Summary
التكوين الحيوي للsnRNAs snRNAs spliceosomal هي عملية معقدة تنطوي على مختلف المقصورات الخلوية. هنا، وظفنا الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت من أجل رصد نقلها داخل الخلية.
Abstract
التكوين الحيوي للsnRNAs snRNAs snrnas هي عملية معقدة تنطوي على كل من المراحل النووية والسيتوبلازمية والخطوة الأخيرة تحدث في مقصورة نووية تسمى هيئة كاجال. ومع ذلك، فإن التسلسلات التي توجه توطين snRNA إلى هذا الهيكل دون النووي لم تكن معروفة حتى وقت قريب. لتحديد تسلسل مهم لتراكم snRNAs في أجسام Cajal، وظفنا الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت تليها توطينها داخل الخلايا. أولا، قمنا بإعداد snRNA حذف المسوخ، توليفها قوالب الحمض النووي للنسخ في المختبر وsnRNAs مسجلة في وجود UTP إلى جانب Alexa488. تم خلط snRNAs وصفت مع 70 kDa-Dextran مترافقة مع TRITC، وحقنها بميكروين في النواة أو السيتوبلازم من خلايا HeLa البشرية. تم احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة وثابتة، وكان تصور اللفائف علامة الجسم Cajal من قبل الفلورة المناعية غير المباشرة، في حين snRNAs وdextran، الذي يعمل كعلامة على الحقن النووي أو السيتوبلازم، لوحظ مباشرة باستخدام المجهر الفلورية. يسمح هذا الأسلوب لاختبار فعال وسريع لكيفية تأثير تسلسلات مختلفة على توطين RNA داخل الخلايا. هنا، نبين أهمية تسلسل SM ملزمة لتوطين كفاءة snRNAs في الجسم Cajal.
Introduction
ربط الحمض النووي الريبي هو واحد من الخطوات الحاسمة في التعبير الجيني، الذي يحفزه مجمع ريبونوكليوبروتين كبير يسمى spliceosome. في المجموع، يتم دمج أكثر من 150 بروتين و 5 RNAs النووية الصغيرة (snRNAs) في spliceosome في مراحل مختلفة من مسار الربط. U1، U2، U4، U5 و U6 snRNAs تشارك في الربط من الإنترونات GU-AG الرئيسية. هذه snRNAs الانضمام إلى spliceosome كما شكلت مسبقا جزيئات ريبونوكليوبروتين النووية الصغيرة (snRNPs) التي تحتوي على snRNA, سبعة البروتينات SM المرتبطة snRNA (أو البروتينات مثل SM, التي ترتبط مع SnRNA U6) و 1-12 البروتينات المحددة لكل snRNP.
تجميع snRNPs ينطوي على مراحل السيتوبلازمية والنووية. يتم تصدير snRNA المكتوبة حديثا إلى السيتوبلازم حيث يكتسب حلقة تجميعها من سبعة بروتينات SM. حلقة SM في وقت لاحق بمثابة إشارة لإعادة استيراد snRNA مرة أخرى إلى النواة. يتم الاحتفاظ snRNAs المعيبة التي تفشل في الارتباط مع البروتينات SM في السيتوبلازم1. تظهر الـ snRNPs المستوردة حديثًا لأول مرة في جسم Cajal حيث تلتقي بالبروتينات الخاصة بالsnRNP وتنهي نضجها (تم استعراضها في المرجع2و3). أظهرنا مؤخرا أن تثبيط خطوات النضج النهائي يؤدي إلى عزل snRNPs غير ناضجة في الهيئات Cajal4،5. اقترحنا نموذجا حيث النضج snRNP النهائي هو تحت مراقبة الجودة التي تراقب إضافة البروتينات الخاصة snRNP وتشكيل snRNPs النشطة. ومع ذلك، فإن التفاصيل الجزيئية لكيفية تمييز الخلايا بين الجسيمات الناضجة والشاذة غير الناضجة التي تم تجميعها بشكل صحيح لا تزال بعيدة المنال.
لتحديد تسلسل snRNA التي هي ضرورية لاستهداف وتراكم snRNAs في الهيئات كاجال النووية، قررنا استخدام الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت. وكان الحقن المجهري طريقة للاختيار لأنه: 1) أنها لا تتطلب علامة تسلسل إضافية للتمييز snRNAs الاصطناعية تشكل نظرائهم الذاتية وهو أمر مهم بشكل خاص لRNAs قصيرة مع مساحة صغيرة لإدراج تسلسل علامة إضافية; 2) فإنه يسمح بتحليل التسلسلات التي هي مهمة للتكوين الحيوي. على سبيل المثال، تسلسل SM ضروري لتجميع حلقة SM وإعادة الاستيراد إلى النواة6. عندما يتم التعبير عن snRNAs في الخلية ، يتم تدهور snRNAs تفتقر إلى تسلسل SM في السيتوبلازم ولا تصل إلى النواة والهيئات Cajal7. مهما, [سنّن] دون ال [سم] تسلسل يستطيع كنت مباشرة [ميكرونّد] داخل النواة ولذلك دور ممكنة من ال [سم] تسلسل في [كجل] جسم توطين يُسَرَّب.
هنا، ونحن نصف بالتفصيل طريقة الحقن المجهري التي طبقناها لتحديد تسلسل snRNA اللازمة لاستهداف snRNAs في الجسم Cajal5. أظهرنا أن SM وSMN مواقع ملزمة ضرورية وكافية لتوطين ليس فقط snRNAs ولكن مختلف قصيرة غير الترميز RNAs في الجسم Cajal. استنادا ً إلى الحقن المجهري بالإضافة إلى أدلة أخرى، اقترحنا أن حلقة SM تجميعها على موقع الربط SM هو إشارة توطين الجسم Cajal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد snRNAs للحقن الدقيق
- إعداد قالب الحمض النووي الذي يحتوي على إصدار كامل الطول أو مقتطع/متحول من snRNA بواسطة PCR باستخدام إعداد PCR التالي: 98 درجة مئوية لـ 60 درجة مئوية، 98 درجة مئوية لمدة 15 ق، 68 درجة مئوية لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 98 درجة مئوية لمدة 15 درجة مئوية لمدة 35 درجة مئوية لمدة 35 درجة مئوية ، و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- يجب أن يحتوي التمهيدي إلى الأمام على تسلسل المروج للنسخ في المختبر فقط المنبع من النيوكليوتيد اتّبع أول. تضخيم تسلسل SnRNA U2 باستخدام التمهيدي إلى الأمام التي تحتوي على المروج T7 والتمهيدي العكسي، الذي ينتهي مع النيوكليوتيد المكتوب الأخير (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل).
- توليف snRNA باستخدام مجموعة لتوليف RNA قصيرة (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) التي تحتوي على T7 RNA بولميراز. إضافة 1 M ATP، 1 M CTP، 1 m م GTP، 0.8 mM UTP، 0.2 m UTP-Alexa488، 1.8 mtrimethylguanosine كاب التناظرية (m32،2،7G (5')ppp(5')G)، 1 مل من الحمض النووي الريبي المانع و 500-700 نانوغرام من قالب الحمض النووي لخليط التفاعل والحضانة في 37 درجة مئوية.
- إضافة 1 μL (2U) من DNase في رد الفعل والحضانة لمدة 15 دقيقة إضافية عند 37 درجة مئوية.
- عزل snRNA عن طريق استخراج الفينول الحمضية / الكلوروفورم. إزالة مرحلة المياه العليا وإضافة 1/10 من الحجم الأصلي من خلات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة = 5.2)، 3 ميكرولتر من الجليكوجين لتحسين التصور بيليه و 2.5 كميات من الإيثانول 100٪. حضانة لمدة 1 ساعة في -80 درجة مئوية، الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 14،000 × ز و 4 درجة مئوية.
- غسل بيليه مع الإيثانول 70٪ وتذوب في 12 درجة مئوية من المياه الخالية من النوكل. وكان العائد المعتاد لالحمض النووي الريبي حوالي 600 نانوغرام/مل. تخزين في -80 درجة مئوية.
- رصد سلامة snRNAs في المختبر من قبل الكهربائي هلام أغاروز.
- قبل الحقن المجهري، تخفيف الحمض النووي الريبي إلى التركيز النهائي 200 نانوغرام / مل في الماء الذي يحتوي على 10 ميكروغرام / ميكرولتر dextran-TRITC 70 كيلودا.
2. الخلايا
- قبل الاستخدام، علاج الأغطية مع 1 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 1 ساعة، وغسل جيدا في الماء المقطر وتخزينها في الإيثانول 100٪. العلاج الحمضي يعزز تصاق الخلايا لمنع تقشير الخلايا أثناء أو بعد الحقن. لتسهيل التعرف على الخلايا المحقونة، استخدم غطاء مع شبكة.
- بذور HeLa أو غيرها من الخلايا الملتصقة 1 يوم قبل الحقن المجهري على الأغطية 12 ملم (رقم 1 أو رقم 1.5) للوصول إلى 50٪ الملاءمة في وقت الحقن المجهري.
3. حقن
ملاحظة: تم حقن خلايا HeLa الدقيقة في وسيط النسر المعدل في دولبيكو (D-MEM، 4.5 غرام / لتر D-الجلوكوز التي تحتوي على الفينول الأحمر والمضادات الحيوية). تم الحقن باستخدام حاقن وميكرومنبولاتور مجهزة بإبرة معقمة (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). تم تسخين نظام المتلاعب المجهري/المجهري بأكمله إلى 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة على الأقل لمنع تقلب الأجزاء الفردية من المجهر والحقن الدقيق.
- وضع طبق بيتري (30 ملم) التي تحتوي على 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة مع غطاء في الوسط في حامل المجهر. تحميل 3 ميكرولتر من خليط snRNA في الإبرة باستخدام محمل صغير. تثبيت الإبرة في حامل الحاقن الصغير في 45 درجة فيما يتعلق بسطح طبق بيتري.
- للعثور على الإبرة، استخدم هدف المسافة الطويلة 10x. أولا، تعيين سرعة الخشنة على حاقن وخفض الإبرة حتى يمس وسط الثقافة. باستخدام مناظير المجهر، والعثور على بقعة مشرقة، وهو المكان الذي تلمس الإبرة وسط الثقافة.
- تغيير السرعة إلى FINE ومزيد من خفض الإبرة أثناء النظر في المجهر حتى يتم ملاحظة غيض من الإبرة. نقل الإبرة في منتصف المجال البصري والتبديل إلى هدف مسافة طويلة 40X.
- بعد تغيير الهدف، حدد الخلية ونقل الإبرة فوق هذه الخلية. تعيين الضغوط والوقت لجهة اتصال الخلية (راجع تلميحات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في المناقشة).
- نقل الإبرة إلى أسفل في الخلية ومن ثم تعيين الحد الأدنى على micromanipulator. يجب الحرص على عدم تحريك الإبرة تحت الخلية.
- بعد تعيين الحد الأدنى، حرك الإبرة مرة أخرى فوق الخلية واضغط على زر الحقن على عصا التحكم في حاقن. الإبرة تتحرك تلقائيا داخل الخلية إلى المكان حيث يتم تعيين الحد وحقن خليط RNA.
- لإنهاء، اضغط على زر MENU على حاقن وإزالة الإبرة من حامل. ثم قطع الأنبوب عن حاقن قبل إيقاف عن طريق الحقن وmicromanipulator.
4. تثبيت الخلية وتلطيخ
- بعد الحقن المجهري، والعودة الخلايا في حاضنة CO2 وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- بعد الحضانة، شطف الخلايا ثلاث مرات مع الفوسفات المخزنة محلول ملحي (PBS) في درجة حرارة الغرفة، وإصلاح لمدة 20 دقيقة مع 4٪ paraformaldehyde في 0.1 M الأنابيب درجة الحموضة 6.9، وغسل ثلاث مرات مع درجة حرارة الغرفة PBS. إذا تم تحليل توطين snRNA فقط، شطف الخلايا لفترة وجيزة في الماء وجبل في وسط تصاعد مع DAPI.
- في حالة توطين البروتين إضافية، نفاذية الخلايا مع 0.5٪ تريتون-X100 في PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاثة شطف مع PBS، حضانة الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية وبعد الغسل النهائي في PBS وشطف قصيرة في الماء، جبل في وسط تصاعد مع DAPI.
5. الفحص المجهري
- إذا لم يتم تصويرها مباشرة بعد التركيب، قم بتخزين الشرائح عند درجة حرارة 4 درجة مئوية حتى التصوير.
- الحصول على الصور باستخدام نظام مجهري الفلورة الراقية مجهزة بهدف الغمر (60X أو 100x/1.4NA).
- مرة واحدة يتم تحديد الخلايا الدقيقة، وجمع كومة من 20 z-المقاطع مع 200 نانومتر ز الخطوات لكل عينة وتخضع للdeconvolution الرياضية. ثم قُدمت إسقاطات قصوى أو أكوام z فردية.
- لتحديد إشارة الفلورسنت، ارسم منطقة الاهتمام حول جسم كاجال الذي تم تحديده بواسطة تلطيخ المناعة من اللفائفي. قياس شدة إشارة snRNA في عائد الاستثمار تعريف اللفائف. بعد ذلك تحديد شدة الفلورة snRNA في ROI وضعت عشوائيا في النيوكليوبلازما وحساب نسبة إشارة الحمض النووي الريبي في الجسم Cajal والنيوكليوبلاسما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لمراقبة توطين snRNA ودور موقع الربط SM في استهداف الجسم Cajal، قمنا بإعداد قالب الحمض النووي الذي يحتوي على المروج T7 وإما كامل طول U2 snRNA أو U2 snRNA تفتقر إلى النيوكليوتيدات السبعة (AUUUUUG) تشكيل موقع الربط SM. [سنّرنا] كان في مختبرة منقولة, يعزل ويمزج مع [تريستك]-يضمّ [دإكسترن-70كد]. قمنا بحقن الخليط الذي يحتوي على الكنانة المنقولة في المختبر في النواة أو السيتوبلازم من خلايا HeLa.
وقد تبين من قبل أن موقع SM ملزمة ضروري للاستيراد النووي6. لاختبار ما إذا كان موقع SM مهم أيضا لتراكم الجسم Cajal، ونحن microinjected snRNA تفتقر إلى موقع SM مباشرة في النواة (الشكل1A). حقن في السيتوبلازم بمثابة عنصر تحكم (الشكل1B). كسيطرة إيجابية، ونحن microinjected كامل طول snRNA(الشكل1C،D). بعد 60 دقيقة من الحضانة في حاضنة CO 2، تم إصلاح الخلايا الدقيقة وتصور كجال الجسم علامة اللفائفي من قبل الفلورة المناعية غير المباشرة. ال [فولّ-لنغث] [سنرنا] يكدّس في [كجل] أجسام بعد على حدّ سواء نوويّة وحقن [سيتوبلازميك]. وعلى النقيض من ذلك، بقي snRNA تفتقر إلى موقع SM في السيتوبلازم بعد الحقن المجهري في هذه المقصورة، وهو ما يتفق مع النتائج السابقة6. كشف الحقن المجهري النووي للسنرنا دون موقع SM أن تسلسل SM ملزمة مهم لتوطين الجسم Cajal. [أو2] [سنرنا] يفتقر ال [سم] بقي موقعة في النواة غير أنّ لم يكدّس في [كجل] أجسام (شكل1[ا]).
في بعض الأحيان، فشل الحقن المجهري في مقصورة خلوية واحدة فقط وتم العثور على TRICT-dextran-70kDa في كل من النواة والسيتوبلازم (الشكل2A). تم التخلص من هذه الخلايا من مزيد من التحليل. على الرغم من حقيقة أن يتم تخزين snRNAs وصفت الفلورسنت في -80 درجة مئوية قبل الحقن، يمكن أن يحدث تدهور الحمض النووي الريبي. لا يتم نقل snRNA المتدهورة التي يتم حقنها في السيتوبلازم في النواة ويبقى مترجمة في السيتوبلازم (الشكل2B). وينبغي التخلص من هذه الرنا، وينبغي توليف snRNA جديدة.
الشكل 1: توطين السنراة الدقيقة. Alexa488-labelled U2 snRNA إما تفتقرإلى موقع SM (A,B)أو كامل طول (C,D)تم حقنها بالميكروين في السيتوبلازم أو نواة خلايا HeLa. يتم وضع علامة على أجسام الكاجال (الأسهم) من قبل اللفائفية مناعية (أحمر)؛ يتم تصوير snRNAs باللون الأخضر. تم استخدام Dextran-TRITC-70kDa (أصفر) لرصد الحقن النووي أو السيتوبلازميك. تم تلوين الحمض النووي من قبل DAPI (الأزرق). [أروهيدس] علامات توطين [ستوبلازميك] من [سنرنا]. شريط مقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عثرة محتملة لنهج الحقن الدقيق. (أ) فشل الحقن المجهري في مقصورة واحدة وWT U2 snRNA تم حقنه بالميكروين في كل من السيتوبلازم والنواة. لاحظ أن Dextran-TRITC-70kDa (أصفر) موجود في كل من المقصورات الخلوية. (B) تم حقن السيتورنا WT U2 في السيتوبلازم من خلايا HeLa (الأخضر) ولكن بقي كمية كبيرة من snRNA في السيتوبلازم (رؤوس الأسهم)، مما يشير إلى تدهور جزئي من snRNA حقن وفقدان موقع الربط SM. يتم وضع علامة على أجسام الكاجال (الأسهم) من قبل اللفائفية مناعية (حمراء). تم تلوين الحمض النووي من قبل DAPI (الأزرق). شريط مقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد استخدمنا الحقن الدقيق للسنRNAs التي تحمل علامة الفلورسنت لتحديد التسلسلات الهامة لتوطين الرنا في أجسام كاجال النووية. نظرًا لإعداد RNAs المسمى بسرعة وبساطة (إعداد قالب الحمض النووي من قبل PCR متبوعاً بالنسخ في المختبر) تقدم الطريقة تحليلاً فعالاً لكيفية مساهمة التسلسلات المختلفة في توطين الحمض النووي الريبي. في وقت قصير نسبيا، كنا قادرين على تحليل عشرة عمليات حذف أو استبدال مختلفة من SnRNA U2 (المرجع5 والبيانات لم تظهر). وبالنسبة لـ RNAs ذات مسار تكوين حيوي معقد، يسمح هذا النهج أيضًا بتسلسلات الاختبار الضرورية للنضج. في حالة snRNAs، يؤدي حذف تسلسلات الربط SM، المطلوبة لتجميع حلقة SM في عزل وتدهور snRNAs المتحولة في السيتوبلازم7. ومن المزايا الأخرى أنه يمكن حقن اثنين من الـ RNAs يحملان علامات مختلفة في وقت واحد وتوطينهما مقارنة مباشرة داخل خلية واحدة. ومع ذلك، كما قد الفلوروكرومات مختلفة تعديل سلوك الحمض النووي الريبي، يجب اختبار كل فلوروكروم الفردية قبل تجارب وضع العلامات المزدوجة. وقد تم حقن RNAs من عدة مئات من النيوكليوتيدات في الطول بنجاحوتوطينها مُسْنسفي في مختلف النظم النموذجية (تم استعراضها في المرجع 8). الخطوة الحد في حالة أطول RNAs عادة في التوليف في المختبر من RNA كامل الطول. أيضا، يمكن تطبيق حقن RNAs مع البروتينات التي تم تجميعها مسبقا لاختبار تأثير البروتينات الفردية على توطين RNP. في مشاريعنا، حقننا snRNA المرتبطة SM البروتينات لتأكيد دور حلقة SM في كاجال توطين الجسم5. وأخيراً، يسمح الحقن المجهري لـ RNAs التي تحمل علامة فلورية بالقياس الكميالمباشر دون أي خطوات إضافية، كما سبق تطبيقها على snRNAs 9.
وهناك أيضا العديد من العيوب من الأساليب التي ينبغي النظر فيها قبل إطلاق مشروع الحقن المجهري. أولا، على الرغم من بعض أتمتة عملية الحقن المجهري، لا تزال الطريقة تتطلب مهارات يدوية والخبرة، وينبغي للباحثين النظر في الوقت اللازم للتدريب. الأجزاء الحرجة من البروتوكول هي إعداد RNAs سليمة، الحقن الدقيق ومن ثم العثور على الخلايا المحقونة في المجهر (انظر نصائح واستكشاف الأخطاء وإصلاحها أدناه). ثانيا، يمثل الحقن المجهري إجهادًا كبيرًا ولا تبقى العديد من الخلايا على قيد الحياة لفترة أطول من الزمن. في حين أن هناك بعض المحاولات الناجحة لمتابعة RNAs microinjected داخل الخلايا عن طريق التصوير بالخلايا الحية10، لاحظنا زيادة كبيرة في موت الخلايا عندما جمعنا الحقن المجهري مع التصوير بالخلايا الحية باستخدام الفحص المجهري الفلوري. ثالثا، كمية الحمض النووي الريبي المحقون في الخلايا البشرية منخفضة جدا مما يمنع التحليل البيوكيميائي للRNAs عن طريق الحقن. وهذا يعني أيضا أنه من الصعب رصد كيفية إدراج النيوكليوتيدات التي تحمل علامة فلورية يؤثر على وظائف الحمض النووي الريبي. ولذلك، ينبغي إدراج نسب مختلفة من NTP المسمى: NTP في الحمض النووي الريبي البري من النوع وتوطينه سيد للحصول على نسبة مثالية بين إشارة الفلورة ووظيفة RNA المسمى. أيضا، قد تؤثر طبيعة الفلوروكروم على توطين الحمض النووي الريبي. في أيدينا، عملت Alexa488-UTP أفضل بكثير من Alexa546-UTP. نحن لم تستكشف هذه الاختلافات أي أبعد من ذلك، ولكن يمكن أن يكون سبب واحد أكبر حجم وشكل مختلف من Alexa546 بالمقارنة مع Alexa488.
مع الأخذ معا, حقن الحمض النووي الريبي هو وسيلة قوية لتوطين الحمض النووي الريبي ولكن ينبغي دائما أن تكون جنبا إلى جنب مع النهج البديلة. في حالتنا، قدمنا بنجاح موقع MS2 ملزمة في U2 snRNA، ورصد توطينها باستخدام MS2-YFP وأكد بعض النتائجالرئيسية التي تم الحصول عليها عن طريق الحقن المجهري snRNA مع نظام MS2 5.
تلميحات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
ضغط الحقن، ضغط التعويض ووقت الحقن تحتاج إلى تحديد تجريبي لكل خط الخلية. طبقنا ضغط الحقن (بي) 170 hPa وضغط التعويض (PC) 50 hPa في حالة الحقن المجهري السيتوبلازمي وPi = 200 hPa وPc = 80 hPa في حالة الحقن المجهري النووي. وكان وقت الحقن في كلتا الحالتين تعيين إلى 0.2 s. يمكنك في بعض الأحيان مراقبة حركة طفيفة من المواد داخل الخلية، وهو مؤشر على حقن ناجحة. إذا انفجرت الخلية، عليك تقليل ضغط الحقن. يجب عليك أيضا التحقق من ضغط التعويض عن طريق قناة الفلورة TRITC. عندما ترى تيار قوي يخرج من طرف الإبرة، ثم تقليل ضغط التعويض.
بين الحقن، تحقق دائما ما إذا كان يتم حقن الخلايا بنجاح. تحديد الخلايا المحقونة عن طريق حقن Dextran-TRITC باستخدام قناة الفلورة TRITC. إذا كنت لا ترى أي خلايا حقن ميكروين، أولا زيادة ضغط الحقن ووقت الحقن. ثانياً، تحقق مما إذا كان الإبرة غير موصول عبر قناة الفلورة (TRITC). إذا كنت ترى Dextran-TRITC يتدفقون بشكل ضعيف من طرف الإبرة، ثم الإبرة وظيفية، والمشكلة من المرجح في وضع الحد الأدنى للحقن. إن تحديد الحد هو خطوة صعبة وهامة للغاية. كل خلية لها شكل مختلف، وسوف لتغيير الحد في كثير من الأحيان لضمان الحقن المجهري السليم.
في الحالة المثالية، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على حقن ميكرون ~ 50 خلية قبل توصيل طرف الإبرة مع حطام الخلية. تحقق مما إذا كان الفلورة يخرج من طرف بانتظام، وإذا كنت لا ترى أي Dextran-TRITC يتدفقون من طرف، ثم يتم حظر الإبرة. لتنظيفه، اضغط على زر CLEAN على حاقن لمدة 3 ق، مما يزيد من الضغط وينبغي إزالة كتلة. إذا كان لا يساعد، ثم هل يمكن أن تحاول كسر غيض من الإبرة عن طريق ضرب الجزء السفلي من طبق بيتري. ومع ذلك، هذا إجراء صعب جدا، الأمر الذي يتطلب قدرا كبيرا من الخبرة وليس هناك ضمان للنجاح. لذلك، للمبتدئين، وتبادل إبرة من المستحسن.
قبل تبادل الإبرة، اضغط على زر MENU على حاقن. خذ الإبرة قليلا ً واضغط على المنزل على المتلاعب ة الدقيقة. الإبرة سوف تذهب على طول الطريق حتى من المتوسط، ولكن micromanipulator يتذكر الموقف الأصلي للإبرة وأنت لا تحتاج إلى العثور على الإبرة مرة أخرى. عندما يتم استبدال الإبرة، اضغط على زر HOME وسوف تذهب الإبرة إلى الوضع الأصلي ويجب أن تكون قادرة على رؤية غيض من الإبرة في المجهر. بعد تغيير الإبرة، لديك لضبط الحد. ثم، اضغط على زر MENU على حاقن مرة أخرى ويتم إعداد الإبرة للحقن الدقيق.
أثناء التصوير، الجزء الأكثر صعوبة هو العثور على الخلايا الدقيقة. لتحديد موقعلهم، استخدم قناة TRITC، حيث Dextran-70kDa TRITC-مترافق هو أفضل بكثير مرئية من إشارة Alexa488 ضعيفة من snRNAs حقن ميكرون. الأغطية مع شبكة مفيدة هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعمت هذا العمل مؤسسة العلوم التشيكية (18-10035S)، والبرنامج الوطني للاستدامة الأول (LO1419)، والدعم المؤسسي (RVO68378050)، والصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) ووكالة المنح التابعة لمنظمة الأمم المتحدة للتنمية الاجتماعية ومنطقة البحر الصناعي. جامعة تشارلز (GAUK 134516). كما نعترف بالمرفق الأساسي للميكروسكوب الخفيف، IMG CAS، براغ، الجمهورية التشيكية (بدعم من المنح (Czech-Bioimaging - LM2015062).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
- Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
- Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits. RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).
- Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
- Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
- Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).
- Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).
- Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).
- Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
