Summary
Presentert her er en protokoll ved hjelp av en temperatur-kontrollerte mikroskop scenen som gjør at en prøve container skal monteres på et vertikalt mikroskop.
Abstract
Prøvene plasseres vanligvis på et horisontalt mikroskop trinn for mikroskopisk observasjon. Men for å observere påvirkning av tyngdekraften på en prøve eller studere flytende atferd, er det nødvendig å gjøre mikroskopet scenen vertikalt. For å oppnå dette, en sidelengs invertert mikroskop vippet av 90 ° er utarbeidet. For å observere prøver med dette mikroskopet, må prøvebeholdere som Petri retter eller glass lysbilder festes til scenen vertikalt. En enhet som kan sikre prøvebeholdere på plass på et vertikalt mikroskop-trinn, er utviklet og beskrevet her. Vedlegg av denne enheten til scenen kan observasjon av sample dynamikk i vertikalplanet. Evnen til å regulere temperaturen ved hjelp av en silikon gummi varmer tillater også observasjon av temperatur avhengig sample atferd. Videre er temperaturdata overført til en Internett-server. Temperaturinnstillinger og logg overvåking kan styres eksternt fra en PC eller smarttelefon.
Introduction
Optisk mikroskopi er en teknikk som brukes til å øke merkbare detaljer via forstørrelse av en prøve med linser og synlig lys. I optiske mikroskopi, er lyset rettet mot en prøve, deretter overføres, reflekteres, eller fluorescerende lys fanges opp av forstørrelsesglass for observasjon. Ulike typer mikroskop er tilgjengelig som varierer i design for å imøtekomme ulike bruksområder og observasjons metoder. De ulike design inkluderer en oppreist mikroskop, som er strukturert for å belyse en prøve fra nedenfor for observasjon ovenfra, og en omvendt mikroskop, som lyser prøven ovenfra for observasjon fra nedenfor. Oppreist mikroskop er den mest vanlige og mye brukt design. Invertert mikroskop brukes ofte til å observere prøver som ikke kan tillate en linse tett i avstand fra oven, for eksempel kulturperler celler tilhenger til bunnen av en container. Mange forskningsgrupper har rapportert observasjoner i et bredt spekter av felt ved hjelp av invertert mikroskop1,2,3,4,5,6,7. Mange ekstra enheter har også blitt utviklet som utnytter funksjonene i invertert mikroskop8,9,10,11,12,13 .
For tiden, i alle konvensjonelle mikroskop design, er mikroskopet scenen horisontalt og er derfor uegnet for observasjon av prøvene som produserer bevegelse i vertikalplanet, (på grunn av gravitasjon, oppdrift, bevegelse, etc.). For å gjøre disse observasjonene mulig, må mikroskopet scenen og lys banen roteres til vertikal. Den vertikale scenen er nødvendig for å vertikalt montere glass lysbilder eller prøvebeholdere som for eksempel en Petri retter til scenen. For å løse dette, en sidelengs invertert mikroskop vippet av 90 ° er allerede utarbeidet. Men å feste prøver med tape eller andre klebemidler ikke gir de nødvendige langsiktige immobilitet. Beskrevet her er en enhet som kan oppnå den nødvendige stabiliteten. Denne enheten tillater observasjon over tid av prøven bevegelse i vertikalplanet. Montering av en silisium gummi varmer har også gjort det mulig å observere påvirkning av temperaturvariasjon på sample atferd. Temperaturdata overføres til en Internett-server via Wi-Fi, og temperaturinnstillinger og logg overvåking kan styres eksternt fra en PC eller smarttelefon. Til vår kunnskap, scenen festet til en sidelengs skråstilt mikroskop vippet av 90 ° har ennå ikke blitt rapportert i tidligere studier.
Mikroskop fasen består av tre aluminiumsplater. Den midterste aluminiumsplaten er montert på den nedre aluminiumsplaten som festes til scenen. Silikon gummi som inneholder temperatursensoren er festet mellom den midtre og øvre aluminiumsplater. Gummibånd brukes til å feste prøven. Klør er festet i venstre og høyre fire punkter i den øvre aluminiumsplate for å sikre gummibåndene. Kontrollkretsen av temperatur regulatoren mottar et signal fra temperatursensoren som er innebygd i silikon gummi og modulerer elektrisk kraft av pulsbredde moduleringshjul (PWM) metoden. Temperaturen kan økes gradvis til 50 ° c i trinn på 1 ° c. Denne enheten er nyttig for applikasjoner der vertikale prøve bevegelser kan være temperatur avhengige.
Denne rapporten gir eksempler på temperatur effekter på flytende fenomenet kiselalger. Som eksempler på diatomeen observasjonsstudier, målinger av sedimentering hastighet av celle klynger, bevegelses analyser, ultrafine struktur studier, etc. har blitt rapportert14,15,16,17 , 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21 priser og , 22 av , 23. Den egenvekt av kiselalger flytende i vann med fotosyntetiske organismer er litt høyere enn vann, så de har en tendens til å synke; Men, vil de stige hvis selv svak konveksjon er forekommende. For å studere dette fenomenet, er et glass lysbilde festet vertikalt til et mikroskop Stadium, og effekten av økende temperatur på diatomeen vertikal bevegelse er observert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utforming
- Fabrikasjon av aluminiumsplater
- Skjær en 101 mm hull i midten av en aluminiumsplate av dimensjoner 150 mm x 200 mm x 2 mm som skal brukes som frontplate med en laser prosesserings maskin. Maskin klør på åtte punkter for å feste to gummibånd over lengden, eller to over bredden på denne platen (se supplerende figur 1a og supplerende figur 2a).
- Skjær en 130 mm hull i midten av en annen 150 mm x 200 mm x 5 mm aluminiumsplate som skal brukes som den midterste øvre plate med en laser prosessering maskin. Maskin åtte hakk for å feste gummibånd på to punkter over lengden, eller to over bredden av denne platen (se supplerende figur 1B og supplerende figur 2b).
- Skjær et 130 mm hull i midten av en 150 mm x 200 mm x 4 mm aluminiumsplate som skal brukes som den midterste nedre platen med en laser prosesserings maskin (se supplerende figur 1C og supplerende figur 2C).
- Skjær en 30 mm hull i midten av en 150 mm x 200 mm x 1,5 mm aluminiumsplate som skal brukes som bunnplate (se supplerende figur 1d og supplerende figur 2D).
- Fabrikasjon av to aluminiums pidestall
- Skjær en 30 mm hull i midten av aluminiumsplaten (100 mm diameter, 3 mm tykkelse) og lage et hakk fra den ene siden med dimensjonene 42 mm bred x 30 mm dyp (se ekstra figur 3a).
- Skjær en 30 mm hull i midten av platen i en aluminiumsplate (100 mm diameter, 4 mm tykkelse) og bore tre 3 mm hull som ligger 25 mm fra sentrum, plassert 120 ° fra hverandre (se supplerende figur 3b).
- Fabrikasjon av tre presset kork plate
- Skjær et 20 mm hull i midten av den pressede kork platen (100 mm diameter, 2 mm tykkelse) med en vannstråle skjære maskin. Lag en cut 42 mm på tvers av x 30 mm dyp, deretter ett kutt 4 mm bred x 5 mm dyp (se ekstra figur 4a).
- Skjær en 20 mm hull i midten av presset kork plate av dimensjoner 100 mm diameter, 1 mm tykkelse med en vannstråle skjære maskin. Lag et kutt 42 mm på tvers av x 30 mm dyp, et kutt 4 mm bredt x 40 mm dyp (se supplerende figur 4b).
- Skjær en presset kork plate fra en 100 mm diameter plate med en 42 mm bredde og 30 mm dybde. Det kreves to ark med 1 mm tykkelse og ett ark med tykkelse på 2 mm (se supplerende figur 4c).
- Fabrikasjon av silikon gummi Varmeapparat
- Dikte opp en ovn ved hjelp av en 100 mm diameter plate av 2,5 mm tykk silisium gummi med innebygd nichrome wire og kuttet et 20 mm hull i midten av platen (se ekstra figur 5).
- Monter deler som er beskrevet i trinn 1.1 – 1.4 ved å stable dem som vist i supplerende figur 6.
- Hvis du vil konstruere et mikroskop trinn, se supplerende figur 6, tverrsnitt av mikroskop scenen. Fix
og 
, da 
og 
med skruer. Fix og 
med skruer. Fix og , 
og 
, og, og, og og 
med lim. 
og 
, da 
og 
med skruer. Fix 
med skruer. Fix 
og 
med lim. 
2. hardware design skisserer
- Forbered en "strømforsyning og programmering krets" som vist i supplerende figur 7. Forsyning 12 V DC til varmeren kontrolleren fra J4 terminalen koblet til AC-adapteren. Reduser spenningen fra 12 V DC til 3,3 V DC for kretsen strømforsyningen ved hjelp av en regulator fordi CPU forsyningsspenningen er 3,3 V DC.
Merk: USB 1 er en Terminal for 5 V DC og seriell signal for utvikling av PC. Selv om 5 V DC ikke er avgjørende, brukes den som strømkilde for å programmere PROSESSOREN. Dette er også konvertert til 3,3 V DC av regulatoren. J1 er en kontrollsignal Terminal på tidspunktet for programmering. Denne kretsen er plassert i kontrolleren tilfellet vist i supplerende figur 8. - Forbered en "varme kontroll krets" som vist i supplerende figur 7. Bytt til 12 V DC med Spm. 2 (P-kanal MOS FET) og levere den til ovnen. Spm. 2 er et koblings element som kontrollerer 12 V DC med PWM for å justere mengden strøm som leveres til ovnen.
Merk: kretsen inkluderer en LED som visuelt bekrefter at spenningen tilføres til ovnen. Denne stasjonen signal (HEATER_C) er en PWM signal fra CPU. Når et signal om overoppheting oppdages av beskyttelseskretsen, skifter BREAKER-signalet til lavt, og driften av MOS-FET stopper. Denne kretsen er plassert i kontrolleren tilfellet vist i supplerende figur 8. - Forbered en "koblings krets for Varmeapparat enhet" som vist i supplerende figur 7. Installer en USB-kontakt for tilkobling til ovnen delen.
Merk: denne kretsen er plassert i kontrolleren tilfellet vist i supplerende figur 8. - Forbered en "koblings krets for temperatur sensor" som vist i supplerende figur 7. Monter kontakten (Euroblock beholder 2P) for å koble til temperatursensoren.
Merk: denne kretsen er plassert i kontrolleren tilfellet vist i supplerende figur 8. - For en "A/D-omformer", som vist i supplerende figur 7, kan du bruke ADS 1015 som en annonse konverteringsenhet.
Merk: annonse konverterings enheten konverterer verdiene til temperatursensoren og registrerings sensoren for overoppheting fra spenning til digitale verdier. Dette er en 12-bits multiplekser AD konvertering enhet og er koblet til CPU med I2C-grensesnittet. Denne kretsen er plassert i kontrolleren tilfellet vist i supplerende figur 8. - Lag en "beskyttelseskrets" som vist i supplerende figur 7 ved å koble til deteksjons sensoren (OHS) til den invertere inngangen på op amp. Sammenlign dette signalet med spenningen på trimmer motstanden koblet til noninverting inngang.
- Sørg for at når spenningen blir lavere enn spenningen på trimmer motstanden, utgangen av OP forsterker går høy, den tilkoblede NPN transistor Q2 slår på og BREAKER signalet går lavt.
- Påse at på samme tid, Q4 slås på og den tilkoblede overoppheting indikator LED D6 lyser opp.
Merk: denne kretsen er plassert i kontrolleren tilfellet vist i supplerende figur 8.
- For en "utfoldelse avdeling" idet vist inne supplerende skikkelsen 7, bruk 192 x 64 PRIKKENE for OLED. Koble til med CPU via I2C-grensesnittet.
- Restarte det OLED av adskilt det GND av det OLED av det CPU signal IO0 benytter en NPN transistor Q1 koplet å det GND av det OLED.
Merk: Dette OLED viser ulike typer informasjon. Denne kretsen er plassert i kontrolleren tilfellet vist i supplerende figur 8.
- Restarte det OLED av adskilt det GND av det OLED av det CPU signal IO0 benytter en NPN transistor Q1 koplet å det GND av det OLED.
- For en "LED & roterende Encoder med push Switch" i supplerende figur 7, montere en roterende Encoder ved loddetinn som fungerer som en push Switch og inkorporerer to lysdioder.
- Koble en LED til VCC for bruk som en strøm LED. Den andre er koblet til CPU for bruk som en indikator under oppvarming drift.
- Bruk en push Switch kontakt for varmeapparatet START/STOP som er koblet til CPU. Koble A-og B-utgangene til den roterende koderen til IO-inngangen som er angitt i CPU-avbruddet.
Merk: denne kretsen er plassert i kontrolleren tilfellet vist i supplerende figur 8.
- For CPU i supplerende figur 7, kan du bruke CPU av WROOM-02D.
- Utdata fra IO12, IO13 til "displayenhet" fordi grensesnittet på skjermen er I2C-standarden. Koble IO0 til "display Unit" og nullstille OLED.
- Koble IO15 til "varme kontrollenhet" og kontrollere strømmen som leveres til varmeren av PWM utgang.
- Koble IO2 til "LED & roterende Encoder med push Switch" og lys START LED. Koble IO4 og IO14 til "LED & roterende Encoder med push Switch" og motta signalene (REA og REB) fra den roterende koderen for å bestemme innstilt temperatur. Koble IO5 til "LED & roterende Encoder med push Switch" og start/stopp ovnen.
3. programvaredesign disposisjon
- Bruk Arduino CORE for WROOM-02D for CPU som kontrolleren for dette systemet.
Merk: som inndataenheter brukes start/stopp-bryteren, roterende koder, temperatur sensor (termistor). Som output enheter, en LED, tegn display (OLED), og varmeapparatet brukes. Kommunikasjonsenheten bruker Wi-Fi. - Omriss av operasjonen
- Oppdag driften av den roterende koderen som vist i LED-& roterende Encoder med push-bryteren i supplerende figur 7, lagre den som innstilt temperatur, og Vis den på OLED. Angi inngangs terminalen for PROSESSOREN som fase terminalene REA og REB er koblet til som en avbrudds inngangsterminal og behandle rotasjonen (forover og bakover) for den roterende koderen ved å avbryte. Sett den til + 1 for rotasjon fremover og-1 for omvendt rotasjon. Skriv den innstilte temperaturen til den globale variabelen og bruke den for varmeapparatet temperaturkontroll. Samtidig, oppdatere innstilt temperaturvisning av OLED.
- Identifiser start og stopp av CPU IO 5 ved start/stopp bryter (SW-S) som vist i CPU av supplerende figur 7. Tilstanden til start/stopp-bryteren er en tidtaker avbrudds prosess hver 50 MS.
Merk: siden bryteren er en kortvarig bryter, reverserer den tilstanden til start/stopp når den skyves og slippes. Denne tilstanden er lagret i den globale variabelen. - Bruk en termistor for temperatursensoren. Les de målte verdiene fra prøve sensoren (se "tilkoblings krets for Varmeovn-tilkobling" i tilleggs figur 7) i CPU etter A/d-konvertering (se "A/d-omformer" i supplerende figur 7). Forsyne strøm til ovnen ved å slå på IO15-porten i "CPU" av supplerende figur 7.
Merk: det finnes to typer temperatur sensorer. En brukes til å måle temperaturen i prøven og kontrollere ovnen på den innstilte temperaturen, og den andre er festet til en ovn og brukes for varme forebygging. Koble termistor til 3,3 V via en motstand og registrere endringen i motstanden som en endring i spenning. Fjern støy med den glidende gjennomsnitts metoden. - Bruk en termistor for temperatur forebygging. Påvisning av overoppheting utføres ved hjelp av en termistor (R2) ("tilkoblings krets for Varmeovn-tilkobling" i supplerende figur 7), og når den innstilte verdien overskrides, slås varmestrømmen av ("beskyttelseskrets" i supplerende figur 7).
Merk: denne sensoren er innlemmet i en krets og ikke gjennom CPU. Denne sensoren er uavhengig av CPU og sammenlignet med motstanden verdien satt av motstanden trimmer av en differensial forsterker på en analog måte. Når den oppdager at temperaturen har overskredet den innstilte verdien, griper inn den i FET-bryteren, som styrer strømmen til varmeapparatet og stopper strømforsyningen. Formålet er å hindre at temperaturen i ovnen overstiger et visst nivå selv i en situasjon der CPU ikke fungerer skikkelig. - Slå på LED-lampen i "LED-& roterende Encoder med push Switch" av ekstra figur 7 av CPU (i "CPU" for supplerende figur 7), når utstyret er i drift.
- Utfoldelse det sette temperatur og målt salgsverdi å OLED inne det "utfoldelse avdeling" av det ekstra skikkelsen 7 av det CPU (inne det "CPU" av supplerende skikkelsen 7).
- Drive FET bryteren i "varmeren kontroll krets" av supplerende figur 7 med PWM fra CPU til å kontrollere ovnen.
- Styr ovnen ved PID, basert på målte temperaturer ervervet ved temperatursensoren. Bruk Arduino ' s pid_v1. h biblioteket for PID prosessering.
Merk: PROSESSOREN kalibrerer tiden, kommuniserer med serveren, overfører data og mottar instruksjoner fra serveren. Når sensor temperaturen overskrider innstilt temperatur, er strømmen til ovnen satt til 0, og overshoot er undertrykt. - Bruk den innebygde Wi-Fi tilkoblingsfunksjonen til PROSESSOREN og koble til Internet t. Overfør sette temperaturen, varmeapparatet temperatur, etc. til utpekt server med Wi-Fi.
4. system konfigurasjon
- Bygg systemet i henhold til supplerende figur 9.
- Utstyr en Wi-Fi med kontrolleren.
- Bruk en termistor som sensor for temperaturmåling. Koble den termistor kabelen til "SENSOR"-terminalen på håndkontroller etuiet. Motta temperatur signalet målt ved termistor.
- Koble til et mikroskop trinn som omfatter gummi varmeren og "Varmeovn" av kontrolleren saken med en dedikert kabel. Kontroller strømmen til gummi varmeren.
- Endre innstilt temperatur med knotten på kontrolleren.
Merk: temperatur Logg overvåkning, temperaturinnstilling kan betjenes eksternt fra en PC eller smarttelefon. - Overfør den målte temperaturen, innstilt temperatur og tids informasjon ved måling fra kontrolleren til serveren via Internett. Data målings syklustiden er 5 s og syklustid for dataoverføring til serveren er 1 min.
- Få tilgang til serveren fra kontrolleren side med jevne mellomrom og overføre måle data som er lagret i CPU av kontrolleren til serveren for analyse og grafer.
- Se supplerende materiale for hvordan du skal betjene serveren.
5. utforming av sidelengs invertert mikroskop
- Fix to aluminiumsplater på 15 mm i tykkelse vertikalt med skruer for å lage en grunnleggende montere.
- Fest en jig (ett sted) til den horisontale delen av base braketten.
- Plasser mikroskop del delen vertikalt, fest jigs (to steder) til den vertikale delen av bunn stativet og fest bunnen av mikroskopet til sokkelen.
- Fest mikroskop etappen med skruer.
6. OPERASJONSMETODE
Merk: Her er prøven som brukes en blanding av Bold modifisert basal freshwater næringsstoff Solution flytende kultur medium, natrium metasilicate, vitaminer, og sterilt vann. 800 μL av dette utvalget fortynnes i 10 mL ferskvanns medium.
- Observasjon metoden
- Injiser 1 000 μL av den tilberedte prøven inn i et selv laget glass kammer.
Merk: den selv-laget glass kammer arrangerer to glass i parallell og fikser dem med et klebemiddel. En normal Petri parabolen har en stor tykkelse og celler flykte i dybden retning i kammeret, noe som gjør det vanskelig å observere med et mikroskop. For å hindre dette, er kammeret med en liten dybde retning gjort, noe som gjør det mulig å hindre at cellene rømmer i dybden retning i kammeret. En lav temperatur kureres epoxy harpiks lim brukes til å binde rundt glasset for å hindre prøven slippe fra kammeret. - Fest et separat forberedt videokamera til mikroskopet. Koble til et videokamera ved hjelp av det dedikerte objektiv kortet på mikroskopet, og skyt prøven.
- Bruk et mikroskop med et 10x okularet og 200x objektiv.
- Fest den vertikale mikroskop etappen til et mikroskop på fire steder med 4 mm skruer.
Merk: referer til supplerende figur 1a og supplerende figur 2a for design tegninger av aluminiumsplater. I dette eksperimentet ble det brukt et omvendt mikroskop. Dette ble vippet av 90 °, og den fabrikkert mikroskop scenen ble festet med skruer. Se figur 1. - Fest prøven med to gummibånd med de fire klørne på langs. Plasser en prøve på et mikroskop trinn vinkelrett på bakke overflaten.
- Still inn temperaturen til 40 ° c med kontrolleren vist i supplerende figur 8. Drei kontrollknappen for å stille inn temperaturen. Kontroller innstilt temperatur på displayet. Trykk på knappen for å starte temperaturkontroll, og det blå LED-lyset vil lyse. Trykk på knappen igjen for å slå av LED-en og stoppe temperatur kontrollen.
Merk: den målte temperaturen vises i sanntid, og ovnen styres for å nå den innstilte temperaturen. Når temperatur kontrollen starter, lyser den blå LYSDIODEN og forblir slik mens ovnen er i drift. Når ovnen blir overopphetet, den røde LED-lys, og ovnen stopper automatisk. - Se "brukerhåndboken for serveren" i tilleggsinformasjon for server-operasjon.
Merk: en server for datalagring er nødvendig. Serverens database bruker min-SQL.
- Injiser 1 000 μL av den tilberedte prøven inn i et selv laget glass kammer.
7. måling av overflatetemperatur fordeling av gummi varmeren
- Mål fordelingen av gummi varmeren overflatetemperatur ved termografi å sjekke temperaturen ensartethet.
- Fest mikroskop etappen som innlemmet en gummi varmer med et stativ.
- Endre innstillings temperaturen for gummi varmer overflaten til 35 ° c, 45 ° c, 55 og 65 ° c, og mål ved termografi fra fronten (se supplerende figur 10).
8. test av temperatur respons
- Start Temperaturregulering ved å stille inn prøve innstilt temperatur til 30 ° c. Vent til måle verdien når 30 ° c og stabiliserer. Øk den forhåndsinnstilte temperaturen trinnvis med 5 ° c fra 30 ° c til 50 ° c og vent til den målte verdien stabiliseres etter den respektive forhåndsinnstilte temperaturen.
- Reduser den forhåndsinnstilte temperaturen trinnvis med 5 ° c fra 50 ° c til 30 ° c og Finn sporings evnen til den målte verdien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser temperatur fordelingen av gummi varmeren. Overflatetemperaturen på gummi varmeren var ensartet ved hver temperatur. Figur 3 viser responsen til den målte temperaturen for å angi temperaturendringer. Den oransje linjen viser innstilt temperatur og blå linje viser endringen av prøvetemperaturen. Overshoot av den målte verdien til innstillingen endringen er liten og sporing er rask.
Diatomeen celler ble observert for å gi et konkret eksempel på bruk av denne enheten. Banen analyse av bevegelige diatomeen celler er en nyttig tilnærming til å evaluere motilitet av diatomeen celler. Men selv om en vanlig invertert mikroskop observerer prøven horisontalt, er det ikke egnet for observasjon av påvirkning av tyngdekraften eller flytende bevegelse i vertikal retning.
I dette eksperimentet var mikroskop scenen med temperatur kontroller festet til en invertert mikroskop som hadde blitt rotert 90 °. Temperatur avhengig vertikal bevegelse av kiselalger ble vellykket registrert. Med denne metoden ble geometriske kiselalger vertikale bevegelse påvist som vist i Figur 4. Som et resultat av å observere med 100 individer av kiselalger, var den gjennomsnittlige hastigheten 7,01 μm/s ved romtemperatur og 470,1 μm/s ved 40 ° c. Effekten av Termisk konveksjon på den vertikale flytende fenomen av diatomeen celler ble visualisere av direkte observasjon.
Figur 1: bilde av enheten som er festet til mikroskopet. Utseendet til enheten som er festet til mikroskopet. Enheten er festet til mikroskop scenen med fire skruer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: temperaturfordeling av gummi varmeren. Fordelingen av gummi varmeren målt ved termografi. Varme temperaturen ble endret trinnvis fra omgivelsestemperatur til 35 ° c, 45 ° c, 55 ° c og 65 ° c. Temperaturen ble jevnt fordelt over ovnen ved hver temperatur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: respons på temperatur signal. Dette viser responsen når den innstilte temperaturen heves fra 30 ° c til 50 ° c og senkes fra 50 ° c til 30 ° c. Innstilt temperatur ble endret i trinn på 5 ° c. I stabil tilstand er den målte temperaturen innenfor ± 1,5 ° c av den innstilte verdien. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: diatomeen bevegelse. Den vertikale baner av diatomeen bevegelse på grunn av temperaturendringer er plottet. De blå linjene viser baner av diatomeen celler ved 25 ° c for 27,06 s og ved 40 ° c for 0,2 s. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: design tegning av aluminiumsplater (med dimensjoner). (A) platen er 2 mm tykk x 150 mm bred x 200 mm lang, med et sentrert 101 mm diameter hull for å tillate innsetting av gummi varmeren. Hver plate kant har to bearbeidede klør som gummibånd kan festes til sikre prøver på scenen. For å feste denne vertikale scenen til et mikroskop med 4 mm skruer, er 4,2 mm skrue hull boret på fire steder symmetrisk rundt det sentrale hullet. (B) platen er 5 mm tykk x 150 mm bred x 200 mm lang, med et sentrert 130 mm diameter hull. Maskin hakk steder for å matche klo steder på frontplaten for å tillate festing av prøve-sikring gummibånd over scenen. For feste av scenen til et mikroskop, er fire 4,2 mm skrue hull boret i matchende steder til de i forkant plate. (C) platen er 4 mm tykk x 150 mm bred x 200 mm lang, med et sentrert 130 mm diameter hull. En 30 mm span er skåret ut av midten av høyre 200 mm ansiktet av platen, til dybden av det sentrale hullet. Dette formålet med cut-out er å tillate feste av varmeapparatet kontakten på høyre side. I samme posisjoner som i frontplaten, er fire 4,2 mm skrue hull boret for festing av scenen til et mikroskop. (D) platen er 1,5 mm tykk x 150 mm bred x 200 mm lang, med en sentrert 30 mm diameter hull. I samme posisjoner som i frontplaten, er fire 4,2 mm skrue hull boret for festing av scenen til et mikroskop. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 2: design tegning av aluminiumsplater (uten dimensjoner). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 3: design tegning av aluminium sokler. (A) installeres på oversiden: diameter er 100 mm, tykkelse er 3 mm. En 30 mm diameter hull er boret i midten og en åpning av 42 mm bredde x 30 mm dybde er laget på den ene siden. (B) for å bli installert på undersiden: diameter er 100 mm, tykkelse er 4 mm. En 30 mm diameter hull er boret i midten, og tre 3 mm hull har blitt plassert ved 120 ° til hverandre i en avstand på 25 mm fra sentrum. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 4: design tegning av presset kork plater. (A) installeres på oversiden mellom silisium gummi varmeren og den øvre aluminiums sokkelen: diameter er 100 mm, tykkelse er 2 mm. En 20 mm diameter hull er boret i midten, og to kutt (42 mm bred x 30 mm dyp, 4 mm bred x 40 mm) er laget i rett vinkel til hverandre i sidene av platen. (B) for å bli installert på undersiden mellom silisium gummi varmeren og den nedre aluminiums sokkelen: diameter er 100 mm, tykkelse er 1 mm. En 20 mm diameter hull er boret i midten. (C) denne støtten er 42 mm bred × 30 mm dyp, og kuttet fra omkretsen av en 100 mm diameter plate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 5: spesifikasjon av silikon gummi varmer. Diameteren er 100 mm og tykkelsen er 2,5 mm. En 20 mm diameter hull er boret i midten. Strømforsyningen er 12 V, med 18 W lastekapasitet. Varmeren består av nichrome wire, med en bly wire koblet til elektroden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 6: tverrsnitt av mikroskop fasen. Dette er en Seksjons visning av mikroskop scenen. Aluminium sokkelen er festet til baksiden aluminiumsplate og gummi varmeren er installert på den ytterste overflaten. Den trykkes kork er installert for isolasjon mellom gummi varmeren og aluminium pidestall. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 7: detaljer om koblingsskjemaet. Dette indikerer kretsen bygget i kontrolleren. Koblingsskjemaet er delt inn i ni deler i henhold til individuelle funksjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 8: design tegning av plast kontrolleren saken. Dimensjonene er 143,9 mm lengde x 85,3 mm dybde x 25 mm bredde. Temperatur innstillingsknotten, drifts/overoppheting-lampen og indikatoren er plassert på plast håndkontroller kabinettet. Temperaturen kan stilles inn mens du ser på indikatoren ved å dreie på innstillingsknotten. Hvis du skyver denne knotten, starter temperatur kontrolleren. Den målte temperaturen vises i sanntid, og ovnen styres slik at den når og holder innstilt temperatur. Når temperatur kontrolleren er slått på, lyser den blå LYSDIODEN og forblir tent mens ovnen er i drift. Når ovnen blir overopphetet, tennes den røde LYSDIODEN og ovnen stopper automatisk. Hvis du trykker på knappen for temperaturkontroll, stoppes den. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggs figur 9: system konfigurasjon. Mikroskop fasen med en innarbeidet kontroller er koblet til gummi varmeren med en dedikert kabel. Målte prøvetemperatur signaler mottas, og strøm til gummi varmeren overføres av kontrolleren. Målte signaler fra kontrolleren er trådløst sendes til serveren via Internett-ruteren. Serveren kompilerer måle data for analyse og grafer. Temperatur Logg overvåking og temperaturinnstillinger kan styres eksternt via en PC eller smarttelefon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 10: temperatur fordelings måling ved termografi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bane analyse av bevegelige diatomeen celler er en nyttig tilnærming til å evaluere diatomeen motilitet. Men mens en vanlig invertert mikroskop observerer prøvene horisontalt, er det ikke egnet for observasjoner av påvirkning av tyngdekraften eller flytende bevegelse i vertikal retning. Utviklet og beskrevet her er en vertikal mikroskop scenen med temperaturkontroll og festet til en omvendt mikroskop, som har blitt rotert ved 90 °. Dette mikroskopet scenen med temperaturkontroll tillater observasjon av temperatur avhengig vertikal bevegelse av diatomeen celler.
Et kritisk trinn i protokollen er kontrolleren krets design. En hammer krets ble iverksatt for å ivareta sikkerheten. Når sensoren kobles fra prøven eller microcontroller ikke fungerer som den skal, blir strømmen til varmeren avskåret av en annen krets enn microcontroller.
Siden kontrollsystemet vedtok PID-systemet for å kontrollere strømmen til varmeren, kreves det en teknikk for å finne den optimale parameteren for PID. Sammenlignet med den eksisterende metoden, ekstern drift og overvåking er mulig med Wi-Fi-funksjon, datainnsamling på en server, og temperaturen innstillingen funksjonen. Som strukturen av scenen del festet til mikroskopet er komplisert, en forenkling av denne strukturen garanterer en fremtidig studie.
Dette utstyret bruker en ovn for å øke temperaturen, men kjøling er unpowered; den innstilte temperaturen kan derfor ikke være under romtemperatur. Kjøle prøver til temperaturer lavere enn romtemperatur vil kreve en komplisert kjøling enhet, som er under vurdering for fremtidig arbeid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekreftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AC adapter 12V2A | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | AD-D120P200 | Tokyo, Japan |
| ADS1015 Substrate | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | adafruit PRODUCT ID: 1083 | Tokyo, Japan |
| Alminium Plate (Back Side Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 1.5mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Forefront Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 2mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 4mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 5mm | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution | Sigma-Aldrich Co. LLC | B5282-500ML | St. Louis, USA |
| Controller Case | Marutsu Elec Co., Ltd. | pff-13-3-9 | Tokyo, Japan |
| CPU | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | ESP-WROOM-02D | Tokyo, Japan |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | CKX 53 | Tokyo, Japan |
| Low temperature hardening epoxy resin adhesive | ThreeBond Co., Ltd. | TB2086M | Tokyo, Japan |
| Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | 3296W-1-501LF | Tokyo, Japan |
| OLED module | Akihabara Inc. | M096P4W | Tokyo, Japan |
| Pressed Cork (For supporting electrode ) | Tera Co., Ltd. | W 42mm×L 30? | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Lower Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 0.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Upper Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Rotary encoder with switch with 2 color LED | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | P-05772 | Tokyo, Japan |
| Silicone rubber heater | Three High Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Kanagawa, Japan |
| Substrate | Seeed Technology Co., Ltd. | mh5.0 | Shenzhen, China |
| Temperature sensor | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | NXFT15XH103FA2B050 | Tokyo, Japan |
| Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V | Marutsu Elec Co., Ltd. | BR301 | Tokyo, Japan |
| Universal Flexible Arm | Banggood Technology Co., Ltd. | YP-003-2 | Hong Kong, China |
| USB cable USB-A - MicroUSB | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | USB CABLE A-MICROB | Tokyo, Japan |
| Video Canera | Sony Corporation | HDR-CX590 | Tokyo, Japan |
References
- Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
- McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
- Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
- Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
- Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM - selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
- Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
- Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
- Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
- Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
- Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
- Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
- Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
- Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
- Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
- Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields - A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
- Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
- Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
- Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
- Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates - potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
- Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
- Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion - An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).
