Summary
Biogenese von spliceosomals snRNAs ist ein komplexer Prozess mit verschiedenen Zellkompartimenten. Hier haben wir Mikroinjektionen von fluoreszierend gekennzeichneten snRNAs eingesetzt, um deren Transport innerhalb der Zelle zu überwachen.
Abstract
Die Biogenese von spliceosomalen snRNAs ist ein komplexer Prozess, der sowohl nukleare als auch zytoplasmatische Phasen einbezieht, und der letzte Schritt findet in einem nuklearen Kompartiment namens Cajal-Körper statt. Sequenzen, die eine direkte snRNA-Lokalisierung in diese subnukleare Struktur direkt machen, sind jedoch bis vor kurzem nicht bekannt. Um Sequenzen zu bestimmen, die für die Akkumulation von snRNAs in Cajal-Körpern wichtig sind, verwendeten wir mikroinjection von fluoreszierend markierten snRNAs, gefolgt von ihrer Lokalisierung in Zellen. Zuerst bereiteten wir snRNA-Deletionsmutanten, synthetisierte DNA-Vorlagen für die In-vitro-Transkription und transkribierte SnRNAs in Gegenwart von UTP in Verbindung mit Alexa488. Beschriftete snRNAs wurden mit 70 kDa-Dextran konjugiert mit TRITC gemischt und mikroinjiziert in den Kern oder das Zytoplasma menschlicher HeLa-Zellen. Die Zellen wurden für 1 h inkubiert und fixiert und das Cajal-Körpermarker-Spulen wurde durch indirekte Immunfluoreszenz visualisiert, während SnRNAs und Dextran, die als Marker der nuklearen oder zytoplasmatischen Injektion dienen, direkt mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet wurden. Diese Methode ermöglicht effiziente und schnelle Tests, wie verschiedene Sequenzen die RNA-Lokalisierung in Zellen beeinflussen. Hier zeigen wir die Bedeutung der Sm-Bindungssequenz für die effiziente Lokalisierung von snRNAs in den Cajal-Körper.
Introduction
DIE RNA-Spleißung ist einer der entscheidenden Schritte in der Genexpression, der durch einen großen Ribonukleoprotein-Komplex, das Spleceoom genannt wird, katalysiert wird. Insgesamt sind mehr als 150 Proteine und 5 kleine nukleare RNAs (snRNAs) in verschiedenen Stadien des Spleißwegs in das Spleißmittel integriert. U1, U2, U4, U5 und U6 snRNAs beteiligen sich an der Spleißung großer GU-AG-Introns. Diese snRNAs verbinden das Sifasam als vorgeformte kleine kernnukleare Ribonukleoproteinpartikel (snRNPs), die snRNA, sieben Sm-Proteine enthalten, die mit snRNA (oder Like-Sm-Proteinen, die mit der U6 snRNA assoziiert werden) und 1-12 Proteine, die für jeden snRNP spezifisch sind, assoziiert werden.
Die Montage von snRNPs umfasst zytoplasmatische und nukleare Stadien. Neu transkribierte snRNA wird in das Zytoplasma exportiert, wo sie einen Ring erhält, der aus sieben Sm-Proteinen zusammengesetzt ist. Der Sm-Ring dient anschließend als Signal für den snRNA-Re-Import zurück in den Kern. Defekte snRNAs, die sich nicht mit Sm-Proteinen verbinden, werden im Zytoplasma1beibehalten. Neu importierte snRNPs erscheinen zuerst im Cajal-Körper, wo sie auf snRNP-spezifische Proteine treffen und ihre Reifung beenden (in Referenz2,3). Wir haben vor kurzem gezeigt, dass die Hemmung der endgültigen Reifungsschritte zur Sequestrierung unreifer SnRNPs in Cajal-Körpern4,5führt. Wir haben ein Modell vorgeschlagen, bei dem die endgültige snRNP-Reifung unter Qualitätskontrolle steht, die die Zugabe von snRNP-spezifischen Proteinen und die Bildung aktiver snRNPs überwacht. Molekulare Details darüber, wie Zellen zwischen richtig zusammengesetzten reifen und aberranten unreifen Partikeln unterscheiden, bleiben jedoch schwer fassbar.
Um snRNA-Sequenzen zu bestimmen, die für die Ausrichtung und Akkumulation von snRNAs in nuklearen Cajal-Körpern unerlässlich sind, haben wir beschlossen, Mikroinjektionen von fluoreszierend markierten snRNAs einzusetzen. Microinjection war eine Methode der Wahl, weil: 1) es erfordert keine zusätzliche Sequenz-Tag, um synthetische snRNAs zu unterscheiden bilden ihre endogenen Gegenstücke, die besonders wichtig für kurze RNAs mit wenig Platz für das Einfügen von zusätzlichen Tag-Sequenz ist; 2) es ermöglicht die Analyse von Sequenzen, die für die Biogenese wichtig sind. Beispielsweise ist die Sm-Sequenz für die Sm-Ringmontage und den erneuten Import in den Kern6unerlässlich. Wenn snRNAs in der Zelle exprimiert werden, werden snRNAs, denen die Sm-Sequenz fehlt, im Zytoplasma abgebaut und erreichen nicht den Kern und die Cajal-Körper7. SnRNAs ohne die Sm-Sequenz können jedoch direkt in den Zellkern injiziert werden und somit eine mögliche Rolle der Sm-Sequenz in der Cajal-Körperlokalisierung sprossiert.
Hier beschreiben wir detailliert eine Mikroinjektionsmethode, die wir angewendet haben, um snRNA-Sequenzen zu bestimmen, die notwendig sind, um snRNAs in den Cajal-Körper5zu zielen. Wir haben gezeigt, dass Sm- und SMN-Bindungsstellen zusammen notwendig und ausreichend sind, um nicht nur snRNAs, sondern auch verschiedene kurze nicht-kodierende RNAs in den Cajal-Körper zu lokalisieren. Basierend auf Mikroinjektionen und anderen Beweisen schlugen wir vor, dass der auf der Sm-Bindungsstelle montierte Sm-Ring das Cajal-Körperlokalisierungssignal ist.
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Protocol
1. Herstellung von snRNAs für die Mikroinjektion
- Erstellen Sie eine DNA-Vorlage mit der abendfüllenden oder abgeschnittenen/mutierten Version von snRNA by PCR unter Verwendung eines folgenden PCR-Setups: 98 °C für 60 s, 98 °C für 15 s, 68 °C für 30 s, 72 °C für 1 min, 98 °C für 15 s für 35x und 72 °C für 5 min.
- Die Vorwärtsgrundierung muss eine Promotorsequenz für die In-vitro-Transkription vor dem ersten transkribierten Nukleotid enthalten. Verstärken Sie die U2-SnRNA-Sequenz mit dem Vorwärtsprimer, der den T7-Promotor und den Reverse primer enthält, der mit dem letzten transkribierten Nukleotid endet (Details siehe Tabelle der Materialien).
- Synthesize snRNA mit einem Kit für kurze RNA-Synthese (siehe Tabelle der Materialien für Details), die T7-RNA-Polymerase enthalten. 1 mM ATP hinzufügen, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM Trimethylguanosin-Kappe analog (m32,2,7G(5')ppp(5')G), 1 ml eines RNA-Inhibitors und 500-700 ng der DNA-Vorlage zum Reaktionsgemisch und inkubieren bei 37 °C über Nacht.
- Fügen Sie 1 L (2U) DNase in die Reaktion ein und brüten Sie weitere 15 min bei 37 °C.
- Isolieren Sie snRNA durch saure Phenol/Chloroform-Extraktion. Entfernen Sie die obere Wasserphase und fügen Sie 1/10 des ursprünglichen Volumens von 3 M Natriumacetat (pH = 5,2), 3 l Glykogen für eine bessere Pellet-Visualisierung und 2,5 Volumen von 100% Ethanol hinzu. 1 h bei -80 °C inkubieren, Zentrifuge 10 min bei 14.000 x g und 4 °C.
- Das Pellet mit 70% Ethanol waschen und in 12 l nukleasefreiem Wasser auflösen. Die übliche RNA-Ausbeute lag bei rund 600 ng/ml. Bei -80 °C lagern.
- Überwachen Sie die Integrität von in vitro transkribierten snRNAs durch Agarose-Gel-Elektrophoresen.
- Vor der Mikroinjektion die RNA auf die Endkonzentration 200 ng/ml in Wasser mit 10 g/l Dextran-TRITC 70 kDa verdünnen.
2. Zellen
- Vor der Verwendung die Deckellipsen mit 1 M HCl für 1 h behandeln, gründlich in destilliertem Wasser waschen und in 100% Ethanol lagern. Die saure Behandlung fördert die Zellhaftung, um das Zellpeeling während oder nach der Injektion zu verhindern. Um die injizierte Zellen leichter zu identifizieren, verwenden Sie einen Deckschein mit einem Raster.
- Seed HeLa oder andere anhantibe Zellen 1 Tag vor der Mikroinjektion auf 12 mm Abdeckungen (Nr. 1 oder Nr. 1.5), um 50% Konfluenz zum Zeitpunkt der Mikroinjektion zu erreichen.
3. Injektion
HINWEIS: HeLa-Zellen wurden im modifizierten Eagle Medium des Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-Glucose mit Phenolrot und Antibiotika) mikroinjiziert. Die Injektion erfolgte mit einem Injektor und einem Mikromanipulator, der mit der sterilen Nadel ausgestattet war (Details siehe Materialtabelle). Das gesamte mikroskopische/mikromanipulatorische System wurde mindestens 4 h lang auf 37 °C vorgeheizt, um Schwankungen einzelner Teile des Mikroskops und des Mikroinjektors zu verhindern.
- Die Petrischale (30 mm) mit 2 ml Kulturmedien mit dem Deckelin in der Mitte in den Halter des Mikroskops geben. Mit einem Mikrolader 3 l snRNA-Mischung in die Nadel geben. Setzen Sie die Nadel in den Halter des Mikroinjektors in 45° in Bezug auf die Oberfläche der Petrischale ein.
- Um die Nadel zu finden, verwenden Sie ein 10x Langstreckenobjektiv. Stellen Sie zunächst die Geschwindigkeit COARSE auf dem Injektor ein und senken Sie die Nadel, bis sie das Kulturmedium berührt. Finden Sie mit dem Mikroskop-Fernglas den hellen Fleck, der der Ort ist, an dem die Nadel das Kulturmedium berührt.
- Ändern Sie die Geschwindigkeit auf FINE und senken Sie die Nadel weiter, während Sie in das Mikroskop schauen, bis die Spitze der Nadel beobachtet wird. Bewegen Sie die Nadel in der Mitte des Gesichtsfeldes und wechseln Sie zu einem 40-fachen Langstreckenobjektiv.
- Nachdem Sie das Ziel geändert haben, wählen Sie die Zelle aus und bewegen Sie die Nadel über diese Zelle. Stellen Sie den Druck und die Zeit für den Zellkontakt ein (siehe Tipps und Fehlerbehebung im Gespräch).
- Bewegen Sie die Nadel nach unten in die Zelle und setzen Sie dann die untere Grenze für den Mikromanipulator. Achten Sie darauf, die Nadel nicht unter die Zelle zu bewegen.
- Nachdem Sie die untere Grenze gesetzt haben, bewegen Sie die Nadel wieder über die Zelle und drücken Sie die Injektionstaste am Joystick des Injektors. Die Nadel bewegt sich automatisch innerhalb der Zelle an die Stelle, an der die Grenze gesetzt wird, und injiziert das RNA-Gemisch.
- Um zu beenden, drücken Sie die Taste MENU auf dem Injektor und entfernen Sie die Nadel aus dem Halter. Trennen Sie dann das Rohr vom Injektor, bevor Sie den Injektor und den Mikromanipulator ausschalten.
4. Zellfixierung und Färbung
- Nach der Mikroinjektion die Zellen in einen CO2-Inkubator zurückgeben und bei 37 °C für 1 h inkubieren.
- Nach der Inkubation die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalinelösung (PBS) bei Raumtemperatur abspülen, 20 min mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PIPES pH 6.9 fixieren und dreimal mit Raumtemperatur PBS waschen. Wenn nur die snRNA-Lokalisierung analysiert wird, spülen Sie die Zellen kurz in Wasser aus und montieren Sie sie in einem Montagemedium mit DAPI.
- Im Falle einer zusätzlichen Proteinlokalisierung permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5% Triton-X100 in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. Nach drei Spülungen mit PBS, inkubieren die Zellen mit primären und sekundären Antikörpern und nach dem letzten Spülen in PBS und kurz spülen in Wasser, in einem Montagemedium mit DAPI montieren.
5. Mikroskopie
- Wenn sie nicht unmittelbar nach der Montage abgebildet werden, lagern Sie die Dias bei 4 °C bis zur Bildgebung.
- Erfassen Sie Bilder mit einem hochwertigen fluoreszenzmikroskopischen System, das mit einem Tauchobjektiv (60X oder 100x/1.4NA) ausgestattet ist.
- Sobald mikroinjizierte Zellen identifiziert sind, sammeln Sie einen Stapel von 20 Z-Abschnitten mit 200 nm z Schritten pro Probe und unterliegen mathematischer Dekonvolution. Anschließend wurden maximale Projektionen oder einzelne z-Stacks vorgestellt.
- Um das fluoreszierende Signal zu quantifizieren, zeichnen Sie Region of Interest (ROI) um einen Cajal-Körper, der durch Coilin-Immunostaining identifiziert wurde. Messen Sie die Intensität des snRNA-Signals im coilindefinierten ROI. Als nächstes bestimmen Sie die Intensität der snRNA-Fluoreszenz im ROI zufällig im Nukleoplasma platziert und berechnen das Verhältnis des RNA-Signals im Cajal-Körper und Nukleoplasma.
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Representative Results
Um die SnRNA-Lokalisierung und die Rolle der Sm-Bindungsstelle im Cajal-Körper-Targeting zu überwachen, haben wir eine DNA-Vorlage mit dem T7-Promotor und entweder der in voller Länge U2-SnRNA oder U2-SnRNA ohne die sieben Nukleotide (AUUUUUG) vorbereitet, die die Sm-Bindungsstelle bilden. snRNAs wurden in vitro transkribiert, isoliert und mit TRITC-gekoppeltem Dextran-70kDa gemischt. Wir haben das In-vitro-Transkribierte snRNA mikroinjiziert in den Zellkern oder das Zytoplasma von HeLa-Zellen.
Es wurde bereits gezeigt, dass die Sm-Bindungsstelle für denAtomimport6 notwendig ist. Um zu testen, ob die Sm-Site auch für die Akkumulation des Cajal-Körpers wichtig ist, haben wir snRNA ohne die Sm-Site direkt in den Kern mikroinjiziert (Abbildung 1A). Die Injektion in das Zytoplasma diente als Kontrolle (Abbildung 1B). Als Positivkontrolle haben wir snRNA in voller Länge mikroinjiziert (Abbildung 1C,D). Nach 60 min Inkubation in einem CO2-Inkubator wurden mikroinjizierte Zellen fixiert und das Cajal-Körpermarker-Pulsesin durch indirekte Immunfluoreszenz visualisiert. Die in voller Länge angesammelte snRNA sammelte sich in Cajal-Körpern nach nuklearen und zytoplasmatischen Injektionen. Im Gegensatz dazu blieb snRNA ohne Sm-Site nach der Mikroinjektion im Zytoplasma in dieses Fach, was mit früheren Befunden übereinstimmt6. Die nukleare Mikroinjektion von snRNA ohne sm-Standort ergab, dass die Sm-Bindungssequenz für die Lokalisierung des Cajal-Körpers wichtig ist. U2 snRNA fehlte die Sm-Site blieb im Kern, aber nicht in Cajal Körper angesammelt (Abbildung 1A).
Manchmal scheiterte die Mikroinjektion in nur ein Zellfach und TRICT-dextran-70kDa wurde sowohl im Kern als auch im Zytoplasma gefunden (Abbildung 2A). Diese Zellen wurden aus der weiteren Analyse verworfen. Trotz der Tatsache, dass die fluoreszierend markierten snRNAs vor der Injektion bei -80 °C gespeichert werden, kann es zu einem RNA-Abbau kommen. Degradierte snRNA, die in das Zytoplasma injiziert wird, wird nicht in den Zellkern transportiert und bleibt im Zytoplasma lokalisiert (Abbildung 2B). Solche snRNA sollte verworfen werden, und neue snRNA sollte synthetisiert werden.
Abbildung 1: Lokalisierung von mikroinjizierten snRNAs. Alexa488-markierte U2-snRNA entweder ohne Sm-Site (A,B) oder in voller Länge (C,D) wurden mikroinjiziert in das Zytoplasma oder den Kern von HeLa-Zellen. Cajalkörper (Pfeile) sind durch Coilin-Immunolabeling (rot) gekennzeichnet; snRNAs sind grün dargestellt. Dextran-TRITC-70kDa (gelb) wurde verwendet, um nukleare oder zytoplasmatische Injektion zu überwachen; Die DNA wurde von DAPI (blau) gebeizt. Pfeilspitzen markieren zytoplasmatische Lokalisation von snRNA. Skalenbalken = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Eine potenzielle Falle des Mikroinjektionsansatzes. (A) Die Mikroinjektion in ein Fach scheiterte und WT U2 snRNA wurde sowohl in das Zytoplasma als auch in den Zellkern mikroinjiziert. Beachten Sie, dass Dextran-TRITC-70kDa (gelb) in beiden Zellfächern vorhanden ist. (B) WT U2 snRNA wurde mikroinjiziert in das Zytoplasma von HeLa-Zellen (grün), aber eine signifikante Menge an snRNA verblieb im Zytoplasma (Pfeilspitzen), was auf einen teilweisen Abbau der injizierten snRNA und einen Verlust der Sm-Bindungsstelle hindeutet. Cajalkörper (Pfeile) sind durch Coilin-Immunolabeling (rot) gekennzeichnet. Die DNA wurde von DAPI (blau) gebeizt. Skalenbalken = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir verwendeten Mikroinjektionen von fluoreszierend markierten snRNAs, um Sequenzen zu bestimmen, die für die snRNA-Lokalisierung in nuklearen Cajal-Körpern wichtig sind. Durch die schnelle und recht einfache Vorbereitung von markierten RNAs (Vorbereitung der DNA-Vorlage durch PCR gefolgt von In-vitro-Transkription) bietet die Methode eine effektive Analyse, wie verschiedene Sequenzen zur RNA-Lokalisierung beitragen. In relativ kurzer Zeit konnten wir zehn verschiedene Deletionen oder Substitutionen der U2 snRNA analysieren (Referenz5 und daten nicht gezeigt). Für RNAs mit einem komplexen Biogeneseweg ermöglicht dieser Ansatz auch Testsequenzen, die für die Reifung unerlässlich sind. Bei snRNAs führt das Löschen von Sm-Bindungssequenzen, die für die Sm-Ringmontage erforderlich sind, zur Sequestrierung und Degradation mutierter snRNAs im Zytoplasma7. Weitere Vorteile sind, dass zwei unterschiedlich gekennzeichnete RNAs gleichzeitig injiziert und ihre Lokalisierung direkt innerhalb einer Zelle verglichen werden kann. Da jedoch verschiedene Fluorchrome das RNA-Verhalten verändern können, muss jedes Fluorchrom vor doppelseitigen Etikettierungsexperimenten einzeln getestet werden. RNAs mit einer Länge von mehreren hundert Nukleotiden wurden erfolgreich injiziert und ihre Lokalisierung in verschiedenen Modellsystemen untersucht (in Referenz8). Der begrenzende Schritt bei längeren RNAs ist in der Regel die In-vitro-Synthese von RNA in voller Länge. Auch die Injektion von RNAs mit vormontierten Proteinen kann angewendet werden, um die Wirkung einzelner Proteine auf die RNP-Lokalisierung zu testen. In unseren Projekten injizierten wir snRNA, die mit Sm-Proteinen assoziiert ist, um die Rolle des Sm-Rings in der Cajal-Körperlokalisierung zu bestätigen5. Schließlich ermöglicht die Mikroinjektion fluoreszierender RNAs eine direkte Quantifizierung ohne zusätzliche Schritte, wie sie zuvor für snRNAs9angewendet wurde.
Es gibt auch mehrere Nachteile der Methoden, die vor dem Start eines Mikroinjektionsprojekts in Betracht gezogen werden sollten. Erstens erfordert die Methode trotz einiger Automatisierung des Mikroinjektionsprozesses noch manuelle Fähigkeiten und Erfahrung, und die Forscher sollten die für die Schulung erforderliche Zeit berücksichtigen. Die kritischen Teile des Protokolls sind die Herstellung intakter RNAs, Mikroinjektion und anschließendes Auffinden injizierter Zellen im Mikroskop (siehe Tipps und Fehlerbehebung unten). Zweitens stellt die Mikroinjektion einen erheblichen Stress dar und viele Zellen überleben nicht über einen längeren Zeitraum. Zwar gibt es einige erfolgreiche Versuche, mikroinjizierten RNAs in Zellen durch Live-Zell-Bildgebung10zu folgen, aber wir beobachteten eine signifikante Zunahme des Zelltodes, als wir Mikroinjektion mit Live-Zell-Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie kombinierten. Drittens ist die Menge der injizierten RNA in menschliche Zellen sehr gering, was die biochemische Analyse von injizierten RNAs verhindert. Dies bedeutet auch, dass es schwierig ist zu überwachen, wie sich die Einbeziehung fluoreszierend markierter Nukleotide auf die RNA-Funktionen auswirkt. Daher sollten verschiedene Verhältnisse von labelled-NTP:NTP in Wild-Typ-RNA integriert und ihre Lokalisation assayed, um das ideale Verhältnis zwischen dem Fluoreszenzsignal und der Funktionalität der markierten RNA zu erhalten. Auch die Art von Fluorchrom könnte die RNA-Lokalisierung beeinflussen. In unseren Händen funktionierte Alexa488-UTP viel besser als Alexa546-UTP. Wir haben diese Unterschiede nicht weiter untersucht, aber ein Grund könnte eine größere Größe und eine andere Form von Alexa546 im Vergleich zu Alexa488 sein.
Zusammengenommen ist die RNA-Mikroinjektion eine leistungsfähige Methode zur RNA-Lokalisierung, sollte aber immer mit alternativen Ansätzen kombiniert werden. In unserem Fall haben wir erfolgreich DIE MS2-Bindungsstelle in U2 snRNA eingeführt, die Lokalisierung mit MS2-YFP überwacht und einige wichtige Ergebnisse bestätigt, die durch snRNA-Mikroinjektion mit dem MS2-System5erzielt wurden.
Tipps und Fehlerbehebung
Injektionsdruck, Kompensationsdruck und Injektionszeit müssen experimentell für jede Zelllinie bestimmt werden. Wir haben Injektionsdruck (Pi) 170 hPa und Kompensationsdruck (Pc) 50 hPa bei zytoplasmatischer Mikroinjektion und Pi=200 hPa und Pc=80 hPa bei Kernmikroinjektion angewendet. Die Injektionszeit wurde in beiden Fällen auf 0,2 s eingestellt. Sie können manchmal eine leichte Bewegung des Materials innerhalb der Zelle beobachten, was ein Hinweis auf eine erfolgreiche Injektion ist. Wenn die Zelle platzt, müssen Sie den Injektionsdruck verringern. Sie sollten auch den Kompensationsdruck über den TRITC-Fluoreszenzkanal überprüfen. Wenn Sie den starken Strom sehen, der von der Spitze der Nadel herauskommt, verringern Sie dann den Kompensationsdruck.
Überprüfen Sie zwischen den Injektionen immer, ob die Zellen erfolgreich injiziert werden. Identifizieren Sie die mikroinjizierten Zellen über injiziertes Dextran-TRITC mithilfe des TRITC-Fluoreszenzkanals. Wenn Sie keine mikroinjizierten Zellen sehen, erhöhen Sie zuerst den Injektionsdruck und die Injektionszeit. Überprüfen Sie zweitens, ob die Nadel nicht über den Fluoreszenzkanal (TRITC) eingesteckt ist. Wenn Sie Dextran-TRITC schwach von der Spitze der Nadel strömen sehen, dann ist die Nadel funktionsfähig, und das Problem ist wahrscheinlich in der Einstellung der unteren Grenze für die Injektion. Die Festlegung des Limits ist ein sehr schwieriger und wichtiger Schritt. Jede Zelle hat eine andere Form und Sie werden die Grenze sehr oft ändern, um eine ordnungsgemäße Mikroinjektion zu gewährleisten.
Im Idealfall sollte man in der Lage sein, 50 Zellen mikroinjizieren zu können, bevor die Spitze der Nadel mit einem Zellabfall verstopft wird. Prüfen Sie, ob die Fluoreszenz regelmäßig aus der Spitze kommt, und wenn Sie kein Dextran-TRITC-Streaming von der Spitze sehen, dann wird die Nadel blockiert. Um es zu reinigen, halten Sie die CLEAN-Taste auf dem Injektor für 3 s, die Druck erhöht und sollte den Block entfernen. Wenn es nicht hilft, dann könnten Sie versuchen, die Spitze der Nadel zu brechen, indem Sie den Boden der Petrischale. Dies ist jedoch ein sehr schwieriges Verfahren, das eine beträchtliche Menge an Erfahrung erfordert und es keine Erfolgsgarantie gibt. Daher ist für Anfänger der Nadelaustausch ratsam.
Bevor Sie die Nadel austauschen, drücken Sie die MENU-Taste auf dem Injektor. Nehmen Sie die Nadel ein wenig nach oben und drücken Sie HOME auf den Mikromanipulator. Die Nadel wird den ganzen Weg vom Medium nach oben gehen, aber der Mikromanipulator erinnert sich an die ursprüngliche Position der Nadel und Sie müssen die Nadel nicht wieder finden. Wenn die Nadel ausgetauscht wird, drücken Sie die HOME-Taste und die Nadel wird in die ursprüngliche Position gehen und Sie sollten in der Lage sein, die Spitze der Nadel im Mikroskop zu sehen. Nach dem Wechsel der Nadel müssen Sie den Grenzwert anpassen. Drücken Sie dann die MENU-Taste wieder auf den Injektor und die Nadel ist für die Mikroinjektion vorbereitet.
Während der Bildgebung besteht der schwierigste Teil darin, die mikroinjizierten Zellen zu finden. Um sie zu lokalisieren, verwenden Sie den TRITC-Kanal, bei dem die TRITC-konjugierte Dextran-70kDa viel besser sichtbar ist als ein schwaches Alexa488-Signal von mikroinjizierten snRNAs. Die Abdeckungen mit einem Gitter sind hier hilfreich.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Tschechischen Wissenschaftsstiftung (18-10035S), dem Nationalen Nachhaltigkeitsprogramm I (LO1419), der institutionellen Unterstützung (RVO68378050), dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) und der Karlsuniversität (GAUK 134516). Wir würdigen ferner die Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Prag, Tschechische Republik (unterstützt durch Stipendien (Czech-Bioimaging - LM2015062).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
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