Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Påvisning av ekstravaskulær Trypanosoma parasitter av fine Needle aspirasjon

doi: 10.3791/59798 Published: August 7, 2019

Summary

Fin nål aspirasjon er en teknikk, der cellene er Hentet fra en lesjon eller organ ved hjelp av en tynn nål. Pustende materialet er smurt, beiset og undersøkt under et mikroskop for diagnose eller brukes til molekylærbiologi, flowcytometri eller in vitro analyse. Det er billig, enkel, rask og forårsaker minimale traumer.

Abstract

Fine Needle aspirasjon (FNA) er en rutinemessig diagnostisk prosedyre avgjørende for både medisinsk og veterinær praksis. Den består av perkutan aspirasjon av celler og/eller mikroorganismer fra håndgripelig massene, organer eller effusions (væskeansamling i en kropp hulrom) ved hjelp av en tynn nål som ligner på den vanlige nålen brukes for venøs punktering. Materialet som samles inn av FNA er generelt svært mobilnettet, og de hentet aspirer blir deretter smurt, luft tørket, våt-fast, beiset og observert under et mikroskop. I den kliniske konteksten, er FNA et viktig diagnostisk verktøy som fungerer som en guide til den aktuelle terapeutiske ledelsen. Fordi det er enkelt, raskt, minimalt invasiv og krever begrenset investering i laboratoriet og menneskelige ressurser, er det mye brukt av veterinær utøvere, hovedsakelig i innenlandsk, men også i husdyr. I studier ved hjelp av dyremodeller, har FNA den fordelen at det kan utføres flere ganger i samme dyr, slik at langsgående studier gjennom innsamling av celler fra svulster og organer/vev i løpet av sykdommen. I tillegg til rutinemessig mikroskopi, kan Hentet materiale også brukes til immuncytokjemi, elektron mikroskopi, biokjemiske analyse, flyt flowcytometri, molekylærbiologi eller in vitro analyser. FNA har blitt brukt til å identifisere protozoan parasitten Trypanosoma brucei i gonader av infiserte mus, åpne muligheten for en fremtidig diagnose i storfe.

Introduction

Fine Needle aspirasjon (FNA) er mye brukt i diagnostisering av kreft og ikke-neoplastic sykdommer, både i menneskelige og innenlandske dyr. Teknikken har blitt standardisert gjennom årene og er beskrevet i mange lærebøker1,2.

Det består i stor grad av perkutan aspirasjon av håndgripelig massene, organer eller effusions med en tynn nål montert på en tom sprøyte, ved hjelp av negativt Trykk for å trekke celler eller væske fra massen1,3. Nåler er vanligvis 22 til 25 G (gauge tilsvarende nålen indre diameter), og bruk av en større bore nål (stor diameter, f. eks, 21 G) er nyttig å øke cellularitet, selv om dette kan gi overdreven blod forurensning. Nållengde vil avhenge av dybden av massen, men 1 eller 11/2 tommer er ofte brukt for overfladiske massene. Sprøyter er vanligvis 5 til 10 mL, med større sprøyter oppnå høyere vakuum, som igjen øker aspirer yield. Ikke-håndgripelig dyptliggende massene kan også være pustende, med lengre nåler og under bilde veiledning (ultralyd). De hentet aspirer kan deretter smøres ut, lufttørkes, våt-fast, beiset og observert under et mikroskop for å oppnå en diagnose3 (figur 1).

Dette er en enkel, billig, smertefri og minimalt invasiv teknikk i hovedsak brukt i preoperativ innstillingen for å oppnå en diagnose på håndgripelig massene og også for organer, som lymfeknuter, skjoldbruskkjertelen, prostata eller til og med ytre mannlige reproduktive strukturer 1. i tillegg til å være et diagnostisk verktøy, kan denne teknikken brukes til innsamling av celler til andre formål også, nemlig cytogenetikk, elektron mikroskopi (figur 1d), Flow analytiske karakterisering4,5 ,6,7, etablering av cellekulturer8. Et vanlig eksempel i klinisk praksis er sperm henting for in vitro befruktning9.

Aspirasjon kan gjentas flere ganger i samme masse for å få flere flekker. I tilfelle av en heterogen lesjon, f. eks, et solid område og en cystisk mellomrom, er det viktig at cellene er pustende fra hver region. Materialet som samles inn av FNA er generelt svært mobilnettet, som i de fleste tilfeller gir mulighet for diagnostisering av sykdommer uten behov for en vevs biopsi. Spesielle flekker, immunofluorescence. immuncytokjemi (figur 1d), og molekylære teknikker kan også utføres i flekker innhentet gjennom Fna, for eksempel for identifisering av smittsomme midler når den ikke gjenkjennes av morfologi alene10. En kort oversikt over de generelle applikasjonene og utstyret og forsyningene som trengs for FNA er oppsummert i henholdsvis tabell 1 og 2.

Den første rapporten om bruk av nålen punktering for diagnostiske formål er beskrevet i tidlige skrifter av arabisk medisin, men det er i begynnelsen av 20th Century at moderne nål aspirasjon teknikker ble gjennomført11. Spesielt, kanskje den første rapporten som antyder bruk av FNA for diagnostisering av smittsomme sykdommer var en studie i 1904, der Grieg og Gray rapporterte nål ambisjoner av lymfeknuter fra pasienter med sovende sykdom avslørt aktive trypanosomes12 . Forfatterne rapporterte tilstedeværelsen av trypanosomes i både tidlig og avansert tilfeller, og i en høyere tetthet enn det sett i blod flekker, hvor disse er ofte sjeldne hendelser12.

Nåværende diagnostisering av Sovesyke i storfe er avhengig av direkte observasjon av parasitter i blodet, lymfe eller i immunodiagnostic teknikker13,14,15. Vi har tidligere vist at i eksperimentelle Trypanosoma infeksjoner i musen, Trypanosoma brucei (T. brucei) har en bemerkelsesverdig tropism til fettvev16 og også til noen av de ytre mannlige reproduktive strukturer, nemlig bitestikkel17. Parasitter akkumuleres i stroma av disse vev i stort antall16.

Protokollen avbildet nedenfor beskriver en detaljert trinn-for-trinn teknisk prosedyre for FNA i levende mus, rettet mot aspirasjon av trypanosomes stede i ytre mannlige reproduktive strukturer (testikkel, bitestikkel, og epididymale fett), etterfulgt av konvensjonelle Cytologi og immunostaining for spesifikke parasitt proteiner (VSG)16,17. Aspirasjon ble utført 6 dager etter at infeksjonen og sikkerhetsprosedyrer som gjelder er de som vanligvis er etablert for rutinemessig håndtering av forsøksdyr. Ytterligere tiltak er nødvendig for dyr som har uimottakelig mangler (iført en damp-sterilisert kappe, maske, hår panseret, sterile hansker, og sikre aseptisk teknikk til alle tider) for å redusere utilsiktet eksponering for opportunistiske patogener.

Protocol

Alle dyr eksperimenter i denne protokollen ble utført i henhold til EUs regelverk og godkjent av Animal etikk Committee of Instituto de Medicina Molecular (iMM), (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM). Dyret anlegget av iMM overholder den portugisiske loven for bruk av forsøksdyr (resolusjon-Law 113/2013) og følger det europeiske direktivet 2010/63/EU og FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science Associations) retningslinjer og anbefalinger om laboratorie dyrevelferd.

1. aspirasjon av parasitter fra eksterne mannlige reproduktive organer av musen

Merk: Fin nål aspirasjon (FNA) ble utført i vill-type mannlige C57BL/6J mus, 6 til 10 uker gammel, smittet med T. brucei gjennom intraperitoneal injeksjon av 200 μL av saltvann med 2 000 parasitter som beskrevet tidligere16.

  1. For FNA av ytre mannlige reproduktive organer, plassere musen i en laminær Flow hette, bedøve dyret med en intraperitoneal injeksjon av 200 μL av en blanding av 75 mg/kg ketamin + 1 mg/kg Medetomidine i saltvann.
    1. Bekreft bedøvelsen med toe klype metoden. Når refleks av tilbaketrekkingen av benet er fraværende, posisjon mus i rygg recumbency (figur 2a).
    2. Forsiktig palpate testikkel, vurdere størrelse og avstand fra overliggende huden. Holde orgelet mellom indeksen og langfingeren eller mellom pekefingeren og tommelen. Strekk den overliggende huden tett over massen for å ytterligere nakkens målet. Rengjør overflaten med alkohol kluter (figur 2a).
    3. Hold den monterte 22 G nålen og 5 mL sprøyte og sett nålespissen inn i målet, alltid med stempelet i hvile staten (figur 2b-C).
    4. Påfør sug ved å trekke sprøyte stempelet til 4 ml til 5 mL merke 2-3 ganger. Omdiriger nålen i orgelet enten i en rett linje eller langs flere forskjellige tangenter for å øke sannsynligheten for et representativt utvalg og av målretting mindre strukturer som bitestikkel. Kontroller at denne prosedyren er mild, for å minimere vevs skaden (figur 2C-D).
    5. Løsne sugeeffekten og trekk deretter ut nålen. Ikke trekke nålen med trukket stempelet da dette vil føre til sug av aspirer inn i sylinderen i sprøyten og hindre dens utvinning (figur 2e). Etter tilbaketrekking av nålen, kontrollere eventuelle blødninger ved å påføre trykk med en sterilisert gasbind svamp på punktering stedet.
    6. Koble sprøyten fra nålen, fyll den med luft, koble nålen og forsiktig kaste ut innholdet av nålen på et lysbilde. Plasser tuppen av nålen svært nær eller til og med på lysbildet for å unngå splattering (figur 2F-I).
    7. Utfør minst en ekstra aspirasjon per organ/dyr for å sikre replikere prøvetaking.
    8. Tilbake anestesi med en subkutan injeksjon av 200 μL av 1 mg/kg Atipamezole i saltvann og returnere dyr til sine hjem buret for utvinning og observere til full gjenoppretting.

2. smøre forberedelser fra det pustende materialet

Merk: Bruk hansker gjennom hele prosedyren og sikre trygg avhending av nåler og sprøyter.

  1. To trinn Pull metode
    1. Plukk opp lysbildet som har dråpe aspirer ved hjelp av nondominant hånd, og klem frostet enden mellom tommelen og pekefingeren (figur 3a).
    2. Plukk opp et nytt, rent lysbilde, med den dominerende hånden og ta det med over det første lysbildet med dråpe aspirer. Plasser den glatte, rene kanten av lysbildet på objektglasset rett på toppen av dråpe i en vinkel på ca. 30 ° (figur 3b).
    3. Gli glidebryteren forover med en lett, kontinuerlig og jevn bevegelse for å få en tynn film (figur 3c).
    4. Hvil raset og la for den komplette og raske lufttørking av materialet (figur 3D). Ikke varme-Fix. Merk frostet kant på lysbildet med en blyant.
      Merk: Protokollen kan settes på pause på dette trinnet og smøres utover kan lagres på ubestemt tid til klar til å bli flekkete.

3. farging av flekker

Merk: Bruk hansker gjennom hele prosedyren og sørg for at trinnene 3.1.4 og 3.2.9 utføres inne i en avtrekksvifte.

  1. Giemsa fargeprotokoll
    1. Fix luft-tørket flekker ved å dyppe lysbildene i en Coplin krukke som inneholder 100% metanol i 5 min (figur 3e).
    2. Overfør lysbildet til en Coplin krukke som inneholder 20% Giemsa oppløsning (fortynnet til 1/5 i destillert vann) i 30 min, eller 10% Giemsa i 10 min (figur 3F).
    3. Skyll av i vann fra springen og tørk grundig ved hjelp av silkepapir til DAB.
    4. Hold lysbildet horisontalt og Påfør en dråpe av det ikke-vandige feste mediet på smøremiddelet. Plasser kanten på et deksel glass på lysbildet, senk det og trykk forsiktig for å fjerne eventuelle luftbobler.
  2. Immuncytokjemi i FNA-flekker
    1. Fix luft-tørket smøres utover i 100% metanol ved romtemperatur i 10 min.
    2. Vask lysbildet i 5 minutter i en Coplin krukke med 1x fosfat buffer (PBS), Gjenta dette trinnet 3 ganger med frisk 1x PBS hver gang.
    3. Fjern lysbildet fra Coplin jar, tørk overflødig buffer uten å berøre smøre og tegne en sirkel rundt smøre med en vannavvisende penn (tabell over materialer).
    4. Hold glidebryteren horisontalt og påfør 150 μL av fortynnet primær antistoff løsning på hver smøre og ruge i 1 time ved romtemperatur.
      Merk: Primær antistoff brukes her er en ikke-renset kanin serum anti-T. brucei VSG13 antigen (kryss-reaktive med mange T. brucei VSGs, produsert i huset), fortynnet i 1x PBS på 1:50000. Utfør negative kontroller ved å erstatte det aktuelle primære antistoff med preimmune serum (materialfortegnelsen) for å muliggjøre vurderingen av den ikke-spesifikke bindingen av sekundær antistoff.
    5. Vask lysbildet i 5 minutter i en Coplin krukke med 1x PBS, Gjenta dette trinnet 3 ganger med frisk 1x PBS hver gang.
    6. Hold raset horisontalt og påfør 150 μL av kommersielt tilgjengelige pepperrot peroksidase/DAB visualisering system til hver smøre. Ruge i 30 minutter ved romtemperatur (tabell av materialer).
    7. Vask for 3x i 5 minutter i 1x PBS.
    8. Counterstain ved å fordype lysbildene i en Coplin krukke som inneholder Harris hematoksylin. Skyll av i vann fra springen og tørk grundig med papir for å DAB.
    9. Hold lysbildet horisontalt og Påfør en dråpe av det ikke-vandige feste mediet på smøremiddelet. Plasser kanten på et deksel glass på lysbildet, senk det og trykk forsiktig for å fjerne eventuelle luftbobler.

Representative Results

FNA ble utført i ytre mannlige reproduktive organer av mus smittet med T. brucei bruke en 22 G nål koplet til en 5 ml sprøyte, og glass lysbilder for smøre preparatet (figur 1a-C). Metoden er enkel, men optimale resultater stole på kritiske trinn: perfekt immobilisering av musen oppnås gjennom narkose, og stabilisering av organene gjennom hele prosedyren (figur 2a-B). Sug ble påført 2-3 ganger og nål Omdirigert 1-2 ganger for å muliggjøre representative prøvetaking av de mindre organer og vev: bitestikkel og epididymale fett. Negativt trykk ble sluppet før externalizing av nålen. Aspirer som finnes i lumen og knutepunkt for nålen (ca. 20 μL), ble brukt til å produsere 2 flekker (figur 3a-C). I tilfeller der nålen ble trukket tilbake uten utgivelsen av sug, ble materialet sugd inn i sprøyten og kunne ikke gjenopprettes. Prosessen ble gjentatt to ganger, en for hver sammenkoblet organ. Etter tørking ble flekker våt-fast og immuncytokjemi for trypanosome overflate proteiner ble utført.

En god kvalitet smøre (figur 4a-C) var preget av en monolag av celler med god cellulær tetthet, der verten cellene viser bevarte morfologiske funksjoner, noe som åpner for identifisering av deres vev av opprinnelse og relative forholdet mellom hverandre. Parasitter var effektivt Immuno-farget, identifiserbar og countable (figur 4b). Ett tilfelle av en FNA av en bukhulen effusjon i en infisert mus, beiset med Giemsa for direkte observasjon og diagnose, er også vist (figur 3D-F og figur 4c).

Et dårlig eller negativt FNA-resultat kan skyldes forskjellige årsaker: (1) for lite FNA-materiale uttrykkes på lysbildet og er under representativt for prøven. (2) for mye FNA-materiale uttrykkes på et enkelt lysbilde, noe som gjør altfor tykke flekker og svekke cytologisk evaluering; (3) for mye kraft påføres når du gjør smøre, og cellene blir forstyrret, noe som resulterer i en rekke nakne kjerner og DNA striper (knuse gjenstand); eller (4) ikke nok kraft påføres når du gjør smøre og cellene ikke disaggregate, noe som resulterer i en lagdelt lag som hindrer evaluering av morfologiske funksjoner i cellene (figur 5).

Når vi sammenligner FNA-cytopathology med histopatologi, det vil si analyse av celler kontra vev, har neven den fordelen at cellulær morfologi er bedre bevart og relative proporsjoner og telling av celler kan bli bedre vurdert (figur 6). Videre er immuncytokjemi enklere, raskere og enklere å optimalisere enn immunhistokjemi, som vanligvis utføres i formalin-fast og parafin-embedded vev.

Målet Programmer Fordeler Begrensninger
Håndgripelig masse Rutinemessig mikroskopi, diagnose Enkelt, raskt Ingen vevs arkitektur
Orgel Immunhistokjemi Lavpris Blind aspirasjon (nål kan savne målet tangentially; aspirasjon kan målrette nekrotisk, cystisk eller hemoragisk områder)
Effusions Flow-flowcytometri Prøvetaking fra flere nettsteder
Cytogenetikk Godt bevart cellulær morfologi
Elektron mikroskopi Uten komplikasjoner
PCR, andre molekylære teknikker Høy diagnostisk nøyaktighet
Biokjemiske analyser Anestesi (for immobilisering)
I vitro-analyser, cellekultur Prosedyre uten Terminal

Tabell 1: Target, generelle applikasjoner, fordeler og begrensning av fin nål aspirasjon.

FNA-sett Arketypen av en aspirasjon nål og sprøyte
Aspirasjon: Nåle deler:
1. engangssprøyter med plast (5 eller 10 mL) (figur 1B) Skråkant. Spissen av nålen akselen er skråstilt å danne et punkt, den skrå er skråkant. Bare skrå nåler er egnet for perkutan ambisjoner.
3. nåler av 22 til 25-gauge (diameter); 0,75, 1,0, 1,5 tommer lang, med standard skrå nål tupp kant (figur 1a) Akselen. Hul rørformede del av nålen hvis lengde kan justeres i henhold til dybden av massen. Måleren av nålen tilsvarer diameteren av sin bore, som er diameteren på innsiden av akselen (mindre nåler har høyere gauge). Bruk av større barnåler (mindre enn 22 G) er nyttig å øke cellularitet, selv om dette kan gi overdreven iatrogenic blod forurensning.
1. anestesi (om nødvendig). Smerter forbundet med FNA er lik som en venøs punktering, men god aspirasjon krever god immobilisering av faget, spesielt viktig i små store dyr og/eller for små, fluctuant lesjoner og organer. Rotter og mus underlagt FNA bør være hensiktsmessig passivt behersket, eller, når det er nødvendig, bedøvet eller være under lys narkose. Hub. Plastdelen av nålen som er festet til sprøyten; bør være transparent for å tillate visualisering av pustende materiale. Det aspirer materialet som oppnås under FNA, skal samles i nåle akselen, og håpet stoppes når materialet blir sett inn i navet.
FNA smøre lage og tolkning: Sprøyte deler:
1. frostet slutten glass mikroskop lysbilder (figur 1C) Tønne/sylinder. Hul delen av sprøyten. Med mindre håndtere cystisk lesjoner eller effusions, materiale som er pustende til fat generelt ikke kan gjenopprettes. Det ideelle volumet av aspirer for FNA-cytologi er ca. 5 μL, tilsvarende det gjennomsnittlige volumet av aspirer som opptar akselen og navet på nålen.
2. Romanowsky type flekker (f.eks. diff-Quik, Giemsa) Tips. Enden av sylinderen som nåle navet er festet til.
3. mikroskop (skarpt felt) Stempelet. Bevegelig del av sprøyten som har en flat disk eller leppe i den ene enden og en gummi forsegling i den andre enden. Passer inn i fatet og gir presset til å trekke cellene, væske inn i nålen. En perfekt forseglet stempel som skaper godt negativt trykk er obligatorisk å få en god aspirer yield.

Tabell 2: utstyr og forsyninger som trengs for å fin nål aspirasjon.

Figure 1
Figur 1 : Verktøy og resultater for fin nål aspirasjon. (A) enideell diameter på NÅLEN for Fna er fra 22 til 25 G. (B) det ideelle sprøyte volumet for å oppnå en god aspirer avkastning på 5 til 10 ml. (C) ren, tørr, fri for fett glass Slide med frostet merke område for skriving med blyant og pre-belagt (Hvis for immunhistokjemi). (D) eksempel på Trypanosomes observert med Giemsa farging (svart pil spiss), immunostained for VSG overflate proteiner (hvit pil spiss) og under overføring elektron mikroskopi (blokk pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Skjematisk viser fin nål aspirasjon (Fna) av ytre mannlige reproduktive organer (testikkel, bitestikkel, og epididymale fett) i mus. (A) Når Dyret er sikret, blir det tidligere monterte aspirasjon instrumentet plukket opp. (B-C) Sett nålespissen inn i målorganet. (D) bruk sugeeffekten ved å trekke sprøytestempelet til 1 ml til 2 ml-merket, gjentatte ganger 3-4. Nålspissen kan også flyttes frem og tilbake innenfor målet mens påføring sug, for å samle tilstrekkelig materiale. (E) løsne sugeeffekten og bare deretter trekke ut nålen. (F) Fjern nålen fra sprøyten og (G) trekk stempelet tilbake. (H) fest nålen. (I) utvise materialet på et glass lysbilde ved å skyve stempelet raskt gjennom sprøyten. For å unngå splattering, må du sørge for at tuppen på nålen hviler svært nær eller til og med på lysbildet. Dråpe aspirer er plassert ca 1 cm fra kanten av frostet merke området. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Smøre forberedelser og flekker. (A) Hold en ende av lysbildet (frostet område) mellom tommelen og pekefingeren. (B) plasser den glatte rene kanten på et annet lysbilde på objektglasset rett foran dråpe materialet. (C) Skyv Spread fremover en gang med moderat hastighet for å få en tynn film. (D) la skyve lufttørke og merke frostet kant på lysbildet med en blyant. (E) etter fullstendig tørking Fix med metanol i 5 min. (F) beis med 20% Giemsa løsning for 30 min (eller 10% Giemsa i 10 min). Skyll lett med vann, tørk helt, dypp i xylen, og montert med et vann-uløselig monterings middel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Microphotographs av flekker innhentet fra Fna av eksterne mannlige reproduktive strukturer hos mus infisert med T. brucei. (A) brutto utseende av en god kvalitet direkte smøre: materialet ble uttrykt på lysbildet ca 1 cm unna frostet kant (svart prikk), smurt og stoppet 0,5 cm før kanten av raset (parallelle linjer). (B) immuncytokjemi for overflaten proteiner av PARASITTEN (VSG) ble utført for flekker HENTET fra Fna av eksterne mannlige reproduktive organer på dagen 6 av infeksjonen. Tallrike parasitter (pilspissen) ble oppdaget admixed med mus bakterieceller (arrow). DAB-counterstained med Harris-hematoksylin. Original forstørrelse: 40x (Scale bar = 50 μm). (C) Giemsa-farging av smøre fremstilt etter Fna av en bukhulen effusjon på dag 21 av infeksjonen, viste mange parasitter (pil spiss) admixed med verten (mus) celler, i dette tilfellet inflammatoriske celler, makrofager (pil) og lymfocytter. Original forstørrelse: 40x (Scale bar = 50 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Dårlig kvalitet Fna smøres utover. (A) dårlig Cellular smøre, under-representant for massen eller organ. (B) veldig tykk smøre. (C) knust gjenstand, med forstyrret celler, nakne kjerner og DNA-striper. (D) aggregater og lagdelt lag av celler. DAB-counterstained med Harris-hematoksylin. Original forstørrelse: 20x (Scale bar = 100 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Sammenligning av epididymale Cytologi og histologi hos mus infisert med T. brucei. (A) Microphotographs tilsvarende en Fna smøre og (B) en 4 μm parafin seksjon, ved samme forstørrelse (20X opprinnelige forstørrelse, Scale bar = 100 μm), begge immunostained for overflaten PROTEINER av parasitten (VSG). Den smøre viste et stort antall parasitter (pilspissen) med godt bevarte cellulær morfologi, admixed med moderat antall bakterieceller og få spermatozoa (pil). Den histologiske delen viste en godt bevart vev arkitektur, sammensatt av epididymale kanaler med intra-luminal spermatozoa (pil), og tilstedeværelsen av et stort antall parasitter utvide epididymale stroma (pilspissen). DAB-counterstained med Harris-hematoksylin. Original forstørrelse: 20x (Scale bar = 100 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Fine Needle aspirasjon (FNA) er en metode mye brukt til å diagnostisere sykdom i menneskelige og innenlandske dyr. Teknikken har blitt standardisert over mange år1,2, som gjør bruk av en liten nål til å aspirer celler eller væske fra en håndgripelig masse eller organ1,3. Den aspirer er da vanligvis smurt på et glass Slide og beiset for mikroskopisk observasjon for å oppnå en diagnose, men teknikken kan også brukes til å hente celler til andre formål4,5,6, 7 andre er , 8 på alle , 9i.

Prosedyren er rask (< 5 min per mus, for en erfaren forsker) og risikoen for komplikasjoner er minimal, lik den risikoen som påløper når gjennomgår enkel venøs punktering. Av denne grunn, for FNA av håndgripelig massene, anestesi er bare nødvendig for sensitive anatomiske steder eller når en god immobilisering av dyret og stabilisering av orgelet eller massen som skal pustende er ekstremt avgjørende for optimale resultater. Dette er hyppig for små forsøksdyr, som sikker og effektiv tilbakeholdenhet av en liten gnager med en hånd samtidig som den sikrer den beste tilgangen til området for aspirasjon med den andre hånden, er vanskelig å oppnå uten anestesi. Kortsiktig anestesi er i de fleste tilfeller tilstrekkelig, likevel nødvendig, for en god FNA i musen. En god immobilisering maksimerer sjansene for å få en aspirer som er representativt for cellulære komponenter av lesjon og også minimerer sjansene for externalizing tuppen av nålen mens negativt trykk påføres.

Selv om prosedyren i seg selv er svært enkel, koordinert søknad og frigjøring av vakuum er de mest kritiske trinnene. Etter innsetting av nålen trekkes stempelet på sprøyten inn for å oppnå et kontrollert vakuum (sug), og nålen kan bare fjernes fra massen etter at det negative trykket slippes ved å slippe stempelet (figur 2); ellers aspirer suges inn i fatet av sprøyten og er så veldig vanskelig å komme seg. Et annet svært viktig skritt er utarbeidelse av høy kvalitet smøres utover. Det finnes ulike metoder for å lage en smøre, men uavhengig av metoden, smøres utover bør være forberedt umiddelbart etter at materialet er plassert på glasset. Det biologiske materialet bør spres forsiktig for å unngå celle knuse artefakter. Bruk av en dekkglass kan bidra til å forhindre disse gjenstandene. Men anvendelsen av for mye kraft samtidig som smøre vil bryte dekkglass. En god kvalitet smøre vanligvis har det meste av cellen befolkningen distribueres som monolag slik at de lett kan overføre lys. Cellular materiale bør ikke være overdrevent fanget i blodpropp.

Målet med en FNA er å samle celler fra en masse, vev eller organ. Bruk av større barnåler er nyttig å øke cellularitet, men kan være forbundet med overdreven blod forurensning, mens prøvetaking med mindre nåler gir høyere kvalitet, men mindre rikelig materiale. I vårt tilfelle, perkutan aspirasjon av ytre mannlige reproduktive strukturer hos mus eksperimentelt smittet med T. brucei, ble utført med 22-gauge nåler koplet til en 5 ml sprøyte. Mus var anesthetized, testikkel ble stabilisert med en hånd og punktering og aspirasjon guidet og fremført med den andre hånden. Vi hentet en rekke trypanosomes admixed med bakterieceller, spermatozoa, epitelceller og stromal celler, som ble smurt og immunostained for parasitter overflate proteiner (VSG) (Figur 4).

Det er alltid den potensielle sampling feil i prøvemålingsaspirasjoner gir negative resultater fordi selv om flere områder av en gitt lesjon kan samples flere ganger, er dette en blind aspirasjon der vi ikke visualisere nålen spissen og målet orgel eller masse. Dette er svært relevant i en klinisk setting, hvor en negativ FNA av en mistenkelig lesjon ikke obviate videre undersøkelser, men det er ikke så relevant i dyremodeller av sykdom. Dermed generelle begrensninger omfatter hovedsakelig falske negative resultater, og mindre ofte falske positive resultater (f. eks, fra blod forurensning), men den viktigste begrensningen i innstillingen av dyr eksperimentering er mangelen på informasjon om vev arkitektur17, som vi har med histopatologi, for eksempel distribusjon mønster av parasitter, av immunceller, og celle-celle interaksjon funksjoner. Likevel, fordelene er at FNA er en ikke-Terminal prosedyre som gir mulighet for gjentatt prøvetaking i samme dyr over tid og alltid gir bedre bevart cellulær morfologi (figur 5). Alternativer til FNA for høsting vert celler, immunceller eller mikroorganismer fra en mus alltid stole på euthanizing musen til å samle massen eller organer av interesse.

Til vår kunnskap, er det bare noen få rapporter om bruk av FNA i små forsøksdyr, en fra 1949 tilsvarende til aspirasjon av benmarg med 22 G nål for å studere hematopoiesen18, og alle andre i kombinasjon med Flow flowcytometri til kvantifisere enten tumor-assosiert inflammatoriske celler eller endothelial celler7,19,20. Vårt arbeid viser at denne teknikken kan utvides til diagnostisering og studier av smittsomme sykdommer modeller og kan kombinere cytologi med teknikker som immuncytokjemi eller elektron mikroskopi. To av de store fordelene med metoden i forsøksdyr er: (1) denne prosedyren er ikke Terminal, det vil si, kan utføres i levende mus; og (2) på grunn av sin milde alvorlighetsgrad det gir mulighet for serielle ambisjoner i samme dyr. Derfor færre mus er nødvendig for hver studie, og sammenhengen mellom progresjon av klinisk sykdom og utviklingen av cellulære og molekylære funksjoner av en sykdom og/eller mikroorganismen kan enkelt utføres, og dermed muliggjør langsgående studier.

Kanskje den første rapporten om bruk av FNA for å diagnostisere en smittsomme sykdommer er en studie av Grieg og Gray i 1904 som rapporterer nål ambisjoner av lymfeknuter fra pasienter med sovende sykdom, som avslørte aktive trypanosomes12. Hvis våre funn i laboratoriet mus finne oversettelse til storfe, det vil si at hvis Trypanosoma lett kan SAMPLET av Fna fra eksterne mannlige reproduktive strukturer, kan man forvente at denne teknikken vil være nyttig for veterinærer for diagnostisering av dyr Sovesyke på gården, i husdyr.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette prosjektet ble finansiert av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) gjennom Fundos do Orçamento de Estado (Ref.: ID/BIM/50005/2019). LMF er en undersøker av Fundação para en Ciência e Tecnologia (IF/01050/2014) og laboratoriet er finansiert av ERC (FatTryp, REF. 771714). Publisering av dette arbeidet ble også finansiert UID/BIM/50005/2019 prosjekt finansiert av Fundação para en Ciência e en Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) gjennom Fundos do Orçamento de Estado. Vi takker Andreia Pinto fra histologi og sammenlignende patologi Laboratory av iMM for ekspert Electron mikroskopi assistanse, og Sandra Trindade, Tiago Rebelo og Henrique Machado (iMM) for deling av vev fra infiserte mus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) Bio 2 7418046 Anesthesia reversal
Cover slips (24 x 60 No.1) VWR 631-0664 Smear making
DAB Dako K3468 Immunocytochemistry
Entellan (500 mL) VWR 1.07961.0500 Mounting media
Envision Flex antibody diluent Dako 8006 Immunocytochemistry
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) Dako K4010 Immunocytochemistry
Envision Flex Wash Buffer Dako K8007 Immunocytochemistry
Giemsa stain Atom Scientific Ltd RRSPSS-A Smear staining
Glass slides (Superfrost Plus) VWR 631-9483 Smear making
Harris Haematoxylin Bio-optica 05-06004E Immunocytochemistry
Hydrogen Peroxidase solution Sigma H1009-500ML Immunocytochemistry
Hypodermic needles Microlance 3 (23 G) Henry Schein 902-8001 Aspiration technique
Ketamin (IMALGENE 1,000-10 mL) Bio 2 7410928 Anesthesia
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) Bio 2 7418335 Anesthesia
Methanol Merck 1.06009.2511 Smear fixative
Pap pen Merck Z377821-1EA Immunocytochemistry
Protein Block Serum free Dako X0909 Immunocytochemistry
Syringes (5 mL, 10 mL) Henry Schein 900-3311, 900-3304 Aspiration technique

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leopold, G., Koss, M. R. M. Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. Lippincott Williams and Wilkins. (2006).
  2. Raskin, R. E., Meyer, D. J. Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. (2016).
  3. Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185, (3), 819-824 (1992).
  4. Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107, (33), 14524-14529 (2010).
  5. Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
  6. Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40, (4), 307-319 (1998).
  7. Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
  8. Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43, (6), 985-990 (1999).
  9. Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63, (5), 1038-1042 (1995).
  10. Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120, (3), 351-367 (1998).
  11. Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47, (2), 191-197 (2009).
  12. Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1, (2265), 1252 (1904).
  13. Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47, (6), 727-734 (1972).
  14. Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. 1-15 (2009).
  15. Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12, (2), 186-194 (2012).
  16. Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19, (6), 837-848 (2016).
  17. Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12, (8), 1-15 (2018).
  18. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, (5), 557-561 (2013).
  19. Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13, (3), 251-258 (2010).
  20. Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21, (7), 648-661 (2013).
Påvisning av ekstravaskulær <em>Trypanosoma</em> parasitter av fine Needle aspirasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).More

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter