Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

미세 바늘 흡인에 의해 혈관 외 Trypanosoma 기생충의 검출

doi: 10.3791/59798 Published: August 7, 2019

Summary

미세 한 바늘 흡인 은 얇은 바늘을 사용하여 병변 이나 장기에서 세포를 수득 하는 기술이다. 흡인 물질은 진단을 위해 현미경으로 얼룩지고, 염색되고 검사되거나 분자 생물학, 세포 분석 또는 시험관 내 분석에 사용됩니다. 그것은 저렴하고 간단하며 빠르며 최소한의 외상을 일으킵니다.

Abstract

정밀 한 바늘 흡인 (FNA) 의료 및 수의학 관행모두에 필수적인 일상적인 진단 절차. 그것은 정맥 천자에 사용되는 일반 바늘과 유사한 얇은 바늘을 사용하여 만져 볼 수있는 덩어리, 장기 또는 삼출물 (체내에 유체 축적)에서 세포 및 / 또는 미생물의 경피적 인 흡인으로 구성됩니다. FNA에 의해 수집된 물질은 일반적으로 고도로 세포적이며, 회수된 흡인은 다음 번지, 공기 건조, 젖은 고정, 염색 및 현미경하에서 관찰된다. 임상 맥락에서, FNA는 적절한 치료 관리에 대한 가이드 역할을하는 중요한 진단 도구입니다. 그것은 간단 하기 때문에, 빠른, 최소 침습 하 고 실험실 및 인적 자원에 제한 된 투자를 필요 하기 때문에, 그것은 광범위 하 게 수의학 실무자에 의해 사용, 주로 국내에서, 뿐만 아니라 농장 동물에서. 동물 모델을 사용 하 여 연구에서, FNA는 동일한 동물에서 반복적으로 수행 될 수 있는 장점이 있다, 질병의 과정을 통해 종양및 장기/조직에서 세포의 수집을 통해 세로 연구를 가능하게. 일상적인 현미경 검사법 이외에, 검색된 물자는 또한 면역 세포화학, 전자 현미경 검사법, 생화확적인 분석, 유세포 분석, 분자 생물학 또는 시험관외 분석학을 위해 이용될 수 있습니다. FNA는 감염된 마우스의 생식선에서 원생 동물 기생충 Trypanosoma brucei를 확인하는 데 사용되어, 가축의 미래 진단을위한 가능성을 열어.

Introduction

미세 바늘 흡인 (FNA)은 인간과 가축 모두에서 암 및 비 신생물 질환의 진단에 널리 사용됩니다. 이 기술은 수년에 걸쳐 표준화되었으며 수많은 교과서1,2에설명되어 있습니다.

그것은 주로 빈 주사기에 장착 된 얇은 바늘을 가진 만져볼 수있는 덩어리, 기관 또는 삼출액의 경피적 인 포부로구성되며, 음의 압력을 사용하여 질량 1,3에서세포 또는 유체를 철회합니다. 바늘은 전형적으로 22 내지 25 G (바늘 내경에 대응하는 게이지) 및 더 큰 보어 바늘의 사용 (큰 직경, 예를 들어, 21 G)은 과도한 혈액 오염을 생성할 수 있지만, 세포성을 증가시키는 데 도움이된다. 바늘 길이는 질량의 깊이에 따라 달라지지만 1 또는 11/2 인치는 일반적으로 표면 질량에 사용됩니다. 주사기는 일반적으로 5 ~ 10 mL이며, 더 큰 주사기는 더 높은 진공을 달성하여 흡인 수율을 증가시킵니다. 만져도 볼 수 없는 깊은 질량은 더 긴 바늘과 이미지 안내(초음파)로 흡인할 수도 있습니다. 회수된 흡아는 다음 번질, 공기 건조, 젖은 고정, 염색 및 진단을 달성하기 위해 현미경하에서 관찰될 수 있다 3(도 1).

이것은 간단하고 저렴하며 통증이 없고 최소 침습적 인 기술로 수술 전 설정에서 주로 만져 볼 수있는 질량과 림프절, 갑상선, 전립선 또는 외부 남성 생식 구조와 같은 장기에 대한 진단을 달성하는 데 사용됩니다. 1. 진단 도구 이외에,이 기술은 세포 유전학, 전자 현미경 검사법 (그림1D),유동 세포 측정 특성화 4,5 와 같은 다른 목적으로 세포의 수집에 사용할 수 있습니다. ,6,7, 세포 배양 의 설립8. 임상 사례에서 일반적인 예는 체외 수정에 대한정자 검색 9.

흡인은 여러 번 얼룩을 얻기 위해 동일한 질량에서 여러 번 반복 될 수 있습니다. 이질성 병변의 경우, 예를 들어, 고체 영역 및 낭포 공간, 세포가 각 영역에서 흡인되는 것이 중요하다. FNA에 의해 수집 된 물질은 일반적으로 매우 세포적이며, 대부분의 경우 조직 생검없이 질병의 진단을 허용합니다. 특수 얼룩, 면역 형광. 면역세포화학(도1D)및 분자 기술은 또한 FNA를 통해 수득된 얼룩에서 수행될 수 있으며, 예를 들어, 형태론으로만 인식할 수 없을 때 감염제의 식별을위해 10. 일반 응용 프로그램 및 FNA에 필요한 장비 및 소모품에 대한 간략한 개요는 각각 1과 2에요약되어 있습니다.

진단 목적을 위한 바늘 구멍의 사용에 대한 첫번째 보고는 아랍 의학의 초기 저술에서 기술됩니다, 그러나 현대 바늘 포부 기술이11를실행되었다는 것은 20 세기 초에 입니다. 특히, 아마도 전염병의 진단을 위한 FNA의 사용을 건의하는 첫번째 보고는 1904년에 연구 결과이었습니다, Grieg와 회색은 수면 병을 가진 환자에게서 림프절의 바늘 포부를 보고한 곳에 12 motile trypanosomes를 제시했습니다12 . 저자는 초기와 고급 케이스 둘 다에 있는 trypanosomes의 존재를 보고하고, 이들은 수시로 희소한 사건12인혈액 얼룩에서 보인 보다는 더 높은 조밀도에서.

가축의 Trypanosomiasis의 현재 진단은 혈액, 림프 또는 면역 진단 기술13,14,15에서기생충의 직접적인 관찰에 의존한다. 우리는 이전에 마우스에 있는 실험적인 Trypanosoma 감염에서, Trypanosoma brucei (T.brucei)는지방 조직(16)에 또한 외부 남성 생식 구조물의 일부에 현저한 tropism가 있다는 것을 보여주었습니다, 즉 부고환17. 기생충은 많은 수의 이 조직의 기질에축적16.

아래에 묘사 된 프로토콜은 외부 남성 생식 구조 (고환, 부고환및 부고환 지방)에 존재하는 trypanosomes의 열망을 목표로 살아있는 마우스에서 FNA에 대한 상세한 단계별 기술 절차를 설명합니다. 특정 기생충 단백질 (VSG)16,17에대한 기존의 세포학 및 면역 염색. 포부는 실험동물의 일상적인 취급을 위해 일반적으로 확립된 감염 및 안전 절차 후 6일 후에 수행되었다. 면역 결핍증이 있는 동물(증기 살균 가운, 마스크, 헤어 보닛, 멸균 장갑 착용, 항상 무균 기술 보장)이 있는 동물은 기회병원균에 우발적으로 노출되는 것을 완화하기 위한 추가적인 조치가 필요합니다.

Protocol

이 프로토콜의 모든 동물 실험은 EU 규정에 따라 수행되었으며 인스티투토 드 메디치나 분자 (iMM)의 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다 (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM). iMM의 동물 시설은 실험실 동물의 사용을 위한 포르투갈 법(법령-법 113/2013)을 준수하며 유럽 지침 2010/63/EU 및 FELASA(유럽 실험실 동물 과학 협회 연맹) 지침 및 실험실 동물 복지에 관한 권고.

1. 마우스의 외부 남성 생식 기관에서 기생충의 포부

참고: 미세한 바늘 흡인(FNA)은 야생형 수컷 C57BL/6J 마우스에서 수행되었으며, 6~10주 령, T. 브루시에 감염된 200 μL의 식염수 주사를 통해 2,000개의 기생충을 상술한 바와 같이16.

  1. 외부 남성 생식 기관의 FNA의 경우, 마우스를 층류 후드에 놓고, 75 mg /kg 케타민 + 식염수에 1 mg / kg 메데토미딘의 혼합물200 μL의 복강 내 주사로 동물을 마취시.
    1. 발가락 핀치 방법으로 마취를 확인하십시오. 다리의 후퇴의 반사가 없을 때, 등쪽 의 자세에서 마우스를 위치 (그림2A).
    2. 고환을 조심스럽게 촉지하여 겹침이 많은 피부로부터의 크기와 거리를 평가합니다. 검지와 가운데 손가락 사이 또는 검지와 엄지 손가락 사이의 장기를 억제합니다. 오버리 스킨을 질량을 가로질러 단단히 뻗어 대상을 더욱 고정시됩니다. 알코올 물티슈로 표면을 청소합니다 (그림2A).
    3. 조립된 22 G 바늘과 5 mL 주사기를 잡고 바늘 팁을 대상에 삽입하고, 항상나머지 상태에서 플런저를 넣습니다(그림 2B-C).
    4. 주사기 플런저를 4 mL에서 5 mL 마크로 2-3회 후퇴시켜 흡입을 적용합니다. 기관 내의 바늘을 직선으로 또는 여러 다른 접선을 따라 리디렉션하여 대표 샘플의 확률을 높이고 부고환과 같은 작은 구조를 대상으로합니다. 이 절차가 부드러운지 확인하여 조직 손상을 최소화하십시오 (그림2C-D).
    5. 흡입을 해제한 다음 바늘을 철회합니다. 이 주사기의 배럴에 흡인의 흡입으로 이어질 것입니다 이리관측 플런저와 바늘을 다시 그리지 말고 그회복을 방해 (그림 2E). 바늘의 철수 후, 천자 부위에 멸균 된 거즈 스폰지로 압력을 가하여 출혈을 제어하십시오.
    6. 바늘에서 주사기를 분리하고 공기로 채우고 바늘을 다시 연결하고 바늘의 내용을 슬라이드에 부드럽게 배출하십시오. 바늘 끝을 매우 가깝게 또는 슬라이드에 놓아 튀는 것을 피하십시오 (그림2F-I).
    7. 복제 샘플링을 보장하기 위해 장기/동물당 적어도 하나의 추가 흡인을 수행합니다.
    8. 식염수에 1 mg/kg Atipamezole의 200 μL의 피하 주사로 마취를 되돌리고 회복을 위해 동물을 홈 케이지로 돌려보내 고 완전한 회복까지 관찰하십시오.

2. 흡인 된 물질에서 얼룩 준비

참고: 절차 전반에 걸쳐 장갑을 사용하고 바늘과 주사기의 안전한 폐기를 보장하십시오.

  1. 2단계 풀 방법
    1. 비지배적 인 손을 사용하여 흡인의 방울이있는 슬라이드를 선택하고 엄지 손가락과 집게 손가락사이에 서리가 내린 끝을 꼬집습니다 (그림 3A).
    2. 두 번째 깨끗한 슬라이드, 지배적 인 손으로 스프레더 슬라이드를 선택하고 흡인의 드롭과 함께 첫 번째 슬라이드를 가로 질러 가져. 슬라이드의 매끄러운 깨끗한 가장자리를 약 30° 각도로 놓는 시편 슬라이드 위에놓습니다(그림 3B).
    3. 슬라이드를 하나의 빛, 연속 및 꾸준한 움직임으로 앞으로미끄러지면서 박막을 얻습니다(그림 3C).
    4. 슬라이드를 휴식시키고 재료의 완전하고 빠른 공기 건조를 허용합니다(그림3D). 열 고정하지 마십시오. 슬라이드의 젖어 있는 가장자리에 연필로 레이블을 지정합니다.
      참고: 이 단계에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 얼룩이 얼룩질 준비가 될 때까지 얼룩을 무기한 으로 저장할 수 있습니다.

3. 얼룩의 염색

참고: 절차 전반에 걸쳐 장갑을 사용하고 3.1.4 및 3.2.9 단계가 연기 후드 내부에서 수행되도록하십시오.

  1. 지임사 염색 프로토콜
    1. 슬라이드를 100% 메탄올이 들어 있는 코플린 항아리에 5분 동안 담그어공기 건조 얼룩을 수정합니다(그림 3E).
    2. 슬라이드를 20% Giemsa 용액(증류수에서 1/5로 희석)을 함유한 코플린 항아리에 30분, 10분 동안10% Giemsa로 옮긴다(그림 3F).
    3. 수돗물로 헹구고 티슈 페이퍼를 사용하여 완전히 건조하여 두드려 주세요.
    4. 슬라이드를 수평으로 잡고 비수성 마운팅 매체를 한 방울 도면에 바릅니다. 커버 글래스의 가장자리를 슬라이드에 놓고 낮추고 부드럽게 눌러 기포를 제거합니다.
  2. FNA 얼룩의 면역 세포 화학
    1. 공기 건조 얼룩을 실온에서 100% 메탄올로 10분 동안 고정합니다.
    2. 1x 인산완충액(PBS)으로 코플린 병에 5분 동안 슬라이드를 세척하고 매번 신선한 1x PBS를 사용하여 이 단계를 3번 반복합니다.
    3. 코플린 항아리에서 슬라이드를 제거하고, 얼룩을 건드리지 않고 여분의 버퍼를 닦고 발수 펜(재료표)으로 얼룩 주위에 원을 그립니다.
    4. 슬라이드를 수평으로 잡고 희석 된 1 차 항체 용액 150 μL을 각 얼룩에 바르고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
      참고: 여기서 사용되는 1차 항체는 비정제 토끼 혈청 항-브루시 VSG13 항원(많은 T. brucei VSGs와 교차 반응성, 사내에서 생산됨)으로 1x PBS에서 1:50,000에서 희석된다. 적절한 1차 항체를 전면역 혈청(TableofMaterials)으로 대체하여 음성 대조군을 수행하여 이차 항체의 비특이적 결합의 평가를 허용한다.
    5. 1x PBS로 코플린 항아리에서 5분 동안 슬라이드를 세척하고 매번 신선한 1x PBS를 사용하여 이 단계를 3번 반복합니다.
    6. 슬라이드를 수평으로 잡고 시판되는 고추냉이 과산화 및 DAB 시각화 시스템의 150 μL을 각 얼룩에 적용합니다. 실온에서 30 분 동안배양하십시오 (재료 표).
    7. 1x PBS에서 5분 동안 3x로 씻으소서.
    8. 해리스 헤마톡실린이 들어있는 코플린 항아리에 슬라이드를 담그고 카운터스테인. 수돗물로 헹구고 종이를 사용하여 완전히 건조하여 두드려 주세요.
    9. 슬라이드를 수평으로 잡고 비수성 마운팅 매체를 한 방울 도면에 바릅니다. 커버 글래스의 가장자리를 슬라이드에 놓고 낮추고 부드럽게 눌러 기포를 제거합니다.

Representative Results

FNA는 5 mL 주사기에 결합된 22 G 바늘을 사용하여 T. brucei에 감염된 마우스의 외부 남성 생식 기관에서 수행하였고, 스미어 준비를 위한 유리 슬라이드(도 1A-C)를 수행하였다. 이 방법은 간단하지만 최적의 결과는 중요한 단계에 의존합니다 : 전신 마취를 통해 달성 된 마우스의 완벽한 고정 및 전체 절차 전반에 걸쳐 장기의 안정화 (그림2A-B). 흡입은 2-3 회 적용되었고 바늘은 1-2 번 리디렉션되어 부고환 및 부고환 지방과 같은 작은 장기 및 조직의 대표적인 샘플링을 허용했습니다. 바늘을 외부화하기 전에 음압이 방출되었습니다. 바늘의 내루및 허브에 함유된 흡인(약 20 μL)을, 2개의 얼룩을 생성하는데 사용되었다(도 3A-C). 흡입이 해제되지 않고 바늘을 철회 한 경우, 재료는 주사기로 흡입되어 회수 할 수 없었습니다. 이 과정은 성공적으로 두 번 반복되었다, 각 쌍을 이룬 기관에 대해 하나. 건조 후, 스미어를 습식-고정및 면역세포화학을 시도하였고 표면 단백질을 시험했다.

좋은 품질의 얼룩 (그림 4A-C)은 숙주 세포가 보존 된 형태학적 특징을 보여 주는 양호한 세포 밀도를 가진 세포의 단층으로 특징 지어졌으며, 기원 및 상대 조직의 식별을 허용합니다. 서로 사이의 비율. 기생충은 효율적으로 면역 염색, 식별 및 카운트 할 수있었다 (도 4B). 감염된 마우스에서 후막 삼출액의 FNA의 한 사례는, 직접 관찰 및 진단을 위해 Giemsa로염색되고, 또한 도시된다(도 3D-F 도 4C).

불량 또는 음수 FNA 결과는 다른 이유로 인해 발생할 수 있습니다: (1) 너무 작은 FNA 물질이 슬라이드상에 표현되고 샘플의 과소 대표성; (2) 너무 많은 FNA 물질이 단일 슬라이드에 표현되어 지나치게 두꺼운 얼룩을 만들고 세포학적 평가를 손상시고; (3) 얼룩을 만들 때 너무 많은 힘이 가해지고 세포가 중단되어 많은 벌거 벗은 핵과 DNA 줄무늬 (호감 아티팩트)가 발생합니다. 또는 (4) 얼룩과 세포가 분해되지 않도록 할 때 충분한 힘이 가해지지 않아 세포의 형태학적 특징의 평가를방해하는 계층화된 층이 생성된다(도 5).

FNA 세포 병리학을 조직 병리학, 즉 세포 대 조직 분석과 비교할 때, 주먹은 세포 형태가 더 잘 보존되고 세포의 상대적 비율과 계수가 더 잘 평가될 수 있다는 장점이 있습니다(그림6). 또한, 면역 세포 화학은 일반적으로 포르말린 고정 및 파라핀 내장 조직에서 수행되는 면역 조직 화학보다 더 간단하고 빠르며 최적화하기 쉽습니다.

대상 응용 프로그램 장점 제한
만져볼 수 있는 질량 일상적인 현미경 검사법, 진단 간단하고 빠른 조직 아키텍처 없음
기관 면역화학 저가 맹목적인 포부 (바늘은 표적 접선으로 놓칠 수 있습니다; 포부는 괴사, 낭포 성 또는 출혈 부위를 표적으로 할 수 있습니다)
유출액 유세포분석 여러 사이트에서 샘플링
세포 유전학 잘 보존된 세포 형태
전자 현미경 검사법 합병증이 없습니다.
PCR, 기타 분자 기술 높은 진단 정확도
생화학 분석 마취 (고정)
체외 세포 내 세포 배양 비 터미널 절차

표 1: 대상, 일반 응용 프로그램, 장점 및 미세 바늘 포부의 제한.

FNA 키트 흡인 바늘과 주사기의 원형
포부: 바늘 부품:
1. 일회용 플라스틱 주사기 (5 또는 10 mL) (그림1B) 경사. 바늘 샤프트의 끝이 비스듬히 비스듬히 비스듬히 비스듬히 비스듬히 비스듬히 비스듬히 기울어져 있습니다. 경피적 인 열망에 적합한 경종 바늘만 있습니다.
3. 22 ~ 25 게이지 (직경)의 바늘; 0.75, 1.0, 1.5 인치 길이, 표준 경정맥 바늘 팁 가장자리 (그림1A) 샤프트. 질량의 깊이에 따라 길이를 조정할 수 있는 바늘의 중공 관 부분. 바늘의 게이지는 샤프트 내부의 직경인 보어의 직경에 해당합니다(작은 바늘은 더 높은 게이지를 가미). 더 큰 보어 바늘의 사용 (미만 22 G) 셀 룰러를 증가 하는 데 도움이, 이 과도 한 불성 혈액 오염을 생산할 수 있지만.
1. 마취 (필요한 경우). FNA와 관련되었던 고통은 정맥 천자의 그것과 유사합니다, 그러나, 좋은 포부는 작은 크기의 동물 및/또는 작고, 변동이 있는 병변 및 기관에 특히 중요한 주제의 좋은 고정을 요구합니다. FNA에 복종하는 쥐와 마우스는 적절히 수동적으로 억제되어야 합니다, 또는, 필요한 경우에, 진정하거나 가벼운 전신 마취의 밑에. 허브. 주사기에 부착되는 바늘의 플라스틱 부분; 흡인된 재질의 시각화를 허용하도록 투명해야 합니다. FNA 동안 얻은 흡인 물질은 바늘 샤프트에 수집되어야하며 재료가 허브로 들어가는 것을 볼 때 흡인이 중지됩니다.
FNA 얼룩 만들기 및 해석 : 주사기 부품:
1. 서리가 내린 끝 유리 현미경 슬라이드 (그림1C) 배럴 / 실린더. 주사기의 빈 부분. 낭포성 병변 또는 삼출액을 다루지 않는 한, 배럴에 흡인되는 물질은 일반적으로 회수될 수 없습니다. FNA 세포학에 대한 흡인의 이상적인 부피는 바늘의 샤프트와 허브를 차지하는 흡인의 평균 부피에 해당하는 약 5 μL입니다.
2. 로마노프스키 타입 얼룩(예: 디프-퀴크, 지움사) 팁. 바늘 허브가 부착된 배럴의 끝입니다.
3. 현미경 (밝은 필드) 플런저. 한쪽 끝에 평평한 디스크 또는 입술이 있고 다른 쪽 끝에 고무 씰이있는 주사기의 이동 가능한 부분. 배럴에 적합하고 바늘에 세포, 유체를 그릴 수있는 압력을 제공합니다. 좋은 음압을 생성하는 완벽하게 밀봉 된 플런저는 좋은 흡인 수율을 얻기 위해 필수적입니다.

표 2: 미세한 바늘 포부를 위해 필요한 장비 및 소모품.

Figure 1
그림 1 : 미세한 바늘 포부를 위한 도구와 결과. (a) FNA용 바늘의 이상적인 직경은 22 내지 25 G. (B) 이상적인 주사기 부피는 5 내지 10 mL의 양호한 흡인 수율을 얻는다. (C) 깨끗하고 건조하며, 연필로 필기할 수 있는 반투명 마킹 영역이 있는 그리스 유리 슬라이드가 없습니다(면역화학의 경우). (D) 지암사 염색(검은 색 화살촉)으로 관찰된 트리파노좀의 예는 VSG 표면 단백질(흰색 화살촉)과 투과 전자 현미경(블록 화살표)에 대해 면역염색을 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2 : 마우스에서 외부 남성 생식 기관(고환, 부고환, 부고환지방)의 미세한 바늘 흡인(FNA)을 보여주는 회로도. (A) 일단 동물이 고정되면, 이전에 조립 된 포부 악기를 집어 들었다. (B-C) 대상 기관에 바늘 팁을 삽입합니다. (D) 주사기 플런저를 1 mL에서 2 mL 마크로 후퇴시켜 흡입을 반복하여 3-4회 적용한다. 바늘 팁은 흡입을 적용하는 동안 대상 내에서 앞뒤로 이동하여 충분한 재료를 수집 할 수 있습니다. (E) 흡입을 해제한 다음 바늘을 철회합니다. (F) 주사기에서 바늘을 제거하고 (G) 플런저를 뒤로 당깁니다. (H) 바늘을 다시 부착합니다. (I) 주사기를 통해 플런저를 빠르게 밀어 유리 슬라이드에 재료를 배출합니다. 튀는 것을 피하기 위해 바늘 끝이 매우 가깝게 또는 슬라이드에 놓여 있는지 확인하십시오. 흡인의 방울은 반투명 마킹 영역의 가장자리에서 약 1cm 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3 : 얼룩 준비 및염색. (A) 엄지와 검지 사이에 슬라이드의 한쪽 끝(반투명 영역)을 잡습니다. (B) 두 번째 슬라이드(스프레더)의 매끄러운 깨끗한 가장자리를 재료 의 방울 바로 앞에 있는 시편 슬라이드에 놓습니다. (C) 적당한 속도로 스프레드를 한 번 앞으로 밀어 박막을 얻습니다. (D) 슬라이드가 공기를 말리도록 하고 슬라이드의 반투명 한 가장자리에 연필로 레이블을 지정합니다. (E) 메탄올로 완전히 건조한 후 5분(F) 얼룩20% 지임사 용액을 30분(또는 10분 동안 10% Giemsa)으로 염색합니다. 물로 가볍게 헹구고, 완전히 말리고, 자일렌에 담그고, 불용성 마운팅제로 장착하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4 : 감염된 마우스의 외부 남성 생식 구조의 FNA에서 얻은 얼룩의 미세 사진 T. 브루시. (a) 좋은 품질의 직접 얼룩의 총 외관: 재료는 반투명 한 가장자리 (검은 점)에서 약 1cm 떨어진 슬라이드상에 표현되었고, 슬라이드의 가장자리 (평행선) 전에 0.5 cm를 얼룩지고 멈췄다. (b) 기생충의 표면 단백질에 대한 면역세포화학(VSG)은 감염 6일째에 외부 남성 생식기관의 FNA로부터 수득된 얼룩에 대해 수행되었다. 수많은 기생충(화살촉)이 마우스 세균 세포(화살표)와 혼합된 것으로 나타났다. DAB는 해리스 헤마톡실린으로 대응했다. 원래 배율: 40x(배율 표시줄 = 50 μm). (C) 감염 의 21 일째에 후막 삼출액의 FNA 후 얻은 얼룩의 Giemsa-염색은, 호스트 (마우스) 세포와 혼합 된 수많은 기생충 (화살촉)을 보였으며, 이 경우 염증 세포, 대식세포 (화살표) 및 림프구. 원래 배율: 40x(배율 표시줄 = 50 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5 : 품질이 좋지 않습니다. (A) 세포 가사 불량, 질량 또는 장기의 대표적. (B) 매우 두꺼운 얼룩. (C) 분쇄 된 유물, 중단 된 세포, 벌거 벗은 핵 및 DNA 줄무늬. (D) 세포의 집합층과 계층화된 층을 집계한다. DAB는 해리스 헤마톡실린으로 대응했다. 원래 배율: 20x(배율 막대 = 100 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6 : 감염된 마우스의 부고세포학 및 역학 비교 T. 브루시. (a) FNA 얼룩에 대응하는 마이크로 사진 및 (B) 4 μm 파라핀 섹션, 동일한 배율 (20x 원래 배율, 스케일 바 = 100 μm), 둘 다 기생충의 표면 단백질에 대해 면역 염색 (VSG). 얼룩은 잘 보존 된 세포 형태와 기생충 (화살촉)의 큰 숫자를 보여 주었다, 세균 세포의 적당한 숫자와 몇 정자 (화살표)와 혼합. 조직학 섹션은 발광 내 정자 (화살표)가있는 부고환 덕트및 부고말 기질 (화살촉)을 확장하는 많은 수의 기생충의 존재로 구성된 잘 보존 된 조직 구조를 보였습니다. DAB는 해리스 헤마톡실린으로 대응했다. 원래 배율: 20x(배율 막대 = 100 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

미세 바늘 흡인 (FNA)은 인간 및 가축의 질병을 진단하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 이 기술은 수년 동안 표준화되어1,2,이는 만져 볼 수있는 질량 또는 기관1,3에서세포 또는 유체를 흡인하기 위해 작은 보어 바늘을 사용합니다. 흡아는 일반적으로 유리 슬라이드에 얼룩지고 진단을 달성하기 위해 현미경 관찰을 위해 염색되지만, 기술은 다른 목적으로 세포를 검색하는데 사용할 수도 있습니다 4,5,6, 7명 , 8개 , 9.

절차는 빠르다 (<5 마우스 당 분, 숙련 된 연구자에 대 한) 합병증의 위험은 최소한의, 간단한 정 맥 천 자 를 겪고 때 발생 하는 위험과 비슷합니다. 이러한 이유로, 만져볼 수 있는 질량의 FNA의 경우, 마취는 민감한 해부학 적 위치에 만 필요하거나 동물의 좋은 고정과 기관 이나 질량의 안정화가 최적의 결과를 위해 매우 중요합니다. 이것은 작은 실험실 동물에 대 한 자주, 다른 손으로 포부를 위한 지역에 대 한 최상의 액세스를 보장 하는 동안 한 손으로 작은 설치류의 안전 하 고 효과적인 구속으로, 마 취 없이 달성 하기 어렵다. 단기 마취는 마우스에 있는 좋은 FNA를 위해, 그럼에도 불구하고, 대부분의 경우에 충분합니다, 그럼에도 불구하고 필요합니다. 좋은 고정화는 병변의 세포 성분을 대표하는 흡인을 얻을 수있는 기회를 극대화하고 음압이 가해지는 동안 바늘 끝을 외부화 할 가능성을 최소화합니다.

절차 자체는 매우 간단하지만, 조정 된 응용 프로그램 및 진공의 방출은 가장 중요한 단계입니다. 바늘을 삽입한 후, 주사기의 플런저는 제어된 진공(흡입)을 달성하기 위해 후퇴되고, 바늘은 플런저를 놓아 음압을 방출한 후에만질량으로부터 제거될 수 있다(도 2); 그렇지 않으면 흡인은 주사기의 배럴로 빨려 들어간 다음 복구하기가 매우 어렵습니다. 또 다른 매우 중요한 단계는 고품질 얼룩의 준비입니다. 얼룩을 만드는 다양한 방법이 있지만 방법에 관계없이 재료가 유리에 배치 된 직후에 얼룩을 준비해야합니다. 생물학적 물질은 세포 분쇄 유물을 피하기 위해 부드럽게 퍼져야합니다. 커버슬립을 스프레더로 사용하면 이러한 아티팩트를 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 얼룩을 만드는 동안 너무 많은 힘의 적용은 커버 슬립을 깰 것입니다. 좋은 품질의 얼룩은 일반적으로 빛을 쉽게 전달할 수 있도록 대부분의 세포 집단이 단층으로 분포되어 있습니다. 세포 물질은 혈전에 과도하게 갇혀서는 안됩니다.

FNA의 목표는 질량, 조직 또는 기관에서 세포를 수집하는 것입니다. 더 큰 보어 바늘의 사용은 셀룰러를 증가시키는 데 도움이되지만, 작은 바늘로 샘플링하는 동안 과도한 혈액 오염과 연관 될 수 있지만 적은 풍부한 물질을 생산합니다. 우리의 경우, T. brucei에실험적으로 감염된 마우스에서 외부 남성 생식 구조의 경피적 흡인은 5 mL 주사기에 결합된 22 게이지 바늘로 수행하였다. 마우스를 마취시키고, 한 손으로 고환을 안정화시키고, 천공 및 흡인을 유도하고, 다른 손으로 수행하였다. 우리는 세균 세포, 정자, 상피 세포 및 기질 세포와 혼합 된 수많은 trypanosomes를 검색, 이는 기생충의 표면 단백질에 대한 번짐 및면역 염색했다 (VSG) (그림 4).

주어진 병변의 여러 영역이 여러 번 샘플링 될 수 있지만, 이것은 우리가 바늘 팁과 대상 기관 또는 질량을 시각화하지 않는 맹목적인 포부이기 때문에 흡인에 항상 부정적인 결과를 산출하는 잠재적 인 샘플링 오차가 있습니다. 이것은 의심스러운 병변의 부정적인 FNA가 추가 조사를 없애지 않는 임상 환경에서 매우 관련이 있지만 질병의 동물 모델에서는 그다지 관련이 없습니다. 따라서, 일반적인 한계는 주로 거짓 음성 결과를 포함하고, 덜 자주 거짓 양성 결과 (예를 들어, 혈액 오염에서), 그러나 동물 실험의 설정에 가장 중요한 제한은 조직에 대한 정보의 부족이다 아키텍처17,우리는 조직 병리학, 예를 들어 기생충의 분포 패턴, 면역 세포, 및 세포 상호 작용 특징과 같이. 그럼에도 불구하고, 장점은 FNA가 동일한 동물에서 반복 샘플링을 허용하는 비말단 절차이며 항상 더 잘보존된 세포 형태를 허용한다는 것이다(도 5). 마우스로부터 숙주 세포, 면역 세포 또는 미생물을 수확하기 위한 FNA에 대한 대안은 항상 마우스를 안락사시켜 관심 있는 덩어리 또는 장기를 수집한다.

우리의 지식에, 작은 실험실 동물에 FNA의 사용에 대 한 몇 가지 보고서가 있다, 1949 에서 하나 와 골수의 포부에 대응 22 조혈을 공부 하기 위한 G 바늘18,그리고 다른 모든 유세포 분석과 함께 종양 관련 염증 세포 또는 내피 세포를 정량화7,19,20. 우리의 일은 이 기술이 감염성 질병 모형의 진단 그리고 연구 결과로 확장될 수 있고 면역 세포화학 또는 전자 현미경 검사법과 같은 기술과 세포학을 결합할 수 있다는 것을 보여줍니다. 실험 동물에서 방법의 주요 장점 중 두 가지는 다음과 같습니다: (1) 이 절차는 말단이 아니며, 즉, 살아있는 마우스에서 수행될 수 있다; (2) 온화한 심각도 때문에 동일한 동물의 연쇄 포부를 허용합니다. 따라서 각 연구에 필요한 마우스 수가 적고, 임상 질환의 진행과 질병 및/또는 미생물의 세포 및 분자 특징의 진화 사이의 상관 관계가 쉽게 수행될 수 있으므로 세로 연구를 가능하게 합니다.

아마도 전염병 진단을 위한 FNA의 사용에 대한 첫 번째 보고서는 1904년에 Grieg와 Gray가 수면 중 질병을 앓고 있는 환자로부터 림프절의 바늘포부를 보고한 연구이며, 이는 12개의 변성 trypanosomes를 밝혀냈습니다. 실험실 마우스에 있는 우리의 사실 인정은 가축에 번역을 찾아내는 경우에, 즉, Trypanosoma가 외부 남성 생식 구조물에서 FNA에 의해 쉽게 샘플링될 수 있는 경우에, 하나는 이 기술이 동물 진단을 위한 수의사에게 유용할 것이라는 점을 기대할 수 있습니다 농장에서 trypanosomiasis, 가축에.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 프로젝트는 Fundação 파라 에 의해 투자되었다 Ciência e Tecnologia (FCT)/ 미니스테리오 다 시에엔시아, 테크놀로지아 e 엔시노 슈페리어 (MCTES) Fundos do Orçamento 드 에스타도를 통해 (참조.: ID/ BIM/50005/2019). LMF는 Fundação 파라 Ciência e Tecnologia (IF/01050/2014)의 조사관이며, 실험실은 ERC (FatTryp, ref.771714)에 의해 투자됩니다. 이 작품의 출판은 또한 Fundação 파라 에 의해 투자 UID / BIM / 50005 / 2019 프로젝트는 Tecnologia (FCT)/ 미니스테리오 다 시에엔시아, Tecnologia e 엔시노 슈페리어 (MCTES) Fundos do Orçamento de Estado를 통해. 우리는 전문가 전자 현미경 지원을 위한 iMM의 조직학 및 비교 병리학 실험실에서 안드레이아 핀토, 및 산드라 Trindade, 티아고 Rebelo 및 헨리크 마차도 (iMM)에 감염된 마우스에서 조직을 공유하기위한 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) Bio 2 7418046 Anesthesia reversal
Cover slips (24 x 60 No.1) VWR 631-0664 Smear making
DAB Dako K3468 Immunocytochemistry
Entellan (500 mL) VWR 1.07961.0500 Mounting media
Envision Flex antibody diluent Dako 8006 Immunocytochemistry
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) Dako K4010 Immunocytochemistry
Envision Flex Wash Buffer Dako K8007 Immunocytochemistry
Giemsa stain Atom Scientific Ltd RRSPSS-A Smear staining
Glass slides (Superfrost Plus) VWR 631-9483 Smear making
Harris Haematoxylin Bio-optica 05-06004E Immunocytochemistry
Hydrogen Peroxidase solution Sigma H1009-500ML Immunocytochemistry
Hypodermic needles Microlance 3 (23 G) Henry Schein 902-8001 Aspiration technique
Ketamin (IMALGENE 1,000-10 mL) Bio 2 7410928 Anesthesia
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) Bio 2 7418335 Anesthesia
Methanol Merck 1.06009.2511 Smear fixative
Pap pen Merck Z377821-1EA Immunocytochemistry
Protein Block Serum free Dako X0909 Immunocytochemistry
Syringes (5 mL, 10 mL) Henry Schein 900-3311, 900-3304 Aspiration technique

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leopold, G., Koss, M. R. M. Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. Lippincott Williams and Wilkins. (2006).
  2. Raskin, R. E., Meyer, D. J. Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. (2016).
  3. Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185, (3), 819-824 (1992).
  4. Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107, (33), 14524-14529 (2010).
  5. Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
  6. Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40, (4), 307-319 (1998).
  7. Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
  8. Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43, (6), 985-990 (1999).
  9. Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63, (5), 1038-1042 (1995).
  10. Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120, (3), 351-367 (1998).
  11. Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47, (2), 191-197 (2009).
  12. Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1, (2265), 1252 (1904).
  13. Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47, (6), 727-734 (1972).
  14. Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. 1-15 (2009).
  15. Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12, (2), 186-194 (2012).
  16. Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19, (6), 837-848 (2016).
  17. Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12, (8), 1-15 (2018).
  18. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, (5), 557-561 (2013).
  19. Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13, (3), 251-258 (2010).
  20. Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21, (7), 648-661 (2013).
미세 바늘 흡인에 의해 혈관 외 <em>Trypanosoma</em> 기생충의 검출
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).More

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter