Summary
המוצג כאן הוא פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ טמפרטורה שבשליטת המצב המאפשר מכולה לדוגמה להיות רכוב על מיקרוסקופ אנכי.
Abstract
הדגימות ממוקמות בדרך כלל על מיקרוסקופ אופקי להתבוננות מיקרוסקופית. עם זאת, כדי להתבונן ההשפעה של הכבידה על מדגם או לחקור התנהגות הצפה, יש צורך להפוך את הבמה המיקרוסקופ אנכית. כדי להשיג זאת, מיקרוסקופ הפוכה הצידה מוטה על ידי 90 ° כבר המציאו. כדי להתבונן בדגימות במיקרוסקופ זה, יש לאבטח מכולות כגון מנות פטרי או מגלשות זכוכית לשלב האנכי. מכשיר שיכול לאבטח מכולות לדוגמה במקום על במת מיקרוסקופ אנכי פותחה והוא מתואר כאן. ההחזקה של התקן זה לבמה מאפשרת התבוננות של דינמיקה לדוגמה במישור האנכי. היכולת לווסת את הטמפרטורה באמצעות דוד גומי סיליקון גם מאפשר התבוננות של התנהגויות לדוגמה תלויי טמפרטורה. יתר על כן, נתוני הטמפרטורה מועברים לשרת אינטרנט. ניתן לשלוט בהגדרות הטמפרטורה ובניטור יומן הרישום מרחוק ממחשב או מטלפון חכם.
Introduction
מיקרוסקופ אופטי היא טכניקה המועסקים כדי להגדיל את הפרטים הנצפה באמצעות הגדלה של מדגם עם עדשות ואור גלוי. במיקרוסקופיה אופטית, אור מופנה למדגם, ולאחר מכן משודר, משתקף, או אור ניאון נתפס על ידי עדשות מגדלת להתבוננות. סוגים שונים של מיקרוסקופ זמינים שונים בעיצוב כדי להתאים שימושים שונים ושיטות התבוננות. העיצובים השונים כוללים מיקרוסקופ זקוף, הבנוי להאיר מדגם מלמטה להתבוננות מלמעלה, ומיקרוסקופ הפוך, המאיר את המדגם מלמעלה להתבוננות מלמטה. מיקרוסקופים זקופה הם העיצוב הנפוץ ביותר בשימוש נרחב. מיקרוסקופים הפוכים משמשים לעתים קרובות כדי להתבונן בדגימות שאינן יכולות לאפשר לעדשה להיסגר במרחק מלמעלה, כגון תאים מתורבתים העומדים בתחתית המיכל. קבוצות מחקר רבות דיווחו על תצפיות במגוון רחב של שדות באמצעות מיקרוסקופים הפוכה1,2,3,4,5,6,7. התקנים נוספים רבים פותחו גם כי לנצל את התכונות של מיקרוסקופים הפוכה8,9,10,11,12,13 .
כיום, בכל העיצובים המקובלים במיקרוסקופ, בשלב המיקרוסקופ הוא אופקי ולכן הוא לא מתאים להתבוננות של דגימות הפקת תנועה במישור האנכי, (בשל כוח הכבידה, ציפה, תנועה, וכו '). כדי לגרום לתצפיות אלה להיות אפשריות, יש לסובב את שלב המיקרוסקופ ואת הנתיב האור לאנכי. השלב האנכי נדרש להרכבה אנכית של שקופיות זכוכית או לדוגמה מכולות כגון מנות פטרי לבמה. כדי לענות על כך, מיקרוסקופ הפוכה הצידה מוטה על ידי 90 ° כבר המציאו. עם זאת, הצמדת דגימות באמצעות קלטת או דבקים אחרים אינה מהווה את היכולת הדרושה לניידות ארוכת טווח. המתואר כאן הוא מכשיר שיכול להשיג את היציבות הנדרשת. התקן זה מאפשר תצפית לאורך זמן של תנועה לדוגמה במישור האנכי. הרכבה של דוד גומי סיליקון גם עשה את זה ניתן לצפות את ההשפעה של וריאציה טמפרטורה על התנהגות מדגם. נתוני הטמפרטורה מועברים לשרת אינטרנט על-ידי Wi-Fi, והגדרות הטמפרטורה וניטור היומן ניתנים לשליטה מרחוק ממחשב או מטלפון חכם. לידיעתך, השלב המצורף למיקרוסקופ מוטה לצדדים, שוטה על ידי 90 °, עדיין לא דווח במחקרים קודמים.
בשלב המיקרוסקופ מורכב שלושה צלחות אלומיניום. לוחית האלומיניום האמצעית מותקן לצלחת האלומיניום התחתונה המתחבר לבמה. גומי הסיליקון המכיל את חיישן הטמפרטורה מחובר בין לוחיות האלומיניום האמצעיות באמצע ובחלק העליון. גומיות משמשות להצמיד את המדגם. טפרים הם מחוברים בשמאל ובימין ארבע נקודות של צלחת האלומיניום העליון כדי לאבטח את להקות גומי. מעגל הבקרה של וסת הטמפרטורה מקבל אות מחיישן הטמפרטורה מוטבע גומי סיליקון ומודולציה חשמל באמצעות אפנון רוחב הדופק (PWM) שיטה. ניתן להגדיל בהדרגה את הטמפרטורה ל-50 ° c בהפרשים של 1 ° c. התקן זה שימושי עבור יישומים שבהם תנועות לדוגמה אנכית עשויות להיות תלויות טמפרטורה.
דו ח זה מספק דוגמאות לאפקטי טמפרטורה על התופעה הצפה של דיטומים. כדוגמאות של צורניות לימודי תצפית, מדידות של מהירות משקעי מצברים של אשכולות תאים, ניתוח תנועה, לימודי מבנה ultrafine, וכו ' דווחו14,15,16,17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , 23. הכבידה הספציפית של דיאטומים הצפים במים עם אורגניזמים פוטוסינתטיים הוא מעט גבוה יותר מזה של מים, כך הם נוטים לשקוע; עם זאת, הם יעלו אם אפילו הסעה קלה מתרחשת. כדי ללמוד תופעה זו, שקופית זכוכית מודבקת אנכית לשלב המיקרוסקופ, ואת ההשפעות של הטמפרטורה הגוברת על התנועה האנכית צורניות הם נצפו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב
- ייצור פלטות אלומיניום
- חותכים חור 101 מ"מ במרכז של צלחת אלומיניום של מידות 150 mm x 200 mm x 2 מ"מ לשמש צלחת החזית עם מכונת עיבוד לייזר. מכונת טפרים בשמונה נקודות להצמיד שתי רצועות גומי באורך, או שתיים לרוחב הצלחת הזאת (ראה משלים איור 1a ומשלים איור 2a).
- חותכים חור 130 מ"מ במרכז של אחר 150 mm x 200 mm x 5 מ"מ צלחת אלומיניום לשמש לצלחת העליונה האמצעית עם מכונת עיבוד לייזר. מכונת שמונה חריצים לחיבור להקות גומי בשתי נקודות באורך, או שתיים לרוחב הצלחת הזאת (ראה משלים איור 1b ואיור 2 ב').
- חותכים חור 130 מ"מ במרכז של 150 מ"מ x 200 mm x 4 מ"מ לוחית אלומיניום כדי לשמש את הצלחת הנמוכה באמצע עם מכונת עיבוד לייזר (לראות משלים איור 1c ומשלים איור 2c).
- חותכים חור 30 מ"מ במרכז של 150 mm x 200 מ"מ x 1.5 מ"מ לוח אלומיניום לשמש לוחית הבסיס (ראה משלים איור 1d ו משלימה איור 2d).
- הייצור של שני ממעמד אלומיניום
- חותכים חור 30 מ"מ במרכז צלחת האלומיניום (100 מ"מ קוטר, 3 מ"מ עובי) ולעשות חריץ מצד אחד עם מידות 42 מ"מ רחב x 30 מ"מ עמוק (לראות משלים איור 3A).
- חותכים חור 30 מ"מ במרכז הצלחת בצלחת אלומיניום (100 מ"מ קוטר, 4 מ"מ עובי) ומקדחה שלושה גומות 3 מ מ הממוקם 25 מ"מ מהמרכז, במרווחים 120 ° זה מזה (ראה משלים איור 3B).
- הייצור של שלושה דיסקת השעם הדחוסה
- חותכים חור 20 מ"מ במרכז של דיסק שעם לחצה (100 מ"מ קוטר, 2 מ"מ עובי) עם מכונת חיתוך סילון מים. לעשות אחד לחתוך 42 מ"מ על פני x 30 מ"מ עמוק, ואז אחד לחתוך 4 מ"מ רוחב x 5 מ"מ עמוק (לראות משלים איור 4A).
- חותכים חור 20 מ"מ במרכז של דיסק שעם לחצה של מידות 100 מ"מ קוטר, 1 מ"מ עובי עם מכונת חיתוך מטוס מים. לעשות לחתוך 42 mm על פני x 30 מ"מ עמוק, לחתוך 4 מ"מ רוחב x 40 מ"מ עמוק (לראות משלים איור 4B).
- חותכים צלחת שעם לחצה מדיסק קוטר 100 מ"מ עם רוחב 42 מ"מ ו 30 מ"מ עומק. שני גיליונות של עובי 1 מ"מ וגיליון אחד של עובי 2 מ"מ נדרשים (ראה משלים איור 4C).
- ייצור דוד גומי סיליקון
- הרכיבו חימום באמצעות דיסק 100 מ"מ בקוטר של 2.5 מ"מ גומי סיליקון עבה עם מובנה תיל Nichrome וחותכים חור 20 מ"מ במרכז הדיסק (ראה משלים איור 5).
- להרכיב חלקים שתוארו בשלבים 1.1 – 1.4 על ידי הערמה אותם כפי שמוצג באיור המשלים 6.
- לבניית מיקרוסקופ, התייחס לאיור 6, חתך רוחב של שלב המיקרוסקופ. תקן
ולאחר 
מכן 
עם ברגים. תקן 
עם ברגים. תקן ו 
, ו, ו, ו, ועם דבק. 
ולאחר 
מכן 
עם ברגים. תקן 
עם ברגים. תקן 
, ו, ו, ו, ועם דבק. 
2. קווי מתאר לעיצוב חומרה
- הכן "מעגל אספקת חשמל ותיכנות" כפי שמוצג באיור 7. אספקת 12 V DC לבקר החימום מהמסוף J4 המחובר למתאם AC. הנמך את המתח מ-12 וולט DC ל-3.3 V DC עבור ספק הכוח המעגלי באמצעות וסת מכיוון שמתח אספקת ה-CPU הוא 3.3 V DC.
הערה: USB 1 הוא מסוף עבור 5 מחשבי DC ואות טורי של מחשב הפיתוח. למרות DC 5 V אינו חיוני, הוא משמש כמקור הכוח לתכנת את ה-CPU. זה מומר גם ל-3.3 V DC על ידי הרגולטור. J1 הוא מסוף אותות שליטה בזמן התיכנות. מעגל זה שוכן במקרה הבקר המוצג באיור משלים 8. - הכן "מעגל בקרת חימום" כמוצג באיור המשלים 7. מעבר ל 12 V DC עם Q5 (ערוץ P מעיל MOS) ולספק אותו לחימום. Q5 הוא רכיב מיתוג השולט ב-12 וולט DC עם PWM כדי לכוונן את כמות החשמל המסופקת לחימום.
הערה: המעגל כולל LED כדי לוודא חזותית כי מתח מסופק החימום. אות כונן זה (HEATER_C) הוא אות PWM מתוך ה-CPU. כאשר מזוהה אות התחממות יתר על-ידי מעגל ההגנה, אות השובר מתחלף לנמוכה, והפעולה של ה-MOS-בספט עוצרת. מעגל זה שוכן במקרה הבקר המוצג באיור משלים 8. - הכן "מעגל מחבר ליחידת חימום" כפי שמוצג באיור המשלים 7. התקן מחבר USB לחיבור עם מקטע החימום.
הערה: מעגל זה שוכן במארז הבקר המוצג באיור המשלים 8. - הכן "מעגל מחבר עבור חיישן הטמפרטורה" כפי שמוצג באיור המשלים 7. הר את המחבר (2P השקע Euroblock) כדי לחבר את חיישן הטמפרטורה.
הערה: מעגל זה שוכן במארז הבקר המוצג באיור המשלים 8. - עבור ממיר "A/D" כפי שמוצג באיור המשלים 7, השתמש ב-ADS 1015 כהתקן המרת AD.
הערה: התקן המרת AD ממיר את הערכים של חיישן הטמפרטורה ואת חיישן זיהוי התחממות יתר ממתח לערכים דיגיטליים. זוהי יחידת ההמרה של 12 סיביות AD התקן המרה והוא מחובר ל-CPU עם ממשק I2C. מעגל זה שוכן במקרה הבקר המוצג באיור משלים 8. - לעשות "להגן על מעגל" כפי שמוצג באיור משלים 7 על ידי חיבור חיישן זיהוי התחממות יתר (ohs) האות לתוך הזנה היפוך של מגבר OP. השווה אות זה למתח של מסמן הקוצץ המחובר לקלט שאינו מיפוך.
- ודא כי כאשר המתח הופך נמוך יותר מאשר המתח של המפר הקוצץ, הפלט של מגבר OP הולך גבוה, טרנזיסטור NPN מחובר Q2 מופעל ו האות מפסק עובר נמוך.
- ודא כי באותו זמן, רבעון 4 מפעיל את אינדיקטור התחממות יתר מחובר LED D6 אורות למעלה.
הערה: מעגל זה שוכן במארז הבקר המוצג באיור המשלים 8.
- עבור "מקטע תצוגה" כפי שמוצג באיור משלים 7, השתמש 192 x 64 נקודות עבור OLED. התחבר עם ה-CPU באמצעות ממשק I2C.
- לאפס את OLED על ידי הפרדת ה-GND של OLED על ידי אות ה-CPU IO0 באמצעות טרנזיסטור NPN Q1 מחובר ל-GND של OLED.
הערה: OLED זה מציג סוגים שונים של מידע. מעגל זה שוכן במקרה הבקר המוצג באיור משלים 8.
- לאפס את OLED על ידי הפרדת ה-GND של OLED על ידי אות ה-CPU IO0 באמצעות טרנזיסטור NPN Q1 מחובר ל-GND של OLED.
- עבור "LED & מקודד רוטרי עם מתג לדחוף" באיור משלים 7, הר מקודד רוטרי על ידי הלחמה שמתפקד כמו מתג דחיפה משלבת שני נוריות.
- חבר נורית LED אחת ל-VCC לשימוש כנורית חשמל. השני מחובר ל-CPU לשימוש כמחוון במהלך פעולת החימום.
- השתמש במתג דחיפה ליצירת קשר עם הפעלת מחמם הפעלה/עצירה המחוברת ל-CPU. חבר את התפוקות A ו-B של המקודד הרוטרי לערכת קלט ה-IO בפסיקת ה-CPU.
הערה: מעגל זה שוכן במארז הבקר המוצג באיור המשלים 8.
- עבור ה-CPU באיור המשלים 7, השתמש ב-CPU של Wroom-02d.
- פלט מ-IO12, IO13 ל "יחידת התצוגה" מאחר שהממשק של התצוגה הוא I2C תקן. חבר IO0 "להציג יחידה" ולאפס את OLED.
- חיבור IO15 "יחידת בקרת חימום" ולשלוט על הכוח המסופק החימום על ידי פלט PWM.
- לחבר IO2 "LED & מקודד רוטרי עם מתג לדחוף" ולהדליק את ההתחלה LED. חבר IO4 ו IO14 "LED & מקודד רוטרי עם מתג לדחוף" ולקבל את האותות (REA ו-ר') מן המקודד רוטרי כדי לקבוע את טמפרטורת set. לחבר IO5 "LED & מקודד רוטרי עם מתג לדחוף" ולהתחיל/לעצור את החימום.
3. מיתאר לעיצוב תוכנה
- השתמש Arduino CORE עבור WROOM-02D עבור ה-CPU כבקר עבור מערכת זו.
הערה: כהתקני קלט, מתג ההפעלה/העצירה, מקודד הרוטרי, חיישן הטמפרטורה (thermistor) משמשים. כמו התקני פלט, LED, תצוגת תווים (OLED), ו חימום משמשים. התקן התקשורת משתמש ב-Wi-Fi. - חלוקה לרמות של הפעולה
- לזהות את הפעולה של מקודד רוטרי כפי שמוצג LED מקודד & רוטרי עם מתג לדחוף באיור משלימה 7, לאחסן אותו כמו טמפרטורת להגדיר, ולהציג אותו על OLED. הגדר את מסוף הקלט של ה-CPU שאליו מחוברים מסופי הפאזה REA ו-ר' כמסוף קלט פסיקות ומעבדים את הסיבוב (קדימה ואחורה) של המקודד החוגה באמצעות פסיקה. הגדר אותה ל-+ 1 עבור סיבוב קדימה ו -1 לסיבוב הפוך. כתוב את טמפרטורת הערכה למשתנה הגלובלי והשתמש בו לבקרת טמפרטורת החימום. במקביל, לעדכן את התצוגה הטמפרטורה להגדיר של OLED.
- זיהוי הפעלה ועצירה על-ידי CPU IO 5 באמצעות מתג הפעלה/הפסקה (SW-S) כפי שמוצג ב-CPU של איור משלים 7. מצב ההתחלה/הפסקת ההפעלה הוא תהליך של פסיקת קוצב הזמן בכל 50 אלפיות.
הערה: מכיוון שהמתג הוא מתג רגעי, הוא הופך את מצב ההתחלה/העצירה כאשר הוא נדחף ומשוחרר. מצב זה מאוחסן במשתנה הגלובלי. - . תשתמש בתרמוסטור לחיישן הטמפרטורה קרא את הערכים נמדד מן החיישן לדוגמה (עיין "מעגל מחבר עבור חיבור חימום" באיור משלים 7) לתוך ה-CPU לאחר ממיר/d (עיין "A/d ממיר" באיור משלים 7). לספק את הזרם לחימום על ידי הפעלת יציאת IO15 ב "CPU" של איור משלים 7.
הערה: ישנם שני סוגים של חיישני טמפרטורה. אחד משמש כדי למדוד את הטמפרטורה של המדגם ולשלוט על החימום על הטמפרטורה להגדיר, והשני מחובר לחימום ומשמש למניעת חום. לחבר את תרמיסטור כדי 3.3 V באמצעות התנגדות ולהקליט את השינוי בהתנגדות כשינוי מתח. הסירו רעש מהשיטה הממוצעת לתנועה. - השתמש תרמיסטור עבור חיישן טמפרטורה מניעת טמפרטורה. זיהוי התחממות יתר מבוצע באמצעות תרמיסטור (R2) ("מעגל מחבר עבור חיבור חימום" באיור משלים 7), וכאשר ערך set הוא חרג, הזרם חימום הוא נכבה ("להגן על המעגל" באיור משלים 7).
הערה: חיישן זה משולב לתוך מעגל ולא דרך ה-CPU. חיישן זה אינו תלוי במעבד ובהשוואה לערך ההתנגדות שנקבע על-ידי הקוצץ המשתנה על-ידי מגבר דיפרנציאלי באופן אנלוגי. כאשר הוא מגלה שהחום חרג מערך הערכה, הוא מתערב במתג ה-, ששולט על הזרם לחימום ומפסיק את האספקה הנוכחית בכפייה. המטרה היא למנוע את הטמפרטורה של התנור מפני מעל רמה מסוימת אפילו במצב שבו ה-CPU לא עובד כראוי. - הפעל את ה-LED ב "מקודד & רוטרי עם מתג דחיפה" של האיור המשלים 7 על ידי ה-cpu (ב-"cpu" של איור משלים 7), כאשר הציוד הוא בפעולה.
- הצג את טמפרטורת הערכה וערך נמדד לOLED ב "מקטע התצוגה" של האיור המשלים 7 על ידי ה-cpu (ב-"cpu" של איור משלים 7).
- כונן את הבורר לכונן "מעגל בקרת החימום" של איור משלימה 7 עם pwm מ-CPU כדי לשלוט על החימום.
- לשלוט על החימום על ידי PID, מבוסס על טמפרטורות נמדד שנרכש על ידי חיישן הטמפרטורה. השתמש בספריית ה-pid_v1. h של Arduino לעיבוד PID.
הערה: ה-CPU מכייל את הזמן, מתקשר עם השרת, מעביר נתונים ומקבל הוראות מהשרת. כאשר טמפ ' החיישן חורגת מטמפרטורת הערכה, הזרם לתנור מוגדר כ-0, והיתר מודחק. - השתמש בפונקציית החיבור המובנית Wi-Fi של ה-CPU והתחבר לאינטרנט. שידור להגדיר את הטמפרטורה, חום חימום, וכו ' לשרת ייעודי על ידי Wi-Fi.
4. תצורת המערכת
- בניית המערכת על פי איור משלים 9.
- צייד Wi-Fi עם הבקר.
- השתמש תרמיסטור כחיישן למדידת טמפרטורה. חבר את חוט תרמיסטור לטרמינל "חיישן" במקרה של בקר. קבל את אות הטמפרטורה. שנמדד ע י התרמית
- לחבר בשלב המיקרוסקופ המשלב את התנור גומי ואת "החימום" של המקרה בקר עם כבל ייעודי. . שלוט על הזרם לדוד הגומי
- שנה את טמפרטורת הערכה עם הידית בבקר.
הערה: ניטור יומן הטמפרטורה, הגדרת הטמפרטורה יכולה להיות מופעלת מרחוק ממחשב או טלפון חכם. - העבר את הטמפרטורה הנמדדת, הגדר את הטמפרטורה ומידע הזמן במדידה מהבקר לשרת באמצעות האינטרנט. זמן מחזור הנתונים הוא 5 s וזמן המחזור עבור העברת נתונים לשרת הוא 1 דקות.
- גש לשרת מתוך צד הקונטרולר במרווחי זמן קבועים והעבר את נתוני המדידה המאוחסנים ב-CPU של הבקר לשרת לשם ניתוח ויצירת גרפים.
- עיין בחומר המשלים להפעלת השרת.
5. עיצוב מיקרוסקופ הפוך לצדדים
- תקן שני צלחות אלומיניום של 15 מ"מ עובי אנכית עם ברגים כדי ליצור הר בסיסי.
- הצמד לג (מקום אחד) לחלק האופקי של הר הבסיס.
- הציבו את החלק השני של המיקרוסקופ באופן אנכי, חברו את הקלעים (2 מקומות) לחלק האנכי של מעמד הבסיס ותקנו את תחתית המיקרוסקופ למעמד הבסיס.
- לתקן את הבמה במיקרוסקופ עם ברגים.
6. שיטת הפעולה
הערה: כאן, המדגם בשימוש הוא תערובת של הדגשה מודגש מים מתוקים בסיס פתרון מזינים תרבות נוזלית בינונית, נתרן מטאפיסיליקט, ויטמינים, ומים סטרילי. 800 μL של מדגם זה מדולל ב 10 מ ל של מדיום מים מתוקים.
- שיטת תצפית
- הכנס 1,000 μL של המדגם המוכן לתוך תא זכוכית מתוצרת עצמית.
הערה: תא הזכוכית העשוי בעזרת עצמו מארגן שתי משקפיים במקביל ומתקן אותם בדבק. צלחת פטרי נורמלית יש עובי ותאים גדולים לברוח בכיוון העומק בחדר, מה שמקשה להתבונן עם מיקרוסקופ. כדי למנוע זאת, החדר עם כיוון קטן נעשה, מה שמאפשר למנוע את התאים לברוח בכיוון העומק בחדר. בטמפרטורה נמוכה לריפוי שרף אפוקסי דבק משמש לקשר סביב הזכוכית כדי למנוע את המדגם יורד מן החדר. - חברו מצלמת וידאו שהוכנה בנפרד למיקרוסקופ. חבר מצלמת וידאו באמצעות מתאם העדשה הייעודי של המיקרוסקופ ולירות את המדגם.
- השתמש במיקרוסקופ עם העינית 10x ו 200x המטרה.
- חברו את שלב המיקרוסקופ האנכי למיקרוסקופ בארבעה מיקומים עם ברגים באורך 4 מ"מ.
הערה: עיין באיור 1a ובאיור 2 א עבור שרטוטי עיצוב של לוחות אלומיניום. בניסוי זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך. זה היה מוטה על ידי 90 °, ובשלב המיקרוסקופ מפוברק הותקנו ברגים. עיין באיור 1. - לאבטח את המדגם עם שתי להקות גומי באמצעות ארבעת הטפרים שנעשו לאורכו. מניחים דגימה על מיקרוסקופ בניצב על פני הקרקע.
- הגדר את הטמפרטורה ל-40 ° צ' עם הבקר המוצג באיור המשלים 8. סובב את כפתור הבקר כדי לקבוע את הטמפרטורה. בדוק את טמפרטורת הערכה שבצג. לחץ על כפתור כדי להתחיל בקרת טמפרטורה, נורית כחולה להאיר. לחץ שוב על הכפתור כדי לבטל את בקרת הטמפרטורה של נורית ולהפסיק.
הערה: הטמפרטורה הנמדדת מוצגת בזמן אמת, והחימום נשלט כדי להגיע לטמפרטורת הערכה. כאשר מתחיל בקרת הטמפרטורה, נורית הכחול דולקת ונשארת כך בזמן שדוד החימום נמצא בפעולה. כאשר החימום מתחמם, נורות LED אדומות, והחימום עוצר באופן אוטומטי. - עיין ב"מדריך לפעולת שרת" במידע המשלים לפעולת השרת.
הערה: דרוש שרת לאחסון נתונים. מסד הנתונים של השרת משתמש ב-SQL.
- הכנס 1,000 μL של המדגם המוכן לתוך תא זכוכית מתוצרת עצמית.
7. מדידת טמפרטורת פני השטח של הפצת מחמם גומי
- למדוד את ההתפלגות של הטמפרטורה משטח חימום גומי על ידי התרמוגרפיה כדי לבדוק את אחידות טמפרטורה.
- חברו את שלב המיקרוסקופ אשר שילב דוד מגומי עם עמדה.
- שינוי טמפרטורת ההגדרה של משטח חימום הגומי ל-35 ° c, 45 ° c, 55 ° c, 65 ו-° c, ולמדוד על-ידי התרמוגרפיה מהחזית (עיין באיור המשלים 10).
8. מבחן תגובת הטמפרטורה
- הפעל את בקרת הטמפרטורה על-ידי הגדרת טמפרטורת ערכת המדגם ל-30 ° c. המתן עד שערך המדידה יגיע ל-30 ° צ' ומייצב. הגדילו את הטמפרטורה הקבועה מראש באמצעות 5 ° c מ-30 ° צ' עד 50 ° צ' והמתן עד שהערך הנמדד מייצב בעקבות הטמפרטורה המוגדרת מראש.
- הפחת את הטמפרטורה הקבועה מראש באמצעות 5 ° c מ-50 ° c עד 30 ° צ' ואתר את יכולת המעקב של הערך הנמדד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מראה את התפלגות הטמפרטורה של דוד הגומי. טמפרטורת פני השטח של הדוד הגומי היה אחיד בכל טמפרטורה. איור 3 מראה את התגובתיות של הטמפרטורה נמדד כדי לקבוע שינויי טמפרטורה. הקו הכתום מציג את טמפרטורת הערכה והקו הכחול מציג את השינוי בטמפרטורת המדגם. הצילום העודף של הערך הנמדד לשינוי ההגדרה קטן והמעקב מהיר.
תאים diatom נצפו כדי לספק דוגמה ספציפית של השימוש במכשיר זה. ניתוח מסלול של הזזת תאים צורניות היא גישה שימושית להערכת תנועתיות של תאים צורניות. עם זאת, למרות מיקרוסקופ הפוכה נורמלית מתבונן המדגם אופקית, הוא אינו מתאים להתבוננות על השפעת הכבידה או תנועה צפה בכיוון האנכי.
בניסוי זה, בשלב המיקרוסקופ עם בקר הטמפרטורה היה מחובר למיקרוסקופ הפוכה אשר היה מסובב 90 °. התנועה האנכית התלוית טמפרטורה של אלהלמה נרשמה בהצלחה. בשיטה זו, מקור התנועה האנכית של אלהלמה זוהה כמוצג באיור 4. כתוצאה של התבוננות עם 100 אנשים של diatoms, המהירות הממוצעת היתה 7.01 μm/s בטמפרטורת החדר ו 470.1 μm/s ב 40 ° c. ההשפעות של הסעה תרמית על התופעה הצפה האנכית של תאים צורניות היו דמיינו על ידי התבוננות ישירה.
איור 1: צילום של המכשיר קבוע לשלב המיקרוסקופ. הופעת המכשיר תוקנה. לשלב המיקרוסקופ המכשיר קבוע לשלב המיקרוסקופ עם ארבעה ברגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התפלגות טמפרטורה של חימום גומי. התפלגות דוד הגומי כפי שנמדד על ידי התרמוגרפיה. טמפרטורת החימום השתנתה מטמפרטורת הסביבה ועד 35 ° c, 45 ° c, 55 ° c, ו65 ° c. הטמפרטורה הופצה בצורה אחידה. על פני החימום בכל טמפרטורה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תגובתיות של אות טמפרטורה. זה מראה את התגובה כאשר הטמפרטורה להגדיר עולה מ 30 ° צ' עד 50 ° צ' והוריד מ 50 ° צ' עד 30 ° c. טמפרטורת הסט השתנתה בהפרשים של 5 ° c. במצב יציב, הטמפרטורה נמדד בטווח של ± 1.5 ° c של ערך set. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מקור התנועה הדיאטום. מסלולים אנכיים של התנועה צורניות בשל שינויי טמפרטורה הותוו. הקווים הכחולים מציגים מסלולים של תאים צורניות ב 25 ° צ' עבור 27.06 s ו ב 40 ° צ' עבור 0.2 s. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 1: ציור עיצוב של לוחות אלומיניום (עם ממדים). (A) הצלחת הוא 2 מ"מ עובי x 150 מ"מ רחב x 200 מ"מ ארוך, עם ממורכז 101 מ מתחת קוטר החור כדי לאפשר החדרת דוד הגומי. כל צלחת הלוח יש שני טפרים מכונת שבהם להקות גומי עשוי להיות מחובר דגימות מאובטח על הבמה. כדי לצרף שלב זה אנכי למיקרוסקופ עם ברגים 4 מ"מ, 4.2 מילימטר חורים בורג הם קדח בארבעה מיקומים באופן סימטרי סביב החור המרכזי. (ב) הצלחת היא 5 מ"מ עובי x 150 מ"מ רוחב x 200 מ"מ ארוך, עם ממורכז 130 מ מרוכז החור קוטר. מיקום חריץ מחשב כדי להתאים מיקומים טופר על צלחת החזית כדי לאפשר החזקה של לדוגמה הידוק להקות גומי על פני הבמה. עבור ההחזקה של הבמה למיקרוסקופ, ארבעה 4.2 מילימטר חורים בורג הם קדח במיקומים תואמים לאלה בצלחת החזית. (ג) הצלחת היא 4 מ"מ עובי x 150 מ"מ רחב x 200 מ"מ ארוך, עם ממורכז 130 מ ל בקוטר החור. טווח של 30 מ"מ מנותק ממרכז הימני 200 מ"מ של הצלחת, עד לעומק החור המרכזי. מטרה זו של החתך היא לאפשר חיבור של מחבר החימום בצד ימין. באותם עמדות כמו בצלחת החזית, ארבעה 4.2 מילימטר חורים בורג הם קדחו להחזקה של הבמה למיקרוסקופ. (ד) הצלחת היא 1.5 mm עבה x 150 מ"מ רחב x 200 mm ארוך, עם ממורכז 30 מ"מ חור קוטר. באותם עמדות כמו בצלחת החזית, ארבעה 4.2 מילימטר חורים בורג הם קדחו להחזקה של הבמה למיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 2: ציור עיצוב של לוחות אלומיניום (ללא ממדים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 3: עיצוב ציור של כנים אלומיניום. (א) להיות מותקן בצד העליון: הקוטר הוא 100 מ"מ, עובי הוא 3 מ"מ. חור בקוטר 30 מ"מ הוא קדח במרכז והחיתוך של 42 מ"מ רוחב x 30 מ"מ מורכב בצד אחד. (ב) להיות מותקן בצד התחתון: הקוטר הוא 100 מ"מ, עובי הוא 4 מ"מ. חור בקוטר 30 מ"מ הוא קדח במרכז, ושלושה חורים 3 מ"מ הונחו ב 120 ° אחד לשני במרחק של 25 מ"מ מהמרכז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 4: ציור עיצוב של דיסקי שעם לחוצים. (א) להיות מותקן בצד העליון בין דוד הסיליקון גומי ואת המעמד האלומיניום העליון: קוטר הוא 100 מ"מ, עובי הוא 2 מ"מ. חור קוטר 20 מ"מ הוא קדח במרכז, ושני חתכים (42 mm רחב x 30 מ"מ עמוק, 4 מ"מ רוחב x 40 מ"מ) נעשים בזוויות ישרות אחד לשני בצד של הדיסק. (ב) להיות מותקן בצד התחתון בין דוד גומי סיליקון המעמד אלומיניום נמוך: קוטר הוא 100 מ"מ, עובי הוא 1 מ"מ. חור קוטר של 20 מ"מ קדח במרכז. (ג) תמיכה זו היא 42 mm רחב × 30 מ"מ עמוק, וחותכים היקף של דיסק 100 מ"מ קוטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלימה איור 5: מפרט של דוד סיליקון גומי. הקוטר הוא 100 מ"מ ועובי הוא 2.5 מ"מ. חור קוטר של 20 מ"מ קדח במרכז. ספק הכוח הוא 12 V, עם קיבולת עומס של 18 ואט. התנור מורכב תיל Nichrome, עם חוט עופרת מחובר האלקטרודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 6: חתך הבמה של המיקרוסקופ. זו תצוגה מסקצרית. של מיקרוסקופ הבמה מעמד האלומיניום מוצמד לצלחת האלומיניום האחורי ומחמם הגומי מותקן על המשטח החיצוני ביותר. הפקק הדחוס מותקן לבידוד בין מחמם הגומי למעמד האלומיניום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 7: פירוט של דיאגרמת המעגל. הדבר מציין את המעגל שנבנה בבקר. דיאגרמת המעגל מחולקת לתשעה חלקים בהתאם לפונקציות בודדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 8: ציור עיצוב של תיק בקר פלסטיק. מידות הן 143.9 mm אורך x 85.3 מ"מ עומק x 25 מ"מ רוחב. כפתור הטמפרטורה, מנורה הפעלה/התחממות יתר, ו אינדיקטור ממוקמים על המקרה של בקר הפלסטיק. ניתן להגדיר את הטמפרטורה תוך כדי צפייה במחוון על-ידי הפיכת כפתור הערכה. דוחף את הידית הזאת מפעיל את בקר הטמפרטורה. הטמפרטורה הנמדדת מוצגת בזמן אמת, והחימום נשלט כך שהוא מגיע ומחזיק בטמפרטורת הערכה. כאשר בקר הטמפרטורה מופעל, הנורית הכחולה דולקת ונותרת דולקת כאשר החימום בפעולה. כאשר החימום מתחמם, הנורית האדומה מגיעה והחימום עוצר באופן אוטומטי. לחיצה על כפתור בקר הטמפרטורה שוב תגרום לעצירת הלחיצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 9: תצורת המערכת. במת המיקרוסקופ עם בקר משולב מחובר לתנור גומי עם כבל ייעודי. נמדד אותות טמפרטורה לדוגמה מתקבלים, והנוכחי של דוד הגומי משודר על ידי הבקר. אותות שנמדדו מהבקר נשלחים באופן אלחוטי לשרת באמצעות נתב האינטרנט. השרת מבצע הידור של נתוני מדידה עבור ניתוח ויצירת גרפים. בקרת והגדרות טמפרטורה ניתן לשלוט מרחוק באמצעות מחשב או טלפון חכם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 10: התפלגות טמפרטורה מדידה על ידי התרמוגרפיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוח מסלול של תאים מתקדמים בתאי האטום הוא גישה שימושית להערכת הטיפול בדיאטום. עם זאת, בעוד מיקרוסקופ הפוכה נורמלי מתבונן דגימות אופקית, הוא אינו מתאים לתצפיות על השפעת הכבידה או תנועה צפה בכיוון האנכי. פיתח ותיאר כאן הוא שלב מיקרוסקופ אנכי עם בקרת טמפרטורה מוצמד מיקרוסקופ הפוך, אשר מסובבת על ידי 90 °. בשלב זה מיקרוסקופ עם בקרת טמפרטורה מאפשר התבוננות של טמפרטורה תלוי תנועה אנכית של תאים צורניות.
שלב קריטי בתוך הפרוטוקול הוא עיצוב מעגל הבקר. מעגל השבירה יושם כדי להבטיח בטיחות. כאשר החיישן מנותק ממדגם או המיקרו בקר אינו פועל כראוי, הזרם לחימום הוא נחתך על ידי מעגל שונה מן המיקרו בקר.
מאחר שמערכת הבקרה אימצה את מערכת ה-PID לשלוט בזרם החימום, נדרשת טכניקה למציאת הפרמטר האופטימלי של ה-PID. בהשוואה לשיטה הקיימת, הפעלה וניטור מרחוק אפשריים על-ידי פונקציית Wi-Fi, איסוף נתונים בשרת ופונקציית הגדרת הטמפרטורה. כמבנה של חלק הבמה המצורף למיקרוסקופ הוא מסובך, פישוט של מבנה זה מצדיק מחקר עתידי.
ציוד זה משתמש חימום כדי להעלות את הטמפרטורה, אבל הקירור אינו מופעל; לפיכך, הטמפרטורה שנקבעה אינה יכולה להיות מתחת לטמפרטורת החדר. מתקני קירור לטמפרטורות נמוכות יותר מטמפרטורת החדר ידרשו מתקן קירור מסובך, שנמצא תחת התחשבות בעבודה העתידית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים לגלות.
Acknowledgments
. למחברים אין תודות
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AC adapter 12V2A | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | AD-D120P200 | Tokyo, Japan |
| ADS1015 Substrate | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | adafruit PRODUCT ID: 1083 | Tokyo, Japan |
| Alminium Plate (Back Side Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 1.5mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Forefront Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 2mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 4mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 5mm | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution | Sigma-Aldrich Co. LLC | B5282-500ML | St. Louis, USA |
| Controller Case | Marutsu Elec Co., Ltd. | pff-13-3-9 | Tokyo, Japan |
| CPU | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | ESP-WROOM-02D | Tokyo, Japan |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | CKX 53 | Tokyo, Japan |
| Low temperature hardening epoxy resin adhesive | ThreeBond Co., Ltd. | TB2086M | Tokyo, Japan |
| Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | 3296W-1-501LF | Tokyo, Japan |
| OLED module | Akihabara Inc. | M096P4W | Tokyo, Japan |
| Pressed Cork (For supporting electrode ) | Tera Co., Ltd. | W 42mm×L 30? | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Lower Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 0.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Upper Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Rotary encoder with switch with 2 color LED | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | P-05772 | Tokyo, Japan |
| Silicone rubber heater | Three High Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Kanagawa, Japan |
| Substrate | Seeed Technology Co., Ltd. | mh5.0 | Shenzhen, China |
| Temperature sensor | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | NXFT15XH103FA2B050 | Tokyo, Japan |
| Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V | Marutsu Elec Co., Ltd. | BR301 | Tokyo, Japan |
| Universal Flexible Arm | Banggood Technology Co., Ltd. | YP-003-2 | Hong Kong, China |
| USB cable USB-A - MicroUSB | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | USB CABLE A-MICROB | Tokyo, Japan |
| Video Canera | Sony Corporation | HDR-CX590 | Tokyo, Japan |
References
- Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
- McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
- Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
- Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
- Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM - selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
- Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
- Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
- Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
- Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
- Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
- Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
- Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
- Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
- Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
- Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields - A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
- Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
- Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
- Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
- Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates - potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
- Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
- Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion - An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).
