Summary
我们描述了使用高频超声与对比成像作为测量膀胱体积、膀胱壁厚度、尿速、空隙体积、空隙持续时间和尿道直径的方法。此策略可用于评估下尿路功能障碍 (LUTD) 的各种小鼠模型中的无效功能障碍和治疗效果。
Abstract
由于人口老龄化,临床良性前列腺增生(BPH)和下尿路症状(LUTS)的发病率呈上升趋势,造成了严重的经济和质量负担。转基因和其他小鼠模型已经开发,以重现这种多因素疾病的各个方面;然而,缺乏准确量化尿功能障碍的方法和新的治疗方案的有效性。在这里,我们描述了一种可用于测量膀胱体积和分泌物壁厚、尿速、空隙体积和空隙持续时间以及尿道直径的方法。这将允许评估疾病进展和治疗效果随着时间的推移。小鼠用胶质麻醉,用超声波对膀胱进行可视化。对于非对比度成像,对膀胱进行三维图像,以计算体积和评估形状;从这张图像测量了膀胱壁厚度。为了进行对比度增强成像,使用 PE50 管连接到注射器的 27 号针在膀胱圆顶上放置导管。在排尿事件发生之前,将0.5 mL的对比波勒注入膀胱。在第一次空隙事件中,在多普勒速度样品窗口的点处确定了尿道直径。对产生流速的每个后续事件测量速度。最后,高频超声证明是评估小鼠泌尿功能期间膀胱和尿道测量的有效方法。此技术在实验环境中评估 BPH/LUTS 的新疗法可能很有用。
Introduction
良性前列腺增生(BPH)是一种随着男性年龄增长而发展的疾病,影响近90%的80岁以上男性1、2岁。虽然BPH的发展一般与衰老有关,其他因素,包括肥胖和代谢综合征,可导致BPH在相对年轻的男性3,4。许多患有BPH的男性出现下尿道症状(LUTS),这大大降低了他们的生活质量,有些症状并发症可能包括出血、感染、膀胱出口阻塞(BOO)、膀胱结石和肾衰竭。BPH的治疗费用每年超过40亿美元。BPH引起的LUTS诊断通常依赖于使用AUA症状指数(AUASI)评分,尿流测量,以及前列腺大小8的评估。BPH/LUTS 的病因是复杂和多因素的,疾病的发展和进展与前列腺增生(前列腺增殖)、平滑肌肉收缩和纤维化相关。目前的治疗包括使用β-肾上腺素阻滞剂调节膀胱和前列腺内的平滑肌肉张力,以减轻LUTS和/或5+还原酶抑制剂,以减少雄激素代谢和减少前列腺大小。更好的疾病模型,鼠等,使准确的研究各种因果关系和治疗因素的影响,在这种疾病过程中是极可取的9。
啮齿动物模型已被广泛用于研究泌尿动力学;然而,大多数研究都集中在女性云母和疾病10。为了全面检查雄性LUTS的各个方面,已经开发并用于研究BPH的不同方面,包括细胞增殖的变化,平滑的肌肉功能,胶原蛋白沉积和炎症11。12,13,然而,啮齿动物和人类前列腺解剖学不同.虽然人类前列腺是紧凑的,包裹在冷凝纤维肌肉层,啮齿动物前列腺是球状;这些差异使疾病进展和治疗效果的直接比较复杂化。此外,LUTS在小鼠中很难评估,因为无法直接测量麻烦。相反,目前研究疾病的方法将组织特征与比较泌尿水平的生理特征(即膀胱体积和壁厚与尿流测定、空隙点测定和膀胱学终点数据)相关联BPH模型和控制动物之间的功能障碍12,15,16,17,18。生理特征经常被评估为死后的尸检终点,并且在同一动物内无法跨时间观察BOO。最近,我们确定了骨盆尿道(前列腺尿道)的细分,其中外源性激素植入物导致缩小基于验尸后尸检评估12。目前的方法不允许在空隙期间对尿道缩小进行直接的体内评估。
超声波是一种非侵入性诊断和评估技术,已成功应用于其他疾病模型。它用于量化器官体积和评估血管流量19,20,21。超声波还用于可视化和指导显微注射,允许有针对性地注射干细胞或其他药物,并评估收缩和舒张心脏功能。
该协议描述了使用高频超声波来评估下尿道解剖学和评估麻醉小鼠的泌尿生理学。我们描述了超声波用于测量膀胱体积和壁厚。我们还描述了使用对比度增强的超声波来测量尿速、尿量、空隙持续时间和尿道直径。超声波的使用提供了对体内下尿道的更全面的了解,确定疾病如何改变正常的空隙功能,并为我们提供了更好的评估新治疗方案有效性的工具。目前,非对比度成像协议是非终端,而当前对比度增强成像协议是一个终端程序。
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Protocol
威斯康星大学麦迪逊分校的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准了涉及动物受试者的程序。
1. 动物准备
- 将一只24个月大的C57Bl6/J雄性小鼠放入预充电室,带3-5%的离室,直到正确的反射丢失,呼吸速率减慢。
- 如有必要,使用剪子从动物的腹部头发,手术和/或成像。使用脱毛霜去除所有剩余的头发。
- 将鼠标置于鼻锥中,鼻锥体中带有 2% 的异常,放在加热平台上,以保持麻醉。确认麻醉的深度,因为动物在踏板退步反射时失去运动(图1B)。
2. 超声波设置
- 将中心频率为 30 MHz 的 MV707 探头连接到有源端口,并将应用预设为"腹部成像"(图 1A)。
- 将超声波探头与膀胱长轴平行放置(图1C)。
- 膀胱、前列腺和尿道的长轴和短轴图像在B模式中制作(图1D)。
- 使用"xy"微操纵器移动鼠标。
3. 非对比度成像协议
- 使用线性距离测量工具测量膀胱壁厚度,并跟踪膀胱壁 b 模式采集后的外部边缘到内边缘。
- 通过跟踪膀胱壁内部以创建轮廓,在 3D 模式采集时使用体积工具测量膀胱 3D 体积。然后,通过膀胱的厚度生成多个轮廓以计算体积。
4. 微气泡对比度重新悬浮/激活
- 通过在涡旋混合器中摇动 45 s 以封装溶液中的微气泡,激活造影剂(例如 DEFINITY)。此步骤对于优化对比度增强至关重要。
5. 导管插入
- 用小鼠麻醉并贴在加热平台上,用直锋利/直的剪刀将膀胱用中线切口穿过皮肤和腹壁。
- 通过柔性聚乙烯管 (PE 50) 将连接到注射器的 27 号针头插入膀胱。用盐水预填充管子,以确保没有气泡注入膀胱。
6. 对比度增强成像协议
- 为了确认针头放置,在通过超声波观察时向膀胱中注入10μL的盐水。
- 将盐水注射器替换为含有对比度的注射器,以改善尿道壁的可视化和排空事件,因为尿道通常折叠。获得尿道的完整长轴视图并保存图像后,旋转探头 90°以获得短轴视图和 M-Mode 图像。
- 以每3s0.5 mL的微气泡注入膀胱,直到发生排尿事件。
- 在第一次空隙事件中,使用线性距离工具和测量边缘到边缘的多普勒速度采样窗口点处的尿道直径。
- 正确定位尿道后,将探头与尿道相关的角度,使之与尿流更平行。
- 向膀胱中注入第二个微气泡,并使用速度时间积分 (VTI) 工具测量事件速度。
- 收集数据后,用宫颈脱位对小鼠实施安乐死。
7. 数据计算和分析
- 选择 VTI 工具通过跟踪记录的图像来测量速度。
- 使用前缘到前缘约定测量从 B 模式或 M 模式图像的尿道直径。
- 使用上述公式 (CSA ) 使用上述图像测量值计算横截面面积 (CSA)。
- 使用尿道的 CSA 计算空隙体积,并将其乘以多普勒跟踪(速度时间积分)下的面积(CSA x VTI = 体积)。
- 假设每立方厘米密度为 1克,计算实际空隙尿量。
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Representative Results
超声波可以使用或不带对比度增强,具体取决于实验设计和端点测量。老鼠用除胶和被洗去的毛分,所有的头发痕迹都用脱毛霜去除。麻醉动物被放置在加热平台上,超声波探头沿膀胱的长轴定位(图1)。
图2显示了在没有造影剂的情况下获得的小鼠膀胱的代表性超声图像。膀胱壁为高呼(白色),膀胱壁厚度使用软件测量包测量。可以渲染膀胱表面投影以确定膀胱体积、壁厚和壁体积(表1)。
为了对比增强膀胱和下尿道成像,必须插入导管到膀胱和微气泡注射。激活每个制造商的协议的微气泡以获得最佳成像效果非常重要。图 3显示了微气泡填充膀胱的代表性图像。膀胱是高回声(在图像中显示为白色)。低频超声波爆裂破坏气泡,膀胱在气泡改革前变得暂时性低微(显示为黑色),确认这种结构为膀胱。在破坏脉冲期间,发射功率达到100%,传输频率降至10 MHz。微气泡(每 3 s 0.5 mL)触发空隙事件,并使得尿道可视化成为可能。尿道在排尿过程中应用低频超声波爆裂,观察微气泡的破坏和改造,从而得到确认。在排尿活动期间可以进行多次测量。尿道流明直径可随尿流流过尿道区域和总流出的流速一起获得,在排尿前和尿后流动速度(图4)。使用对比成像,测量了尿道的整个长度(表2)。从这些测量中,进一步计算,以检查尿流和膀胱符合性(表3)。
图 1.超声波设置。(A) 整体成像设置。(B) 鼠标在平台上的位置。(C) 膀胱暴露和导管与超声波探头排列长轴膀胱成像。(D) 超声凝胶和探头放置在暴露的导管膀胱上,用于长轴和短轴成像。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.小鼠膀胱的非对比成像。(A) 小鼠膀胱的图像没有微气泡.(B) 从 b 模式膀胱图像测量膀胱壁厚度。(C) 小鼠膀胱的三维重建.(D) 从三维图像推断的表面积和形状,以便进一步分析.请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.小鼠膀胱和尿道的对比增强成像。(A) 带微气泡的全膀胱.(B) 销毁事件后充满微气泡的膀胱。(C) 带微气泡的小鼠尿道.(D) 破坏事件后带有微气泡的小鼠尿道.乌雷斯拉用红色勾勒。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.从小鼠尿道测量。(A) 尿道流明直径在泌尿活动期间测量.(B) 在排空过程中 , 尿流流速通过尿道。请点击此处查看此图的较大版本。
| 试验 | 气囊体积 (mm3) | 气囊壁厚(毫米) | 气囊壁体积 (mm3) |
| 164 | 47.44 | 0.82 | 12.14 |
| 166 | 87.54 | 0.83 | 29.84 |
| 167 | 100.94 | 0.58 | 51.53 |
| 163 | 152.12 | 0.7 | 74.61 |
| 165 | 116.39 | 0.61 | 59.28 |
表 1.膀胱的非侵入性超声测量。通过超声波测量的膀胱体积和膀胱壁厚度。
| 测量类型 | 需要图像 | 位置 | 测量 |
| 气囊体积 (mm3) | 膀胱 3D 模式 | 膀胱 | 335 |
| 气囊壁厚(毫米) | 膀胱 B 模式 | 远至膀胱颈部 近囊颈部 |
0.25 0.23 |
| 尿道直径(毫米)* | 乌雷拉 B 模式 | 膀胱颈部 前列腺尿道 膜尿道 尿道 |
0.83 0.33 0.5 0.25 |
| 尿路事件时间(毫秒)* | 乌雷特拉 PW 模式 | 膀胱颈部 前列腺尿道 膜尿道 尿道 |
3960 3740 3530 4490 |
| 加速时间(毫秒)* | 乌雷特拉 PW 模式 | 膀胱颈部 前列腺尿道 膜尿道 尿道 |
580 440 240 180 |
| 加速度 (毫米/s2)* | 乌雷特拉 PW 模式 | 膀胱颈部 前列腺尿道 膜尿道 尿道 |
1218.08 3685.76 3054.79 11031.4 |
| 速度时间积分 (厘米)* | 乌雷特拉 PW 模式 | 膀胱颈部 前列腺尿道 膜尿道 尿道 |
184.2 490.48 157.55 676.93 |
| 平均速度(毫米/s)* | 乌雷特拉 PW 模式 | 膀胱颈部 前列腺尿道 膜尿道 尿道 |
494.09 1256.82 467.04 1565 |
| 峰值速度(毫米/s)* | 乌雷特拉 PW 模式 | 膀胱颈部 前列腺尿道 膜尿道 尿道 |
780.74 1655.85 820.97 2190.94 |
| 平均梯度 (mmHg)* | 乌雷特拉 PW 模式 | 膀胱颈部 前列腺尿道 膜尿道 尿道 |
0.98 6.32 0.87 9.8 |
| 峰值梯度 (mmHg)* | 乌雷特拉 PW 模式 | 膀胱颈部 前列腺尿道 膜尿道 尿道 |
2.44 10.97 2.7 19.2 |
| • 尿检期间捕获的测量值 |
表2.膀胱和尿道的超声波测量。膀胱和尿道测量在尿空时用超声波进行。
| 计算类型 | 公式 |
| 横截面面积 (mm2) | CSA = \r2 |
| 流速 (毫米3/s) | 流速 = CSA x 平均速度 |
| 估计空隙体积 (mL) | V = (流速/1000) x(事件时间(以秒为单位) |
| 体积拉伸 | 拉伸 = (V后-V之前)/V之前 |
表 3.使用超声波测量进行计算。适用于超声波测量的计算和公式,以评估膀胱功能和尿流。
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Discussion
目前评估啮齿动物下尿路的技术受限于它们将空隙生理学的变化与导致疾病进展的前列腺动物学变化直接关联的能力。虚斑测定和尿流测定可用于评估啮齿动物的自发排尿事件,这些技术可用于评估15、16、17期间的变化。然而,对于这两种技术,膀胱丰满不能在测试开始前评估。此外,排尿的变化可能由于行为,而不是疾病进展的直接结果,使得很难确定疾病对排尿的影响。囊肿测量是评估啮齿动物膀胱功能的另一种技术,可以提供膀胱功能16的体内评估。然而,啮齿动物前列腺对空隙功能的动态影响尚不清楚。先前的研究已经记录了小鼠尿道组织学的变化,与改变的空隙功能12相关。然而,这些研究只能看一个离散的时间点,膀胱、前列腺和尿道解剖学不能与功能测试同时评估。其他评估膀胱内变化的方法(即质量、体积)发生在安乐死11、12时,使得观察疾病过程随时间的演变是不可能的。由于在牺牲时有排尿的风险,以及无法在牺牲前调节水摄入量,即使在治疗组内,测量的膀胱体积的变异性也会增加。本文介绍了使用超声波对有或没有造影剂的小鼠下尿道进行成像。该技术允许可视化完整动物的膀胱大小变化,以及评估膀胱体积、膀胱壁厚度、尿道流明直径和通过尿道的对比度速度的功能变化。具体来说,对比增强超声允许在空隙过程中,以精确定位潜在功能障碍区域的方式,对尿道流明进行可视化,特别是在前列腺区域。
为了确保收集一致和准确的超声数据,在研究过程中,单个经过培训的超声学家收集和读取超声波至关重要。对于对比度增强成像,根据制造商协议激活商业微气泡非常重要。激活的微气泡应用0.9%盐溶液稀释。未稀释的微气泡非常集中,它们可以防止超声波渗透,并将阴影结构位于它们下面。微气泡稀释还降低了实验成本。微泡稀释可以变化,没有用户所需的负面实验效果。
评估完整动物的膀胱体积和膀胱壁厚度,可以检查疾病进展,并评估治疗效果。目前,BPH的治疗是在啮齿动物模型中,要么作为疾病的诱导,要么在以前确定导致重大疾病进展11,22,23的时间点。治疗的有效性通常在单一离散的时间段后确定,尽管生物变异性可能会影响对治疗作出反应所需的时间。利用这一新技术,可以从疾病表型的诱导到整个治疗方案,对BPH的啮齿动物模型进行评估。
造影剂使下尿道在排尿事件之前、期间和之后被可视化。我们之前在BPH的小鼠模型中研究了尿道体学。我们本地化了前列腺尿道作为引起尿功能障碍的假定区域。该区域含有更多的前列腺导管,密度更大的胶原蛋白,和较小的流明比对照小鼠12。此外,BPH-易感小鼠表现出排空功能障碍,通过尿流测量和虚斑测定。使用微气泡的超声波,我们可以直接评估前列腺尿道的区域,以测量流速、持续时间和光径(图3和4)。通过使用超声波确定阻碍流动的区域,然后可以通过组织学进一步评估该特定区域,以确定功能障碍的主要组成部分。
该技术可重复小鼠菌株,并跨越一系列小鼠年龄和治疗条件。除了老年雄性小鼠外,该技术还可用于评估代谢异常的年轻小鼠,这些异常可能导致BPH/LUTD。该技术还可用于评估雌性小鼠的空隙和下尿路功能。虽然此处描述的具有对比度的超声方案是一个终端程序,但我们可以进行超阴囊切除术,为下尿道24的非终端造影创造潜力。未来的实验将优化尿路功能的可视化,以便重复测量。根据实验问题,此处描述的技术可以与其他功能性泌尿测试技术相结合,以更深入地了解疾病进展和治疗效果。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
我们要感谢艾米莉·里克、克里斯汀·乌赫特曼和里克实验室在畜牧业方面的协助和对这份手稿的反馈。我们要感谢NIDDK和NIEHS对这些研究的财政支持:U54 DK104310(WAR、JAM、PCM、CMV、DEB)、R01 ES001332(WAR、CMV)、K12 DK100022(TTL、AR-A、DH)。内容由作者全权负责,并不代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| 27 gauge needle | BD | Z192376 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| DEFINITY | Lantheus Medical Imaging | DE4 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| MV707 probe | Fujifilm VisualSonics Inc | ||
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| Polyethylene 50 tubing | BD | 427516 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Inov | ACC526 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T) | 14054-13 | |
| Syringe | BD | 309646 | 5mL |
| Vevo 770 | Fujifilm VisualSonics Inc | ||
| VIALMIX | Lantheus Medical Imaging | VMIX |
References
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