חיל ה, כדי ליצור וקטורים קידוד מוטציות התמזגו GT-מותע על ידי שימוש בשיטות אותן כמתואר בשלב 1.1.1.
3. אמת את כל הווקטורים באמצעות הזגים של דנ א לפני ההעברה.
הלוח 293T תאים ב 6-היטב צלחות בצפיפות של 5 x 10⁵ תאים/גם יום אחד לפני הזיהום. כאשר צפיפות התא מגיע 80 ~ 90% המפגש ביום השני, transfect עם וקטורים קידוד דגל מתויג חיל השמש או המוטנטים שלהם משלב 1.1 לתוך התאים על ידי ביצוע הפרוטוקול של הייצור של ריאגנטים החצייה (טבלת חומרים).
החליפו את מדיום התרבות 24 שעות לאחר החצייה.
מנושף את התרבות בינונית 48 h לאחר הגידול ולהוסיף 400 μL/הבאר של מאגר לפירוק (25 מ"מ טריס · HCl, 150 מ"מ היום, 1 מ"מ מילימטר (EDTA), 0.25% NP-40, pH 7.2) שיושלם עם פרוטאז ו פוספספטאז מעכבי כדי lyse תאים על הקרח.
הערה: הריכוז של NP-40 במאגר הליזה הוא קריטי לגילוי הפעילות הקטליטית של מוטציות חיל-הים הבריטי עם זיקה מתונה של דימר/יציבות בתוך מבחנה. ריכוז גבוה של חומרי ניקוי או חומר ניקוי חזק במאגר הליזה עשוי לשבור את הדימרס ובכך להרוג את הפעילות הקטליטית של החיל המלכותי או המוטציות שלהם.
העבר את lysates תא לצינור 1.5 mL, ספין למטה על ידי 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' כדי פסולת תא מרוקן.
העברת 300 μL לכל מדגם של ליטים תאים שלמים נקיים לצינורות mL, 1.5 להוסיף 20 μL לכל מדגם של חרוזי אהדה נגד דגל, ולסובב בחדר קר (4 ° c) עבור 1 h. גם לקחת 40 μL לכל מדגם של התאים השלם נקי מחוץ לזיהוי הביטוי והפעילות (פוספאו-ERK1/2) של המוטציות המלכותי על ידי חיסוני כמתואר להלן.
לשטוף את החרוזים נגד הדגל פעם אחת עם מאגר הליזה, ואז פעם עם מאגר התגובה קינאז (20 מ"מ HEPES, 10 מ"מ MgCl₂, 0.5 mm Na₃VO₄, 0.5 mm dtt, pH 7.2), ולהוסיף 20 μl של תערובת התגובה קינאז (2 μg של MEK1 (K97A) ו100 μm ATP ב 20 מאגר פעולה) לכל מדגם.
הערה: יש להשלים את שטיפת החרוזים בעדינות ובמהירות, החוצץ השיורי צריך להיות מוקשה לחלוטין לפני הוספת תערובת התגובה של קינאז, וכל הפעולות בשלב זה אמורות להתבצע ב -4 ° c בחדר קר.
להטיל את התגובות קינאז בטמפרטורת החדר (25 ° c) עבור 10 דקות, ולהפוך את הצינורות המכילים התגובות קינאז עם אצבעות בכל דקה אחרת במהלך הדגירה.
הוסף 5 μL של מאגר לדוגמה של 5x SDS (375 mM טריס · HCl, 9% נתרן dodecyl סולפט (SDS), 50% גליצרול, 0.03% ברומרופנול כחול) לכל מדגם כדי להפסיק את התגובות קינאז, ולאחר מכן לחמם את הדגימות ב 90 ° c עבור 5 דקות.
הפעל את הדגימות ב 9 ~ 12% פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) עם 0.1% SDS, להעביר את החלבונים כדי ניטרוגליצרין הקרום התאית, ולזהות את רמות של פוספהו-מק ו חיל המוטציות המלכותי בדגימות על ידי חיסוני.
הערה: פוספהו-מק יכול גם להיות כימות באמצעות γ³²P-ATP התאגדות. בקצרה, 10 μm γ³²P-ATP מתווסף למאגר התגובות קינאז, וכמות ה-מק זרחנית מכמת לאחר הפרדת העמוד באמצעות האדיגרפיה האוטומטית הסטנדרטית, הפוספורימטר, או הקלוריות הנוזלית שיטות הספירה כ מתאים.

2. הפעלת שיתוף הפעולה של החברה להערכת פעילות האלוסטריה של קינאז-חיל המוטציות המת

בניית וקטורים קידוד המקלט של חיל הנחתים המלכותי (מתחם craf קינאז עם מוטיב של נ. ת. ע בלתי ניתן לתרגום) או מפעילי החיל המלכותי המלח קינאז (חיל הנחתים קינאז, הקמת מוטיב של ת. ד. נ. ד. פ.,האיור 1א) כ מתואר בשלב 1.1.
Transfect 293T תאים עם שני וקטורים קידוד הן המקלט המלכותי ואת הראשון קינאז-המלח המלכותי activator או קידוד וקטורי יחיד אחד של חלבונים כמתואר בשלבים 1.2 ו 1.3.
החלף את בינונית התרבות ב 24 שעות לאחר החצייה, ו 293T הקציר הטרנספלרים ב 48 h כדי להכין את כל lysates תא כמתואר בשלבים 1.4 ו 1.5.
מערבבים את התאים הנקיים שלמים עם מאגר המדגם 5x SDS במהירות בטמפרטורת החדר (25 ° c) ולאחר מכן מרתיחים ב 90 ° c עבור 5 דקות.
הפעל את הדגימות תא שלם מבושל בשנת 9 ~ 12% עמוד עם 0.1% SDS, להעביר את החלבונים כדי ניטרוצלולוזה קרום, ולזהות את רמות של פוספאו-ERK1/2 וחלבונים לשלוט על ידי חיסוני.

3. בחינם מפוצל לוציפראז שיטת למדידת אהדה Dimer היחסי/יציבות של חיל המוטציות

בניית וקטורים קידוד דגל-מתויג חיל המוטאס מוטציות התמזגו N-טרמינוס של Nluc (N-טרמינוס של גחלילית לוציפראז, aa2-416) או C-טרמינוס של Cluc (C-טרמינוס של גחלילית לוציפראז, aa398-550) כמתואר בשלב 1.1.
Transfect 293T תאים עם זוג וקטורים קידוד שונים Nluc-המוטנטים מוטציות ו Cluc-חיל המוטציות כמתואר בשלב 1.2.
ב -24 שעות לאחר החצייה, replate 293T מעבר תאים לתוך לוחות תמונה שחורה שחור בצפיפות התא של 2x10⁵לכל טוב עם בינונית ללא צבע (כלומר, DMEM גברת ללא פנול אדום).
24 שעות מאוחר יותר, להוסיף D-לluciferin (0.2 mg/mL) 293T הטרנספררים תא, מודטה עבור 30 דקות, ולמדוד את האותות לוציפראז באמצעות מערכת זיהוי רב (טבלת חומרים).
לאחר מדידת אותות לוציפראז, מתיף את המדיום ואת lyse 293T הטרנספררים עם מאגר לפירוק להכין את כל lysates תא כמתואר בשלבים 1.4 ו 1.5.
הפעל את כל הדגימות של התא בתוך 9 ~ 12% עמוד עם 0.1% SDS ולזהות את רמות הביטוי של מוטציות Nluc-חיל ה, מוטציות Cluc-חיל ידי אנטי דגל כמתואר בשלב 2.5. רמות הביטוי היחסיות הן של המוטציות Nluc-סי והן של המוטציות ה-Cluc-293T מוטצות באמצעות התמונה J מתוך הכתמים האימונוגנטים שלהם.
לנרמל את האותות לוציפראז של 293T תא הטרנספררים על פי רמות הביטוי של המוטציות Nluc-חיל ו מוטציות Cluc-. בקצרה, זה מושגת על ידי חלוקת האות הלוציפראז raw על ידי רמות הביטוי היחסי של מוטציות Nluc-חיל ה, מוטציות Cluc-חיל משלב 3.6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

משפחת חיל-ההים הבריטי הינם בעלי פעילויות קטליטי ו-אלוסטריה, המאפשרות למוטציות הקשורות במחלות שלהם להפעיל את איתות הזרם דרך מנגנונים שונים¹³^,¹⁴,¹⁶^,¹⁷ ^,¹⁸. המוטנטים הפעילים מבחינה חוקתית באופן ישיר מזטים את מצעים שלהם, בעוד המוטציות המתות-ה, ממלאות את תפקידם באמצעות הפעלת מקבילים מסוג פראי. כפי שמוצג באיור 1ב', הן מוטציות באופן קונסטיטוטיולי (כגון עמוד השדרה (R-עמוד השדרה) מוטציות (braf (L505M), craf (ddee/L397M), ו araf (ddee/L358M))¹³^,²³^,²⁵ ^, ²⁶, BRAF (V600E) ו-braf (∆ NVTAP)) ומוטציות בעלי החיים המתים של קינאז (כגון עמוד השדרה הקטליטי (C-עמוד השדרה)-התמזגו braf (∆ NVTAP/V471F)¹⁵) מפעילה את הטיפשה כשהיא מתבטאת בתאי t ב293t לפיכך, היכולת של מוטציות של חיל ההים הבריטי להפעיל איתות טיפשה בתאים לא יכול לשמש כסטנדרט להבדיל בין מוטציה פעילה באופן מכונן מתוך מוטציה מתים של קינאז, למרות שכמה מוטציות מתות-קינאז עם זיקה מתונה של דימר מפעילה מאותת במורד הזרם רק עם שיתוף פעולה של ראס פעיל. שלוש שיטות שהוצגו כאן יכולות לעזור לנו לאפיין ביעילות את כל המוטציות הקשורות במחלות. המאפיינים הביולוגיים של כל המוטציות של חיל-ה, התגלו באמצעות מחקרים אלה במחקרים הקודמים שלנו מסוכמים בטבלה 1.

השיטה הראשונה בה נוכל להשתמש כדי להבדיל בין המוטנטים הפעילים של חיל-ההים הבריטי לבין המוטציות המתות-מוות של ה-קינאז, היא בתוך שיטת המבחנה. באותה מידה, המוטאנטים של חיל-החוץ הimmunoprecipitation מטוהר על ידי ה, והתגובות הקטליטיים בוצעו במבחנה עם MEK1 (K97A) ו-ATP בתור מצעים. הפעילות הקטליטית של מוטציות החיל המלכותי נמדדה כ- "אל" (כמובן)-זירחון של MEK1 (K97A) בתערובות התגובה של קינאז באמצעות כתמי החיסונית. כפי שמוצג באיור 1C, שיטת הפעולה הזאת יכולה לחקור ביעילות את הפעילות הקטליטית של מוטציות R-עמוד השדרה של braf, craf ו-araf¹³^,¹⁵^,²³, braf (V600E)⁹, ו braf (∆ nvtap)¹⁵, אבל לא זה של קינאז-מת BRAF (V471F/∆ NVTAP)¹⁵ כי יש התמזגו C-עמוד השדרה. עם זאת, הפעילות הקטליטית של מוטציות מוטעות עם זיקה דימר חלש/יציבות כגון araf R-השדרה מוטציה (araf (dgee/L358M)) (איור 1ג, ליין 4), craf ו araf מוטציות עם ממשק דיימר שונה (craf (dgee/ L397M/R401H), araf (dgee/L358M/APE/R362H))¹⁵^,²² (איור 1D, E) לא להיות נחקר על ידי שימוש זה, מאז הדימרס שלהם נשברו במהלך הטיהור, במיוחד כאשר הטיהור היה מבוצע עם מאגרים המכילים חומרי ניקוי חזקים או בעלי ריכוז גבוה. כדי למנוע אובדן של פעילות קטליטי של מוטציות חיל הארה ב עם אהדה דיימר חלש/יציבות, אנחנו בדרך כלל התמזגו אלה מוטציות עם gt (glutathione S-tבראנפראז), חלבון dimeric עם זיקה חזקה/יציבות לפני ביצוע בתוך שיטת "חוץ גופית קינאז", שיכולה להציל את הפעילות הקטליטית של המוטציות האלה¹⁵^,²² (איור 1E). באופן כללי, רוב המוטציות של חיל ה, המוטאנטים יכולים להיות מסווגים כמוטאנטים פעילים או קינאז-מתים מבחינה חוקתית באמצעות השיטה הזו.

השיטה השנייה שתיארנו כאן היא האפשרות להפעלת שיתוף הפעולה היחידה שניתן להשתמש בה כדי להעריך את הפעילות האלוסטרומית של המוטציות המתות-המוות של קינאז,¹³^,¹⁵^,²¹^,²²^,²³ ^, ²⁵. למרות שכמה קינאז-מוטציות בעלי מוות גבוה מאוד בעלי זיקה גבוהה מאוד/יציבות כגון braf (V471F/∆ NVTAP)¹⁵, יכול ישירות להפעיל מולקולות האנדוגני כאשר מבוטא בתאים (איור 1B, ליין 7), רוב קינאז-מוטציות חיל ההים המלח דורשים שיתוף פעולה של ראס פעיל כדי להפעיל RAFs סוג פראי. עם זאת, ראס פעיל הוא activator ישירה של איתות של טיפשה, אשר מבוא יגדיל את הרמה הבזבולית של טיפשה פעילה. כדי למנוע את ההפרעה של ראס הפעיל, השתמשנו במוטציות הללו (איור 2א). כפי שמוצג באיור 2ב', מוטציות המתים של braf, craf, ו-אפ. בי. סי. עם מוטיב של נ. ת. ע ושידרה (braf (V471F, aa431-766), craf (ddee/V363F, aa323-648), ו-araf (ddee/V324F, aa284-606)) פעלו כ להפעיל את הפעילות הקטליטית של CRAF עם מוטיב לא זרחתי של נ. ת. ע (מקלט CRAF, CRAF (aa323-648)) כאשר באים לידי ביטוי בתאי 293T. לעומת זאת, המוטציה המתה של קינאז (V471F/∆ NVTAP, aa431-766) שיש להם אהדה מאוד גבוהה/יציבות (ראה להלן) מופעלת על-ידי הפעלת איתות על ידי מפעיל את הרדוגני, גם ללא הביטוי המשותף של מקלט CRAF. באופן כללי, ניתן להשתמש באפשרות זו כדי להעריך את יכולת ההפעלה של כל מוטציות ה-קינאז.

הדימריזציה של משפחת חיל החוץ הבריטי לא רק מווסת את יכולתם להפעיל את האיתות במורד הזרם מק-טיפשה, אלא גם קובע את רגישותם למעכבי חיל השמאל¹⁵^,¹⁶^,²⁰^,²²^,²⁴^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹^,³². בניגוד לאינטראקציות חלבון-חלבון אחרות בין השביל הזה³³^,³⁴^,³⁵, הדימרזציה של משפחת חיל-ההים והמוטציות שלהם היא חלשה יחסית וקשה להערכה באמצעות ביוכימיה מסורתית כגון שיתוף immunoprecipitation. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו לאחרונה שיטת פיצול מפוצלת ללא תשלום למדידת הזיקה היחסית/יציבות של משפחת חיל ההים והמוטציות שלהם¹⁵^,²²^,³⁶. כפי שמוצג באיור 3קצת, התחומים (aa431-766 for BRAF, aa323-648 עבור CRAF, ו aa284-606 עבור ARAF) היו התמזגו בהתאמה עם N-הטרמינוס (aa2-416) או C-הטרמינוס (aa398-550) של גחלילית לוציפראז (Nluc ו Cluc), אשר יובא יחד כדי להרכיב שלמים לוציפראז על הדירטיזציה. הפעילות של לוציפראז בתוך שיטת הפעולה הזאת מתבצעת ישירות עם כמות הדימרס של חיל ההים. הבחינה הזאת רגישה מאוד ויכולה להבחין אפילו בסטייה חלשה מאוד של המוטציות של חיל-הדגל. כפי שדווחו לפני¹⁵, ברגניים braf (V600E) פונקציות כמו דיימר, ורק מוטציה מורכבת עם arg-to-שלו מוטציה (R509H) בממשק דיימר ואת שינוי קוף שאינו canonic (P622A ב APE מוטיב) יכול לבטל לחלוטין dimerזציה שלה ובכך לחסום קטליטי שלה פעילותאיור 3B). באמצעות שימוש בתוך שיטת החוץ, מצאנו כי braf (V600E) גרסה עם מוטיב קוף שונה, braf (V600E/aae), אבל לא עם המוטציה arg-to-שלו ממשק דיימר, braf (V600E/R509H), איבד את פעילותה קטליטי על טיהור (איור 3C), הרומז כי לגרסה הקודמת יש הרבה פחות אהדה/יציבות מאשר האחרונים. כדי למדוד באופן ישיר את הנטייה של אלה braf (V600E) משתנים לטופס דימרס, אנו ביצעו בחינם מפוצל ללוציפראז שיטת, ואישר כי גרסאות אלה היו אהדה dimers שונה למדי/יציבות עם braf (V600E) גבוה יותר braf (V600E/ R509H) מאשר BRAF (V600E/AAE) מאשר BRAF (V600E/R509H/AAE) (איור 3D). האות לוציפראז המיוצר על ידי monomeric BRAF (V600E/R509H/AAE) היה דומה לזה של בקרת 293T שאינם מפומרים (איור 3D, שמאלה למסלול הלוח 5), המציין כי באותו מקרה יש רקע נמוך מאוד. כדי לקבוע עוד את האפקטיביות של שיטת פיצול מפוצל ללא תשלום, אנו מודדים באמצעות באמצעות זה באמצעות הגישה היחסית דיימר אהדה/יציבות של קבוצה של מוטציות braf במסגרת עם מחיקות מסגרת של β3-αC לולאה שזוהו על ידינו ואחרים קבוצות¹⁵^,³⁷^,³⁸. כפי שידוע לנו, למרות כל המוטציות הללו הפעילו איתות מתוך כאשר מבוטא בתאי 293T (איור 3E), הם הציגו למעשה פעילות קטליטי דיפרנציאלית בלתי מתורבת (איור 3F). BRAF (∆ MLN (aa484-486 del)) ו BRAF (∆ NVTAP (aa486-490 del)) היו פעילים מאוד על טיהור על ידי immunoprecipitaion, בעוד BRAF (∆ NVTAPT (aa486-491 del)) ו BRAF (∆ QA (aa496-497 del)) איבדו את פעילותם הקטליטית באותו מצב יכול להינצל על ידי היתוך GT. בנוסף, הגרסה המתה קינאז של BRAF (∆ NVTAP), BRAF (V471F/∆ NVTAP) הציגו עוצמה חזקה כדי להפעיל את ההפעלה האנדוגניים כאשר מבוטא בתאים (איור 1Bליין 7). נתונים אלה מראים כי קבוצה זו של מוטציות braf יש זיקה דיימר שונה לגמרי/יציבות עם braf (∆ nvtap) גבוה יותר braf (∆ mln) מ braf (∆ nvtapt) ו braf (∆ QA). אכן, התוצאה של הספק מפוצל בחינם לוציפראז תמך לחלוטין היסק שלנו (איור 3G). יחד, הנתונים שלנו מצביעים על כך את העובדה הפיצול ללא תשלום לוציפראז היא שיטה אמינה כדי למדוד את האהדה דיימר היחסי/יציבות של מוטציות חיל ההים הבריטי.

איור 1 : לחקור את הפעילות הקטליטית של מוטציות חיל-ההים באמצעות שימוש בשיטת השימוש. (א) תרשים סכמטי למוטציות של חיל המלכותי המשמש במחקר זה. (ב) שני המוטציות הפעילים והלא-מתים של מוטציות בעלי החיים יכולים להפעיל איתות של טיפשה כאשר הם מבוטאים בתאים. 293T תאים היו מזוהמים עם וקטורים כי לקודד שונים מוטציות חיל הים, ואת הפעילות של טיפשה זוהה על ידי אנטי פוספהו-ERK1/2 חיסוני. (ג) המוטאנטים הפעילים והאנטי-מוטנטים הנמוכים עם אהדה ויציבות נמוכה, כמו גם מוטציות בעלי החיל הקיסרי המת קינאז, אינם יכולים לזזול את ה-immunoprecipitation באופן מתורבת על ידי טיהור. מוטציות של חיל-החוץ ב-B התטוהר באמצעות חרוזים נגד דגל, ופעילותם הקטליטית נבחנה באמצעות שימוש בתייית מחוץ למבחנה כמתואר בפרוטוקול. (D-E) בפעילות החוץ-גופית הקטליטית של מוטציות בעלות מוטאר מוטנטים עם זיקה דימר נמוכה ליציבות ניתן להציל על ידי היתוך GT. (ד) המוטנטים הפעילים והמוטאים שלהם ב-293t הביעו מוטציות מוטטיים, והפעילות שלהם נמדדה על-ידי כתמי החיסוני אנטי-פוספהו-ERK1/2. (ה) המוטאנטים ב -D היו מטוהרים על ידי הimmunoprecipitation, והפעילות שלהם באמצעות מבחנה מחוץ למבחנה הייתה בעלת שימוש בתייית הבחנה מחוץ למבחנה כמתואר בפרוטוקול. אר. ג'י. מוטציות בעמוד השדרה: BRAF (L505M), CRAF (DDEE/L397M), ו ARAF (DDEE/L358M). "∆ NVTAP" מייצג למחיקה של aa486-490 ב BRAF. מוטציה APE של ARAF פירושו A475P שמייצר מוטיב קוף קאנוני ב ARAF. "KD" מייצג את "מתחם קינאז" בטקסט המלא. BRAF (KD) פירושו קטע aa431-766 של BRAF, בעוד CRAF (KD) ו-ARAF (KD) מייצגים בהתאמה עבור הקטע aa323-648 של CRAF ואת הקטע aa284-606 של ARAF. התוצאות באיור זה דווחו בעבר¹⁵^,²². אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2 : להעריך את היכולת של מוטציות חיל ההים כדי להפעיל RAFs סוג פראי באמצעות הפעלה שיתוף ההפעלה של חיל ההים המלכותי. (א) דיאגרמה המדגימה את הפעלת ההפעלה השותפת של החיל המלכותי. (ב) קינאז-המוטנטים המתים המוטאים עם מוטיב חומצי נ. ת. ע. הביעו שיתוף עם מקלט מוסמך מ293t זרז בתאי t, והפעילות של ERK1/2 ב 293t הטרנספורים נמדדה על-ידי אנטי-פוטשו-ERK1/2 כתמי חיסוני. המוטציות המתות-מתות ביותר מלבד braf (V471F/∆ nvtap) כי יש זיקה מאוד גבוהה דיימר/יציבות נדרש את הביטוי המשותף של המקלט אקסוגני להפעיל איתות טיפשה. התוצאות באיור זה דווחו בעבר¹⁵^,²². אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3 : למדוד את האהדה דיימר היחסי/יציבות של מוטציות חיל הארה ב באמצעות שימוש מפוצל לוציפראז מפוצלת. (א) דיאגרמה המדגימה את שיטת הלוציפראז המפוצלת ללא תשלום. (B-D) הדימרזציה של משתני BRAF (V600E) נדרשת עבור פעילותם הקטליטית בvivo ובמבחנה. (ב) monomeric BRAF (V600E) VARIANT, BRAF (V600E/R509H/aae) אין פעילות קטליטי ב vivo, אשר ניתן לשחזר על ידי היתוך gt. BRAF (V600E) משתנים ועמיתיהם התמזגו GT שלהם הביעו בתאי 293T, ופעילותם נמדדה על ידי anti-פוספהו ERK1/2. (ג) המשתנה braf (V600E) עם אהדה דיימר נמוך/יציבות, braf (V600E/aae) איבד פעילות קטליטי שלה בחוץ גופית על טיהור, אשר ניתן להציל על ידי היתוך gt. הגרסאות BRAF (V600E) מ- B היו מטוהרים על ידי immunoprecipitation ופעילותם הקטליטית הייתה בעלת מבחנה בתוך שיטת "מחוץ למבחנה" כפי שתוארה בפרוטוקול. (ד) האהדה היחסית/יציבות של משתנים braf (V600E) נמדדה באמצעות השימוש בשיטת הלוציפראז המפוצלת בחינם כמתואר בפרוטוקול. (E-G) BRAF מוטציות עם מחיקה במסגרת הפונקציה β3-αC לולאה כדימרס כדי להפעיל איתות טיפשה. (ה) braf מוטציות עם מחיקה במסגרת של לולאה Β3-αC להפעיל איתות טיפשה כאשר מבוטא בתאים. מוטציות BRAF ביטאו בתאי 293T ופעילותם נמדדה כמתואר ב B. (ו) braf מוטציות עם אהדה דיימר נמוך/יציבות מ-E איבדו פעילות קטליטי שלהם בתוך מבחנה, אשר ניתן להציל על ידי היתוך gt. בפעילות החוץ-גופית הקטליטית של מוטציות BRAF ו-GT-התמזגו שלהם מ E נמדד כמו C. (G) braf מוטציות עם מחיקה במסגרת של β3-αC לולאה יש זיקה דיימר שונה לגמרי/יציבות. אהדה דיימר היחסי/יציבות של מוטציות braf עם מחיקת מסגרת של β3-αC לולאה נמדד כמו D. קווי שגיאה ב-D & G מייצגים ש גויטיין כדי להציג סטיה בין ניסויים עצמאיים (n = 4). המוטציה AAE של BRAF פירושו P622A במוטיב APE שמייצר מוטיב APE לא קאנוני. "∆ MLN", "∆ NVTAPT", ו "∆ QA" מייצגים בהתאמה עבור מחיקות של aa484 486, aa486-491, aa496-497 בלולאה β3-αC של BRAF. תוצאות מסוימות באיור זה דווחו בעבר¹⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Table 1
טבלה 1: הרכוש הביולוגי של המוטציות השונות בחיל הים. הפעילות הקטליטית, פעילות אלוסטריה והזיקה היחסית והיציבות של כל המוטציות של חיל ה, ששימשו במחקר זה, מסוכמות בטבלה זו. "Y" פירושו "כן", בזמן ש-"נ'" מייצג "לא". "N^*" מציין כי למוטציות האלה יש פעילות קטליטית אם התמזגו ב-gt. "+ + + +", "+ + +", "+ +", "+" ו-"-" מייצגים בהתאמה עבור "חזק מאוד", "חזק", "ביניים", "חלש" ו-"none".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה, הצגנו שלוש שיטות לאפיון מוטציות הקשורות למחלות, אשר כוללות את שיטת הפעולה הבין-גופית, שיתוף הפעולה של החיל המלכותי הבריטי ושיטת לוציפראז מפוצלת בחינם. מאז חיל הים הבריטי יש גם פעילות קטליטית ו אלוסטריה פעילות, מוטציות מסוגים שונים של חיל הים יכול להפעיל את הזרם איתות דרך שני מנגנונים ברורים¹³^,¹⁴^,¹⁶^,¹⁷ , ¹⁸. המוטנטים הפעילים מבחינה חוקתית באופן ישיר מזיתים ישירות את מעבר הזרם המורד, ואילו המוטציות המתות בזרם ה-קינאז מפעילים את המטה ומפעילים את מקביליהם הפראיים. עם זאת, שני המוטציות הפעילים והאנטי-מוטתים הללו מחייבים את הדימרזציה למלא את תפקידם¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁹^,²⁰והדימר הנטייה של מוטציות החיל המלכותי קובע לא רק את הפעילות קטליטי או אלוסטריה של מוטציות חיל הים, אלא גם את רגישותם לחיל המעכבי¹⁵^,²⁴. השימוש בשיטת החוץ הגופית, שיתוף ההפעלה של חיל ההים הבריטי, ושיטת לוציפראז מפוצלת מספקת לנו סדרה של שיטות פשוטות, יעילות ואמינות להבחנה בין המוטנטים הפעילים והאקטיביים מפני המוטציות המתות-קינאז, כמו גם הערכת יכולת להפעיל איתות במורד הזרם.

השיטה הקלאסית לגילוי הפעילות הקטליטית של החלבון. כדי לאמץ את השיטה למדידת הפעילות הקטליטית של מוטציות בחיל-ההים, עשינו כמה שינויים משמעותיים בריאגנטים ובהליכים¹⁵^,²¹^,²². מאז משפחת חיל ההים הבריטי לתפקד כדימרס כדי זרחני המצע שלהם, מק, ואהדה דימרים שלהם/היציבות היא נמוכה יחסית, יש לנו הפחיתו את הריכוז של כביסה NP-40 מ 1% כדי 0.25% במאגרי לטיהור חלבונים של חיל הז כדי למנוע החיל המלכותי הבריטי מהניתוק. באותו האסימון, השתמשנו גם בנוהל כביסה עדין מהיר לטיהור חלבונים של חיל החוץ. שינויים אלה הם קריטיים לגילוי הפעילות הקטליטית של מוטציות בעלות החיים הפעילים, עם אהדה ויציבות מאוד חלשים, שניתן לזהותו כמוטציות של "קינאז-מתים" על-ידי מוטציות הקלאסיות בתוך מערכת המידע הקלאסית. בנוסף, הדגמנו שהפיוז של gt היא דרך חלופית טובה למנוע מחיל הים הבריטי מדיסוציאציה במהלך הטיהור באותו שיטת הפעולה¹⁵^,²¹^,²². באשר למוטציות המתות-היום, גם אם הן מותכות באמצעות GT, הן אינן מפגינות פעילות קטליטית באותה שיטת הפעולה.

מערכת ההפעלה שיתוף העין של חיל ההים פותחה על ידינו להעריך את היכולת של מוטציות בעלי החיים המתים של קינאז כדי לשנות את מקביליהם הפראיים¹³^,¹⁵^,²¹^,²²^,²³ ^, ²⁵. בתוך שיטת הרומן הזאת, אנו משתמשים בחלבונים שנחתכו מ-N-טרמינוס, ובכך לא צריך את הביטוי המשותף של מוטציות של ras פעיל או הפעלת ras, מה שהופך את הדבר הזה לרגיש מאוד. בנוסף, ה-אלוסטריה activator (קינאז-המוטציה של חיל ההים המלח) והמקבל (מוטציה לזרז המוסמכת לחיל המידע) בתוך שיטת הפעולה ניתן לבודד ולטהר בקלות לחקירת אירועים מולקולריים בתהליך ההפעלה^{המונעת של דימרזציה . שלוש עשרה}

כפי שהזכרנו לעיל, הזיקה לדימר/יציבות היא גורם מפתח המסדיר את התפקוד של משפחת חיל-ההים והמוטציות שלהם, וקובע גם את רגישותם למעכבי¹³^,¹⁴,¹⁵^, ¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,²⁴ עם זאת, הזיקה הדימר של משפחת חיל ה, והמוטנטים הקשורים ביותר למחלות שלהם נמוך מאוד. כדי למדוד פרמטר זה, הביוכימיה המסורתית דורשת לסבך את ההליכים הניסיוניים וציוד מתקדם (כגון שיטת SPR), או בקושי להפיק נתונים אמינים ומתפיקים (כגון immunoprecipitation). לעומת זאת, שיטת הפיצול לוציפראז ללא תשלום היא שיטה פשוטה, רגישה, עקבית וחסכונית למדידת האהדה היחסית/יציבות של משפחת חיל-ההים והמוטציות שלהם¹⁵^,²¹^, ²²^,³⁶. שיטת הפעולה הזו יכולה לחקור את ההבדל העדין בין אהדה/יציבות בקרב המוטציות השונות של חיל הפרשים. כפי שדווחו לפני¹⁵, braf (V600E/aae) יש אהדה מאוד חלשה דיימר/יציבות הדימרס שלה יהיה שבור לחלוטין על טיהור גם אם באמצעות הליך עדין מאוד. באמצעות השיטה הזו, אנחנו יכולים להבחין את האהדה דיימר חלש/יציבות של braf (V600E/aae) מתוך זה של monomeric braf (V600E/aae/R509H) (איור 3).

לסיכום, קבוצה זו של שיטות מעשיות וביצוע יכולות למלא את הדרישות של הגדרת כל המוטציות הקשורות למחלות, ובכך לעזור לנו לבחור אסטרטגיות מתאימות לטיפול במחלות מונעות שונות בתחום המוטציות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים רוצים להכיר את המענק לוקמיה של תאים שעירים לתמיכה של יואן Jimin. עבודה זו נתמכה על ידי אסיה קרן מחקר הסרטן (AFCR2017/2019-JH), דוכס-נוס Khoo גשר מימון פרס (דוכס-נוס-KBrFA/2018/0014), מענק הגישור של NCFF (NCCRF YR2018-יולי-BG4), המענק של NCCRF מענק (NCCRF YR2017-יולי-PG3), ו- מענק מחקר (AM/TP011/2018).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-phosphoERK1/2	Cell Signaling Technologies	4370
anti-phosphoMEK1/2	Cell Signaling Technologies	9154
anti-ERK1/2	AB clonal	A0229
anti-MEK1/2	Cell Signaling Technologies	9124
anti-FLAG(mouse)	Sigma-Aldrich	F3165
anti-HA	Novus Biologicals	MAB6875
anti-FLAG(Rabbit)	Cell Signaling Technologies	14793
anti-β-actin	Sigma-Aldrich	A2228
anti-FLAG beads(M2)	Sigma-Aldrich	A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG	Jackson Laboratories	115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG	Jackson Laboratories	111-035-144
pcDNA3.1(+)	In vitrogen	V79020
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Fugene 6	Roche	11 814 443 001
DMEM w/o phenol red	Invitrogen	21063-029
D-luciferin	GoldBio	LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)	prepared in our previous studies	N.A.	Reference 15.
GloMax-Multi Detection System.	Promega	E7041

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase". FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).
Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).
Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).
Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. "RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).

Cancer Research

אפיון מוטציות הקשורות למחלות של חיל המשפחה באמצעות קבוצה של שיטות מעשיות ושימושיות

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.