Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Обнаружение внесосудистой трипаносомой паразитов путем тонкого аспирации иглы

doi: 10.3791/59798 Published: August 7, 2019

Summary

Fine Needle Aspiration - это метод, при котором клетки получаются из поражения или органа с помощью тонкой иглы. Аспирированный материал смазывается, окрашивается и исследуется под микроскопом для диагностики или используется для молекулярной биологии, цитометрии или анализа пробирки. Это дешево, просто, быстро и вызывает минимальную травму.

Abstract

Fine Needle Aspiration (FNA) является обычной диагностической процедурой, необходимой как для медицинской, так и для ветеринарной практики. Она состоит из перкутанного аспирации клеток и/или микроорганизмов из ощутимых масс, органов или выпотов (накопление жидкости в полости тела) с помощью тонкой иглы, похожей на обычную иглу, используемую для венозного прокола. Материал, собранный FNA, в целом высококлеточный, и извлеченный аспират затем смазывается, сушат воздух, мокрые фикчированные, окрашенные и наблюдается под микроскопом. В клиническом контексте, FNA является важным диагностическим инструментом, который служит в качестве руководства для соответствующего терапевтического управления. Поскольку он прост, быстр, малоинвазивн и требует ограниченных инвестиций в лабораторные и людские ресурсы, он широко используется ветеринарными специалистами, в основном в домашних, но и в сельскохозяйственных животных. В исследованиях с использованием моделей животных, FNA имеет то преимущество, что она может быть выполнена неоднократно в том же животном, что позволяет продольных исследований через сбор клеток из опухолей и органов / тканей в течение болезни. В дополнение к обычной микроскопии, извлеченный материал также может быть использован для иммуноцитохимии, электронной микроскопии, биохимического анализа, цитометрии потока, молекулярной биологии или in vitro assays. FNA был использован для выявления простейшей паразит trypanosoma brucei в гонады инфицированных мышей, открывая возможность для будущего диагноза у крупного рогатого скота.

Introduction

Fine Needle Aspiration (FNA) широко используется в диагностике онкологических и неопластических заболеваний, как у животных, так и у домашних животных. Техника была стандартизирована на протяжении многих лет и описана в многочисленных учебниках1,2.

Она в значительной степени состоит из перкутанного стремления ощутимых масс, органов или выпотов с тонкой иглой, установленной на пустой шприц, используя отрицательное давление, чтобы вывести клетки или жидкость из массы1,3. Иглы, как правило, от 22 до 25 G (калибровка, соответствующая иглы внутреннего диаметра), и использование больших иглы (большой диаметр, например, 21 G) полезно для увеличения клеточной, хотя это может привести к чрезмерному загрязнению крови. Длина иглы будет зависеть от глубины массы, но 1 или 11'2 дюйма обычно используется для поверхностных масс. Шприцы, как правило, от 5 до 10 мл, с большими шприцев достижения более высокого вакуума, который, в свою очередь, увеличивает выход аспирата. Не-ощутимые глубоко сидячие массы также могут быть аспирированы, с более длинными иглами и под руководством изображения (ультрасонография). Извлеченный аспират может быть смазан, высушен воздухом, мокрой фиксированной, окрашенных и наблюдается под микроскопом для достижения диагноза3 (Рисунок 1).

Это простая, недорогая, безболезнененная и минимально инвазивная техника, в основном используемая в предоперационной обстановке для достижения диагноза на ощутимых массах, а также для органов, таких как лимфатические узлы, щитовидная железа, простата или даже внешние мужские репродуктивные структуры 1. В дополнение к тому, диагностический инструмент, этот метод может быть использован для сбора клеток для других целей, а именно, цитогенетика, электронная микроскопия (Рисунок 1D), поток цитометрической характеристики4,5 ,6,7, создание клеточных культур8. Распространенным примером в клинической практике является поиск спермыдля экстракорпорального оплодотворения 9.

Стремление может быть повторено несколько раз в той же массе, чтобы получить несколько мазков. В случае разнородного поражения, например, твердой области и кистозного пространства, важно, чтобы клетки аспирировались из каждого региона. Материал, собранный ФНА, в целом высококлеточный, что в большинстве случаев позволяет диагностировать заболевания без необходимости биопсии тканей. Специальные пятна, иммунофлуоресценция. иммуноцитохимия(рисунок 1D),и молекулярные методы также могут быть выполнены в мазках, полученных через FNA, например, для идентификации инфекционных агентов, когда не узнаваемы ежей только по морфологии10. Краткий обзор общих заявок и оборудования и материалов, необходимых для ФНА, обобщен в таблицах 1 и 2,соответственно.

Первый доклад об использовании прокола иглы для диагностических целей описан в ранних писаниях арабской медицины, но это в начале 20-го века, что современные методы аспирации иглы были реализованы11. Примечательно, что, возможно, первый доклад, который предлагает использование FNA для диагностики инфекционных заболеваний было исследование в 1904 году, где Григ и Грей сообщили иглы стремления лимфатических узлов от пациентов со сонной болезнью показали мотилические trypanosomes12 . Авторы сообщили о наличии трипаносомы как в ранних, так и в запущенных случаях, причем при более высокой плотности, чем в мазках крови, где это часто редкие события12.

Текущий диагноз трипаносомоза у крупного рогатого скота опирается на прямое наблюдение паразитов в крови, лимфатической или иммунодиагностической технике13,14,15. Мы ранее показали, что в экспериментальных инфекций трипаносомы у мыши, Trypanosoma brucei (T. brucei) имеет замечательный тропизм жировой ткани16, а также некоторые внешние мужские репродуктивные структуры, а именно эпидидимис17. Паразиты накапливаются в строми этих тканей в большом количестве16.

Протокол, изображенный ниже, описывает подробную пошаговую техническую процедуру для FNA у живых мышей, направленную на стремление трипаносом, присутствующих во внешних мужских репродуктивных структурах (testis, epididymis и эпидидимальных жира), а затем традиционная цитология и иммуностоинг для специфических белков паразитов (VSG)16,17. Стремление было выполнено через 6 дней после инфекции и процедуры безопасности, которые применяются те, обычно установленных для регулярного обращения с экспериментальными животными. Дополнительные меры необходимы для животных, которые имеют иммунный дефицит (ношение паростерилизовательное платье, маска, капот для волос, стерильные перчатки, и обеспечение асептической техники во все времена), чтобы смягчить случайное воздействие оппортунистических патогенов.

Protocol

Все эксперименты на животных в этом протоколе были проведены в соответствии с правилами ЕС и одобрены Комитетом по этике животных Института Молекулярной Медицины (iMM), (AEC-2011-006-LF-TBrucei-IMM). Объект iMM в отношении животных соответствует португальскому законодательству об использовании лабораторных животных (Декрет-Закон 113/2013) и следует Европейской директиве 2010/63/EU и руководящим принципам FELASA (Федерация европейских лабораторных ассоциаций по науке о животных) и рекомендации, касающиеся лабораторного благополучия животных.

1. Стремление паразитов от внешних мужских репродуктивных органов мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Изобразительная аспирация иглы (FNA) была выполнена в диких типа мужчин C57BL/6J мышей, от 6 до 10 недель, инфицированных T. brucei через интраперитонеальной инъекции 200 Л соления с 2000 паразитов, как описано ранее16.

  1. Для FNA внешних мужских репродуктивных органов, поместите мышь в ламинар ный капот потока, обезболять животное с интраперитонеальной инъекцией 200 л смеси 75 мг/кг кетамин 1 мг/кг медетомитин в сольном.
    1. Подтвердите анестезию методом щепотки. Когда рефлекс опрокидки ноги отсутствует, положение мыши в подошве recumbency(рисунок 2A).
    2. Тщательно пальпировать яичка, оценивая размер и расстояние от надлежащей кожи. Ограничите орган между указательным и средним пальцами или между указательным и большим пальцами. Вытяните надлежащую кожу плотно по всей массе, чтобы еще больше обездвижить цель. Очистите поверхность спиртными салфетками(рисунок 2A).
    3. Держите собранную 22 G иглу и шприц 5 мл и вставьте кончик иглы в цель, всегда с поршенем в состоянии отдыха(рисунок 2B-C).
    4. Примените всасывание путем втягивать поршень шприца к метке 4 mL до 5 mL 2-3 времени. Перенаправьте иглу внутри органа либо по прямой линии, либо по нескольким различным касательным, чтобы увеличить вероятность репрезентативного образца и ориентации на более мелкие структуры, такие как эпидидимис. Убедитесь, что эта процедура является мягкой, чтобы свести к минимуму повреждение тканей(Рисунок 2C-D).
    5. Отпустите всасывание, а затем снять иглу. Не перерисовывайте иглу с убранным поршенем, так как это приведет к всасыванию аспирата в бочку шприца и затрудните его восстановление(рисунок 2E). После снятия иглы, контролировать любые кровотечения, применяя давление со стерилизованные губки марли на месте прокола.
    6. Отсоедините шприц от иглы, заполните его воздухом, воссоедините иглу и аккуратно вывешивайте содержимое иглы на горку. Поместите кончик иглы очень близко или даже на слайд, чтобы избежать брызг(рисунок 2F-I).
    7. Выполните по крайней мере одно дополнительное стремление на орган/животное, чтобы обеспечить репликацию выборки.
    8. Вернуть анестезию с подкожной инъекцией 200 л 1 мг/кг атипамезола в солевой растворе и вернуть животных в родную клетку для выздоровления и наблюдать до полного выздоровления.

2. Подготовка мазка из аспирового материала

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки на протяжении всей процедуры и обеспечить безопасное удаление игл и шприцев.

  1. Метод вытягивания двух шагов
    1. Возьмите слайд, который имеет падение аспирата с помощью недоминирующей стороны, и щепотку матовый конец между большим и указательным пальцем (Рисунок 3A).
    2. Возьмите второй чистый слайд, распределительник слайд, с доминирующей рукой и довести его через первый слайд с падением аспирата. Поместите гладкий чистый край слайда на образец слайд только на верхней части капли под углом примерно 30 "(Рисунок3B).
    3. Скользить слайд вперед с одним легким, непрерывным и устойчивым движением, чтобы получить тонкую пленку(Рисунок 3C).
    4. Отдых слайд и обеспечить полную и быструю сушку воздуха материала(Рисунок 3D). Не нагревайте. Наклейте карандашом матовый край горки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен на этом этапе и мазки могут храниться бесконечно, пока не будет готов к окрашивания.

3. Окрашивание мазков

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки на протяжении всей процедуры и убедитесь, что шаги 3.1.4 и 3.2.9 выполняются внутри капота дыма.

  1. Протокол окрашивания Гимсы
    1. Исправить высушенные в воздухе мазки, погрузив слайды в банку Коплин, содержащий 100% метанола в течение 5 мин(рисунок 3E).
    2. Перенесите слайд в банку Коплина, содержащую 20% раствор giemsa (разбавленный до 1/5 в дистиллированной воде) в течение 30 мин, или 10% Giemsa в течение 10 мин(рисунок 3F).
    3. Промыть в водопроводной воде и высушить тщательно с помощью бумаги ткани, чтобы мазок.
    4. Держите слайд горизонтально и нанесите одну каплю неводно-разводной среды крепления на мазок. Поместите край крышки стекла на слайд, опустите его и нажмите осторожно, чтобы удалить любые пузырьки воздуха.
  2. Иммуноцитохимия в мазках ФНА
    1. Исправить высушенные на воздухе мазки в 100% метанола при комнатной температуре в течение 10 минут.
    2. Вымойте слайд в течение 5 минут в банку Коплин с 1x фосфат буфера (PBS), повторяя этот шаг 3 раза с помощью свежих 1x PBS каждый раз.
    3. Удалите слайд из банки Коплин, протрите лишний буфер, не касаясь мазка и нарисуйте круг вокруг мазка с водоотталкивающим пером (Таблица материалов).
    4. Держите слайд горизонтально и нанесите 150 л разбавленного первичного раствора антитела к каждому мазку и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичное антитело, используемое здесь, является неочищенным антигеном сыворотки кролика anti-T. brucei VSG13 (кросс-реактивным со многими T. brucei VSGs, произведенным в доме), разбавленным в 1x PBS в 1:50,000. Выполните отрицательный контроль, заменив соответствующее первичное антитело с предиммунной сывороткой(Таблица материалов), чтобы обеспечить оценку неспецифических связывания вторичного антитела.
    5. Вымойте слайд в течение 5 минут в банку Коплин с 1x PBS, повторяя этот шаг 3 раза с помощью свежих 1x PBS каждый раз.
    6. Держите слайд горизонтально и нанесите 150 л коммерчески доступной системы визуализации куньда/DAB для каждого мазка. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре(Таблицаматериалов).
    7. Вымойте в течение 3 раз в течение 5 мин в 1x PBS.
    8. Противокоесть, погружая слайды в банку Коплин, содержащий Харрис гематоксилин. Промыть в водопроводной воде и высушить тщательно с помощью бумаги, чтобы мазок.
    9. Держите слайд горизонтально и нанесите одну каплю неводно-разводной среды крепления на мазок. Поместите край крышки стекла на слайд, опустите его и нажмите осторожно, чтобы удалить любые пузырьки воздуха.

Representative Results

FNA была выполнена во внешних мужских репродуктивных органов мышей, инфицированных T. brucei с использованием 22 G иглы в сочетании с 5 мл шприц, и стеклянные слайды для подготовки мазка (Рисунок1A-C). Метод прост, но оптимальные результаты опираются на критические шаги: идеальная иммобилизация мыши, достигнутая с помощью общей анестезии, и стабилизация органов на протяжении всей процедуры(рисунок 2A-B). Всасывание применялось 2-3 раза и иглы перенаправлялось 1-2 раза, чтобы обеспечить репрезентативную выборку мелких органов и тканей: эпидидимиса и эпидидимального жира. Отрицательное давление было выпущено до экстернализации иглы. Аспират, содержащийся в просвете и концентраторе иглы (примерно 20 кЛ), был использован для производства 2 мазков(рисунок 3A-C). В тех случаях, когда игла была изъята без высваски, материал всасывался в шприц и не поддавился. Процесс успешно повторялся дважды, по одному для каждого парного органа. После высыхания были выполнены мазки, и была проведена иммуноцитохимия для пробаносомных поверхностных белков.

Мазок хорошего качества(рисунок 4A-C) характеризовался монослой клеток с хорошей плотностью клеток, в котором клетки-хозяина показывают сохранившиеся морфологические особенности, позволяющие идентифицировать их ткани происхождения и относительного пропорции между друг другом. Паразиты были эффективно иммуно-окрашенные, идентифицируемые и подсчитывается(рисунок 4B). Также показан один случай ФНА перитонеального выпота в инфицированной мыши, окрашенной giemsa для прямого наблюдения и диагностики(рисунок 3D-F и Рисунок 4C).

Плохой или отрицательный результат FNA может быть обусловлен различными причинами: (1) слишком мало материала FNA выражается на слайде и является недопредставленной выборки; (2) слишком много материала FNA выражается на одном слайде, делая слишком толстые мазки и ухудшая цитологические оценки; (3) слишком много силы применяется при принятии мазка, и клетки нарушаются, в результате чего много голых ядер и ДНК полосы (раздавить артефакт); или (4) недостаточно силы применяется при принятии мазка и клетки не дезагрегировать, в результате чего стратифицированный слой, который препятствует оценке морфологических особенностей клеток (Рисунок 5).

Когда мы сравниваем синтопатологию ФНА с гистопатологией, т.е. анализ клеток и тканей, кулак имеет то преимущество, что клеточная морфология лучше сохраняется и относительные пропорции и подсчет клеток можно лучше оценить(рисунок 6). Кроме того, иммуноцитохимия проще, быстрее и проще в оптимизации, чем иммуногистохимия, которая обычно выполняется в формилино-фиксированной и парафина встроенных тканей.

Целевой Приложений Преимущества Ограничения
Ощутимая масса Обычная микроскопия, диагностика Простой, быстрый Нет архитектуры тканей
Орган Иммуногистохимия Низкая стоимость Слепое устремление (игла может пропустить цель касательно; аспирация может быть нацелена на некротические, кистозные или геморрагические области)
Излияния Цитометрия потока Выборка с нескольких сайтов
Цитогенетика Хорошо сохранившаяся клеточная морфология
Электронная микроскопия Без осложнений
ПЦР, другие молекулярные методы Высокая точность диагностики
Биохимический анализ Анестезия (для иммобилизации)
Анализы в пробирке, клеточная культура Нетерминальная процедура

Таблица 1: Целевые, общие приложения, преимущества и ограничение тонкой аспирации иглы.

Комплект FNA Архетип аспирации иглы и шприца
Стремление: Игла части:
1. Одноразовые пластиковые шприцы (5 или 10 мл)(рисунок 1B) Бевел. Наконечник вала иглы наклонен, чтобы сформировать точку, наклонная будучи скотом. Только смелые иглы подходят для перкутанных устремлений.
3. Иглы от 22 до 25 калибров (диаметр); 0,75, 1,0, 1,5 дюйма в длину, со стандартной сквежовой иглой наконечник края(рисунок 1A) Шафт. Полая трубчатая часть иглы, длина которой может быть скорректирована в зависимости от глубины массы. Колеизг иглы соответствует диаметру ее скважины, которая представляет собой диаметр внутренней части вала (меньшие иглы имеют более высокий датчик). Использование больших игл (менее 22 G) полезно для повышения клеточной, хотя это может привести к чрезмерному ятрогенного загрязнения крови.
1. Анестезия (при необходимости). Боль, связанная с FNA, аналогична боли венозного прокола, однако хорошее стремление требует хорошей иммобилизации предмета, особенно важного у мелких животных и/или для небольших, колеблющиеся поражения и органов. Крысы и мыши, подпадающие под действие ФНА, должны быть надлежащим образом пассивно сдержаны или, при необходимости, успокоительны или находиться под легкой общей анестезией. Концентратор. Пластиковая часть иглы, прикрепленной к шприцу; должны быть прозрачными, чтобы обеспечить визуализацию аспирированных материалов. Материал аспирата, полученный во время ФНА, должен быть собран в вал иглы, и аспирация прекращается, когда материал проявляется в концентраторе.
FNA мазка решений и интерпретации: Части шприца:
1. Замороженные конце стекла микроскоп слайды(Рисунок 1C) Баррель/цилиндр. Полая часть шприца. Если дело с кистозными поражениями или выпотов, материал, который аспирируется в бочке, как правило, не могут быть восстановлены. Идеальный объем аспирата для цитологии ФНА составляет примерно 5 зл, что соответствует среднему объему аспирата, который занимает вал и концентратор иглы.
2. Пятна романовского типа (например, Дифф-Квик, Гимса) Совет. Конец ствола, к которому крепится концентратор иглы.
3. Микроскоп (яркое поле) Пвермер. Подвижная часть шприца, который имеет плоский диск или губу на одном конце и резиновый уплотнитель на другом конце. Подходит в бочку и обеспечивает давление, чтобы привлечь клетки, жидкость в иглу. Идеально запечатанный поршень, который создает хорошее негативное давление, является обязательным для получения хорошей аспиратодоходности.

Таблица 2: Оборудование и материалы, необходимые для тонкого аспирации иглы.

Figure 1
Рисунок 1 : Инструменты и результаты для тонкого аспирации иглы. (A) Идеальный диаметр иглы для FNA составляет от 22 до 25 G. (B) Идеальный объем шприца для получения хорошего аспирата выход от 5 до 10 мл. (C) Чистый, сухой, без смазки стеклянной горки с матовой маркировки области для написания карандашом и предварительно покрытием (если для иммуногистохимии). (D) Пример трипаносомы наблюдается с Giemsa окрашивания (черная стрелка), immunostained для VSG поверхностных белков (белая наконечник стрелки) и под передачей электронной микроскопии (блок стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Схемы, показывающие тонкое стремление иглы (FNA) внешних мужских репродуктивных органов (testis, epididymis, и эпидидимальный жир) у мышей. (A) После того, как животное защищено, предварительно собранный инструмент аспирации берется. (B-C) Вставьте кончик иглы в целевой орган. (D) Применить всасывания, втягивая шприц поршень на 1 мл до 2 мл знака, неоднократно 3-4 раза. Наконечник иглы также может быть перемещен туда и обратно в пределах цели при применении всасывания, чтобы собрать достаточно материала. (E) Отпустите всасывание и только после этого снимите иглу. (F) Удалить иглу из шприца и (G) Потяните поршень обратно. (H) Прикрепите иглу. (Я) Изгнать материал на стеклянную горку, нажав поршень быстро через шприц. Для того, чтобы избежать брызг, убедитесь, что кончик иглы отдыха очень близко или даже на слайде. Капля аспирата находится примерно в 1 см от края матовой зоны маркировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Подготовка мазка и окрашивание. (A) Держите один конец слайда (замороженная область) между большим и указательным пальцами. (B) Поместите гладкий чистый край второго слайда (распределителя) на слайде образца прямо перед каплей материала. (C) Сдвиньте распространение вперед один раз с умеренной скоростью, чтобы получить тонкую пленку. (D) Разрешить слайд воздух сухой и этикетки матовый край слайда с карандашом. (E) После полной сушки исправить с метанолом в течение 5 мин. (F) Пятно с 20% Giemsa раствор для 30 мин (или 10% Giemsa в течение 10 мин). Слегка смыть водой, полностью высушить, окунуть в ксилен и смонтировать с водорастворимым монтажным агентом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Микрофотографии мазков, полученных из ФНА внешних мужских репродуктивных структур у мышей, инфицированных Т. Брюси. ()Грубый внешний вид хорошего качества прямого мазка: материал был выражен на слайде примерно на 1 см от матового края (черная точка), смазаны и остановился 0,5 см до края слайда (параллельные линии). (B) Иммуноцитохимия для поверхностных белков паразита (VSG) была выполнена для мазков, полученных от FNA внешних мужских репродуктивных органов на 6-й день инфекции. Многочисленные паразиты (стрелка) были обнаружены admixed с мышью зародышевых клеток (стрелка). DAB противопоставляет Харрису гематоксилин. Оригинальное увеличение: 40x (шкала бар 50 мкм). (C) Giemsa-окрашивая мазка полученного после FNA перитонеального выпота на день 21 инфекции, показанной многочисленнNp даримоза (стрелка) admixed с клетками хозяина (мыши), в этом случае воспалительные клетки, макрофаги (стрелка) и лимфоциты. Оригинальное увеличение: 40x (шкала бар 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5 : Плохое качество fNA мазков. (A) Плохо клеточный мазок, под-представитель массы или органа. (B) Очень толстый мазок. (C) Измельченный артефакт, с нарушенными клетками, голыми ядрами и полосами ДНК. (D) Агрегаты и стратифицированные слои клеток. DAB противопоставляет Харрису гематоксилин. Оригинальное увеличение: 20x (шкала бар 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6 : Сравнение эпидидимальной цитологии и гистологии у мышей, инфицированных Т. Брюси. (A) Микрофотографии, соответствующие мазку FNA и (B) 4 мм парафин раздел, при том же увеличении (20x оригинальное увеличение, шкала бар 100 мкм), как иммуноокрашенные для поверхностных белков паразита (VSG). Мазок показал большое количество паразитов (стрелка) с хорошо сохранившейся клеточной морфологии, admixed с умеренным числом зародышевых клеток и несколько сперматозоидов (стрелка). Гистологический раздел показал хорошо сохранившуюся архитектуру тканей, состоящую из эпидидимальных протоков с внутрисветовой сперматозоидов (стрелка), а также наличие большого количества паразитов, расширяющих эпидидимальную строму (стрелку). DAB противопоставляет Харрису гематоксилин. Оригинальное увеличение: 20x (шкала бар 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Fine Needle Aspiration (FNA) является методом, широко используемым для диагностики заболеваний у человека и домашних животных. Техника была стандартизирована на протяжении многих лет1,2, который использует мелкой иглы, чтобы аспирировать клетки или жидкость из ощутимой массы или органа1,3. Аспират затем, как правило, смазывают на стеклянной горке и окрашенных для микроскопического наблюдения для достижения диагноза, но техника также может быть использован аспиратом для других целей4,5,6, 7 (г. , 8 , 9.

Процедура быстрая (для опытного исследователя 5 мин на мышь) и риск осложнений минимален, по аналогии с риском, понесенным при прохождении простого венозного прокола. По этой причине, для FNA ощутимых масс, анестезия требуется только для чувствительных анатомических местах или когда хорошая иммобилизация животного и стабилизации органа или массы, чтобы быть аспирированным чрезвычайно важно для оптимальных результатов. Это часто для мелких лабораторных животных, как безопасное и эффективное ограничение небольшого грызуна с одной стороны, обеспечивая лучший доступ к области для устремления с другой стороны, трудно достичь без анестезии. Краткосрочная анестезия в большинстве случаев достаточна, тем не менее необходима, для хорошего FNA в мыши. Хорошая иммобилизация максимизирует шансы получения аспирата, который является репрезентативным для клеточных компонентов поражения, а также сводит к минимуму шансы на экстернализацию кончика иглы при применении отрицательного давления.

Хотя сама процедура очень проста, скоординированное применение и высвобождение вакуума являются наиболее важными шагами. После вставки иглы, поршень шприца убирается для достижения контролируемого вакуума (всасывания), и игла может быть удалена из массы только после освобождения отрицательное давление, отпустив поршень (Рисунок 2); в противном случае аспират всасывается в бочку шприца, а затем очень трудно восстановить. Еще одним очень важным шагом является подготовка высококачественных мазков. Существуют различные методы, чтобы сделать мазок, но независимо от метода, мазки должны быть подготовлены сразу же после того, материал был помещен на стекло. Биологический материал должен быть распространен осторожно, чтобы избежать клеточной дробления артефактов. Использование coverslip в качестве распределители может помочь предотвратить эти артефакты. Тем не менее, применение слишком много силы при принятии мазок сломает coverslip. Мазок хорошего качества обычно имеет большую часть популяции клеток, распределенных как монослой, так что они могут легко передавать свет. Сотовый материал не должен быть чрезмерно в ловушке в сгусток крови.

Целью FNA является сбор клеток из массы, ткани или органа. Использование больших игл ы полезны для увеличения клеточной, но может быть связано с чрезмерным загрязнением крови, в то время как выборка с меньшими иглами дает более высокое качество, хотя и менее обильный материал. В нашем случае, перкутанное стремление внешних мужских репродуктивных структур у мышей, экспериментально инфицированных T. brucei, было выполнено с 22-калиберными иглами в сочетании с 5 мл шприца. Мыши были под анестетом, яички стабилизировались одной рукой и проколить и стремление руководствоваться и выполняется с другой стороны. Мы извлекли многочисленные трипаносомы, смешанные с зародышевыми клетками, сперматозоидами, сперматозоидами, эпителиальными клетками и стромальными клетками, которые были смазаны и ослаблены на поверхностные белки паразитов (VSG) (Рисунок 4).

Существует всегда потенциальная ошибка выборки в аспирати дает отрицательные результаты, потому что, хотя несколько областей данного поражения могут быть отобраны несколько раз, это слепое стремление, где мы не визуализировать кончик иглы и целевой орган или массу. Это крайне актуально в клинических условиях, где негативное FNA подозрительного поражения не отменяет дальнейших исследований, но это не так актуально в животных моделях болезни. Таким образом, общие ограничения включают в основном ложные отрицательные результаты и реже ложные положительные результаты (например, от загрязнения крови), но наиболее важным ограничением в настройках экспериментов на животных является отсутствие информации о тканях архитектура17, как у нас с гистопатологией, например, распределение картины паразитов, иммунных клеток, и клеточных взаимодействий особенностей. Тем не менее, преимущества в том, что FNA является нетерминальной процедурой, позволяющей проводить повторный отбор проб в одном и том же животном, и всегда позволяет лучше сохранившуюся клеточную морфологию(рисунок 5). Альтернативы FNA для сбора клеток-хозяев, иммунных клеток или микроорганизмов от мыши всегда полагаются на эвтаназию мыши для сбора массы или органов, представляющих интерес.

Насколько нам известно, Есть только несколько докладов об использовании FNA в небольших лабораторных животных, один из 1949, соответствующие стремление костного мозга с 22 G иглы для изучения hematopoiesis18, и все другие в сочетании с потоком цитометрии количественно либо опухолевых воспалительных клеток или эндотелиальных клеток7,19,20. Наша работа показывает, что этот метод может быть распространен на диагностику и изучение моделей инфекционных заболеваний и может сочетать цитологию с такими методами, как иммуноцитохимия или электронная микроскопия. Два основных преимущества метода у экспериментальных животных: (1) эта процедура не является терминальной, т.е. может быть выполнена у живых мышей; и (2) из-за своей легкой тяжести он позволяет для серийных устремлений в том же животном. Таким образом, меньше мышей требуется для каждого исследования, и корреляция между прогрессированием клинических заболеваний и эволюции клеточных и молекулярных особенностей болезни и / или микроорганизмов может быть легко выполнена, что позволяет продольных исследований.

Возможно, первый доклад об использовании FNA для диагностики инфекционных заболеваний является исследование Григ и Грей в 1904 году, что доклады иглы стремления лимфатических узлов от пациентов со сонной болезнью, которая показала, мотилические trypanosomes12. Если наши выводы на лабораторных мышах найдут перевод на крупный рогатый скот, т.е. если трипаносома может быть легко отобрана ФНА из внешних мужских репродуктивных структур, можно ожидать, что этот метод будет полезен ветеринарам для диагностики животных трипаносомоз на ферме, в животноводстве.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Этот проект был профинансирован Фондом пара Ci'ncia e Tecnologia (FCT)/ Министерио да Сьенсия, Tecnologia электронной Ensino Superior (MCTES) через Fundos ду Оршаменто де Эстадо (реф.: ID / BIM/50005/2019). LMF является исследователем Фонда пара Ci'ncia электронной Tecnologia (IF/01050/2014) и лаборатория финансируется ERC (FatTryp, ref.771714). Публикация этой работы также финансировалась UID/BIM/50005/2019 проект, финансируемый Funda'o para a Ci'ncia e a Tecnologia (FCT)/ Министерио да Сьенсия, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) через Fundos do Or'amento de Estado. Мы благодарим Андрея Пинто из Лаборатории гистологии и сравнительной патологии ИММ за помощь эксперта по электронной микроскопии, а Сандру Триндаде, Тиаго Ребело и Энрике Мачадо (iMM) за обмен тканями инфицированных мышей.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) Bio 2 7418046 Anesthesia reversal
Cover slips (24 x 60 No.1) VWR 631-0664 Smear making
DAB Dako K3468 Immunocytochemistry
Entellan (500 mL) VWR 1.07961.0500 Mounting media
Envision Flex antibody diluent Dako 8006 Immunocytochemistry
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) Dako K4010 Immunocytochemistry
Envision Flex Wash Buffer Dako K8007 Immunocytochemistry
Giemsa stain Atom Scientific Ltd RRSPSS-A Smear staining
Glass slides (Superfrost Plus) VWR 631-9483 Smear making
Harris Haematoxylin Bio-optica 05-06004E Immunocytochemistry
Hydrogen Peroxidase solution Sigma H1009-500ML Immunocytochemistry
Hypodermic needles Microlance 3 (23 G) Henry Schein 902-8001 Aspiration technique
Ketamin (IMALGENE 1,000-10 mL) Bio 2 7410928 Anesthesia
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) Bio 2 7418335 Anesthesia
Methanol Merck 1.06009.2511 Smear fixative
Pap pen Merck Z377821-1EA Immunocytochemistry
Protein Block Serum free Dako X0909 Immunocytochemistry
Syringes (5 mL, 10 mL) Henry Schein 900-3311, 900-3304 Aspiration technique

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leopold, G., Koss, M. R. M. Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. Lippincott Williams and Wilkins. (2006).
  2. Raskin, R. E., Meyer, D. J. Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. (2016).
  3. Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185, (3), 819-824 (1992).
  4. Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107, (33), 14524-14529 (2010).
  5. Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
  6. Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40, (4), 307-319 (1998).
  7. Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
  8. Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43, (6), 985-990 (1999).
  9. Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63, (5), 1038-1042 (1995).
  10. Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120, (3), 351-367 (1998).
  11. Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47, (2), 191-197 (2009).
  12. Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1, (2265), 1252 (1904).
  13. Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47, (6), 727-734 (1972).
  14. Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. 1-15 (2009).
  15. Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12, (2), 186-194 (2012).
  16. Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19, (6), 837-848 (2016).
  17. Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12, (8), 1-15 (2018).
  18. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, (5), 557-561 (2013).
  19. Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13, (3), 251-258 (2010).
  20. Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21, (7), 648-661 (2013).
Обнаружение внесосудистой <em>трипаносомой</em> паразитов путем тонкого аспирации иглы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).More

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter