Summary
乘腔snRNA的生物发生是一个复杂的过程,涉及各种细胞隔间。在这里,我们采用荧光标记snRNA的显微注射,以监测其在细胞内的传输。
Abstract
乘子鼻核素的生物发生是一个复杂的过程,涉及核和细胞质阶段,最后一步发生在一个称为Cajal体的核隔间中。然而,将snRNA定位到这种亚核结构的序列直到最近才被发现。为了确定在Cajal体内积累snRNA的重要序列,我们采用荧光标记snRNA的显微注射,然后在其细胞内进行定位。首先,我们准备了snRNA缺失突变体,合成DNA模板进行体外转录,并在UTP与Alexa488相伴的情况下转录snRNA。标记snRNA与70kDa-Dextran与TRITC结合,并微注入到人类HeLa细胞的细胞质。细胞孵育1小时,固定,Cajal身体标记线圈通过间接免疫荧光可视化,而作为核或细胞质注射标志物的snRNA和dextran直接使用荧光显微镜观察。这种方法可以高效、快速地测试各种序列如何影响细胞内的RNA定位。在这里,我们展示 Sm 绑定序列对于将 snRNA 有效定位到 Cajal 体中的重要性。
Introduction
RNA拼接是基因表达的关键步骤之一,基因表达是由一种称为拼接体的大型核糖核蛋白复合物催化的。总共,超过150种蛋白质和5种小核RNA(snRNA)在拼接途径的不同阶段被集成到拼接体中。U1、U2、U4、U5和U6 snRNA正在参与主要GU-AG的拼接。这些snRNA加入拼接的拼接体作为预形成的小核核核核核核核核核核核核蛋白颗粒(snRNA),含有snRNA,7个Sm蛋白与snRNA(或类似Sm蛋白,与U6 snRNA相关)和1-12个特定蛋白质为每个snRNP。
snRNP 的组装涉及细胞质和核阶段。新转录的snRNA被导出到细胞质中,在那里它获得一个从七种Sm蛋白组装而成的环。Sm环随后充当snRNA重新导入到核的信号。有缺陷的snRNA,不能与Sm蛋白关联,被保留在细胞质1。新进口的snRNPs首先出现在Cajal体内,它们与snRNP特异性蛋白质相遇并完成其成熟(参考文献2,3)。我们最近表明,抑制最终成熟步骤导致在Cajal身体4,5中固存未成熟的snRNPs。我们提出了一个模型,其中最终的snRNP成熟是在质量控制下,监测snRNP特异性蛋白质的添加和活性snRNPs的形成。然而,细胞如何区分正确组装的成熟颗粒和异常未成熟颗粒的分子细节仍然难以捉摸。
为了确定在核Cajal体内靶向和积累snRNA所必需的snRNA序列,我们决定采用荧光标记snRNA的显微注射。微注射是一种选择的方法,因为:1) 它不需要额外的序列标记来区分合成 snRNA 形成其内源性对应物,这对短 RNA 尤其重要,空间很小,无法插入额外的标记序列;2) 它允许分析对生物发生很重要的序列。例如,Sm 序列对于 Sm 环组件和重新导入到原子核6中至关重要。当snRNA在细胞中表达时,缺乏Sm序列的snRNA在细胞质中降解,并且不到达细胞核和Cajal体7。然而,没有Sm序列的snRNA可以直接微注入到细胞核中,从而在Cajal身体定位测定中Sm序列的潜在作用。
在这里,我们详细描述了一种显微注射方法,我们应用这种方法来确定将snRNA靶向Cajal体5所需的snRNA序列。我们表明,Sm 和 SMN 绑定位点是必要和足够的,不仅 snRNA,而且各种短非编码 RNA 到 Cajal 身体。基于显微注射和其他证据,我们提出在Sm绑定位点上组装的Sm环是Cajal体定位信号。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 制备用于显微注射的snRNA
- 使用以下 PCR 设置,准备包含全长或截断/突变版本的 SnRNA 的 DNA 模板:98 °C,60 s,98 °C,15 s,68 °C,1 分钟,98 °C 15 秒和 72 °C 5 分钟。
- 前引物必须包含一个促进因子序列,用于第一个转录核苷酸的上游体外转录。使用含有T7启动子和反向底漆的正向底漆放大U2 snRNA序列,该底漆以最后一个转录的核苷酸结束(详情见材料表)。
- 使用用于短RNA合成试剂盒(详情见材料表)的含有T7RNA聚合酶的snRNA合成。添加 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0.8 mM UTP, 0.2m UTP-Alexa488, 1.8 mM 三甲基苯丙胺帽模拟 (m32,2,7G(5') ppp(5')G, 1 mL RNA抑制剂和 500-700 ng 的 DNA 模板到反应混合物和孵育在 37 °C 过夜.
- 在反应中加入1μL(2U)的DNase,并在37°C下孵育15分钟。
- 通过酸性苯酚/氯仿提取分离snRNA。去除顶部水相,加入3M醋酸钠(pH = 5.2)、3 μL糖原原体积的1/10,以更好的颗粒可视化和2.5体积的100%乙醇。在-80°C下孵育1小时,在14,000 x g和4°C下离心10分钟。
- 用70%乙醇清洗颗粒,并溶解在12μL的无核酸酶水中。通常的RNA产量约为600纳克/mL。储存在-80°C。
- 通过阿加辛胶电泳监测体外转录的snRNA的完整性。
- 在显微注射之前,将RNA稀释至含有10μg/μL dextran-TRITC 70 kDa的水中的最终浓度为200纳克/mL。
2. 单元格
- 使用前,用1M HCl处理盖玻片1小时,在蒸馏水中彻底清洗,并储存在100%乙醇中。酸性治疗促进细胞粘附,以防止注射期间或注射后细胞剥落。为了更容易识别注入的细胞,请使用带网格的封面玻片。
- 种子HeLa或其他粘附细胞在12mm盖玻片(1号或1.5号)上注射前1天达到显微注射时50%的汇合。
3. 注射
注:HeLa细胞在Dulbeco的改性鹰培养基(D-MEM,4.5g/L D-葡萄糖中含有苯酚红和抗生素)中进行微注射。注射使用喷油器和装有无菌针的显微操作器进行(详情见材料表)。将整个显微/显微操作器系统预热至37°C至少4小时,以防止显微镜和显微注射器各部分的波动。
- 将含有 2 mL 培养基的培养皿(30 mm)与中间的盖玻片放入显微镜支架中。使用微装载机将 3 μL 的 snRNA 混合物加载到针头中。将针头安装在 45° 的显微注射器支架中,相对于培养皿的表面。
- 要找到针头,请使用 10 倍长距离目标。首先,在喷油器上设置速度,降低针头,直到其接触培养基。使用显微镜双筒望远镜,找到亮点,这是针接触培养基的地方。
- 将速度更改为FINE并进一步降低针头,同时观察显微镜,直到观察到针头尖。在视场中间移动指针,然后切换到 40 倍长距离目标。
- 更改目标后,选择细胞并将指针移到此细胞上方。设置电池触点的压力和时间(请参阅讨论中的提示和故障排除)。
- 将针向下移入细胞,然后在微操作器上设置下限。小心不要将针头移到细胞下方。
- 设置下限后,将针头移回电池上方,然后按下喷油器操纵手柄上的喷射按钮。针在细胞内自动移动到设定极限的位置,并注射RNA混合物。
- 要完成操作,请按下喷油器上的MENU 按钮,然后从支架上取下针头。然后,在关闭喷油器和微操作器之前,断开喷管与喷油器的连接。
4. 细胞固定和染色
- 微注射后,将细胞返回到CO2培养箱,并在37°C孵育1小时。
- 孵育后,在室温下用磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)冲洗细胞三次,在0.1 M PIPES pH 6.9中用4%的甲醛固定20分钟,用室温PBS洗涤三次。如果仅分析 snRNA 定位,请在水中短暂冲洗细胞,然后用 DAPI 安装在安装介质中。
- 在额外的蛋白质定位的情况下,在室温下用0.5%Triton-X100在PBS中渗透细胞5分钟。使用PBS冲洗三次后,用初级和二级抗体孵育细胞,在PBS中最后洗净后在水中短暂冲洗,用DAPI安装在安装介质中。
5. 显微镜
- 如果在安装后没有立即进行成像,则将幻灯片存放在 4°C,直到成像。
- 使用配备浸入物镜(60X 或 100x/1.4NA)的高端荧光显微系统获取图像。
- 一旦识别微注入细胞,收集一个20个z截面的堆栈,每个样本有200 nm z步长,并受到数学反卷积。然后,提出了最大投影或单个 z 堆栈。
- 要量化荧光信号,在通过线圈免疫染色识别的 Cajal 身体周围绘制感兴趣区域 (ROI)。测量线圈IN定义ROI中snRNA信号的强度。接下来确定随机放置在核质中的ROI中的snRNA荧光强度,并计算Cajal体和核质中RNA信号的比例。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
为了监测snRNA的定位和Sm结合位点在Cajal身体靶向中的作用,我们准备了一个DNA模板,其中包含T7启动子和全长U2 snRNA或U2 snRNA,缺少构成Sm结合位点的七个核苷酸(AUUUUG)。snRNA在体外转录、分离和与TRITC耦合dextran-70kDa混合。我们微注射含有体外转录的snRNA的混合物到HeLa细胞的细胞质。
此前已经表明,Sm绑定场址是核进口6所必需的。为了测试Sm位点是否对Cajal身体积累也很重要,我们微注射snRNA,缺乏Sm位点直接进入细胞核(图1A)。注射到细胞质作为对照(图1B)。作为一种正对照,我们微注射全长snRNA(图1C,D)。在CO2培养箱中孵育60分钟后,确定微注入细胞,通过间接免疫荧光对Cajal体标记线圈进行可视化。核和细胞质注射后在Cajal体内积累的全长snRNA。相比之下,缺乏Sm位点的snRNA在微注射到这个隔间后仍留在细胞质中,这与之前的发现6一致。无Sm位点snRNA的核显微注射表明,Sm结合序列对Cajal体定位非常重要。缺乏Sm位点U2snRNA的部位仍留在细胞核中,但没有在Cajal体内积累(图1A)。
有时,微注射到只有一个细胞室失败,在细胞核和细胞质中都发现TRICT-dextran-70kDa(图2A)。这些细胞被从进一步分析中丢弃。尽管荧光标记的snRNA在注射前储存在-80°C,但RNA降解可能发生。注入细胞质的降解snRNA不会输送到细胞核中,并保持在细胞质中局部化(图2B)。这种snRNA应该被丢弃,新的snRNA应该被合成。
图1:微注入snRNA的本地化。Alexa488 标记的 U2 snRNA 要么缺乏 Sm位点 (A,B) 或全长 (C,D) 被微注入细胞质或 HeLa 细胞核。卡哈尔体(箭头)用线圈免疫标记标记(红色);snRNA 以绿色表示。Dextran-TRITC-70kDa(黄色)用于监测核或细胞质注射;DNA被DAPI(蓝色)染色。箭头标记snRNA的细胞质定位。刻度条 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:显微注射方法的潜在缺陷。(A) 微注射到一个隔间失败,WT U2 snRNA 被微注射到细胞质和细胞核中。请注意,Dextran-TRITC-70kDa(黄色)存在于两个蜂窝隔间中。(B) WT U2 snRNA 被微注入 HeLa 细胞(绿色)的细胞质中,但细胞质(箭头)中仍保留大量 snRNA,这表明注射的 snRNA 部分降解和 Sm 结合位点的损失。Cajal 体(箭头)以线圈免疫标记(红色)标记。DNA被DAPI(蓝色)染色。刻度条 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们采用荧光标记snRNA的显微注射来确定对snRNA定位到核Cajal体中的重要序列。由于标签RNA的快速且相当简单制备(通过PCR制备DNA模板,然后进行体外转录),该方法提供了有效分析各种序列如何促进RNA定位。在相对较短的时间内,我们能够分析U2 snRNA的10个不同的删除或替换(参考文献5和未显示的数据)。对于具有复杂生物成因途径的RNA,这种方法还允许对成熟至关重要的测试序列。在snRNA的情况下,删除Sm结合序列,这是Sm环组装所必需的,导致在细胞质7中固存和退化突变的snRNA。其他优势包括两种不同标记的RNA可以同时注射,并在一个细胞内直接比较其定位。然而,由于各种氟铬可能改变RNA行为,在双重标签实验之前,必须单独测试每个氟铬。已成功地注射了数百个长度的核苷酸RNA,并在各种模型系统中对其定位进行了测定(参考文献8中对此进行了审查)。长RNA的极限步骤通常是全长RNA的体外合成。此外,使用预组装蛋白注射RNA可以用于测试单个蛋白质对RNP定位的影响。在我们的项目中,我们注射了与Sm蛋白相关的snRNA,以确认Sm环在Cajal身体定位5中的作用。最后,荧光标记RNA的显微注射允许直接定量,无需任何额外的步骤,如以前应用于snRNA9。
在启动微注射项目之前,还应考虑这些方法的几个缺点。首先,尽管显微注射过程有些自动化,但该方法仍然需要手工技能和经验,研究人员应考虑培训所需的时间。该协议的关键部分是制备完整的RNA,显微注射,然后在显微镜中找到注射的细胞(请参阅下面的提示和故障排除)。其次,微注射代表一种巨大的压力,许多细胞不能存活更长的时间。虽然有一些成功的尝试,通过活细胞成像10跟踪细胞内的微注射RNA,但当我们使用荧光显微镜将微注射与活细胞成像相结合时,我们观察到细胞死亡显著增加。第三,注入人体细胞的RNA量非常低,这阻碍了对注射RNA的生化分析。这也意味着很难监测荧光标记核苷酸的加入如何影响RNA功能。因此,标签-NTP:NTP的各种比率应纳入野生型RNA及其定位化测定,以获得荧光信号与标记RNA功能之间的理想比率。此外,氟铬的性质可能会影响RNA定位。在我们手中,Alexa488-UTP 比 Alexa546-UTP 工作得更好。我们没有进一步探讨这些差异,但原因之一可能是与 Alexa488 相比,Alexa546 的尺寸更大,形状不同。
总之,RNA显微注射是RNA定位的有力方法,但应始终与替代方法相结合。在我们的案例中,我们成功地将MS2结合位点引入U2snRNA,使用MS2-YFP监测其定位,并证实了SnRNA微注射与MS2系统5获得的一些关键结果。
提示和故障排除
需要为每个细胞系确定注射压力、补偿压力和注射时间。在细胞质显微注射和Pi=200 hPa和Pc=80 hPa中,在核显微注射的情况下,我们应用了注射压力(Pi)170 hPa和补偿压力(Pc)50 hPa。两种情况下的注射时间都设置为 0.2 s。有时,您可以观察到细胞内物质的轻微移动,这是成功注射的迹象。如果细胞破裂,您必须降低注射压力。您还应通过 TRITC 荧光通道检查补偿压力。当你看到强流从针尖流出时,然后降低补偿压力。
在注射之间,始终检查细胞是否成功注入。使用TRITC荧光通道通过注射的Dextran-TRITC识别微注入细胞。如果您没有看到任何微注入细胞,首先增加注射压力和注射时间。第二,检查针头是否未通过荧光通道 (TRITC) 堵塞。如果您看到 Dextran-TRITC 从针头弱流,则针头功能正常,并且问题可能位于注射的下限设置上。设定限制是一个非常棘手和重要的步骤。每个细胞有不同的形状,你会经常改变限制,以确保适当的显微注射。
在理想情况下,在针头被细胞碎片堵塞之前,应能对+50个细胞进行显微注射。检查荧光是否定期从尖端流出,如果您没有看到任何从尖端流出的 Dextran-TRITC 流,则针头被阻塞。要清洁它,请按住喷油器上的CLEAN按钮 3 s,这会增加压力,并应拆下块。如果它没有帮助,那么你可以尝试打破针尖,击中培养皿的底部。然而,这是一个非常棘手的过程,需要大量的经验,并不能保证成功。因此,对于初学者来说,针头交换是可取的。
在更换针头之前,按下喷油器上的MENU按钮。把针头向上一点,按上微型机械手。针会从介质一直向上,但微操作器会记住针头的原始位置,您不需要再次找到针头。更换针头时,按下"主页"按钮,针头将转到原始位置,您应该能够在显微镜中看到针头。更换针头后,您必须调整限制。然后,再次按下喷油器上的MENU按钮,为显微注射准备针头。
在成像过程中,最棘手的部分是找到微注入细胞。要找到它们,请使用TRITC通道,其中TRITC结合的Dextran-70kDa比弱的Alexa488微喷射snRNA信号更明显。带网格的封面在这里很有帮助。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了捷克科学基金会(18-10035S)、国家可持续发展方案I(LO1419)、机构支持(RVO68378050)、欧洲区域发展基金(CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775)和赠款机构的支持。查尔斯大学 (GAUK 134516)。我们进一步认可光显微镜核心设施,IMG CAS,捷克共和国布拉格(由赠款支持(捷克生物成像 - LM2015062)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
- Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
- Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits. RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).
- Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
- Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
- Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).
- Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).
- Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).
- Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
