Summary
Biogenesis af Spliceosomal snRNAs er en kompleks proces, der involverer forskellige cellulære rum. Her beskæftigede vi mikroinjektion af fluorescently mærkede snRNAs for at overvåge deres transport inde i cellen.
Abstract
Biogenesis af Spliceosomal snRNAs er en kompleks proces, der involverer både nukleare og cytoplasmiske faser, og det sidste trin forekommer i et nukleart rum kaldet Cajal-kroppen. Men sekvenser, der direkte snRNA lokalisering i denne subnukleare struktur har ikke været kendt indtil for nylig. For at bestemme sekvenser, som er vigtige for akkumulering af snRNAs i Cajal-kroppe, anvendte vi mikroinjektion af fluorescently mærkede snRNAs efterfulgt af deres lokalisering inde i cellerne. Først forberedte vi snRNA sletning mutanter, syntetiseret DNA skabeloner til in vitro transkription og transskriberede snRNAs i nærværelse af UTP kombineret med Alexa488. Mærkede snRNAs blev blandet med 70 kDa-dextran konjugeret med TRITC, og microinjiceres til kernen eller cytoplasmaet af humane HeLa celler. Cellerne blev inkuberet i 1 time og fast, og Cajal Body Marker coilin blev visualiseret ved indirekte immunofluorescens, mens snRNAs og dextran, som fungerer som markør for nuklear eller cytoplasmisk injektion, blev observeret direkte ved hjælp af et fluorescens mikroskop. Denne metode giver mulighed for effektiv og hurtig test af, hvordan forskellige sekvenser påvirker RNA lokalisering inde celler. Her viser vi vigtigheden af SM-bindings sekvensen for effektiv lokalisering af snRNAs i Cajal-kroppen.
Introduction
RNA splejsning er et af de afgørende skridt i genekspression, som er katalyseret af en stor ribonucleoprotein kompleks kaldet spliceosome. I alt er mere end 150 proteiner og 5 små nukleare RNAs (snrnas) integreret i spliceosome på forskellige stadier af splejsning pathway. U1, U2, U4, U5 og U6 snrnas deltager i splejsning af Major Gu-AG introns. Disse snRNAs slutte sig til spliceosome som præ-dannet små nukleare ribonucleoprotein partikler (snRNPs), der indeholder snRNA, syv SM proteiner forbundet med snRNA (eller lignende-SM proteiner, der forbinder med U6 snRNA) og 1-12 proteiner specifikke for hver snRNP.
Montering af snRNPs involverer cytoplasmiske og nukleare stadier. Nyligt transkriberet snRNA eksporteres til cytoplasmaet, hvor det erhverver en ring samlet fra syv SM proteiner. SM ring efterfølgende tjener som et signal for snRNA re-import tilbage til kernen. Defekte snRNAs, der undlader at associere med SM proteiner er bevaret i cytoplasmaet1. Nyligt importerede snrnp'er vises først i Cajal-kroppen, hvor de møder snrnp-specifikke proteiner og afslutter deres modning (gennemgået i reference2,3). Vi har for nylig vist, at hæmning af de endelige modning trin resulterer i binding af umodne snrnps i Cajal organer4,5. Vi foreslog en model, hvor den endelige snRNP modning er under kvalitetskontrol, der overvåger tilsætning af snRNP-specifikke proteiner og dannelsen af aktive snRNPs. Molekylære detaljer om, hvordan celler skelner mellem korrekt monterede modne og afvigende umodne partikler, forbliver dog flygtige.
For at bestemme snRNA-sekvenser, der er afgørende for målretning og akkumulering af snRNAs i nukleare Cajal-organer, besluttede vi at anvende mikroinjektion af fluorescently mærkede snRNAs. Mikroinjektion var en metode til valg, fordi: 1) det kræver ikke en ekstra sekvens tag at skelne syntetiske snRNAs danne deres endogene modparter, som er særligt vigtigt for korte RNAs med lidt plads til indsættelse af ekstra tag sekvens; 2) det giver mulighed for analyse af sekvenser, der er vigtige for Biogenesis. For eksempel, SM sekvens er afgørende for SM ring samling og re-import i Nucleus6. Når snRNAs er udtrykt i cellen, snRNAs mangler SM sekvens er forringet i cytoplasmaet og ikke nå kernen og Cajal organer7. Men, snRNAs uden SM sekvens kan være direkte microinjiceres i kernen og dermed en potentiel rolle af SM sekvens i Cajal Body lokalisering assayed.
Her beskriver vi i detaljer en mikroinjektionsmetode, som vi anvendte til at bestemme snRNA-sekvenser, der er nødvendige for at målrette snRNAs ind i Cajal-kroppen5. Vi viste, at SM og SMN bindende sites er sammen nødvendige og tilstrækkelige til at lokalisere ikke kun snRNAs men forskellige korte ikke-kodning RNAs i Cajal kroppen. Baseret på mikroindsprøjtning samt andre beviser, foreslog vi, at SM ring samlet på SM binding site er Cajal Body lokaliserings signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af snRNAs til mikroinjektion
- Forbered en DNA-skabelon, der indeholder den fulde længde eller afkortet/muteret version af snRNA ved PCR ved hjælp af en følgende PCR-opsætning: 98 °C for 60 s, 98 °C for 15 s, 68 °C for 30 s, 72 °C i 1 min, 98 °C for 15 s for 35x og 72 °C i 5 min.
- Forward primer skal indeholde en promotor sekvens for in vitro transkription lige opstrøms for den første transkriberet nucleotid. Amplify U2 snRNA-sekvens ved hjælp af fremad primer, der indeholder T7-promotoren og den omvendte primer, som slutter med det sidste transkriberede nukleotid (Se tabel over materialer for detaljer).
- Syntetisere snRNA ved hjælp af et kit til kort RNA-syntese (Se tabel over materialer for detaljer) indeholdende T7 RNA polymerase. Tilføj 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosin Cap analog (m32, 2, 7G (5 ') PPP (5 ') G), 1 ml af en RNA-hæmmer og 500-700 ng af DNA-skabelonen til reaktionsblandingen og inkuber ved 37 °c natten over.
- 1 μL (2U) af DNase tilsættes til reaktionen og inkubatorer i yderligere 15 min ved 37 °C.
- Isoler snRNA ved sur phenol/chloroform ekstraktion. Fjern den øverste vandfase og tilsæt 1/10 af det oprindelige volumen på 3 M natriumacetat (pH = 5,2), 3 μL glykogen for bedre pellet visualisering og 2,5 volumener af 100% ethanol. Inkuber i 1 time ved-80 °C, centrifugeres i 10 minutter ved 14.000 x g og 4 °c.
- Du vasker pellet med 70% ethanol og opløses i 12 μL nuklease frit vand. Det sædvanlige RNA-udbytte var ca. 600 ng/mL. Opbevares ved-80 °C.
- Overvåge integriteten af in vitro transkriberede snRNAs af agrose gel elektrophoreses.
- Før mikroinjektion fortyndes RNA til den endelige koncentration 200 ng/mL i vand, der indeholder 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa.
2. celler
- Før brug behandles dæksedlerne med 1 M HCl i 1 time, vaskes grundigt i destilleret vand og opbevares i 100% ethanol. Sure behandling fremmer cellernes adhæsion for at forhindre celle afskalning under eller efter injektion. For lettere identifikation af injicerede celler, bruge en cover seddel med et gitter.
- Frø HeLa eller andre vedlige celler 1 dag før mikroinjektion på 12 mm dæksedler (nr. 1 eller No. 1,5) for at nå 50% konfluency på tidspunktet for mikroinjektion.
3. injektion
Bemærk: HeLa-cellerne blev mikroinjiceret i Dulbecco's modificerede Eagle medium (D-MEM, 4,5 g/L D-glucose indeholdende phenol rød og antibiotika). Injektion blev udført ved hjælp af en injektor og en micromanipulator udstyret med den sterile nål (Se tabel over materialer for detaljer). Hele mikroskopisk/micromanipulatorsystemet blev forvarmet til 37 °C i mindst 4 timer for at forhindre udsving i de enkelte dele af mikroskopet og mikroinjektoren.
- Sæt Petri skålen (30 mm), der indeholder 2 mL kultur medier, med dæksedlen i midten ind i mikroskopholderen. Læg 3 μL snRNA-blandingen i nålen ved hjælp af en mikroloader. Nålen sættes i holderen på mikroinjektoren i 45 ° med hensyn til overfladen af Petri skålen.
- For at finde nålen, brug en 10x langdistance mål. Først indstille den hastighed grove på injektoren og sænke nålen, indtil det rører kulturmediet. Ved hjælp af mikroskop kikkert, finde den lyse plet, som er det sted, hvor nålen rører kulturmediet.
- Skift hastigheden til fine og yderligere sænke nålen, mens du kigger ind i mikroskopet, indtil spidsen af nålen observeres. Flyt nålen i midten af det visuelle felt og skifte til en 40x langdistance mål.
- Når du har ændret målsætningen, skal du markere cellen og flytte nålen over denne celle. Indstil tryk og tid for celle kontakten (Se tip og fejlfinding i diskussionen).
- Flyt nålen ned i cellen og sæt derefter den nedre grænse på micromanipulatoren. Pas på ikke at bevæge nålen under cellen.
- Når du har fastslået den nedre grænse, skal du flytte nålen tilbage over cellen og trykke på injektionsknappen på injektorens joystick. Nålen bevæger sig automatisk inde i cellen til det sted, hvor grænsen er indstillet og tilfører RNA-blandingen.
- For at afslutte skal du trykke på knap menuen på injektoren og fjerne nålen fra holderen. Fjern derefter røret fra injektoren, før du slukker for injektoren og micromanipulatoren.
4. celle fiksering og farvning
- Efter mikroinjektionen returneres cellerne til en CO2 -inkubator, og der inkubes ved 37 °c i 1 time.
- Efter inkubationen skylles cellerne tre gange med fosfat bufferet saltvandsopløsning (PBS) ved stuetemperatur, Fix for 20 min med 4% PARAFORMALDEHYD i 0,1 M rør pH 6,9, og vask tre gange med stuetemperatur PBS. Hvis kun snRNA-lokalisering analyseres, skylles cellerne kortvarigt i vand og monteres i et monterings medium med DAPI.
- I tilfælde af yderligere protein lokalisering, permeabilize cellerne med 0,5% Triton-X100 i PBS i 5 min ved stuetemperatur. Efter tre skylning med PBS, Inkuber cellerne med primære og sekundære antistoffer og efter sidste skylning i PBS og kort skyl i vand, Monter i et monterings medium med DAPI.
5. mikroskopi
- Hvis det ikke afbildes umiddelbart efter monteringen, opbevares slidene ved 4 °C indtil billeddannelse.
- Erhverve billeder ved hjælp af en high-end fluorescens mikroskopisk system udstyret med en fordybelse mål (60X eller 100x/1.4 NA).
- Når mikroinjicerede celler er identificeret, indsamle en stak af 20 z-sektioner med 200 Nm z trin pr prøve og underlagt matematisk dekoncentrering. Der blev derefter præsenteret maksimale fremskrivninger eller individuelle z-stakke.
- At kvantificere det fluorescerende signal, trække region af interesse (ROI) omkring en Cajal krop identificeret ved coilin immunofarvning. Mål intensiteten af snRNA-signalet i det coilin-definerede ROI. Dernæst bestemme intensiteten af snRNA fluorescens i ROI tilfældigt placeret i nucleoplasmaet og beregne forholdet mellem RNA-signal i Cajal krop og nucleoplasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at overvåge snRNA lokalisering og rollen som SM binding site i Cajal krop målretning, vi udarbejdet en DNA-skabelon, der indeholder T7 promoter og enten fuld længde U2 snRNA eller U2 snRNA mangler de syv nukleotider (auuuuug) danner SM binding site. snRNAs blev in vitro transkriberet, isoleret og blandet med TRITC-koblet dextran-70kDa. Vi microinjiceres blandingen indeholder in vitro transkriberet snRNA i kernen eller cytoplasmaet af HeLa celler.
Det har tidligere vist sig, at SM-bindingsstedet er nødvendigt for nuklear import6. At teste, om SM site er også vigtigt for Cajal Body akkumulering, vi microinjiceres snRNA mangler SM site direkte ind i kernen (figur 1a). Injektion i cytoplasmaet fungerede som kontrol (figur 1b). Som en positiv kontrol, vi microinjiceres fuld længde snRNA (figur 1c,D). Efter 60 min inkubation i en CO2 -kuruator blev der fastsat mikroinjicerede celler, og Cajal Body Marker coilin blev visualiseret ved indirekte immunofluorescens. Den fulde længde snRNA akkumuleret i Cajal organer efter både nukleare og cytoplasmiske injektioner. I modsætning, snRNA mangler SM site forblev i cytoplasmaet efter mikroinjektion i dette rum, som er i overensstemmelse med tidligere fund6. Den nukleare mikroinjektion af snRNA uden SM-webstedet afslørede, at SM-bindings sekvensen er vigtig for Cajal-krops lokalisering. U2 snRNA mangler SM site forblev i kernen, men ikke ophobes i Cajal organer (figur 1a).
Sommetider, mikroinjektion i kun én cellulære rum mislykkedes og TRICT-dextran-70kDa blev fundet i både kernen og cytoplasmaet (figur 2a). Disse celler blev kasseret fra yderligere analyse. Trods det faktum, at de fluorescently mærkede snRNAs opbevares ved-80 °C før injektionen, kan RNA-nedbrydning forekomme. Forringet snRNA injiceres i cytoplasmaet transporteres ikke ind i kernen og forbliver lokaliseret i cytoplasmaet (figur 2b). Sådan snRNA skal kasseres, og nye snRNA skal syntetiseres.
Figur 1: lokalisering af mikroinjicerede snRNAs. Alexa488-mærket U2 snRNA, der enten mangler SM-stedet (A,B) eller fuld længde (C,D), blev mikroinjiceret i cytoplasmaet eller kernen i Hela-cellerne. Cajal organer (pile) er markeret med coilin immunolabeling (rød); snRNAs er afbildet med grønt. Dextran-TRITC-70kDa (gul) blev brugt til at overvåge nuklear eller cytoplasmisk injektion; DNA blev plettet af DAPI (blå). Arrowheads markerer cytoplasmisk lokalisering af snRNA. Skala bjælke = 10 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: en potentiel faldgrube af mikroinjektion tilgang. (A) mikroinjektion i ét rum mislykkedes, og WT U2 snRNA blev microinjiceres i både cytoplasmaet og kernen. Bemærk, at dextran-TRITC-70kDa (gul) er til stede i begge celle segmenter. (B) WT U2 snRNA blev microinjiceres i cytoplasmaet i Hela-cellerne (grøn), men signifikant mængde snRNA forblev i cytoplasmaet (arrowheads), hvilket indikerer delvis nedbrydning af injiceret snRNA og tab af SM-bindingsstedet. Cajal organer (pile) er markeret med coilin immunolabeling (rød). DNA blev plettet af DAPI (blå). Skala bjælke = 10 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskæftigede mikroinjektion af fluorescently mærkede snRNAs for at bestemme sekvenser, som er vigtige for snRNA-lokalisering i nukleare Cajal-kroppe. På grund af hurtig og ret simpel tilberedning af mærkede RNAs (udarbejdelse af DNA-skabelon ved PCR efterfulgt af in vitro-transskription) giver metoden en effektiv analyse af, hvordan forskellige sekvenser bidrager til RNA-lokalisering. På relativt kort tid, vi var i stand til at analysere ti forskellige sletninger eller erstatninger af U2 snRNA (reference5 og data ikke vist). For RNAs med en kompleks Biogenese pathway, denne fremgangsmåde giver også testsekvenser, der er afgørende for modning. I tilfælde af snRNAs, sletning af SM bindende sekvenser, som er nødvendige for SM ring samling resulterer i binding og nedbrydning af muterede snRNAs i cytoplasmaet7. Andre fordelagtige omfatter, at to forskelligt mærkede RNAs kan injiceres samtidigt og deres lokalisering direkte sammenlignet inden for en celle. Men, som forskellige fluorchromes kan ændre RNA adfærd, hver vha skal testes individ før dobbelt mærkning eksperimenter. RNAs af flere hundrede nukleotider i længden er blevet injiceret med succes og deres lokalisering analyseret i forskellige modelsystemer (revideret i reference8). Det begrænsende trin i tilfælde af længere RNAs er normalt in vitro-syntese af fuld længde RNA. Også injektion af RNAs med præ-monterede proteiner kan anvendes til at teste effekten af individuelle proteiner på RNP lokalisering. I vores projekter injicerede vi snRNA forbundet med SM-proteiner for at bekræfte rollen af SM-ringen i Cajal Body lokalisering5. Endelig giver mikroinjektion af fluorescently mærkede RNAs mulighed for direkte kvantificering uden yderligere trin, som tidligere er blevet anvendt til snRNAs9.
Der er også flere ulemper ved de metoder, der bør overvejes, før lancere en mikroinjektion projekt. For det første, på trods af nogle automatisering af mikroinjektion proces, metoden kræver stadig manuelle færdigheder og erfaring, og forskerne bør overveje tid nødvendigt for uddannelse. De kritiske dele af protokollen er forberedelsen af intakte RNAs, mikroinjektion og derefter finde injicerede celler i mikroskopet (Se tips og fejlfinding nedenfor). For det andet, mikroinjektion repræsenterer en betydelig stress og mange celler ikke overlever i en længere periode. Mens der er nogle vellykkede forsøg på at følge microinjiceres RNAs inde celler ved Live-Cell Imaging10, vi observerede signifikant stigning i celledød, når vi kombinerede mikroinjektion med levende celle billeder ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. For det tredje er mængden af injiceret RNA i humane celler meget lav, hvilket forhindrer biokemisk analyse af injicerede RNAs. Det betyder også, at det er vanskeligt at overvåge, hvordan inkorporering af fluorescently mærkede nukleotider påvirker RNA-funktioner. Derfor bør forskellige nøgletal for mærket-NTP: NTP inkorporeres i Wild-type RNA og dets lokalisering analyseret for at få det ideelle forhold mellem fluorescens signalet og funktionaliteten af mærket RNA. Desuden kan arten af vha påvirke RNA-lokalisering. I vores hænder, Alexa488-UTP fungerede meget bedre end Alexa546-UTP. Vi har ikke udforsket disse forskelle yderligere, men en grund kunne være en større størrelse og anden form for Alexa546 i forhold til Alexa488.
At tage sammen, RNA mikroinjektion er en kraftfuld metode til RNA lokalisering, men bør altid kombineres med alternative tilgange. I vores tilfælde introducerede vi med succes MS2-binding site i U2 snRNA, overvågede sin lokalisering ved hjælp af MS2-YFP og bekræftede nogle vigtige resultater opnået ved snRNA mikroinjektion med MS2 system5.
Tip og fejlfinding
Indsprøjtningstryk, kompensations tryk og indsprøjtningstidspunkt skal bestemmes eksperimentelt for hver cellelinje. Vi anvendte indsprøjtningstryk (PI) 170 hPa og kompensations tryk (PC) 50 hPa i tilfælde af cytoplasmisk mikroinjektion og PI = 200 hPa og PC = 80 hPa i tilfælde af nuklear mikroinjektion. Injektionstiden var i begge tilfælde sat til 0,2 s. Du kan undertiden observere en let bevægelse af materiale inde i cellen, hvilket er en indikation af en vellykket injektion. Hvis cellen brister, er du nødt til at sænke indsprøjtningstrykket. Du bør også kontrollere kompensations trykket via TRITC fluorescens kanal. Når du ser den stærke strøm kommer ud fra spidsen af nålen, derefter sænke kompensations trykket.
Mellem injektioner, altid kontrollere, om cellerne er med succes injiceres. Identificere de mikroinjicerede celler via injiceret dextran-TRITC ved hjælp af TRITC fluorescens kanal. Hvis du ikke kan se nogen mikroinjicerede celler, skal du først øge indsprøjtningstrykket og injektionstiden. For det andet, kontrollere, om nålen ikke er tilsluttet via fluorescens kanal (TRITC). Hvis du ser dextran-TRITC svagt streaming fra spidsen af nålen, så nålen er funktionel, og problemet er sandsynligt i fastsættelsen af den nedre grænse for injektion. Fastsættelsen af grænsen er et meget vanskeligt og vigtigt skridt. Hver celle har forskellig form, og du vil ændre grænsen meget ofte for at sikre korrekt mikroinjektion.
I det ideelle tilfælde bør man være i stand til at mikroinjicere ~ 50 celler før spidsen af nålen er sat med en celle snavs. Kontroller, om fluorescens kommer ud af spidsen regelmæssigt, og hvis du ikke kan se nogen dextran-TRITC streaming fra spidsen, så nålen er blokeret. For at rense det, holde den rene knap på injektoren for 3 s, hvilket øger trykket og bør fjerne blokken. Hvis det ikke hjælper, så kan du prøve at afbryde spidsen af nålen ved at ramme bunden af Petri skålen. Men dette er en meget vanskelig procedure, som kræver en betydelig mængde erfaring, og der er ingen garanti for succes. Derfor, for begyndere, nålen udveksling er tilrådeligt.
Før du udveksler nålen, skal du trykke på menuknappen på injektoren. Tag nålen en lille smule op og tryk hjem på micromanipulator. Nålen vil gå hele vejen op fra mediet, men micromanipulatoren husker den oprindelige position af nålen, og du behøver ikke at finde nålen igen. Når nålen er udskiftet, skal du trykke på knappen hjem og nålen vil gå til den oprindelige position, og du bør være i stand til at se spidsen af nålen i mikroskop. Efter udskiftning af nålen, er du nødt til at justere grænsen. Tryk derefter på menuknappen på injektoren igen, og nålen er forberedt til mikroinjektion.
Under billeddannelse er den vanskeligste del at finde de mikroinjicerede celler. For at finde dem skal du bruge TRITC-kanalen, hvor den TRITC-konjugeret dextran-70kDa er meget bedre synlig end et svagt Alexa488 signal af microinjiceres snRNAs. Dæksedlerne med et gitter er nyttige her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den tjekkiske videnskabs fond (18-10035S), det nationale bæredygtigheds program I (LO1419), institutionel støtte (RVO68378050), den europæiske fond for regional udvikling (CZ. 02.1.01/0,0/0,0/16_013/0001775) og tilskuds organet for Charles University (GAUK 134516). Vi anerkender endvidere den lette mikroskopi kerne facilitet, IMG CAS, Prag, Tjekkiet (støttet af tilskud (tjekkisk-bioimaging-LM2015062).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
- Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
- Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits. RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).
- Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
- Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
- Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).
- Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).
- Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).
- Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
