Summary
Neste artigo, nós apresentamos um jogo de métodos práticos e viáveis para caracterizar mutantes doença-relacionados de kinases da família do RAF, que incluem o ensaio in vitro da quinase, o ensaio da coativação do RAF, e o ensaio rachado complementar do luciferase.
Abstract
O fibrosarcoma ràpida acelerado (RAF) quinases da família jogam um papel central na biologia de pilha e sua deficiência orgânica conduz aos cancros e às desordens desenvolventes. Uma caracterização de mutantes da RAF relacionados à doença nos ajudará a selecionar estratégias terapêuticas apropriadas para o tratamento dessas doenças. Estudos recentes mostraram que as cinases familiares da RAF têm atividades catalíticas e aloestericas, que são fortemente reguladas por dimerização. Aqui, construímos um conjunto de métodos práticos e viáveis para determinar as atividades catalíticas e aloestericas e a afinidade/estabilidade do dímero relativo das cinases familiares da RAF e seus mutantes. Em primeiro lugar, alteramos o ensaio de quinase in vitro clássico, reduzindo a concentração de detergente em buffers, utilizando um procedimento de lavagem rápida suave, e empregando uma fusão de glutationa S-transferase (GST) para evitar que os dímeros da RAF se dissociem durante Purificação. Isto permite-nos de medir apropriadamente a atividade catalítica de mutantes constitutivamente ativos da RAF. Em segundo lugar, nós desenvolvemos um ensaio novo da coativação do RAF para avaliar a atividade alostérico de mutantes da RAF da quinase-inoperante usando proteínas truncadas do RAF do N-terminal, eliminando a exigência de Ras ativas em protocolos atuais e conseguindo desse modo um mais elevado Sensibilidade. Finalmente, nós geramos um único ensaio complementar da luciferase da separação para medir quantitativamente a afinidade/estabilidade do dímero relativo de vários mutantes do RAF, que é mais de confiança e sensível comparado ao ensaio tradicional da co-imunoprecipitação. Em resumo, esses métodos têm as seguintes vantagens: (1) fácil de usar; (2) capaz de realizar eficazmente sem equipamento avançado; (3) custo-eficaz; (4) altamente sensível e reprodutível.
Introduction
As quinases da família RAF são um componente chave da cascata de sinalização Ras/Raf/MEK/Erk, que transmitem um sinal de RAS para ativar a proteína quinase ativada por mitogen (MEK)1,2,3,4. Esta família de quinases desempenha um papel crucial no crescimento celular, sobrevivência e diferenciação, e suas alterações induzem muitas doenças, notadamente o câncer5,6,7,8. Recentemente, os sequenciamentos de Genomic identificaram muitos mutantes doença-relacionados do RAF que exibem propriedades diferentes na transmissão do sinal de Ras/Raf/MEK/Erk cascata9,10,11. Uma caracterização cuidadosa dos mutantes da RAF nos ajudará a entender os mecanismos moleculares de como os mutantes da RAF alteram a saída de sinal da cascata RAS/RAF/MEK/ERK, eventualmente selecionam abordagens apropriadas para o tratamento de várias doenças movidas por mutantes da RAF.
As quinases da família RAF incluem três membros, CRAF, BRAF e Araf, que têm estruturas moleculares semelhantes, mas diferentes habilidades para ativar a sinalização a jusante1,2,3,4. Entre estes paralogs, braf tem a atividade a mais elevada em virtude de seu Motif constitutivamente fosforilada NTA (N-tirtual umcidic)12,13,14, quando Araf tiver o mais baixo atividade decorrente de seu motivo não canônico APE15. Isto pode explicar as freqüências diferentes da mutação de de do RAF nas doenças: BRAF > CRAF > Araf. Além disso, dentro do mesmo paralog do RAF, as mutações em locais diferentes podem provocar a sinalização a jusante em maneiras distintas, que adiciona uma outra camada de complexidade à regulação de kinases da família do RAF. Estudos recentes demonstraram que todas as cinases da RAF têm atividades catalíticas e alopestericas13,14,16,17,18. Mutantes constitutivamente ativos da RAF giram sobre a sinalização a jusante diretamente pela fosforilação MEK, enquanto os mutantes da RAF quinase-Dead podem transacionar seus homólogos do tipo selvagem através da dimerização lado a lado e ativar a sinalização de MEK-ERK16 ,19,20. A afinidade/estabilidade do dímero é um parâmetro-chave que não só determina a atividade alostômica de mutantes da RAF de quinase morta, mas também afeta a atividade catalítica de mutantes da RAF constitutivamente ativos15,21, 22. a quinase-mortos RAF mutantes com alta afinidade de dímero/estabilidade pode transacionar o Wild-Type endógena rafs diretamente15, enquanto aqueles com intermediário dímero afinidade/estabilidade requer uma coordenação de Ras ativas ou um nível elevado de moléculas de RAF do tipo selvagem para funcionar13,15,20,21,23. Similarmente, mutantes constitutivamente ativos do RAF fosforilar MEK em uma maneira dímero-dependente, e aqueles com baixa afinidade/estabilidade do dímero perdem sua atividade catalítica in vitro em cima da imunoprecipitação que quebra os dímeros fracos do RAF15, 21,22. A afinidade/estabilidade do dímero também determina a sensibilidade dos mutantes da RAF aos seus inibidores e correlaciona-se positivamente com a resistência dos inibidores da RAF24. Portanto, para caracterizar os mutantes da RAF relacionados à doença, é necessário medir suas atividades catalíticas e aloestericas e afinidade/estabilidade de dímero.
Nos últimos anos, nosso laboratório e outros desenvolveram vários métodos para caracterizar as cinases da família RAF e seus mutantes. De acordo com o nosso laboratório e a experiência dos outros, pensamos que os três ensaios seguintes têm vantagens na definição de mutantes da RAF relacionados com a doença: (1) o ensaio in vitro quinase que pode ser realizado com facilidade para detectar a atividade catalítica de constitutivamente mutantes ativos da RAF15; (2) o ensaio da co-ativação do RAF que é um método confiável e conveniente para medir a atividade alostérico de mutantes da quinase-inoperante RAF13,15,21,22,23, de 25; (3) o ensaio de luciferase de divisão complementar que tem sensibilidade muito maior na medição da afinidade/estabilidade do dímero relativo dos mutantes da RAF em contraste com o ensaio de co-imunoprecipitação tradicional, e é capaz de realizar sem equipamentos avançados em contraste com os métodos analíticos quantitativos como a análise de SPR (Surface Plasmon Resonance)15,22. Combinando estes três ensaios, nós podemos compreender facilmente como um mutante doença-relacionado da RAF altera a sinalização a jusante e utiliza desse modo uma estratégia terapêutica apropriada para tratar a doença causada por esta mutação do RAF.
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Protocol
1. ensaio in vitro quinase para medir a atividade catalítica de mutantes da RAF
- Construa vetores codificando mutantes da RAF (Figura 1a) com tag Flag (dykddddk) no C-Terminus usando o conjunto Gibson ou métodos tradicionais de clonagem molecular.
- Introduza o Tag e as mutações da bandeira nas seqüências de codificação do RAF por PCRs, e insira então seqüências inteiras no vetor do pCDNA 3.1 (+) usando o conjunto de Gibson ou a ligadura do ADN T4 e seguindo os protocolos da manufatura. Use as seguintes condições para reações de PCR: (1) 95 ° c, 2 min; (2) 95 ° c, 30 s; (3) 59 ° c, 30 s; (4) 68 ° c, 3 min; (5) 20 ciclos de (2 a 4); (6) 4 ° c de retenção.
Nota: Os primers de PCR para clonagem: 5-AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 e 5-CAGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTA-3. - Insira a sequência de codificação GST a montante de sequências de codificação de mutantes da RAF para gerar vetores que codificam mutantes da RAF fundidos por GST usando os mesmos métodos descritos na etapa 1.1.1.
- Valide todos os vetores por seqüenciamentos de DNA antes da transfecção.
- Introduza o Tag e as mutações da bandeira nas seqüências de codificação do RAF por PCRs, e insira então seqüências inteiras no vetor do pCDNA 3.1 (+) usando o conjunto de Gibson ou a ligadura do ADN T4 e seguindo os protocolos da manufatura. Use as seguintes condições para reações de PCR: (1) 95 ° c, 2 min; (2) 95 ° c, 30 s; (3) 59 ° c, 30 s; (4) 68 ° c, 3 min; (5) 20 ciclos de (2 a 4); (6) 4 ° c de retenção.
- Placa 293T células em 6-bem placas em uma densidade de 5 x 105 células/bem um dia antes do transfection. Quando a densidade da célula atinge 80 ~ 90% confluência no segundo dia, transfecção com vetores de codificação Flag-Tagged RAF quinases ou seus mutantes da etapa 1,1 em células, seguindo o protocolo de fabricação de reagentes de transfecção (tabela de materiais).
- Substitua o meio de cultura 24 h após a transfecção.
- Aspirar o meio de cultura 48 h após a transfecção e adicionar 400 μL/poço de tampão de lise (25 mM TRIS · HCl, 150 milímetros NaCl, 1 milímetro de ácido ethylenediaminetetraacético (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) suplementado com os inibidores da protease e da fosfatase às pilhas do lyse no gelo.
Nota: A concentração de NP-40 no tampão do lysis é crítica para detectar a atividade catalítica de mutantes do RAF com afinidade/estabilidade moderadas do dímero in vitro. Uma alta concentração de detergente ou um detergente forte no tampão de Lise pode quebrar dímeros da RAF e, assim, matar a atividade catalítica de cinases RAF ou seus mutantes. - Transfira os lysates da pilha a um tubo de 1,5 mL, e gire para baixo por 12.000 x g por 10 minutos em 4 ° c para esgotar restos da pilha.
- Transfira 300 μL por amostra de lisados de células inteiras limpas para tubos de 1,5 mL, adicione 20 μL por amostra de grânulos de afinidade ANTIBANDEIRA e gire em uma sala fria (4 ° c) por 1 h. Igualmente tome 40 μl por a amostra do lisado inteiro limpo da pilha de lado para detectar a expressão e a atividade (phospho-ERK1/2) de mutantes do RAF por immunoblots como descrito abaixo.
- Lave os grânulos da anti-bandeira uma vez com tampão do lysis, então uma vez com tampão da reação da quinase (20 milímetros HEPES, 10 milímetros MgCl2, 0,5 mm na3vo4, 0,5 mm DTT, pH 7,2), e adicione 20 μl da mistura da reação da QUINASE (2 μg de MEK1 (K97A) e 100 μm ATP em 20 μL de buffer de ação) por amostra.
Nota: A lavagem do grânulo deve ser terminada delicadamente e rapidamente, o amortecedor residual deve ser aspirado completamente antes de adicionar a mistura da reação da quinase, e todas as operações nesta etapa devem ser executadas em 4 ° c em uma sala fria. - Incubar as reações da quinase à temperatura ambiente (25 ° c) durante 10 min, e vire os tubos contendo reações quinase com os dedos a cada minuto durante a incubação.
- Adicionar 5 μL de tampão de amostra de 5x SDS (375 mM TRIS · HCL, 9% Dodecil sulfato de sódio (SDS), 50% glicerol, 0, 3% bromophenol azul) por amostra para interromper as reações da quinase e, em seguida, aquecer as amostras a 90 ° c por 5 min.
- Execute as amostras na electroforese do gel do poliacrilamida 9 ~ 12% (página) com 0,1% SDS, transfira as proteínas à membrana do nitrocelulose, e detecte os níveis de mutantes de Phospho-MEK e de RAF nas amostras por immunoblots.
Nota: O phospho-MEK também pode ser quantificado usando a incorporação de γ32P-ATP. Resumidamente, 10 μM γ32P-ATP é adicionado ao tampão de reação da quinase, e a quantidade de MEK fosforilado é então quantificada após a separação de página usando autoradiografia padrão, fosfoimagem ou técnicas de contagem de cintilação líquida como Apropriado.
2. ensaio de co-ativação da RAF para avaliar a atividade alopática da quinase-mutantes mortos da RAF
- Construa vetores que codificam o receptor do RAF (domínio da quinase de CRAF com motivo unphosphorylatable de NTA, aaff) ou os ativadores quinase-inoperantes do RAF (domínio da quinase do RAF com motivo da fosforilação-mimicked NTA, SSDD, ddee ou DGEE) (Figura 1A) como descrito na etapa 1,1.
- Transfect 293T Cells com dois vetores que codificam o receptor do RAF e o ativador da RAF da quinase-inoperante ou um único vetor que codifica uma das proteínas como descrito nas etapas 1,2 e 1,3.
- Substitua o meio de cultura em 24 h após o transfection, e ACTHR da colheita 293T em 48 h para preparar os lysates inteiros da pilha como descrito nas etapas 1,4 e 1,5.
- Misture o lisado inteiro limpo da pilha com o amortecedor da amostra de 5x SDS rapidamente na temperatura ambiente (° c 25) e ferva então em 90 ° c por 5 minutos.
- Execute as amostras de lisado de células inteiras fervidas em 9 ~ 12% PAGE com 0,1% SDS, transfira as proteínas para a membrana de nitrocelulose e detecte os níveis de Phospho-ERK1/2 e controle as proteínas por immunoblots.
3. ensaio Split luciferase de cortesia para medir a afinidade de dímero relativo/estabilidade de mutantes da RAF
- Construir vetores que codificam mutantes marcados com FLAG RAF fundidos no N-Terminus de nluc (N-Terminus de Firefly luciferase, Aa2-416) ou no C-Terminus de cluc (C-Terminus de Firefly luciferase, aa398-550) conforme descrito na etapa 1,1.
- Transfect 293T Cells com um par de vetores que codificam mutantes diferentes de nluc-RAF e mutantes de cluc-RAF como descrito em etapa 1,2.
- Em 24 h após o transfection, mas os ACTHR da pilha 293T em placas pretas da imagem de Krystal na densidade da pilha de 2x105 por bem com meio cor-livre (isto é, DMEM sem o vermelho do phenol).
- 24 h mais tarde, adicione D-luciferin (0,2 mg/mL) aos transfectants da pilha 293T, incubar por 30 minutos, e meça os sinais do luciferase usando um multi sistema da deteção (tabela dos materiais).
- Após a medição dos sinais de luciferase, aspirar os transfectantes médios e de lyse 293T com tampão de Lise para preparar os lisados de células inteiras, conforme descrito nas etapas 1,4 e 1,5.
- Execute as amostras inteiras do lisado da pilha em 9 ~ 12% Page com 0,1% SDS e detecte os níveis da expressão de mutantes de nluc-RAF e de mutantes de cluc-RAF pelo immunoblot da anti-bandeira como descrito na etapa 2,5. Os níveis relativos da expressão do mutante de nluc-RAF e do mutante de cluc-RAF em ACTHR 293T são quantificados usando a imagem J de seus immunoblots.
- Normalize os sinais da luciferase de ACTHR da pilha 293T de acordo com os níveis da expressão de mutantes de nluc-RAF e de mutantes de cluc-RAF. Momentaneamente, isto é conseguido dividindo o sinal cru do luciferase pelos níveis relativos da expressão de mutantes de nluc-RAF e de mutantes de cluc-RAF da etapa 3,6.
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Representative Results
As quinases da família RAF têm atividades catalíticas e aloestericas, que permitem que seus mutantes relacionados à doença ativem a sinalização a jusante através de diferentes mecanismos13,14,16,17 ,18. Os mutantes da RAF constitutivamente ativos fosforilar diretamente seus substratos, enquanto os mutantes da RAF quinase-Dead cumprem sua função através da transativação de contrapartes do tipo selvagem. Como mostrado na Figura 1B, ambos os mutantes da RAF constitutivamente ativos (como mutantes reguladores da coluna vertebral (R-Spine) (BRAF (L505M), CRAF (ddee/L397M) e Araf (DGEE/L358M))13,23,25 , 26, BRAF (V600E), e BRAF (∆ nvtap)) e mutantes da RAF da quinase-inoperante (tais como a espinha catalítica (C-espinha)-BRAF fundido (∆ nvtap/V471F)15) ativam o Erk quando expressos em células 293T. Portanto, a capacidade dos mutantes da RAF para ativar a sinalização de ERK em células não pode servir como um padrão para distinguir um mutante constitutivamente ativo de um mutante de quinase-Dead, embora alguns mutantes de quinase-Dead com afinidade de dímero moderado/estabilidade gira em sinalização a jusante apenas com a cooperação de Ras activas. Três métodos que apresentamos aqui podem nos ajudar a caracterizar efetivamente todos os mutantes da RAF relacionados à doença. As propriedades biológicas de todos os mutantes da RAF reveladas pelo uso desses ensaios em nossos estudos anteriores foram resumidas na tabela 1.
O primeiro método que podemos usar para distinguir os mutantes da RAF constitutivamente ativos dos mutantes da RAF quinase-morta é o ensaio in vitro quinase. Neste ensaio, os mutantes da RAF foram purificados por imunoprecipitação e as reações catalíticas foram realizadas in vitro com MEK1 (K97A) e ATP de quinase-Dead como substratos. A atividade catalítica dos mutantes da RAF foi medida como o Al (ativação LOOP)-phosphorylation de MEK1 (K97A) nas misturas da reação da quinase pelo immunoblot. Como mostrado na Figura 1C, este ensaio pode efetivamente sondar a atividade catalítica de mutantes da R-espinha de BRAF, CRAF e Araf13,15,23, BRAF (V600E)9, e BRAF (∆ nvtap)15, Mas não a do BRAF quinase-inoperante (V471F/∆ NVTAP)15 que tem uma C-espinha fundida. No entanto, a atividade catalítica de mutantes da RAF constitutivamente ativos com fraca afinidade/estabilidade de dímero como Araf R-Spine Mutant (Araf (DGEE/L358M)) (Figura 1C, pista 4), mutantes de CRAF e Araf com interface de dímero alterada (CRAF (ddee/ L397M/R401H), Araf (DGEE/L358M/APE/R362H))15,22 (Figura 1D, E) pode não ser sondado usando este ensaio, uma vez que seus dímeros foram quebrados durante a purificação, especialmente quando a purificação foi com amortecedores que contenham detergentes fortes ou de alta concentração. Para evitar a perda de atividade catalítica de mutantes da RAF com afinidade/estabilidade de dímero fraco, geralmente fundimos esses mutantes com GST (glutathione S-transferase), uma proteína dimérica com forte afinidade/estabilidade antes realização do ensaio in vitro da quinase, que pode resgatar a atividade catalítica destes mutantes da RAF15,16 (Figura 1E). Em geral, a maioria dos mutantes da RAF podem ser classificados como mutantes ativos ou quinase-mortos, usando este ensaio.
O segundo método que descrevemos aqui é o ensaio de co-ativação da RAF que pode ser usado para avaliar a atividade alostômica de mutantes da RAF quinase-Dead13, 15,21,22,23 , 25. embora alguns mutantes da RAF quinase-Dead com afinidade/estabilidade de dímero muito alto, como BRAF (V471F/∆ nvtap)15, possam ativar diretamente moléculas endógenas da RAF quando expressas em células (Figura 1B, pista 7), a maioria mutantes da RAF de quinase-Dead exigem a cooperação de Ras ativas para transacionar RAFs de tipo selvagem. No entanto, RAS ativas é um ativador direto da sinalização ERK, cuja introdução aumentará o nível basal do ERK ativo. Para evitar a interferência de Ras ativas, utilizou-se mutantes N-Terminus-truncados da RAF neste ensaio (Figura 2A). Como mostrado na Figura 2B, mutantes de BRAF, CRAF e RAF com motivo NTA ácido e fusão C-espinha (BRAF (V471F, aa431-766), CRAF (ddee/V363F, aa323-648) e ARAF (DGEE/V324F, aa284-606)) funcionaram como ativadores alostóicos para desencadear a atividade catalítica de CRAF com motivo NtA não phosphorylatable (receptor CRAF, CRAF (AAFF, aa323-648)) quando coexpressos em células de 293T. Ao contrário, o mutante BRAF quinase-inoperante (V471F/∆ NVTAP, aa431-766) que têm a afinidade/estabilidade do dímero muito elevado (veja abaixo) girado sobre a sinalização de ERK disparando RAFs endógenos, mesmo sem a coexpressão do receptor de CRAF. Globalmente, este ensaio pode ser utilizado para avaliar a capacidade de transactivação de todos os mutantes da RAF com quinase morta.
A dimerização da família RAF cinases não só regula a sua capacidade de ativar a jusante MEK-ERK sinalização, mas também determina a sua sensibilidade aos inibidores da RAF15,16,20,22,24,27,28,29,30,31,32. Em contraste com outras interações proteína-proteína entre esta via33,34,35, a dimerização das cinases familiares da RAF e seus mutantes é relativamente fraca e difícil de ser avaliada por meio de ensaios de bioquímica tradicionais, como a coimunoprecipitação. Para resolver esse problema, desenvolvemos recentemente um ensaio de luciferase dividida de cortesia para medir a afinidade/estabilidade do dímero relativo das cinases da família RAF e seus mutantes15,22,36. Como mostrado naA Figura 3Um, os domínios da RAF quinase (aa431-766 para BRAF, aa323-648 para CRAF e aa284-606 para ARAF) foram fundidos respectivamente com N-Terminus (Aa2-416) ou C-Terminus (aa398-550) de Firefly luciferase (nluc e cluc), que serão reunidos para montagem intacta luciferase após a dimerização da RAF. A atividade da luciferase neste ensaio correlaciona-se diretamente com a quantidade de dímeros da RAF. Este ensaio é muito sensível e pode detectar até mesmo uma dimerização muito fraca de mutantes da RAF. Como relatado antes15, o BRAF oncogênico (V600E) funciona como um dímero, e somente uma mutação composta com a mutação de ARG-to-his (R509H) na relação do dímero e a alteração não-Canonic do APE (P622A no motivo do APE) pode completamente abolir sua dimerização e obstrui desse modo seu catalítico atividadeA Figura 3B). Usando o ensaio in vitro da quinase, nós encontramos mais que a variação de BRAF (V600E) com o Motif alterado do macaco, BRAF (V600E/AAE), mas não aquela com o ARG-à-sua mutação na relação do dímero, BRAF (V600E/R509H), perdeu sua atividade catalítica em cima da purificação (A Figura 3C), sugerindo que a variante anterior tem afinidade/estabilidade muito menos dímero do que a última. Para medir diretamente a propensão destas variantes BRAF (V600E) para formar dímeros, realizou-se um ensaio de luciferase de divisão complementar, e confirmou que essas variantes tinham afinidade/estabilidade de dímero muito diferente com BRAF (V600E) maior que BRAF (V600E/ R509H) do que BRAF (V600E/AAE) do que BRAF (V600E/R509H/AAE) (A Figura 3D). O sinal de luciferase produzido por monomérico BRAF (V600E/R509H/AAE) foi comparável ao do controle não transfectado de 293T (A Figura 3D, pista do painel esquerdo 5), indicando que este ensaio tem um fundo muito baixo. Para determinar ainda mais a eficácia do ensaio de luciferase de divisão complementar, Nós medimos em seguida usando este ensaio a afinidade/estabilidade do dímero relativo de um grupo de mutantes oncogênicos BRAF com deleções no quadro de loop β3-αC que foi identificado por nós e outros Grupos15,37,38. Como sabemos, embora todos esses mutantes ativaram a sinalização de ERK quando expressas em células de 293T (A Figura 3E), apresentaram atividade catalítica bastante diferencial in vitro (A Figura 3F). O BRAF (∆ MLN (aa484-486 del)) e BRAF (∆ NVTAP (aa486-490 del)) foram muito ativos na purificação por imunoprecipitaion, enquanto o BRAF (∆ NVTAPT (aa486-491 del)) e BRAF (∆ QA (aa496-497 del)) perderam sua atividade catalítica a mesma condição, embora pode ser resgatado pela fusão GST. Adicionalmente, a versão quinase-inoperante de BRAF (∆ NVTAP), BRAF (V471F/∆ NVTAP) exibiu uma potência forte para ativar RAFs endógenos quando expressado nas pilhas (Figura 1Bpista 7). Esses dados sugerem que este grupo de mutantes BRAF tem afinidade/estabilidade de dímero muito diferente com BRAF (∆ NVTAP) maior que BRAF (∆ MLN) que BRAF (∆ NVTAPT) e BRAF (∆ QA). De fato, o resultado do ensaio de luciferase dividido de cortesia apoiou completamente nossa inferência (A Figura 3G). Tomados em conjunto, os nossos dados indicam que o ensaio de luciferase de divisão complementar é um método fiável para medir a afinidade/estabilidade do dímero relativo dos mutantes da RAF.
Figura 1 : Sonda a atividade catalítica dos mutantes da RAF usando o ensaio in vitro quinase. (A) um diagrama esquemático para mutações da RAF utilizados neste estudo. (B) ambos os mutantes da RAF constitutivamente ativos e quinase-mortos podem ativar a sinalização de ERK quando expressos em células. 293T as pilhas foram transfected com os vetores que codificam Mutants diferentes do RAF, e a atividade de ERK foi detectada pelo anti-phospho-ERK1/2 immunoblot. (C) mutantes de RAF ativos constitutivamente com baixa afinidade/estabilidade de dímero, bem como mutantes da RAF quinase-mortos não podem fosfolato de MEK in vitro após a purificação por imunoprecipitação. Os mutantes da RAF em B foram purificados usando grânulos antibandeira, e sua atividade catalítica foi sonada usando o ensaio in vitro da quinase como descrito no protocolo. (D-E) A atividade catalítica in vitro de mutantes da RAF constitutivamente ativos com baixa afinidade/estabilidade de dímero pode ser resgatada pela fusão de GST. (D) mutantes de RAF constitutivamente ativos e seus homólogos fusionados por GST foram expressos em células de 293T e sua atividade foi mensurada por immunoblot ERK1/2. (E) os mutantes da RAF em D foram purificados por imunoprecipitação, e sua atividade catalítica in vitro foi sonada usando o ensaio in vitro quinase como descrito no protocolo. Mutants da R-espinha do RAF: BRAF (L505M), CRAF (DDEE/L397M), e ARAF (DGEE/L358M). "∆ NVTAP" representa para a supressão de aa486-490 em BRAF. A mutação APE de ARAF significa A475P que gera um motivo canônico APE em ARAF. "KD" representa para "domínio quinase" no texto completo. BRAF (KD) significa o fragmento aa431-766 de BRAF, enquanto CRAF (KD) e ARAF (KD) representam respectivamente para o fragmento aa323-648 de CRAF e o fragmento aa284-606 de ARAF. Os resultados nesta figura foram relatados previamente15,22. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Avalie a capacidade dos mutantes da RAF de transacionar RAFs de tipo selvagem usando o ensaio de coativação da RAF. A) um diagrama ilustrando o ensaio de coactivação da RAF. (B) mutantes da RAF da quinase-inoperante com o motivo ácido de NTA foi coexpressado com o receptor catálise-competente do CRAF em pilhas de 293T, e a atividade de ERK1/2 em ACTHR 293T foi medida pelo immunoblot anti-phosho-ERK1/2. A maioria de mutantes da RAF da quinase-inoperante exceto BRAF (V471F/∆ NVTAP) que tem uma afinidade/estabilidade muito elevadas do dímero exigiram a coexpressão do receptor exógeno do RAF para girar sobre a sinalização de ERK. Os resultados nesta figura foram relatados previamente15,22. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Meça a afinidade/estabilidade do dímero relativo dos mutantes da RAF usando o ensaio de luciferase de divisão complementar. A) um diagrama ilustrando o ensaio de luciferase dividida complementar. (B-D) A dimerização das variantes BRAF (V600E) é necessária para sua atividade catalítica in vivo e in vitro. (B) a variante monomérica BRAF (V600E), BRAF (V600E/R509H/AAE) não tem atividade catalítica in vivo, que pode ser recuperada pela fusão de GST. As variantes BRAF (V600E) e suas contrapartes fusionadas por GST foram expressas em células de 293T, e sua atividade foi mensurada por anti-fosho-ERK1/2. (C) a variante BRAF (V600E) com baixa afinidade/estabilidade de dímero, BRAF (V600E/AAE) perdeu sua atividade catalítica in vitro após a purificação, que pode ser resgatada pela fusão de GST. BRAF (V600E) variantes de B foram purificadas por imunoprecipitação e sua atividade catalítica foi sonada pelo ensaio in vitro quinase como descrito no protocolo. (D) a afinidade/estabilidade do dímero relativo das variantes BRAF (V600E) foi medida utilizando-se o ensaio de luciferase de divisão complementar, conforme descrito no protocolo. (E-G) Mutantes de BRAF com apagamento do em-frame da função do laço β3-αC como dímeros para ativar a sinalização de ERK. (E) os mutantes BRAF com supressão no quadro do loop β3-αc ativam a sinalização Erk quando expressos em células. Os mutantes BRAF foram expressos em células de 293T e sua atividade foi medida conforme descrito em B. F) mutantes BRAF com baixa afinidade/estabilidade de dímero de E perdeu a atividade catalítica in vitro, que pode ser resgatada pela fusão GST. A atividade catalítica in vitro de mutantes BRAF e seus homólogos fundidos com GST de e foi medido como em C. (G) os mutantes BRAF com supressão no quadro do ciclo β3-αc têm uma afinidade/estabilidade de dímero bastante diferente. A afinidade/estabilidade do dímero relativo dos mutantes BRAF com deleção in-frame do laço β3-αC foi medida como em D. Barras de erro em D & G representam s.d. para mostrar variância entre experimentos independentes (n = 4). A mutação de AAE de BRAF significa P622A no motivo do APE que gera um motivo não-canônico do APE. "∆ MLN", "∆ NVTAPT" e "∆ QA" representam, respectivamente, os deleções de aa484-486, aa486-491, aa496-497 no loop β3-αC de BRAF. Alguns resultados nesta figura foram relatados previamente15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: A propriedade biológica de vários mutantes da RAF. A atividade catalítica, a atividade alopênica e a afinidade/estabilidade do dímero relativo de todos os mutantes da RAF utilizados neste estudo foram resumidas nesta tabela. "Y" significa "Sim", enquanto "N" representa "não". "N*" indica que esses mutantes têm atividade catalítica se fundidos com GST. "+ + + +", "+ + +", "+ +", "+" e "-" representam respectivamente para "muito forte", "forte", "intermediário", "fraco" e "nenhum".
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Discussion
Neste artigo, nós apresentamos três métodos para caracterizar Mutants doença-relacionados do RAF, que incluem o ensaio in vitro da quinase, o ensaio da coativação do RAF, e o ensaio rachado complementar do luciferase. Uma vez que a RAF quinases tem atividade catalítica e atividade alostômica, vários mutantes da RAF podem ativar a sinalização a jusante através de dois mecanismos distintos13,14,16,17, 18. os mutantes da RAF constitutivamente ativos fosforilar diretamente o efetor a jusante MEK, enquanto os mutantes da RAF quinase-Dead desencadeiam a sinalização a jusante através da transativação de seus homólogos do tipo selvagem. No entanto, ambos os mutantes da RAF constitutivamente ativos e quinase-mortos exigem que a dimerização cumpra sua função15,16,17,19,20e o dímero a propensão de mutantes de RAF determina não somente a atividade catalítica ou alostérico de mutantes do RAF mas igualmente sua sensibilidade aos nervos inibidores do RAF15,24. O ensaio in vitro quinase, o ensaio de coativação da RAF e o ensaio de luciferase dividido complementar fornecem-nos um conjunto de métodos simples, eficazes e fiáveis para distinguir os mutantes constitutivamente activos dos mutantes mortos pela quinase, bem como avaliar a sua capacidade de activar a sinalização a jusante.
O ensaio in vitro quinase é um método clássico para detectar a atividade catalítica das proteínas quinases. Para adotar este método para medir a atividade catalítica de mutantes da RAF, fizemos algumas revisões significativas nos reagentes e procedimentos15,21,22. Desde que a família da RAF quinases funcionam como dímeros para fosdilato seu substrato, MEK, e sua afinidade de dímero/estabilidade é relativamente baixa, reduzimos a concentração de detergente NP-40 de 1% para 0,25% em buffers para purificar proteínas da RAF, a fim de evitar Dímeros da RAF de dissociação. Pela mesma ficha, nós também usamos um procedimento de lavagem rápida suave para a purificação de proteínas da RAF. Estas mudanças são críticas para detectar a atividade catalítica de mutantes constitutivamente ativos da RAF com afinidade/estabilidade de dímero muito fraco, que podem ser identificados como mutantes da RAF "quinase morta" pelo ensaio clássico in vitro da quinase. Além, Nós demonstramos que a fusão de GST é uma boa maneira alternativa impedir dímeros do RAF da dissociação durante a purificação neste ensaio15,21,22. Quanto aos mutantes da RAF quinase-Dead, mesmo se forem fundidos com GST, não exibem nenhuma atividade catalítica neste ensaio.
O ensaio de co-ativação da RAF foi desenvolvido por nós para avaliar a capacidade dos mutantes da RAF de quinase-Dead para transacionar seus homólogos do tipo selvagem13, 15,21,22,23 , 25. neste novo ensaio, utilizamos as proteínas do RAF truncados N-Terminus e, assim, não precisamos da coexpressão de mutantes ativos RAS ou da activação de Ras, o que torna este ensaio muito sensível. Além disso, o ativador alostérico (mutante da RAF quinase-inoperante) e o receptor (mutante catalysis-competente do RAF) neste ensaio podem facilmente ser isolados e purificados para investigar eventos moleculars no processo da transativação dimerization-conduzida Trezeanos.
Como mencionamos acima, a afinidade/estabilidade do dímero é um fator chave que regula a função das cinases da família RAF e seus mutantes, e também determina sua sensibilidade aos inibidores da RAF13,14,15, 16,17,18,24. No entanto, a afinidade/estabilidade do dímero das cinases familiares da RAF e seus mutantes mais relacionados à doença é muito baixa. Para medir esse parâmetro, os ensaios de bioquímica tradicionais exigem complicar os procedimentos experimentais e equipamentos avançados (como o ensaio SPR), ou dificilmente produzem dados confiáveis e reprodutíveis (como o ensaio de imunoprecipitação). Por outro lado, o ensaio de luciferase dividido de cortesia é um método simples, sensível, consistente e econômico para medir a afinidade/estabilidade do dímero relativo das quinases da família RAF e seus mutantes15,21, 22,36. Este ensaio pode sondar a diferença subtil da afinidade/estabilidade do dímero entre vários mutantes do RAF. Como nós relatado antes de15, BRAF (V600E/AAE) tem uma afinidade muito fraca do dímero/estabilidade e seus dímeros serão quebrados completamente em cima da purificação mesmo se usando um procedimento muito delicado. Utilizando este ensaio, podemos distinguir a fraca afinidade/estabilidade do dímero de BRAF (V600E/AAE) do monomérico BRAF (V600E/AAE/R509H) (Figura 3).
Em resumo, este conjunto de métodos práticos e viáveis pode cumprir os requisitos de definição de todos os mutantes da RAF relacionados com a doença, e assim nos ajudar a selecionar estratégias apropriadas para o tratamento de várias doenças movidas por mutantes da RAF.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer a bolsa de leucemia de células peludas para o apoio de Yuan Jimin. Este trabalho foi apoiado pela Ásia fundo Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge financiamento Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF Bridging Grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF Pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), e SHF medicina acadêmica Subvenção à investigação (AM/TP011/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
| anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
| anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
| anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
| anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
| GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |
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