Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59795

Summary

Bu yazıda, içinde vitro kinaz assay, raf Co-aktivasyon tahlil ve tamamlayıcı Split Lusiferaz assay dahil raf aile kinazları, hastalık ile ilgili mutantlar karakterize için pratik ve uygulanabilir Yöntemler bir dizi sundu.

Abstract

Hızla hızlandırılmış Fibrosarkom (RAF) aile kinazları hücre biyolojisinde merkezi bir rol oynamaktadır ve bunların fonksiyon bozukluğu kanserler ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Hastalık ile ilgili RAF mutantlarının bir karakterizasyonu, bu hastalıkların tedavisinde uygun terapötik stratejileri seçmemize yardımcı olacaktır. Son çalışmalar RAF aile kinazların hem katalizör ve allosterik faaliyetler, sıkı dimerization tarafından düzenlenmiş olduğunu göstermiştir. Burada, katalitik ve allosterik faaliyetleri ve RAF ailesinin kinazlarının ve mutantların bağıl dimer yakınlık/stabilitesi belirlemek için pratik ve uygulanabilir Yöntemler bir dizi inşa ettik. Öncelikle, biz tampon deterjan konsantrasyonu azaltarak klasik in vitro kinaz tahlil değiştirildi, nazik bir hızlı yıkama prosedürü kullanarak, ve bir glutatyon S-transferase (GST) füzyon sırasında bunalımları raf dimerleri önlemek için istihdam Arıtma. Bu da bize, kurucu aktif RAF mutantların katalitik aktivitesini uygun şekilde ölçmemizi sağlar. İkincisi, biz bir roman raf Co-aktivasyon assay N-terminal kesilmiş raf proteinleri kullanarak kinaz-ölü raf mutantlar allosterik etkinliğini değerlendirmek için geliştirilen, geçerli protokollerde aktif RAS gereksinimini ortadan kaldırarak ve böylece daha yüksek bir elde Duyarlılık. Son olarak, biz kantitatif bağıl dimer yakınlık ölçmek için benzersiz bir tamamlayıcı bölünmüş Lusiferaz tahlil oluşturulan/çeşitli raf mutantların istikrar, hangi daha güvenilir ve duyarlı geleneksel Co-immünoprecipitation tahlil kıyasla. Özetle, bu yöntemlerin aşağıdaki avantajları vardır: (1) Kullanıcı dostu; (2) gelişmiş ekipman olmadan etkili bir şekilde yürütmek mümkün; (3) maliyet-etkili; (4) son derece hassas ve yeniden oluşturulabilir.

Introduction

Raf aile kinazları RAS/raf/mek/erk sinyalizasyon Cascade, Mitojen aktif protein kinaz (mek)1,2,3,4etkinleştirmek için RAS bir sinyal iletme önemli bir bileşenidir. Bu kinazlar ailesi hücre büyüme, hayatta kalma ve farklılaşma önemli bir rol oynar, ve onların değişiklikler birçok hastalık neden, özellikle kanser5,6,7,8. Son zamanlarda, genomik sequencings RAS/raf/mek/erk Cascade9,10,11sinyal iletimi farklı özellikleri sergiler birçok hastalık ile ilgili raf mutantlar belirledi. RAF mutantların dikkatli bir karakterizasyonu bize RAF mutantların RAS/RAF/MEK/ERK Cascade sinyal çıkışını değiştirmek nasıl moleküler mekanizmaları anlamak yardımcı olacaktır, sonunda çeşitli RAF mutant odaklı hastalıklar tedavisinde uygun yaklaşımlar seçin.

RAF aile kinazlar üç üye içerir, CraF, BRAF, ve Araf, benzer moleküler yapıları ama farklı yetenekleri olan1,2,3,4sinyalizasyon akış etkinleştirmek için. Bu paraloglar arasında, BRAF onun kurucu fosforile NTA (N-tTerminal acidic) Motif tarafından en yüksek aktivite vardır12,13,14, Araf en düşük sahip iken , standart olmayan APE motif15' den kaynaklanan aktivite. Bu hastalıklarda RAF paralogları farklı mutasyon frekansları açıklayabilir: BRAF > CRAF > ARAF. Dahası, aynı RAF paralog içinde, farklı sitelerde mutasyonlar, RAF ailesinin kinazlarının düzenlenmesi için karmaşıklık başka bir katman ekler ayrı görgü, akış sinyalizasyon tetikleyebilir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar tüm raf kinlerinin katalitik ve allosterik faaliyetlere sahip olduğunu göstermiştir13, 14,16,17,18. Yapıcı aktif RAF mutantları, doğrudan fosforlama MEK tarafından geri akış sinyallerini açmak, kinaz ölü RAF mutantlar yan yana dimerization aracılığıyla vahşi tip meslektaşları transactivate ve Me-ERK sinyalizasyon aktive edebilirsiniz16 ,19,20. Dimer yakınlık/kararlılık sadece kinaz ölü raf mutantların allosterik etkinliğini belirler değil, aynı zamanda kurucu aktif raf mutantların katalitik etkinliğini etkileyen bir anahtar parametresidir15,21, 22. kinaz-ölü raf mutantlar yüksek dimer benzeşimi/stabilitesi ile doğrudan endojen vahşi tip RAFs transactivate olabilir15, ara dimer yakınlık ile olanlar/istikrar aktif RAS veya bir koordinasyon gerektirir 13,15,20,21,23işlevi için vahşi tip raf moleküllerinin yüksek düzeyde. Benzer şekilde, bir dimer bağımlı şekilde kurucu aktif raf mutantlar fosforylate mek, ve düşük dimer yakınlık/stabilitesi olan zayıf raf dimerleri tatili immünoprecipitation üzerine kendi katalitik etkinliğini kaybetmek15, 21,22. Dimer benzeşimi/kararlılık da kendi inhibitörleri için RAF mutantların duyarlılığı belirler ve pozitif RAF inhibitörleri direnci ile ilişkilidir24. Bu nedenle, hastalıkla ilgili RAF mutantlarını karakterize etmek için Katalitik ve allosterik aktivitelerini ve dimer yakınlık/stabilitesini ölçmek gerekir.

Son yıllarda, laboratuar ve diğerleri RAF aile kinazlar ve mutantları karakterize etmek için çeşitli yöntemler geliştirdik. Laboratuvarımıza ve başkalarının deneyimlerine göre, aşağıdaki üç testin hastalık ile ilgili RAF mutantları tanımlamada avantajları olduğunu düşünüyoruz: (1) kurucu katalitik etkinliğini algılamak için kolaylığı ile gerçekleştirilebilir in vitro kinaz tahlil aktif RAF mutantlar15; (2) kinaz-ölü raf mutantların allosterik etkinliğini ölçmek için güvenilir ve uygun bir yöntemdir raf Co-aktivasyon assay13,15,21,22,23, 25; (3) geleneksel Co-immünoprecipitation tahlil karşıt olarak raf mutantların bağıl dimer benzeşimi/istikrar ölçümünde çok daha yüksek hassasiyete sahip ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil, ve gelişmiş ekipman olmadan yürütmek mümkün SPR (SUrface Plasmon Resonance) analizi15,22gibi nicel analitik yöntemlerle kontrast. Bu üç asder birleştiren, biz kolayca nasıl bir hastalık ile ilgili RAF mutant akış sinyalizasyon değiştirir ve böylece bu RAF mutasyonu nedeniyle hastalığı tedavi etmek için uygun bir terapötik strateji yararlanmak anlayabiliriz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. RAF mutantların katalitik etkinliğini ölçmek için In vitro kinaz assay

  1. , Gibson Assembly ya da geleneksel moleküler klonlama yöntemleri kullanarak C-Terminus Flag (dykddddk) etiketi ile raf mutantlar (Şekil 1A) kodlama vektörler oluşturun.
    1. Flag etiketini ve mutasyonlar raf kodlama dizileri PCRs tarafından tanıtmak ve sonra tüm dizileri pcdna 3.1 (+) vector Gibson derleme veya T4 DNA ligasyonu kullanarak ve üretim protokolleri aşağıdaki ekleyin. PCR reaksiyonları için aşağıdaki koşulları kullanın: (1) 95 °C, 2 dak; (2) 95 °C, 30 s; (3) 59 °C, 30 s; (4) 68 °C, 3 dk; (5) 20 döngüleri (2 için 4); (6) 4 °C tutun.
      Not: Klonlama için PCR astar: 5-AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 ve 5-CAGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTA-3.
    2. GST-Fused raf mutantlar adım 1.1.1 açıklandığı gibi aynı yöntemleri kullanarak vektörler kodlama oluşturmak için raf mutant kodlama dizileri upstream GST kodlama sırası ekleyin.
    3. Transfeksiyon öncesinde DNA sequencings tarafından tüm vektörler doğrulayın.
  2. 5 x 105 hücreli bir yoğunlukta 6-kuyu plakalı plaka 293T hücreler/transfeksiyon önce iyi bir gün. Ne zaman hücre yoğunluğu ulaşır 80 ~ 90% konfluence ikinci gün, vektörler kodlama ile transfekt FLAG-Tagged RAF kinazlar veya onların mutantlar adım 1,1 transfeksiyon reaktifler (malzeme tablosu) üretiminin protokolünü izleyerek hücrelere.
  3. Kültür ortamını değiştirmek 24 h transfeksiyon sonra.
  4. Transfeksiyondan sonra kültür orta 48 h aspirate ve 400 μL/Well liziz tamponu (25 mM Tris · HCl, 150 mM NaCl, 1 mM etylenediaminetetraasetic asit (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) buz üzerinde Lyse hücrelere proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile desteklenmektedir.
    Not: NP-40 liziz tamponunun konsantrasyonu, RAF mutantların katalitik aktivitesini orta dimer benzeşme/stabilite ile algılamak için önemlidir. Yüksek konsantrasyon deterjan veya lizis tampon güçlü bir deterjan raf dimerleri kırabilir ve böylece raf kinazlar veya mutantların katalitik etkinliğini öldürmek.
  5. Hücre endoglikozidazları transfer 1,5 ml tüp ve aşağı spin 12.000 x g 10 dk 4 °c ' de hücre enkaz tüketmek için.
  6. 1,5 ml tüplere temiz tüm hücre endoglikozidazları örnek başına transfer 300 μL, Anti-Flag benzerliği boncuklar örnek başına 20 μl ekleyin ve 1 h için soğuk bir odada (4 °c) döndürün. Ayrıca aşağıda açıklandığı gibi immünoblots tarafından RAF mutantların ifade ve aktivite (phospho-ERK1/2) tespit için bir kenara temiz tüm hücre lysate örnek başına 40 μL alın.
  7. Anti-Flag boncukları bir kez lizis tampon ile yıkayın, sonra bir kez kinaz reaksiyon tampon ile (20 mm HEPES, 10 mm MgCl2, 0,5 mm na3VO4, 0,5 mm DTT, pH 7,2), ve eklemek 20 μl kinaz reaksiyon karışımı (2 μg MEK1 (K97A) ve 100 μM ATP içinde 20 μl kinaz Re eylem arabelleği) örnek başına.
    Not: Boncuk yıkama yavaşça ve hızlı bir şekilde tamamlanmalı, kinaz reaksiyonu karışımı eklemeden önce kalan tampon tamamen aspirasyonlu olmalıdır ve bu adımda yapılan tüm operasyonlar soğuk bir odada 4 °C ' de yapılmalıdır.
  8. Kinaz reaksiyonlarını oda sıcaklığında (25 °C) 10 dakika boyunca kuluçla ve kinaz reaksiyonları içeren tüpleri inkübasyon sırasında her dakika parmaklarla çevirin.
  9. 5 μL 5x SDS örnek tampon ekleyin (375 mM Tris · HCl,% 9 sodyum dodecil sülfat (SDS), 50% gliserol, 0,03% Bromophenol mavi) örnek başına kinaz reaksiyonları durdurmak için, ve sonra ısı örnekleri 90 °C 5 dakika.
  10. Numuneleri 9 ~ 12% Poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) ile 0,1% SDS ile çalıştırın, proteinleri nitroselüloz membrandan aktarın ve immünoblot örneklerinde phospho-MEK ve RAF mutantların seviyelerini algılayın.
    Not: Phospho-MEK de γ32P-ATP birleştirmesi kullanılarak nicelik olabilir. Kısaca, 10 μM γ32P-ATP kinaz reaksiyon tamponuna eklenir ve fosforilated mek miktarı, standart autoradiography, fosforlu görüntüleme veya sıvı scintilik sayma TEKNIKLERINI kullanarak sayfa ayrılması sonrasında nicelik olarak hesaplanır Uygun.

2. RAF Co-kinase-Dead RAF mutantların Allosteric etkinliğini değerlendirmek için aktivasyon assay

  1. Vektörler oluşturmak raf alıcısı (CraF kinaz alanı fosforsız NTA motif, aaff ile) veya kinaz ölü raf aktipolörleri (fosforilasyon-mimicked NTA motif, ssdd, ddee veya dgee ile raf kinaz etki) (Şekil 1A) olarak 1,1 adımda açıklanmıştır.
  2. İki vektörler hem RAF alıcısı ve kinaz ölü RAF aktivatörü ya da tek bir vektör olarak adımları 1,2 ve 1,3 açıklandığı gibi bir protein kodlama kodlama ile 293T hücreleri transfect.
  3. Nakli sonrası 24 saat içinde kültür ortamını değiştirin ve 1,4 ve 1,5 adımda açıklandığı gibi tüm hücre endoglikozidazları hazırlamak için 48 h 293t transfektanları hasat.
  4. Temiz tüm hücre lysate ile 5x SDS örnek tampon hızlı bir şekilde oda sıcaklığında (25 °C) karıştırın ve sonra 90 °C ' de 5 dakika kaynatın.
  5. % 0,1 SDS ile 9 ~ 12% sayfa haşlanmış tüm hücre lysate örnekleri çalıştırın, nitroselüloz membran için proteinleri aktarmak ve phospho-ERK1/2 ve immünoblots tarafından kontrol proteinleri düzeylerini tespit.

3. RAF mutantların bağıl dimer affinity/Istikrar ölçme için ücretsiz Split luciferase assay

  1. Vektörler kodlama yapı bayrak-Tagged raf mutantlar nluc n-Terminus (n-Terminus Firefly luciferase, AA2-416) veya c-Terminus Cluc (c-Terminus Firefly luciferase, aa398-550), adım 1,1 açıklandığı gibi erimiş.
  2. 1,2 adımda açıklandığı gibi farklı Nluc-RAF mutantlar ve Cluc-RAF mutantlar kodlama vektörler bir çift ile 293T hücreleri transfekt.
  3. Transfeksiyondan sonra 24 saat, renk içermeyen orta ile iyi başına 2x105 hücre yoğunluğunda Krystal siyah görüntü plakaları Içine 293t hücre transfektanları replate (yani, fenol kırmızı olmadan dmem).
  4. 24 saat sonra, D-Luciferin (0,2 mg/ml) 293t hücre transfererlerine ekleyin, 30 dakika boyunca inküye yapın ve çok algılama sistemi (malzeme tablosu) kullanarak Lusiferaz sinyallerini ölçün.
  5. Lusiferaz sinyallerini ölçmeden sonra, 1,4 ve 1,5 adımda açıklandığı gibi tüm hücre endoglikozidazları hazırlamak için lizis tampon ile orta ve Lyse 293t transfektanlar Aspire.
  6. % 0,1 SDS ile 9 ~ 12% Page tüm hücre lysate örnekleri çalıştırın ve adım 2,5 açıklandığı gibi anti-Flag immünoblot tarafından nluc-raf mutantlar ve Cluc-raf mutantlar ifade düzeylerini algılamak. 293T transfektanlarında Nluc-RAF mutant ve Cluc-RAF mutant göreli ifade seviyeleri kendi immünoblots gelen J görüntü kullanılarak nicelleşmiş.
  7. Nluc-raf mutantları ve Cluc-raf mutantların ifade seviyelerine göre 293t hücreli transfektanların Lusiferaz sinyallerini normalleştirin. Kısaca, bu adım 3,6 nluc-raf mutantlar ve Cluc-raf mutantların göreli ifade seviyeleri ile ham Lusiferaz sinyali bölünerek elde edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RAF ailesinin kinazları hem katalizör hem de allosterik faaliyetlere sahiptir, bu da hastalıkla ilgili mutantların farklı mekanizmalar üzerinden akış sinyallerini açmasını sağlar13,14,16,17 ,18. Kurucu aktif RAF mutantları doğrudan fosforylate onların substratlar, kinaz-ölü RAF mutantlar vahşi tip meslektaşları transaktive yoluyla işlevlerini yerine getirmek. Şekil 1B'de görüldüğü gibi, hem kurucu aktif raf mutantları (düzenleyici omurga (R-omurga) mutantlar (BRAF (L505M), CraF (ddee/L397M) ve Araf (dgee/L358M))13,23,25 , 26, BRAF (V600E) ve BRAF (∆ nvtap)) ve kinaz ölü raf mutantları (katalitik omurga (C-omurga)-ERIMIŞ BRAF (∆ nvtap/V471F)15), 293t HÜCRELERDE ifade edildiğinde erk 'i etkinleştirir. Bu nedenle, RAF mutantların hücrelerde ERK sinyal etkinleştirmek için yeteneği bir kinaz ölü mutant bir kurucu aktif mutant ayırt etmek için bir standart olarak hizmet edemez, orta dimer benzeşimi ile bazı kinaz ölü mutantlar rağmen/istikrar açar aktif RAS işbirliği ile sadece akış sinyalizasyon. Biz burada sunulan üç yöntem etkili tüm hastalık ilgili RAF mutantlar karakterize yardımcı olabilir. Önceki çalışmalarda bu bilgiler kullanılarak ortaya çıkan tüm RAF mutantların biyolojik özellikleri Tablo 1' de özetlenmiştir.

Biz kinaz ölü RAF mutantlar gelen kurucu aktif RAF mutantları ayırt etmek için kullanabileceğiniz ilk yöntem in vitro kinaz tahlil olduğunu. Bu tahlil, raf mutantlar immünopresipitasyon tarafından arındırılmış ve katalitik reaksiyonlar kinaz-ölü MEK1 (K97A) ve ATP substratlar olarak içinde vitro yapılmıştır. RAF mutantlarının katalizör aktivitesi, immünoblot tarafından kinaz reaksiyon karışımlarında MEK1 (K97A) ' ın fosforilasyonu olan AL (Activation LOOP) olarak ölçülmüştür. Şekil 1C'de gösterildiği gibi bu tahlil, BRAF, CraF ve Araf13,15,23, BRAF (V600E)9ve BRAF (∆ nvtap)15' in R-omurga mutantların katalitik aktivitesini etkili bir şekilde araştırabilir. Ama kinaz-ölü BRAF (V471F/∆ NVTAP)15 bir erimiş C-omurga vardır. Ancak, Araf R-omurga mutant (Araf (dgee/L358M)) (Şekil 1C, şerit 4), CraF ve Araf mutantlar değiştirilmiş dimer arayüzü (CraF (ddee/gibi zayıf dimer yakınlık/istikrar ile kurucu aktif raf mutantların katalitik aktivite L397M/R401H), Araf (dgee/L358M/Ape/R362H))15,22 (Şekil 1D, E) bu tahlil kullanarak probed olmayabilir, çünkü onların dimerleri arıtma sırasında kırık, özellikle zaman arıtma güçlü veya yüksek konsantrasyonlu deterjanlar içeren tamponlar ile gerçekleştirilir. Zayıf dimer yakınlık/stabilitesi ile RAF mutantların katalitik aktivite kaybını önlemek için, biz genellikle GST (glutathione S-transferaz), önce güçlü benzeşimi/stabilitesi olan bir dimerik protein ile Bu mutantları erimiş Bu raf mutantların katalitik etkinliğini kurtarabilen in vitro kinaz tahlil yürütülmesi,15,22 (Şekil 1E). Genel olarak, çoğu RAF mutantlar bu tahlil kullanarak kurucu aktif veya kinaz ölü mutantlar olarak sınıflandırılmış olabilir.

Burada açıklanan ikinci yöntem, kinaz-ölü raf mutantların allosterik etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilecek raf Co-aktivasyon assay olduğunu13, 15,21,22,23 , 25. ancak BRAF (V471F/∆ nvtap)15gibi çok yüksek dimer yakınlık/istikrar ile bırkaç kinaz ölü raf mutantlar, doğrudan hücrelerde Ifade edildiğinde endojen raf molekülleri etkinleştirebilirsiniz (Şekil 1B, şerit 7), en kinaz-ölü RAF mutantlar vahşi tip RAFs transactivate aktif RAS işbirliği gerektirir. Ancak, aktif RAS, giriş aktif ERK bazal seviyesini artıracak ERK sinyalizasyon, doğrudan aktivatör olduğunu. Aktif RAS müdahalesi önlemek için, biz bu tahlil N-Terminus-kesilmiş RAF mutantlar kullanılan (Şekil 2A). Şekil 2B'de gösterildiği gibi, asidik NTA motif ve C-vertebra füzyon (BRAF (V471F, aa431-766), CraF (ddee/V363F, aa323-648) ve Araf (dgee/V324F, aa284-606) ile BRAF, CraF ve raf kinaz-ölü mutantlar 293T hücrelerinde birlikte ifade edildiğinde, fosforsuz NtA motif (CRAF alıcısı, CRAF (AAFF, aa323-648)) ile CRAF katalitik aktivitesini tetikler. Buna karşılık, çok yüksek dimer benzeşimi/stabilitesi olan kinaz ölü BRAF mutant (V471F/∆ NVTAP, aa431-766) (aşağıya bakın), CRAF alıcısının ortak ifadesi olmadan bile endojen rafları tetikleyerek ERK sinyaline açık. Genel olarak, bu tahlil tüm kinaz ölü RAF mutantların transaktivasyonu yeteneğini değerlendirmek için kullanılabilir.

RAF ailesinin kinazlarının dimerization sadece aşağı MEK-ERK sinyalizasyon etkinleştirmek için yeteneklerini düzenler değil, aynı zamanda RAF inhibitörleri için duyarlılık belirler15,16,20,22,24,27,28,29,30,31,32. Bu yol arasında diğer protein-protein etkileşimlerini aksine33,34,35, raf aile kinazlar ve onların mutantların dimerization nispeten zayıf ve zor ortak immünoprecipitation gibi geleneksel Biyokimya deneyleri kullanılarak değerlendirilmelidir. Bu sorunu çözmek için, yakın zamanda raf aile kinazlarının ve mutantların bağıl dimer yakınlık/istikrar ölçmek için ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil geliştirdi15,22,36. Gösterildiği gibiŞekil 3A, raf kinaz etki (aa431-766 BRAF için, aa323-648 CraF için, ve aa284-606 Araf için) sırasıyla N-Terminus (AA2-416) veya C-Terminus (aa398-550) Firefly Lusiferaz (nluc ve Cluc), hangi bir araya getirilecektir ile bozulmamış monte edilir RAF dimerization üzerine Lusiferaz. Bu tahlil Lusiferaz etkinliği doğrudan raf dimers miktarı ile ilişkilidir. Bu tahlil çok hassas ve RAF mutantların bile çok zayıf dimerization tespit edebilir. Daha önce rapor ettiğimiz gibi15, Onkojenik BRAF (V600E) bir dimer olarak fonksiyonları, ve sadece bir bileşik mutasyon arg-to-onun mutasyon (R509H) dimer arayüzü ve non-kanonik APE alteration (P622A APE motif) tamamen dimerization ortadan kaldırmak ve böylece katalitik bloke etkinlikŞekil 3B). İn vitro kinaz assay kullanarak, daha fazla bulundu bu BRAF (V600E) değiştirilmiş maymun motif ile varyant, BRAF (V600E/AAE), ama arg-to-dimer arayüzünde onun mutasyonu ile, BRAF (V600E/R509H), arıtma üzerine katalitik etkinliğini kaybetti (Şekil 3C), eski varyant daha az dimer yakınlık/istikrar ikincisi daha olduğunu düşündürmektedir. Doğrudan bu BRAF eğilimi ölçmek için (V600E) türevleri dimers oluşturmak için, biz ücretsiz bir bölünmüş Lusiferaz tahlil yürütülen ve bu türevleri BRAF (V600E) daha yüksek BRAF ile oldukça farklı dimer benzeşimi/istikrar olduğunu doğruladı (V600E/ R509H) daha BRAF (V600E/AAE) daha BRAF (V600E/R509H/AAE) (Şekil 3D). Monomerik BRAF (V600E/R509H/AAE) tarafından üretilen Lusiferaz sinyali, transferleştirilmiş 293t kontrol ile karşılaştırılabilir (Şekil 3D, sol panel şeridi 5), bu tahlil çok düşük bir arka plan olduğunu belirten. Daha fazla ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil etkinliğini belirlemek için, bir sonraki bizim tarafımızdan tespit edildi β3-αc döngüsünün çerçeve silmeleri ile Onkojenik BRAF mutantlar bir grup göreli dimer benzeşimi/istikrar bu tahlil kullanılarak ölçülür Grup15,37,38. Bilindiği gibi, tüm bu mutantlar, 293T hücrelerinde ifade edildiğinde ERK sinyallerini aktive etse de (Şekil 3E), onlar oldukça diferansiyel katalitik aktivite içinde vitro sergilenmektedir (Şekil 3F). BRAF (∆ MLN (aa484-486 del)) ve BRAF (∆ NVTAP (aa486-490 del)) immünoprecipitaion tarafından arıtılması üzerine çok aktif, BRAF (∆ NVTAPT (aa486-491 del)) ve BRAF (∆ QA (aa496-497 del)), katalitik aktivitesini aynı durumda kaybetti, ancak GST Fusion tarafından kurtarılabilirdi. Buna ek olarak, BRAF (∆ NVTAP), BRAF (V471F/∆ NVTAP) kinaz-ölü sürümü hücrelerde ifade edildiğinde endojen rafları etkinleştirmek için güçlü bir potens sergiledi (Şekil 1BŞerit 7). Bu veriler, bu BRAF mutantlar grubunun, BRAF (∆ MLN) ' den daha yüksek olan BRAF (∆ NVTAPT) ve BRAF (∆ QA) ile oldukça farklı dimer yakınlık/stabilitesi olduğunu göstermektedir. Nitekim, ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil sonucu tamamen bizim ayrılımı desteklenen (Şekil 3G). Birlikte Taken, bizim veri ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil göreli dimer yakınlık ölçmek için güvenilir bir yöntem olduğunu gösterir/raf mutantların istikrar.

Figure 1
Şekil 1 : İn vitro kinaz assay kullanarak raf mutantların katalitik aktivitesini Probe. (A) bu ÇALıŞMADA kullanılan raf mutasyonları için şematik bir diyagram. (B) hem kurucu aktif hem de kinaz ölü raf mutantları, hücrelerde Ifade edildiğinde erk sinyalini etkinleştirebilir. 293t hücreler farklı raf mutantları kodlayan vektörler ile transfekte ve erk etkinliği Anti-phospho-ERK1/2 immünoblot tarafından tespit edildi. (C) düşük dimer yakınlık/istikrar yanı sıra kinaz ölü raf mutantları ile kurucu aktif raf mutantlar immünoprecipitation tarafından arıtılması üzerine in vitro fosforilylate olmaz. B 'de RAF mutantları Anti-FLAG boncukları kullanılarak temizlenmiş ve katalitik aktivite protokolde açıklandığı gibi in vitro kinaz assay kullanılarak probed edildi. (D-E) Düşük dimer yakınlık/istikrar ile kurucu aktif RAF mutantların in vitro katalitik aktivite GST Fusion tarafından kurtarılabilir. (D) kurucu aktif raf mutantlar ve onların GST-Fused meslektaşları 293T hücrelerde ifade edildi ve faaliyetleri Anti-PHOSPHO-ERK1/2 immünoblot tarafından ölçülmüştür. (E) D 'de raf mutantları immünopmakilitasyon ile temizlenmiş ve onların in vitro katalitik aktivite protokolde açıklandığı gibi in vitro kinaz tahlil kullanılarak probed edildi. RAF R-omurga mutantlar: BRAF (L505M), CRAF (DDEE/L397M), ve ARAF (DGEE/L358M). "∆ NVTAP", BRAF 'ta aa486-490 ' nın silinmesi için temsil edilir. ARAF 'ın APE mutasyonu, ARAF 'ta standart bir APE motif oluşturan A475P anlamına gelir. "KD" tam metinde "kinaz Domain" için temsil eder. BRAF (KD), aa431-766 BRAF parçası, CRAF (KD) ve ARAF (KD) ise sırasıyla CRAF aa323-648 parçası ve ARAF 'ın aa284-606 parçası olarak temsil edilir. Bu rakam sonuçları daha önce15,22bildirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2 : Raf mutantların raf Co-aktivasyon tahlil kullanarak vahşi tip RAFs transactivate yeteneğini değerlendirmek. (A) raf Co-aktivasyon assay gösteren bir diyagram. (B) asidik NTA motif ile kinaz ölü raf mutantları, 293t hücrelerde kataliz yetkılı CraF alıcısı ile ortak ifade edildi ve 293t TRANSFERERINDE ERK1/2 aktivitesi Anti-PHOSHO-ERK1/2 immünoblot ile ölçülmüştür. Çok yüksek dimer benzeşimi/stabilitesi olan BRAF (V471F/∆ NVTAP) dışında en kinaz ölü RAF mutantları ERK sinyalizasyon açmak için eksojen RAF alıcısı ortak ifade gerekli. Bu rakam sonuçları daha önce15,22bildirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil kullanarak raf mutantlar bağıl dimer benzeşimi/istikrar ölçmek. (A) ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil gösteren bir diyagram. (B-D) BRAF (V600E) türevlerinin dimerizasyonu, katalitik aktivitesi içinde vivo ve in vitro olarak gereklidir. (B) monomerik BRAF (V600E) varyantı, BRAF (V600E/R509H/AAE), GST Fusion tarafından kurtarılabilir hiçbir katalitik aktivite içinde vivo vardır. BRAF (V600E) türevleri ve GST-Fused meslektaşları 293T hücrelerde ifade edildi ve faaliyetleri Anti-phospho-ERK1/2 ile ölçülmüştür. (C) düşük dimer benzeşimi/stabilitesi olan BRAF (V600E) varyantı, BRAF (V600E/AAE), GST Fusion tarafından kurtarılabilen arıtma üzerine katalitik aktivitesini kaybetti. B 'den BRAF (V600E) türevleri immünopmakititasyon ile temizlenmiş ve katalizör aktivitesi, protokolde açıklandığı gibi in vitro kinaz assay ile probed edildi. (D) BRAF (V600E) türevleri göreli dimer yakınlık/istikrar protokolde açıklandığı gibi ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil kullanılarak ölçülmüştür. (E-G) BRAF mutantlar ile β3-αC döngü fonksiyonunun çerçeve içi silinmesiyle ERK sinyalleme aktive edilir. (E) β3-αc döngüsünün çerçeve içi silinmesiyle BRAF mutantlar, hücrelerde Ifade edildiğinde erk sinyalini etkinleştirir. BRAF mutantlar 293T hücrelerde ifade edildi ve faaliyetleri B'de açıklandığı gibi ölçüldü. (F) E 'den düşük dimer benzeşme/stabilitesi olan BRAF mutantlar, GST Fusion tarafından kurtarılabilen katalitik aktivitesini kaybetti. BRAF mutantlarının in vitro katalitik aktivitesi ve E 'den GST-Fused karşı bölümleri Colarak ölçülmüştür. (G) β3-αc döngüsünün çerçeve içi silinmesiyle yapılan BRAF mutantlar oldukça farklıdır. BRAF mutantların β3-αC döngüsünün çerçeve içi silinmesiyle bağıl dimer yakınlık/stabilitesi Dolarak ölçülmüştür. D & G 'deki hata çubukları, bağımsız denemeler arasındaki farkı göstermek için SD 'yi temsil eder (n = 4). BRAF 'ın AAE mutasyonu, standart olmayan bir APE motif üreten APE motif P622A anlamına gelir. "∆ MLN", "∆ NVTAPT" ve "∆ QA", aa484-486, aa486-491, aa496-497 ' i n β3-αC döngüsünde BRAF 'ın silmeleri için sırasıyla temsil eder. Bu rakam bazı sonuçlar önceden bildirilmiştir15. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Table 1
Tablo 1: ÇEŞITLI raf mutantların biyolojik özelliği. Bu çalışmada kullanılan tüm RAF mutantların katalitik aktivitesi, allosterik aktivite ve bağıl dimer yakınlık/istikrar bu tabloda özetlenmiştir. "Y" "Evet" demek, "N" ise "Hayır" anlamına gelmektedir. "N*", GST ile birlikte kullanılırsa bu mutantların katalitik aktiviteye sahip olduğunu gösterir. "+ + + +", "+ + +", "+ +", "+" ve "-" sırasıyla "çok güçlü", "güçlü", "ara", "zayıf" ve "none" için temsil eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, içinde vitro kinaz assay, raf Co-aktivasyon tahlil ve ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil dahil hastalık ile ilgili raf mutantlar, karakterize etmek için üç yöntem sundu. Raf kinazları hem katalitik aktivite ve allosterik aktivite olduğundan, çeşitli raf mutantlar iki farklı mekanizmalar aracılığıyla akış sinyalizasyon aktive edebilir13,14,16,17, 18. kurucu aktif raf mutantlar doğrudan aşağı efektör mek fosforylate, kinaz ölü raf mutantlar onların vahşi tip meslektaşları transaktivasyonu ile akış sinyalizasyon tetiklemek ise. Ancak, hem kurucu aktif ve kinaz ölü raf mutantlar fonksiyonu15, 16,17,19,20ve dimer yerine getirmek için dimerization gerektirir raf mutantlarının eğilimi sadece raf mutantlarının katalitik veya allosterik aktivitesini değil, aynı zamanda raf inhibitörleri15,24' e olan hassasiyetini de belirler. İn vitro kinaz tahlil, raf Co-aktivasyon tahlil ve ücretsiz Split Lusiferaz tahlil bize kinaz-ölü mutantlar gelen kurucu aktif mutantlar ayırt etmek için basit, etkili ve güvenilir yöntemler bir dizi sağlamak yanı sıra değerlendirmek onların akım sinyalizasyon etkinleştirmek için yeteneği.

İn vitro kinaz tahlil protein kinazların katalitik etkinliğini algılamak için klasik bir yöntemdir. RAF mutantlarının katalitik aktivitesini ölçmek için bu yöntemi benimsemek için, reaktifler ve prosedürler15,21,22bazı önemli revizyonlar yaptık. RAF aile kinazları fosforylate kendi substrat, MEK ve onların dimer benzeşimi/stabilitesi nispeten düşük olduğu gibi fonksiyonu beri, biz deterjan konsantrasyonu azalttı NP-40% 1 ' den 0,25% için tamponlar içinde RAF proteinleri arındırmak için önlemek için Dissociation dan raf dimerleri. Aynı belirteç, biz de RAF protein arıtma için nazik bir hızlı yıkama prosedürü kullandık. Bu değişiklikler, klasik in vitro kinaz assay ile "kinaz ölü" RAF mutantları olarak tanımlanabilecek çok zayıf dimer yakınlık/stabilitesi ile kurucu aktif RAF mutantların katalitik etkinliğini algılamak için önemlidir. Ayrıca, biz GST Fusion bu tahlil15,21,22içinde arıtma sırasında ayrışma raf dimerleri önlemek için iyi bir alternatif yolu olduğunu göstermiştir. Kinaz ölü RAF mutantlar için, onlar GST ile erimiş olsa bile, bu tahlil herhangi bir katalitik aktivite sergiler yok.

Raf Co-aktivasyon tahlil kinaz-Dead raf mutantların kendi vahşi tip karşı parçaları transactivate yeteneğini değerlendirmek için bizim tarafımızdan geliştirilmiştir13, 15,21,22,23 , 25. bu roman tahlil, biz N-TERMINUS kesilmiş raf proteinleri kullanın ve böylece aktif RAS mutantlar veya aktive RAS, bu tahlil çok hassas kılan Co-ifade gerekmez. Buna ek olarak, allosterik aktivatör (kinaz ölü RAF mutant) ve alıcı (kataliz-yetkili RAF mutant) bu tahlil kolayca izole edilebilir ve dimerization odaklı Transaktivasyon sürecinde moleküler olayları araştırmak için saflaştırılmış 13olmak üzere.

Yukarıda belirtildiği gibi, dimer yakınlık/istikrar raf aile kinazlar ve mutantların fonksiyonunu düzenleyen bir anahtar faktördür, ve ayrıca raf inhibitörleri için duyarlılık belirler13,14,15, 16,17,18,24. Ancak, RAF aile kinazlar ve en hastalıkla ilgili mutantların dimer yakınlık/istikrar çok düşüktür. Bu parametreyi ölçmek için, geleneksel Biyokimya deneysel prosedürler ve gelişmiş ekipman (örneğin spr tahlil), ya da neredeyse güvenilir ve tekrarlanabilir veri (örneğin immünoprecipitation tahlil) üretmek zorlaştırmak gerektirir. Buna karşılık, ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil bir basit, hassas, tutarlı, ve uygun maliyetli bir yöntem bağıl dimer benzeşimi ölçmek için/raf aile kinazlar ve mutantların istikrar15,21, 22,36. Bu tahlil çeşitli RAF mutantlar arasında dimer yakınlık/istikrar ince fark prob olabilir. Biz15önce bildirilen gibi, BRAF (V600E/AAE) çok zayıf dimer benzeşimi/stabilitesi vardır ve onun dimerleri tamamen arıtma üzerine bile çok nazik bir prosedür kullanarak kırık olacaktır. Bu tahlil kullanarak, biz monomerik BRAF (V600E/AAE/R509H) (Şekil 3) dan BRAF (V600E/AAE) zayıf dimer yakınlık/istikrar ayırt edebilirsiniz.

Özetle, bu pratik ve uygulanabilir yöntemler kümesi tüm hastalık ile ilgili RAF mutantlar tanımlama gereksinimlerini yerine getirebilir ve böylece çeşitli RAF mutant odaklı hastalıkları tedavi etmek için uygun stratejileri seçmemize yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, rakip finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Yazarlar Yuan Jimin desteği için Tüylü hücre lösemi Bursu kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Asya Fonu kanser Araştırması (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS KBrFA/2018/0014), NCCRF köprüleme hibe (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot hibe (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) ve SHF akademik tıp tarafından desteklenmektedir Araştırma hibe (AM/TP011/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
  2. Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
  3. Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase". FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
  4. Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
  5. Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
  6. Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
  7. McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
  8. Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
  9. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
  10. Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
  11. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
  12. Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
  13. Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
  14. Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
  15. Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
  16. Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
  17. Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
  18. Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
  19. Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
  20. Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
  21. Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).
  22. Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
  23. Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
  24. Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
  25. Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
  26. Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
  27. Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  28. Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
  29. Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).
  30. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
  31. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
  32. Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
  33. Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).
  34. Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. "RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
  35. García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
  36. Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  37. Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
  38. Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).

Tags

Kanser araştırma sayı 149 raf aile kinazları raf mutasyonu RAS/raf/mek/erk sinyalizasyon dimerization dimer benzeşimi/istikrar katalitik aktivite allosterik aktivite in vitro kinaz tahlil raf Co-aktivasyon tahlil tamamlayıcı Split Lusiferaz tahlil kanser
Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H.,More

Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter