Summary
La biogénesis de los snRNA spliceosomales es un proceso complejo que involucra varios compartimentos celulares. Aquí, empleamos microinyección de nmRNA etiquetados fluorescentemente con el fin de monitorear su transporte dentro de la célula.
Abstract
La biogénesis de los snRNA spliceosomales es un proceso complejo que implica fases nucleares y citoplasmáticas y el último paso se produce en un compartimiento nuclear llamado cuerpo Cajal. Sin embargo, las secuencias que dirigen la localización de ARN SnRNA en esta estructura subnuclear no se han conocido hasta hace poco. Para determinar secuencias importantes para la acumulación de SnRNAs en cuerpos de Cajal, empleamos microinyección de snRNAs etiquetados fluorescentemente seguido de su localización dentro de las células. Primero, preparamos mutantes de eliminación de SnRNA, sintetizamos plantillas de ADN para transcripción in vitro y snRNAs transcritos en presencia de UTP junto con Alexa488. Los snRNA etiquetados se mezclaron con 70 kDa-Dextran conjugados con TRITC, y microinyectados al núcleo o al citoplasma de células HeLa humanas. Las células fueron incubadas durante 1 h y fijas y la bobina marcadora del cuerpo Cajal fue visualizada por inmunofluorescencia indirecta, mientras que los snRNA y el dextran, que sirve como marcador de inyección nuclear o citoplasmamática, se observaron directamente utilizando un microscopio de fluorescencia. Este método permite realizar pruebas eficientes y rápidas de cómo varias secuencias influyen en la localización del ARN dentro de las células. Aquí, mostramos la importancia de la secuencia de encuadernación Sm para la localización eficiente de los snRNAs en el cuerpo de Cajal.
Introduction
El empalme de ARN es uno de los pasos cruciales en la expresión génica, que es catalizado por un gran complejo de ribonucleoproteína llamado spliceosoma. En total, más de 150 proteínas y 5 pequeños ARN nucleares (snRNA) se integran en el espliceosoma en diferentes etapas de la vía de empalme. Los nmarendes U1, U2, U4, U5 y U6 participan en el empalme de los principales intrones GU-AG. Estos snRNAs se unen al spliceosoma como pequeñas partículas de ribonucleoproteína sinformato preformados (snRNPs) que contienen snRNA, siete proteínas Sm asociadas con el ARNs (o proteínas Like-Sm, que se asocian con el ARNS U6) y 1-12 proteínas específicas para cada snRNP.
El montaje de los snRNPs implica etapas citoplasmáticas y nucleares. El ARNN recién transcrito se exporta al citoplasma donde adquiere un anillo ensamblado a partir de siete proteínas Sm. El anillo Sm sirve posteriormente como señal para el ARN SnRNA re-importación de nuevo al núcleo. Los snRNA defectuosos que no se asocian con las proteínas Sm se retienen en el citoplasma1. Los snRNP recién importados aparecen por primera vez en el cuerpo de Cajal, dondese encuentran con proteínas específicas de snRNP y terminan su maduración (revisada en la referencia 2,3). Recientemente mostramos que la inhibición de los pasos finales de maduración resulta en el secuestro de snRNPs inmaduros en cuerpos Cajal4,5. Propusimos un modelo donde la maduración final de snRNP está bajo control de calidad que monitorea la adición de proteínas específicas de snRNP y la formación de snRNPs activos. Sin embargo, los detalles moleculares de cómo las células distinguen entre partículas maduras correctamente ensambladas y aberrantes inmaduras siguen siendo esquivas.
Para determinar las secuencias de ARNQue que son esenciales para la focalización y acumulación de ARNA en cuerpos nucleares de Cajal, decidimos emplear microinyección de snRNA etiquetados fluorescentemente. La microinyección fue un método de elección porque: 1) no requiere una etiqueta de secuencia adicional para distinguir los snRNA sintéticos forman sus homólogos endógenos, lo que es especialmente importante para ARN cortos con poco espacio para la inserción de secuencia de etiquetas adicionales; 2) permite el análisis de secuencias que son importantes para la biogénesis. Por ejemplo, la secuencia Sm es esencial para el montajedel anillo Sm y reimportar en el núcleo 6. Cuando los snRNA se expresan en la célula, los NMNAr que carecen de la secuencia de Sm se degradan en el citoplasma y no alcanzan el núcleo y los cuerpos de Cajal7. Sin embargo, los snRNA sin la secuencia Sm se pueden microinyectar directamente en el núcleo y, por lo tanto, se puede ensayar un papel potencial de la secuencia Sm en la localización del cuerpo de Cajal.
Aquí, describimos en detalle un método de microinyección que aplicamos para determinar las secuencias de ARNS necesarios para apuntar a los NMNm en el cuerpo de Cajal5. Mostramos que los sitios de unión Sm y SMN son juntos necesarios y suficientes para localizar no sólo los ARN de snRNA, sino varios ARN cortos no codificantes en el cuerpo de Cajal. Basándonos en la microinyección, así como en otras pruebas, propusimos que el anillo Sm ensamblado en el sitio de unión Sm sea la señal de localización del cuerpo Cajal.
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Protocol
1. Preparación de snRNAs para microinyección
- Preparar una plantilla de ADN que contenga la versión de longitud completa o truncada/mutada de snRNA por PCR utilizando una siguiente configuración de PCR: 98 oC para 60 s, 98 oC para 15 s, 68 oC para 30 s, 72 oC para 1 min, 98 oC para 15 s para 35x , y 72 oC durante 5 min.
- La imprimación delantera debe contener una secuencia promotora de la transcripción in vitro justo aguas arriba del primer nucleótido transcrito. Amplifique la secuencia de ARN U2 utilizando la imprimación delantera que contiene el promotor T7 y la imprimación inversa, que termina con el último nucleótido transcrito (ver Tabla de Materiales para más detalles).
- Sintetizar el ARNS utilizando un kit para la síntesis corta de ARN (ver Tabla de Materiales para más detalles) que contiene ARN t7 polimerasa. Añadir 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0.8 mM UTP, 0.2 mM UTP-Alexa488, 1.8 mM tapón de trimetilguanosina analógico (m32,2,7G(5')ppp(5')G), 1 mL de un inhibidor de ARN y 500-700 ng de la plantilla de ADN a la mezcla de reacción y la incubación a la noche a 37.
- Añadir 1 l (2U) de DNase en la reacción e incubar durante 15 min adicionales a 37 oC.
- Aislar el ARNN mediante la extracción ácida de fenol/cloroformo. Retirar la fase superior del agua y añadir 1/10 del volumen original de acetato de sodio de 3 M (pH a 5,2), 3 ml de glucógeno para una mejor visualización del pellet y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar durante 1 h a -80oC, centrífuga durante 10 min a 14.000 x g y 4oC.
- Lavar el pellet con 70% de etanol y disolver en 12 ml de agua libre de nucleasas. El rendimiento habitual del ARN era de alrededor de 600 ng/ml. Conservar a -80oC.
- Supervise la integridad de los snRNA transcritos in vitro mediante electroforeses de gel de agarosa.
- Antes de la microinyección, diluir el ARN hasta la concentración final 200 ng/ml en agua que contenga 10 g/l dextran-TRITC 70 kDa.
2. Células
- Antes del uso, tratar las cubiertas con 1 M HCl durante 1 h, lavar bien en agua destilada y almacenar en 100% etanol. El tratamiento ácido promueve la adhesión de las células para prevenir la descamación celular durante o después de la inyección. Para facilitar la identificación de las células inyectadas, utilice un cubreobjetos con una rejilla.
- Semilla HeLa u otras células adherentes 1 día antes de la microinyección en cubrepitos de 12 mm (n.o 1 o no. 1.5) para alcanzar el 50% de confluencia en el momento de la microinyección.
3. Inyección
NOTA: Las células de HeLa se inyectaron microinyectas en el medio de águila modificado de Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L de glucosa D que contiene rojo fenol y antibióticos). La inyección se llevó a cabo utilizando un inyector y un micromanipulador equipado con la aguja estéril (ver Tabla de Materiales para más detalles). Todo el sistema microscópico/micromanipulador se precalentaba a 37 oC durante al menos 4 h para evitar fluctuaciones de partes individuales del microscopio y del microinyector.
- Coloque el plato Petri (30 mm) que contiene 2 ml de medios de cultivo con el cubreobjetos en el centro en el soporte del microscopio. Cargue 3 ml de mezcla de ARN en la aguja utilizando un microcargador. Instale la aguja en el soporte del microinyector en 45o con respecto a la superficie de la placa Petri.
- Para encontrar la aguja, utilice un objetivo de larga distancia de 10x. En primer lugar, ajuste la velocidad COARSE en el inyector y baje la aguja hasta que toque el medio de cultivo. Usando los prismáticos del microscopio, encuentre el punto brillante, que es el lugar donde la aguja toca el medio de cultivo.
- Cambie la velocidad a FINE y baje aún más la aguja mientras mira en el microscopio hasta que se observe la punta de la aguja. Mueva la aguja en el medio del campo visual y cambie a un objetivo de larga distancia de 40x.
- Después de cambiar el objetivo, seleccione la celda y mueva la aguja por encima de esta celda. Establezca las presiones y el tiempo para el contacto de la célula (consulte Consejos y solución de problemas en la discusión).
- Mueva la aguja hacia abajo en la celda y luego establezca el límite inferior en el micromanipulador. Tenga cuidado de no mover la aguja debajo de la celda.
- Después de ajustar el límite inferior, mueva la aguja hacia atrás por encima de la celda y presione el botón de inyección en el joystick del inyector. La aguja se mueve automáticamente dentro de la célula hasta el lugar donde se establece el límite e inyecta la mezcla de ARN.
- Para finalizar, pulse el botón MENU del inyector y retire la aguja del soporte. A continuación, desconecte el tubo del inyector antes de apagar el inyector y el micromanipulador.
4. Fijación y tinción celular
- Después de la microinyección, vuelva a colocar las células en una incubadora de CO2 e incubar a 37 oC durante 1 h.
- Después de la incubación, enjuague las células tres veces con solución salina tamponada de fosfato (PBS) a temperatura ambiente, fijar durante 20 minutos con 4% de paraformaldehído en 0,1 M PIPES pH 6.9, y lavar tres veces con PBS a temperatura ambiente. Si solo se analiza la localización del ARNs, enjuague brevemente las células en agua y monte en un medio de montaje con DAPI.
- En caso de localización adicional de proteínas, permeabilizar las células con 0.5% Triton-X100 en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Después de tres enjuagues con PBS, incubar las células con anticuerpos primarios y secundarios y después de lavados finales en PBS y breve enjuague en agua, montar en un medio de montaje con DAPI.
5. Microscopía
- Si no se toma la imagen inmediatamente después del montaje, guarde las diapositivas a 4 oC hasta que se muestren imágenes.
- Adquiera imágenes utilizando un sistema microscópico de fluorescencia de alta gama equipado con un objetivo de inmersión (60X o 100x/1.4NA).
- Una vez identificadas las células microinyectadas, recoja una pila de 20 secciones z con pasos de 200 nm z por muestra y sujeto a desconvolución matemática. A continuación, se presentaron proyecciones máximas o pilas z individuales.
- Para cuantificar la señal fluorescente, dibuje región de interés (ROI) alrededor de un cuerpo Cajal identificado por inmunoinsero de bobina. Mida la intensidad de la señal snRNA en el ROI definido por bobina. A continuación, determinar la intensidad de la fluorescencia del ARNS en el ROI colocado aleatoriamente en el nucleoplasmo y calcular la relación de la señal de ARN en el cuerpo de Cajal y el nucleoplasmo.
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Representative Results
Para monitorear la localización de SnRNA y el papel del sitio de unión SM en la segmentación del cuerpo de Cajal, preparamos una plantilla de ADN que contiene el promotor T7 y el snRNA U2 de longitud completa o el snRNA U2 que carece de los siete nucleótidos (AUUUUUU) que forman el sitio de unión SM. los snRN fueron transcritos in vitro, aislados y mezclados con dextran-70kDa acoplado a TRITC. Hemos microinyectado la mezcla que contiene ARNn transcrito in vitro en el núcleo o el citoplasma de las células de HeLa.
Se ha demostrado previamente que el sitio de unión SM es necesario para la importación nuclear6. Para probar si el sitio Sm también es importante para la acumulación de cuerpo Cajal, microinyectamos snRNA que carece del sitio Sm directamente en el núcleo (Figura1A). Inyección en el citoplasma sirvió como control (Figura 1B). Como control positivo, microinyectamos snRNA de longitud completa(Figura1C,D). Después de 60 minutos de incubación en una incubadora de CO2, se fijaron las células microinyectadas y la bobina marcadora del cuerpo Cajal fue visualizada por inmunofluorescencia indirecta. El ARNS de longitud completa se acumuló en cuerpos Decajal después de inyecciones nucleares y citoplasmasmicas. Por el contrario, el ARNN que carecía del sitio Sm permaneció en el citoplasma después de la microinyección en este compartimiento, lo que es consistente con los hallazgos anteriores6. La microinyección nuclear de ARNS sin el sitio Sm reveló que la secuencia de unión Sm es importante para la localización del cuerpo de Cajal. El ARNU U2 que carecía del sitio Sm permaneció en el núcleo pero no se acumuló en cuerpos de Cajal (Figura1A).
A veces, la microinyección en un solo compartimiento celular falló y TRICT-dextran-70kDa se encontró tanto en el núcleo como en el citoplasma (Figura2A). Estas células fueron descartadas de un análisis posterior. A pesar del hecho de que los nmRNA con etiqueta fluorescente se almacenan a -80 oC antes de la inyección, puede producirse una degradación del ARN. El ARNN degradado inyectado en el citoplasma no se transporta al núcleo y permanece localizado en el citoplasma (Figura2B). Dicho ARN snRNA debe descartarse, y se debe sintetizar el nuevo ARNS.
Figura 1: Localización de los nmRAS inyectados microinyectados. Alexa488-etiquetado U2 snRNA ya sea carente del sitio Sm (A,B) o de longitud completa (C,D) fueron microinyectados en el citoplasma o el núcleo de las células HeLa. Los cuerpos de Cajal (flechas) están marcados por el inmunoetiquetado de bobina (rojo); los snRNAs están representados en verde. Dextran-TRITC-70kDa (amarillo) se utilizó para monitorear la inyección nuclear o citoplasmática; El ADN fue manchado por DAPI (azul). Las puntas de flecha marcan la localización citoplasmática del ARNS SnRNA. Barra de escala a 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Un posible escollo del enfoque de la microinyección. (A) La microinyección en un compartimiento falló y el ARNWT U2 fue microinyectado tanto en el citoplasma como en el núcleo. Tenga en cuenta que Dextran-TRITC-70kDa (amarillo) está presente en ambos compartimentos celulares. (B) EL arNM WT U2 fue microinyectado en el citoplasma de las células de HeLa (verde), pero se mantuvo una cantidad significativa de ARNN en el citoplasma (puntas de flecha), lo que indica la degradación parcial del ARNs NMNm inyectado y una pérdida del sitio de unión SM. Los cuerpos de Cajal (flechas) están marcados por el inmunoetiquetado de bobina (rojo). El ADN fue manchado por DAPI (azul). Barra de escala a 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Empleamos microinyección de NMNM con etiqueta fluorescente para determinar secuencias importantes para la localización de ARNEnS en cuerpos nucleares de Cajal. Debido a la preparación rápida y bastante simple de ARN etiquetados (preparación de la plantilla de ADN por PCR seguida de transcripción in vitro), el método ofrece un análisis eficaz de cómo varias secuencias contribuyen a la localización del ARN. En relativamente poco tiempo, pudimos analizar diez eliminaciones o sustituciones diferentes del ARNU U2 (referencia5 y datos no mostrados). Para los ARN con una vía de biogénesis compleja, este enfoque también permite secuencias de prueba que son esenciales para la maduración. En el caso de los snRNAs, la eliminación de secuencias de enlace Sm, que son necesarias para el ensamblaje del anillo Sm, da como resultado el secuestro y la degradación de los snRNA mutados en el citoplasma7. Otros ventajosos incluyen que dos ARN etiquetados de manera diferente se pueden inyectar simultáneamente y su localización directamente en comparación dentro de una celda. Sin embargo, como varios fluorocromos podrían modificar el comportamiento del ARN, cada fluorocromo debe probarse individualmente antes de los experimentos de doble etiquetado. Los ARN de varios cientos de nucleótidos de longitud se han inyectado con éxitoy su localización se ha analizado en varios sistemas de modelos (revisado según la referencia 8). El paso limitante en caso de ARN más largos suele ser la síntesis in vitro de ARN de longitud completa. Además, la inyección de ARN con proteínas preensambladas se puede aplicar para probar el efecto de las proteínas individuales en la localización de RNP. En nuestros proyectos, inyectamos el ARNN asociado con las proteínas Sm paraconfirmar el papel del anillo Sm en la localización del cuerpo de Cajal 5. Por último, la microinyección de ARN con etiqueta fluorescente permite la cuantificación directasin ningún paso adicional, como se ha aplicado previamente para los snRNA 9.
También hay varias desventajas de los métodos que deben tenerse en cuenta antes de lanzar un proyecto de microinyección. En primer lugar, a pesar de alguna automatización del proceso de microinyección, el método todavía requiere habilidades manuales y experiencia, y los investigadores deben considerar el tiempo necesario para la formación. Las partes críticas del protocolo son la preparación de ARN intactos, microinyección y luego encontrar células inyectadas en el microscopio (ver Consejos y Solución de problemas a continuación). En segundo lugar, la microinyección representa un estrés significativo y muchas células no sobreviven durante un período de tiempo más largo. Si bien hay algunos intentos exitosos de seguir los ARN microinyectados dentro de las células por imágenes de células vivas10,observamos un aumento significativo de la muerte celular cuando combinamos la microinyección con la imagen de células vivas mediante microscopía de fluorescencia. En tercer lugar, la cantidad de ARN inyectado en las células humanas es muy baja, lo que impide el análisis bioquímico de los ARN inyectados. Esto también significa que es difícil monitorear cómo la incorporación de nucleótidos etiquetados fluorescentemente afecta las funciones de ARN. Por lo tanto, varias relaciones de NTP:NTP etiquetado deben incorporarse en el ARN de tipo salvaje y su localización ensayada para obtener la relación ideal entre la señal de fluorescencia y la funcionalidad del ARN etiquetado. Además, la naturaleza del fluorocromo podría afectar la localización del ARN. En nuestras manos, Alexa488-UTP funcionó mucho mejor que Alexa546-UTP. No hemos explorado estas diferencias más, pero una razón podría ser un tamaño más grande y diferente forma de Alexa546 en comparación con Alexa488.
Tomando juntos, la microinyección de ARN es un método poderoso para la localización del ARN, pero siempre debe combinarse con enfoques alternativos. En nuestro caso, introdujimos con éxito el sitio de enlace MS2 en el ARNNU U2, monitoreamos su localización usando MS2-YFP y confirmamos algunos resultados clave obtenidos por microinyección de ARN snRNA con el sistema MS25.
Consejos y solución de problemas
La presión de inyección, la presión de compensación y el tiempo de inyección deben determinarse experimentalmente para cada línea celular. Aplicamos presión de inyección (Pi) 170 hPa y presión de compensación (Pc) 50 hPa en el caso de microinyección citoplasmática y Pi-200 hPa y Pc-80 hPa en el caso de microinyección nuclear. El tiempo de inyección se estableció en ambos casos en 0,2 s. A veces se puede observar un ligero movimiento de material dentro de la célula, que es una indicación de una inyección exitosa. Si la célula estalla, usted tiene que disminuir la presión de inyección. También debe comprobar la presión de compensación a través del canal de fluorescencia TRITC. Cuando vea la corriente fuerte que sale de la punta de la aguja, entonces disminuya la presión de compensación.
Entre inyecciones, compruebe siempre si las células se inyectan correctamente. Identifique las células microinyectadas a través de Dextran-TRITC inyectado utilizando el canal de fluorescencia TRITC. Si no ve ninguna célula microinyectada, primero aumente la presión de inyección y el tiempo de inyección. En segundo lugar, compruebe si la aguja no está enchufada a través del canal de fluorescencia (TRITC). Si ve Dextran-TRITC fluyendo débilmente desde la punta de la aguja, entonces la aguja es funcional, y el problema es probable en el ajuste del límite inferior para la inyección. La configuración del límite es un paso muy complicado e importante. Cada célula tiene una forma diferente y usted cambiará el límite muy a menudo para asegurar la microinyección adecuada.
En el caso ideal, uno debe ser capaz de microinyectar 50 células antes de que la punta de la aguja se enchufe con un residuo celular. Compruebe si la fluorescencia sale de la punta regularmente, y si no ve ninguna transmisión de Dextran-TRITC desde la punta, entonces la aguja está bloqueada. Para limpiarlo, sostenga el botón CLEAN en el inyector durante 3 s, lo que aumenta la presión y debe eliminar el bloque. Si no ayuda, entonces usted podría tratar de romper la punta de la aguja golpeando la parte inferior de la placa Petri. Sin embargo, este es un procedimiento muy complicado, que requiere una cantidad significativa de experiencia y no hay garantía de éxito. Por lo tanto, para los principiantes, el intercambio de agujas es aconsejable.
Antes de cambiar la aguja, pulse el botón MENU del inyector. Tome la aguja un poco hacia arriba y presione HOME en el micromanipulador. La aguja irá hasta el final desde el medio, pero el micromanipulador recuerda la posición original de la aguja y no es necesario encontrar la aguja de nuevo. Cuando se reemplaza la aguja, presione el botón HOME y la aguja irá a la posición original y usted debe ser capaz de ver la punta de la aguja en el microscopio. Después de cambiar la aguja, usted tiene que ajustar el límite. A continuación, vuelva a pulsar el botón MENU en el inyector y la aguja está preparada para la microinyección.
Durante la toma de imágenes, la parte más difícil es encontrar las células microinyectadas. Para localizarlos, utilice el canal TRITC, donde el Dextran-70kDa conjugado por TRITC es mucho mejor visible que una señal Alexa488 débil de los snRNA inyectados por microinyectas. Los cubreobjetos con una rejilla son útiles aquí.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Checa de la Ciencia (18-10035S), el Programa Nacional de Sostenibilidad I (LO1419), el apoyo institucional (RVO68378050), el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) y la Agencia de Subvenciones de Universidad Charles (GAUK 134516). Además, reconocemos el Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, República Checa (apoyado por subvenciones (Checo-Bioimagen - LM2015062).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
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