Transcriptie start site mapping met behulp van Super-lage input Carrier-CAGE

Summary

De analyse van het GLB van de uitdrukking van het gen (kooi) is een methode voor genoom-brede kwantitatieve afbeelding van mRNA 5 ' einden om RNA polymerase II transcriptie begin plaatsen bij een enig-nucleotide resolutie te vangen. Dit werk beschrijft een laag-input (SLIC-kooi) protocol voor generatie van de bibliotheken van uitstekende kwaliteit gebruikend nanogramgebied-bedragen van totaal RNA.

Abstract

De analyse van het GLB van de uitdrukking van het gen (kooi) is een methode die voor enig-nucleotide resolutie opsporing wordt gebruikt van RNA polymerase II transcriptie begin plaatsen (TSSs). De nauwkeurige opsporing van TSSs verbetert identificatie en ontdekking van kern promotors. Daarnaast kunnen actieve enhancers worden gedetecteerd door middel van handtekeningen van bidirectionele transcriptie initiatie. Hier beschreven is een protocol voor het uitvoeren van Super-lage input Carrier-CAGE (SLIC-CAGE). Deze aanpassing SLIC van het kooi protocol minimaliseert de verliezen van RNA door de hoeveelheid van RNA kunstmatig te verhogen door middel van een in vitro getranscribeerde de vervoerder mengeling van RNA die aan de steekproef van belang wordt toegevoegd, waardoor bibliotheek voorbereiding van nanogramgebied-bedragen van totale RNA (dat wil zeggen, duizenden cellen). De vervoerder bootst de verwachte DNA-bibliotheek fragmentlengte verdeling, waardoor het elimineren van vooroordelen die kunnen worden veroorzaakt door de overvloed van een homogene drager. In de laatste stadia van het Protocol, wordt de drager verwijderd door degradatie met het automatisch besturen beperkingsendonucleases en de doelbibliotheek wordt versterkt. De doelsteekproef bibliotheek is beschermd tegen degradatie, aangezien de het besturen endonuclease erkenningsplaatsen lang (tussen 18 en 27 BP) zijn, makend de waarschijnlijkheid van hun bestaan in eukaryotic genoom zeer laag. Het eindresultaat is een DNA-bibliotheek klaar voor de volgende generatie sequencing. Alle stappen in het Protocol, tot sequencing, kunnen binnen 6 dagen worden voltooid. De vervoerder voorbereiding vereist een volledige werkdag; het kan echter worden bereid in grote hoeveelheden en bevroren gehouden bij-80 ° c. Eenmaal gesequenced, de leest kan worden verwerkt tot genoom-brede single-nucleotide resolutie TSSs te verkrijgen. TSSs kan gebruikt worden voor Core Promoter of Enhancer Discovery, die inzicht verschaft in Gene regulatie. Eenmaal samengevoegd tot promotors, kunnen de gegevens ook worden gebruikt voor 5 '-centric Expression profilering.

Introduction

De analyse van het GLB van de uitdrukking van het gen (kooi) is een methode die voor enig-nucleotide resolutie genoom-brede in kaart brengen wordt gebruikt van RNA polymerase II transcriptie begin plaatsen (TSSs)¹. De kwantitatieve aard maakt het ook mogelijk 5 '-end centric Expression profilering. Regio's rond de TSSs (ongeveer 40 BP stroomopwaarts en stroomafwaarts) zijn kern promotors en vertegenwoordigen de fysieke locatie waar RNA polymerase II en algemene transcriptiefactoren binden (herzien eerder^2,3). Informatie over de exacte locaties van TSSs kan gebruikt worden voor Core Promoter Discovery en voor het monitoren van promotor dynamiek. Bovendien, als actieve enhancers vertonen handtekeningen van bidirectionele transcriptie, kooi gegevens kunnen ook worden gebruikt voor Enhancer ontdekking en monitoring van Enhancer Dynamics⁴. De methodologie van de kooi heeft onlangs in populariteit wegens zijn brede toepassing en gebruik in high-profile onderzoekprojecten zoals coderen⁵, modENCODE⁶, en Fantom projecten⁷gestegen. Bovendien, TSS informatie blijkt ook belangrijk te zijn voor het onderscheiden van gezonde en zieke weefsels, zoals ziekte-specifieke TSSs kan worden gebruikt voor diagnostische doeleinden⁸.

Hoewel verschillende methoden voor TSS mapping beschikbaar zijn (CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-aftopping), hebben wij en anderen onlangs aangetoond dat CAGE is de meest onbevooroordeelde methode om echte TSSs te vangen met het minste aantal valse positieven^{9 , 10}. het recente kooi protocol, NAnT-iCAGE¹¹, is het meest onbevooroordeelde protocol voor TSS profilering, aangezien het het snijden van de fragmenten aan korte markeringen vermijdt gebruikend beperkingsenzymen en gebruikt geen PCR versterking. Een beperking van het nAnT-iCAGE protocol is de vereiste voor een grote hoeveelheid van uitgangsmateriaal (b.v., 5 µ g van totaal RNA voor elk steekproef). Om specifieke, biologisch relevante vragen te beantwoorden, is het vaak onmogelijk om zulke hoge hoeveelheden uitgangsmateriaal te verkrijgen (bijv. voor FACS cellen of vroege embryonale stadia). Tot slot als nAnT-iCAGE succesvol is, is slechts 1-2 ng van het materiaal van de bibliotheek van DNA beschikbaar van elk steekproef, daardoor beperkend de haalbare het rangschikken diepte.

Om TSS profilering met behulp van slechts nanograms van Total RNA, hebben we onlangs ontwikkeld super-low input Carrier-CAGE¹⁰ (SLIC-Cage, Figuur 1). SLIC-CAGE vereist slechts 10 ng van totaal RNA om hoge ingewikkeldheid bibliotheken te verkrijgen. Ons protocol vertrouwt op de zorgvuldig ontworpen synthetische drager van RNA die aan RNA van belang wordt toegevoegd om een totaal van 5 μg van het materiaal van RNA te bereiken. De synthetische drager bootst de doelbibliotheek van DNA in lengte distributie na om potentiële biases te vermijden die door homogene molecules kunnen worden veroorzaakt in overmaat. De volgorde van de vervoerder is gebaseerd op de volgorde van de Escherichia coli Leucyl-tRNA synthetase gen (tabel 1) om twee redenen. Ten eerste, elke rest van de vervoerder in de definitieve bibliotheek, zelfs indien gesequenced, zal niet kaart om een eukaryotische genoom. Ten tweede, aangezien E. coli een mesofiele soort is, worden zijn huishouden genen geoptimaliseerd voor de temperatuurwaaier geschikt voor SLIC-kooi. De carrier opeenvolging is ook ingebed met het automatisch berijden endonuclease erkenningsplaatsen om specifieke degradatie van DNA toe te staan die uit de molecules van RNA van de drager wordt afgeleid. De doelgroep, sample-afgeleide bibliotheek blijft intact, als de besturen endonuclease herkenning sites zijn lang (I-CeuI = 27 BP; I-SceI = 18 BP) en statistisch onwaarschijnlijk te vinden in eukaryote genoom. Na specifieke degradatie van de drager en de verwijdering van fragmenten door grootte uitsluiting, wordt de doelbibliotheek PCR versterkt en klaar voor volgende-generatie het rangschikken. Afhankelijk van het beginnende bedrag van RNA (1-100 ng), tussen 13-18 PCR versterkings cycli zouden moeten worden vereist. Het uiteindelijke bedrag van DNA per elk monster varieert tussen 5-50 ng, waardoor voldoende materiaal voor zeer diepe sequencing. Wanneer het gebruiken van slechts 1-2 ng van totaal RNA, kan de ware TSSs worden ontdekt; echter, de bibliotheken zijn naar verwachting van een lagere complexiteit. Tenslotte, zoals sneetje-kooi zit op basis van naar de nAnT-iCAGE protocol¹¹, op in staat stellen multiplexing van tot aan acht steekproef vooraleer voor sequencing.

Protocol

1. voorbereiding van de vervoerder

1. Voorbereiding van DNA-templates voor in-vitro transcriptie
   1. Bereid de PCR mengeling voor elke PCR malplaatje voor door 41 µ L van water te combineren, 20 µ L van 5x HF buffer, 8 µ L van 2,5 mM dNTPs, 10 µ L van 10 µ M unieke voorwaartse primer (PCR_GN5_f1, tabel 2; primers worden opgelost en verdund in water) , 10 µ L van 2 ng/µ L template plasmide met de synthetische drager gen en 1 µ L phusion polymerase. Meng de PCR mix door het pipetteren. Een Master mix voor alle 10 templates kan worden voorbereid in een keer (voor te bereiden op 11 reacties).
   2. Voeg 90 µ L van de PCR mengeling aan 10 µ L van elke 10 µ M omgekeerde inleiding (PCR_N6_r1-R10, lijst 2) toe. Meng door pipetten.
   3. PCR versterken de malplaatjes gebruikend het volgende programma: 98 °C voor 60 s, (98 °C voor 10 s, 50 °C voor 30 s, 72 °C voor 30 s) 35 cycli, 72 °C voor 10 min, greep bij 4 °C.
   4. De reiniging van het gel van PCR-versterkte malplaatjes van DNA
      1. Bereid een 1% agarose gel voor (het laag-smelten agarose wordt geadviseerd).
      2. Om het volume te verminderen, concentreer de PCR reactie mengsels van 100 µ L tot 20 µ L totaal volume gebruikend de vacuüm concentrator bij een lage-middelgrote temperatuur (30-40 °C).
      3. Voeg 6 µ L van de 6x laden kleurstof, meng goed, en de belasting op de gel. De Elektroforese van de looppas voor 30 min in 1x TAE buffer bij de voltage aangewezen voor de gebruikte elektroforese tank (5 – 10 V/cm). In parallel lopen een 100 BP of 1.000 BP DNA ladder.
      4. Met behulp van een schone scalpel, accijnzen de gel plakjes die het doel PCR product. Vermijd bovenmatig agarose gel. Zuiver de PCR-producten met behulp van een gel extractie Kit (volgens de instructies van de fabrikant).
         Opmerking: A260/A230 verhoudingen van DNA geïsoleerd van agarose gels zijn meestal laag (0.1 – 0.3). Verwachte doelproduct-en nevenproducten worden weergegeven in Figuur 2a. De verwachte opbrengsten van 100 µ L PCR reacties zijn 1.2 – 3 µ g. reacties kunnen worden opgeschaald tot een hogere opbrengst te krijgen.
2. In vitro transcriptie van drager moleculen
   1. Transcribeer vervoerder RNA in vitro gebruikend de polymerase van RNA volgens de instructies van de fabrikant. Stel 10 – 20 µ L Reacties (de aanbevolen Kit is in de tabel van materialen).
   2. Zuiver het in vitro getranscribeerde RNA gebruikend een de reinigings uitrusting van RNA. De spijsvertering van DNA in oplossing gebruikend DNase ik volg de standaard instructies van de fabrikant, en elueer RNA in 50 µ L van water. Voor het verhogen van de elutie opbrengst, laat het water in de kolom voor 5 minuten voor centrifugeren.
      Opmerking: Wees voorzichtig niet te overschrijden de maximale bindende capaciteit van de kolommen (in de kit vermeld in de tabel van materialen, capaciteit is tot 100 µ g). De verwachte opbrengst van PCR malplaatjes 1 – 10 (1 KBP aan 200 BP in lengte) is 25 – 50 µ g van 10 µ L in vitro transcriptie reacties. Reacties kunnen worden opgeschaald tot een grotere voorraad van carrier moleculen te krijgen.
3. Aftopping van in vitro getranscribeerde vervoerder RNA moleculen
   1. Bereid de aftopping mix door het combineren van 2 µ L van 10x aftopping buffer, 1 µ L van 10 mM GTP, 1 µ L van 2 mM SAM (vers verdund), en 1 µ L van vaccinia aftopping enzym per vervoerder RNA.
   2. Meng tot 10 µ g van elk vervoerder molecuul in 15 µ L van het totale volume en denature voor 10 min bij 65 °C. Plaats op ijs onmiddellijk om secundaire structuurvorming te voorkomen.
   3. Meng de gedenatureerde vervoerder RNA met 5 µ L van de aftopping mix en incubeer voor 1 uur bij 37 ° c.
   4. Zuiver afgetopte RNA moleculen gebruikend een de reinigings uitrusting van RNA-Volg het Clean-up Protocol van de fabrikant. Elueer RNA in 30 µ L water. Voor het verhogen van de elutie opbrengst, laat het water in de kolom voor 5 minuten voor centrifugeren.
      Opmerking: Meet de concentratie met behulp van de microvolume spectrofotometer. Verwachte A260/A280 verhouding is > 2 en A260/A230 is > 2. Merk op dat voor sommige RNA monsters A260/A230 kan worden tussen 1,3-2. Verwachte opbrengst bij het gebruik van 10 µ g van de niet-afgetopte RNA is 9 – 10 µ g van afgetopte RNA.
4. Bereid de mix van de afgetopte en niet-afgedekte drager samen door de in tabel 3beschreven bedragen te combineren. Meng goed door flicking de buis en meet de concentratie met behulp van de micro volume spectrofotometer.
   Opmerking: Als een hogere concentratie van de vervoerder nodig is om te passen in de omgekeerde transcriptie reactie (zie hieronder), kan de vervoerder mix worden geconcentreerd met behulp van de vacuüm concentrator bij lage-medium temperatuur (30-35 ° c) tot het bereiken van de gewenste uiteindelijke concentratie. Stappen 2 – 14 worden gewijzigd van het standaard nAnT-iCAGE protocol gerapporteerd door de

2. omgekeerde transcriptie

1. Combineer 1 µ L van de RT primer (2,5 mM TCT-N6 opgelost in water, voor opeenvolging Zie supplementaire lijst 1), 10 ng van totaal RNA van belang en 4.990 ng van drager mengeling (lijst 3) in 10 µ l van totaal volume in een laag-bindende PCR plaat. Meng door flicking de buis.
   Opmerking: Als het monster RNA is te verdund voor omgekeerde transcriptie (zie hieronder), te combineren met het juiste bedrag van de vervoerder, concentraat met behulp van de vacuüm concentrator tot 9 µ L totale volume, en voeg 1 µ L van de RT primer. Het toevoegen van de drager graaf, om 5 µ g van RNA in totaal te bereiken verhindert steekproef verlies.
2. Verhit de mix van stap 2,1 bij 65 °C voor 5 min, en plaats op ijs onmiddellijk om renaturatie te voorkomen.
3. Bereid de omgekeerde transcriptie (RT) mix voor.
   1. Voor elke steekproef Combineer 6,1 µ L van water (ASE-en DNase-vrij), 7,6 µ L van 5x eerste-bundel buffer, 1,9 µ L van 0,1 M DTT, 1 µ L van 10 mM dNTPs, 7,6 µ L van trehalose/sorbitol mix (zie recept in de richting vande "" van de aanbevolen reverse µ (zie < c 3,8 6 > lijst van materialen). Meng goed door flicking de buis.
4. Voeg 28 µ L van de RT mix in de PCR buis toe met 10 µ L van RNA, carrier en de RT primer (totaal volume 38 µ L). Meng goed door te pipetteren.
   Opmerking: De mix is zeer kleverig als gevolg van trehalose/sorbitol. Meng tot zichtbaar homogeen.
5. Incubeer in een thermische fietser gebruikend het volgende programma: 25 °C voor 30 s, 50 °C voor 60 min, en greep bij 4 °C.
6. Zuivering van cDNA: de hybriden van RNA gebruikend SPRI magnetische parels
   1. Voeg 68,4 µ L van de aanbevolen ASE-en DNase-vrije SPRI kralen (Zie de lijst van materialen) tot 38 µ l van de RT mix (kralen naar sample ratio 1,8:1). Meng goed door het pipetteren en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT).
   2. Scheid de kralen op een magnetische stand voor 5 min. Gooi de bovendrijvende en was de kralen tweemaal met 200 µ L van 70% ethanol (vers bereid).
      Opmerking: De ethanol wordt toegevoegd aan de kralen zonder te mengen en terwijl de buis is op de magnetische stand. De toegevoegde ethanol wordt onmiddellijk verwijderd. De zorg zou moeten worden genomen om geen parels tijdens wasbeurten te verliezen aangezien het tot steekproef verlies kan leiden.
   3. Terwijl de buis is nog steeds op de magnetische stand, verwijder alle sporen van ethanol. Druppels van ethanol kunnen worden verwijderd en uit de buis geduwd met behulp van een P10 pipet. Laat de kralen niet drogen.
   4. Voeg 42 µ L van het water voorverwarmd bij 37 ° c aan de kralen en elueer het monster door pipetten op en neer 60x.
      Opmerking: Wees voorzichtig om geen schuim te veroorzaken door te pipetteren, omdat het kan leiden tot verlies van kralen (dat wil zeggen, gebonden monster) in het schuim.
   5. Incubeer bij 37 °C voor 5 min zonder het deksel om verdamping van sporenhoeveelheden ethanol mogelijk te maken.
   6. Scheid de kralen op een magnetische stand voor 5 min en breng de bovendrijvende naar een nieuwe plaat.
      Opmerking: Probeer om alle bovendrijvende te halen om steekproef verlies te verhinderen terwijl het vermijden van parel overdracht. Gebruik de P10 pipet om het laatste monster druppeltjes te krijgen.

3. oxidatie

1. Voeg 2 µ L van 1 M NaOAc (pH 4,5) toe aan de gezuiverde RT-reactie. Meng door het pipetteren, voeg 2 µ L van 250 mM NaIO₄ toe en meng opnieuw.
2. Incubeer op ijs voor 45 min. Bedek de plaat met aluminiumfolie om licht te voorkomen.
3. Voeg 16 µ L van tris-HCl (pH 8,5) toe in de oxidatie mengeling om de pH te neutraliseren.
4. Zuiver geoxideerde cDNA: RNA hybriden met behulp van SPRI magnetische kralen. Voeg 108 µ L van SPRI kralen toe aan 60 µ L van de oxidatie mix (1,8:1 kralen naar sample ratio). Herhaal de zuivering zoals beschreven in stap 2.6.1 – 2.6.6. Elueer gebruikend 42 µ L van water voorverwarmd aan 37 °C.
   Opmerking: Vers bereid 250 mM NaIO₄ door toevoeging van 18,7 µ l water per 1 mg NaIO₄. NaIO₄ is lichtgevoelig; Houd daarom de oplossing in een buis bedekt met aluminiumfolie of in een lichtbestendige buis.

4. Biotinylation

1. Voeg 4 µ L van 1 M NaOAc (pH 6,0) toe in de buis met het gezuiverde geoxideerde monster en meng door het pipetteren.
2. Voeg 4 µ L van 10 mM Biotine-oplossing toe, Meng door het pipetteren en incubeer voor 2 h bij 23 °C in een thermische fietser om licht te voorkomen.
   Opmerking: Bereid de Biotine oplossing door het mengen van 50 mg Biotine met 13,5 mL DMSO. Maak eenmalig gebruik en bevriezen bij-80 °C.
3. Zuiveren biotinylated cDNA: RNA hybriden met behulp van SPRI magnetische kralen. Voeg 12 µ L van 2-propanoel toe en meng door het pipetteren. Voeg 108 µ L van SPRI kralen (1,8:1 kralen naar sample ratio) en herhaal de zuivering zoals beschreven in stap 2.6.1 – 2.6.6. Elueer gebruikend 42 µ L van water voorverwarmd bij 37 °C.
   Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken, en monsters bevroren bij-80 ° c.

5. ASE ik Ddigestion

1. Bereiden van de ASE ik mix door het mengen van 4,5 µ L van 10x ASE ik buffer met 0,5 µ L van ASE I (10 U/µ L) per elke steekproef. Meng door pipetten.
2. Voeg 5 µ L van de mix toe aan elk gezuiverd monster (45 µ L in totaal). Meng door het pipetteren en incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.

6. bereiding van Streptavidin kralen

1. Voor elk monster, meng 30 µ L van de streptavidin kralen drijfmest met 0,38 µ L van 20 mg/mL tRNA. Incubeer op ijs voor 30 min en meng elke 5 min door flicking de buis.
   Opmerking: Opnieuw op te schorten de streptavidin kralen drijfmest goed voor het pipetten door flicking de fles. De tRNA oplossing moet worden opgesteld volgens de
2. Scheid de kralen op de magneet stand voor 2 – 3 min. Verwijder de bovendrijvende.
3. Was de kralen door opnieuw op te schorten in 15 µ L van de buffer A. Scheid de kralen op de magnetische stand voor 2 – 3 min en verwijder de bovendrijvende. Herhaal de was en verwijder de bovendrijvende.
4. Hersuspendeer de kralen in 105 µ L van buffer A en Voeg 0,19 µ L van 20 mg/mL tRNA toe. Meng goed door te pipetteren.
   Opmerking: De kralen moeten vers worden bereid voorafgaand aan het gebruik. Begin voorbereiding van de parels tijdens ASE I spijsvertering. Voor meerdere monsters voor te bereiden de kralen samen in een enkele buis.

7. Cap-overvullen

1. Steekproef bindend
   1. Voeg 105 µ L van voor bereide streptavidin parels aan 45 µ L van de ASE I-behandelde steekproef toe. Meng goed door het pipetteren en Incubeer bij 37 °C voor 30 min. Meng door elke 10 min. te pipetteren.
   2. Scheid de kralen op de magneet stand voor 2 – 3 min. Verwijder de bovendrijvende.
2. Wassen kralen
   1. Voeg 150 µ L van was buffer A en de kralen opnieuw op te schorten door te pipetteren. Scheid de kralen op de magnetische stand voor 2 – 3 min en verwijder de bovendrijvende.
   2. Voeg 150 µ L van de Wash buffer B toe en hersuspendeer de kralen door te pipetteren. Scheid de kralen op de magnetische stand voor 2 – 3 min en verwijder de bovendrijvende.
   3. Voeg 150 µ L van de was buffer C en de kralen opnieuw op te schorten door te pipetteren. Scheid de kralen op de magnetische stand voor 2 – 3 min en verwijder de bovendrijvende.
      Opmerking: Buffers B en C moeten worden voorverwarmd tot 37 °C. Recepten voor wassen buffers A, B en C zijn zoals beschreven in de
3. cDNA release
   1. Bereid 1x ASE ik buffer door het mengen van 58,5 µ L van water met 6,5 µ L van 10x ASE ik buffer.
   2. Hersuspendeer de kralen in 35 µ L van 1x ASE I buffer. Incubeer bij 95 °C voor 5 min en breng direct op ijs voor 2 min om reassociatie van cDNA te voorkomen. Houd de deksels tijdens de overdracht naar ijs als ze kunnen pop-off als gevolg van de druk op te bouwen.
   3. Scheid de kralen voor 2 – 3 min op een magnetische stand en breng de bovendrijvende over naar een nieuwe plaat.
   4. Hersuspendeer de kralen in 30 µ L van 1x ASE I buffer. Scheiden de kralen op de magnetische stand voor 2 – 3 min en de overdracht van de bovendrijvende naar de eerder verzamelde bovendrijvende (totale volume van geëlueerd cDNA moet ongeveer 65 µ L).

8. de verwijdering van RNA door ASE H en ASE ik spijsvertering

1. Per steekproef, combineren 2,4 µ L van water, 0,5 µ L van 10x ASE I buffer, 0,1 µ L van ASE H, en 2 µ L van ASE I.
2. Voeg 5 µ L van de mix toe aan de 65 µ L van het vrijgegeven cDNA monster en meng door pipetten. Incubeer bij 37 °C voor 15 min en houd bij 4 °C.
3. Zuiveren cDNA uit de ASE spijsvertering mix met behulp van SPRI magnetische kralen. Voeg 126 µ L van SPRI kralen toe aan 70 µ L van degradatie reactie en meng door het pipetteren. Volg de zuiveringsstappen zoals beschreven voor SPRI kralen zuivering in 2.6.1 – 2.6.6. Elueer gebruikend 42 µ L van water voorverwarmd bij 37 °C zoals beschreven.
4. Bereiden ASE ik mix door het combineren van 4,5 µ L van 10x ASE I buffer en 0,5 µ L van ASE I.
5. Voeg 5 µ L van de ASE-mix toe aan de 40 µ L van het gezuiverde cDNA monster. Meng door pipetten en Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min. Houd bij 4 °C.
6. Zuiver het monster met behulp van SPRI magnetische kralen. Voeg 81 µ L van SPRI kralen toe aan 45 µ L van degradatie reactie en meng door het pipetteren. Volg de zuiveringsstappen zoals beschreven voor SPRI kralen zuivering in 2.6.1 – 2.6.6. Elueer met behulp van 42 µ L water zoals beschreven.

9. Afbinding van 5 ' linker

1. Concentreer het gezuiverde cDNA monster tot 4 µ L met behulp van de vacuüm concentrator. Houd de temperatuur bij 30 – 35 °C. Test het volume met behulp van een pipet. Als het monster is gedroogd tot volledigheid, oplossen door toevoeging van 4 µ L water.
   Opmerking: Het is beter om te voorkomen dat het drogen van de volledigheid om monster verlies te voorkomen.
2. Incubeer de geconcentreerde steekproef bij 95 °C voor 5 min en onmiddellijk plaats op ijs voor 2 min om renaturatie te voorkomen. Houd de deksels terwijl de overdracht van de buizen als de deksels kan pop-off als gevolg van de drukopbouw.
3. Incubeer 4 µ L van de 2,5 µ M 5 ' linker bij 55 °C voor 5 min en onmiddellijk plaats op ijs voor 2 min om renaturatie te voorkomen.
4. Meng 4 µ L van de 2,5 µ M 5 ' linker met 4 µ L van het monster.
   Opmerking: De 5 ' linker moet worden opgesteld volgens de aanvullende tabel 2, aanvullende tabel 3, aanvullende tabel 4, en aanvullende tabel 5. Verdun de 10 µ M 5 ' linker naar een 2,5 µ M concentratie met behulp van 100 mM NaCl voorafgaand aan het gebruik.
5. Voeg 16 µ L van de afbinding premix (Zie de lijst van materialen) aan de gemengde 5 ' linker en het monster en meng goed door het pipetteren. Incubeer bij 16 °C voor 16 uur.
6. Zuiver de afbinding mix met behulp van SPRI magnetische kralen. Voeg 43,2 µ L van SPRI kralen en volg de stappen 2.6.1-2.6.6. Elueer zoals beschreven gebruikend 42 µ L van water voorverwarmd bij 37 °C.
7. Herhaal de reiniging gedaan in stap 9,6 door toevoeging van 72 µ L van SPRI kralen aan de overgedragen bovendrijvende (1,8:1 kralen naar sample ratio).
   Opmerking: 5 ' linkers bevatten barcodes die het mogelijk maken om maximaal acht monsters te bundelen voorafgaand aan de sequencing (acht trinucleotide barcodes zijn beschikbaar, zoals beschreven in de periode van de lijst van de in-en uitslagen.¹¹ en aanvullende tabel 1).

10. Afbinding van 3 ' linker

1. Concentreer het gezuiverde monster tot 4 µ L met behulp van de vacuüm concentrator zoals beschreven in stap 9,1.
2. Incubeer de geconcentreerde steekproef bij 95 °C voor 5 min en onmiddellijk plaats op ijs voor 2 min om renaturatie te voorkomen. Houd de deksels terwijl de overdracht van de buizen als de deksels kan pop uit als gevolg van de druk op te bouwen.
3. Incubatie 4 µ L van de 2,5 µ M 3 ' linker bij 65 °C voor 5 min en onmiddellijk plaats op ijs voor 2 min om renaturatie te voorkomen.
4. Voeg 4 µ L van de 2,5 µ M 3 ' linker toe aan de 4 µ L van het geconcentreerde monster.
5. Voeg 16 µ L van de afbinding premix toe en meng goed door te pipetteren. Incubeer bij 16 °C voor 16 uur.
6. Zuiver de afbinding mix met behulp van SPRI magnetische kralen. Voeg 43,2 µ L van SPRI kralen en volg de stappen 2.6.1-2.6.6. Elueer zoals beschreven gebruikend 42 µ L van water voorverwarmd aan 37 °C.
   Opmerking: De 3 ' linker moet worden opgesteld volgens de aanvullende tabellen 6 en aanvullende tabel 7. Verdun de 10 µ M 3 ' linker naar een 2,5 µ M concentratie met 100 mM NaCl.

11. Dephosphorylation

1. Bereid de SAP mix door het combineren van 4 µ L water, 5 µ L van 10x SAP buffer, en 1 µ L van SAP-enzym.
2. Voeg 10 µ L van SAP mix toe aan het gezuiverde afgebonden monster (totaal volume 50 µ L) en broed in de Thermocycler met behulp van het volgende programma: 37 °C voor 30 min, 65 °C voor 15 min, en houd bij 4 °C.

12. degradatie van 3 ' linker bovenste strand met behulp van uracil specifieke besnijdenis enzym

1. Voeg 2 µ L van uracil specifiek besnijdend enzym (Zie de lijst van materialen) aan het gedefosforyleerd monster toe, Meng door het pipetteren en incubeer in de Thermocycler gebruikend het volgende programma: 37 °c voor 30 min, 95 °c voor 5 min, en onmiddellijk plaats op ijs 2 min aan Voorkom regloeien van de gefragmenteerde bovenste streng.
2. Zuiver de reactiemengsel door toevoeging van 93,6 µ L van SPRI magnetische kralen aan de 52 µ l mengsel en meng goed door pipetten. Herhaal de zuiveringsstappen 2.6.1 – 2.6.6. Elueer met 42 µ L van water voorverwarmd bij 37 °C zoals beschreven.

13. tweede onderdeel synthese

1. Bereid de tweede bundel synthese mix (volumes worden uitgedrukt per monster) door het combineren van 5 µ L van 10x DNA polymerase reactiebuffer, 2 µ L water, 1 µ L van 10 mM dNTPs, 1 µ L van 50 µ M nAnT-iCAGE tweede streng primer (sequentie is in aanvullende tabel 1) en 1 µ l van D NA exonuclease-gebrekkige polymerase (Zie geadviseerde polymerase in lijst van materialen).
2. Voeg 10 µ L van de mix toe aan het gezuiverde monster en meng goed door pipetten (het totale volume is 50 µ L). Incubeer in de thermische fietser met behulp van het volgende programma: 95 °C voor 5 min, 55 °C voor 5 min, 72 °C voor 30 min, en houd bij 4 °C.

14. degradatie van tweede onderdeel synthese primer met behulp van exonuclease I

1. Voeg 1 µ L van exonuclease I toe aan het tweede onderdeel synthese mengsel. Meng goed door het pipetteren en Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min, gevolgd door een holding bij 4 °C.
2. Zuiveren dubbel gestrande DNA door toevoeging van 91,8 µ L van SPRI magnetische kralen tot 51 µ L van de exonuclease I-behandelde monster. Herhaal de zuiveringsstappen beschreven in 2.6.1-2.6.6. en elueer met 42 µ L van water voorverwarmd tot 37 °C zoals beschreven.
3. Concentreer het monster met de vacuüm concentrator tot 15 µ L zoals beschreven in stap 9,1.

15. controle van de kwaliteit en kwantiteit

1. Gebruik 1 µ L van de geconcentreerde monsters en voer een hoge gevoeligheid DNA-chip op een DNA-kwaliteit Analyzer. Verwachte profiel/hoeveelheid wordt weergegeven in Figuur 3.

16. eerste ronde van vervoerder degradatie

1. Bereid de degradatie mix door het combineren van 2 µ L water, 2 µ L van 10x beperking enzym buffer, 1 µ L van I-SceI, en 1 µ L van I-CeuI.
2. Voeg 6 µ L van de afbraak mengsel toe aan 14 µ L van het geconcentreerde monster en meng door het pipetteren. Incubeer bij 37 °C voor 3 uur gevolgd door 20 min deactivering bij 65 °C en houd bij 4 °C.
3. Zuiver de degradatie mix met behulp van SPRI magnetische kralen. Voeg 5 µ L van water toe om het volume van de degradatie mengeling te verhogen en 45 µ L van SPRI parels (1.8:1 parels aan steekproef verhouding) toe te voegen. Herhaal zuivering zoals beschreven in stap 2.6.1 – 2.6.6. en elueer met 42 µ L van water voorverwarmd tot 37 °C.
4. Concentreer de geëlueerd steekproef van 42 µ L tot 20 µ L van het totale volume zoals beschreven in stap 9,1.

17. controle van degradatie niveau en het bepalen van het aantal PCR versterkings cycli

1. Bereid qPCR mix voor het versterken van hele bibliotheken (adapter mix). Combineer 3,8 µ L van water, 5 µ L van qPCR premix (2x), 0,1 µ L van 10 µ M adaptor_f1 primer (5 '-AATGATACGGCGACCACCGA-3 '), en 0,1 µ L van 10 µ M adaptor_r1 primer (5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 ') voor elk monster (Zie de lijst van materialen voor aanbevolen qPCR premix).
2. Combineer 9 µ L van qPCR adapter mix met 1 µ L monster van stap 16,4 en meng goed door pipetten.
3. Bereid qPCR mix voor het versterken van DNA afgeleid van de drager (Carrier mix). Combineer 3,8 µ L van water, 5 µ L van qPCR premix (2x), 0,1 µ l van 10 µ M carrier_f1 primer (5 '-GCGGCAGCGTTCGCTATAAC-3 '), en 0,1 µ L van 10 µ M adaptor_r1 primer voor elk monster
4. Combineer 9 µ L van qPCR Carrier mix met 1 µ L van het monster van stap 16,4 en meng goed door te pipetteren.
5. Reeks qPCR programma: 95 °C voor 3 min (95 °C voor 20 s, 60 °C voor 20 s, 72 °C voor 2 min) herhaalde 40x, gevolgd door instrument-specifieke denaturatie kromme (65 – 95 °C), en greep bij 4 °C.
   Opmerking: Bereid een negatieve controle door het monster te vervangen door water.

18. PCR versterking van de doelbibliotheek

1. Bereid de PCR versterkings mengeling voor door 6 µ L van water, 0,5 µ L van 10 µ M adaptor_f1 inleiding, 0,5 µ L van 10 µ M adaptor_r1 inleiding en 25 µ L van PCR premix (2x) te combineren. Meng door het pipetteren (Zie lijst van materialen voor de geadviseerde PCR premix).
2. Voeg 32 µ L van de PCR mengeling aan 18 µ L van het steekproef van stap 16,4 toe. Meng grondig door te pipetteren.
3. Plaats de PCR versterking: 95 °C voor 3 min, (98 °C voor 20 s, 60 °C voor 15 s, 72 °C voor 2 min) 12-18 cycli, 72 °C voor 2 min en greep bij 4 °C.
   Opmerking: Het nauwkeurige aantal PCR cycli wordt bepaald door qPCR resultaten en beantwoordt aan de CT waarde die met de adapter wordt verkregen de mengeling van de inleiding (het aantal PCR cycli is gelijk aan de CT waarde).
4. Zuiver de versterkte steekproef door toevoeging van 90 µ L van SPRI magnetische kralen tot 50 µ L van het versterkte monster en meng grondig door pipetten. Herhaal de zuiveringsstappen die worden beschreven in stap 2.6.1 – 2.6.6. en elueer het monster met behulp van 42 µ L water zoals beschreven.

19. tweede ronde van vervoerder degradatie

1. Herhaal de stappen 16.1 – 16.3.
2. Zuiver de degradatie mix met behulp van SPRI magnetische kralen. Voeg 10 µ L water toe aan het monster om het volume te verhogen en meng met 30 µ L SPRI kralen (1:1 kralen naar sample ratio). Herhaal zuivering zoals beschreven in stap 2.6.1 – 2.6.6. en elueer met 42 µ L van water voorverwarmd bij 37 °C zoals beschreven.
3. Concentreer de geëlueerd steekproef van 42 µ L tot 30 µ L van totaal volume.

20. bibliotheek grootte selectie

1. Meng 24 µ L van SPRI magnetische kralen met 30 µ L van het monster van stap 19,3. (0.8:1 kralen naar sample ratio). Herhaal de zuiveringsstappen zoals beschreven in stap 2.6.1 – 2.6.6. en elueer de steekproef in 42 µ L van water zoals beschreven.
2. Concentreer het monster tot ongeveer 14 µ L zoals beschreven in stap 9,1.

21. kwaliteitscontrole

1. Beoordeling van de grootte-verdeling
   1. Run 1 µ L van het monster op de hoge gevoeligheid DNA-chip. De verwachte resultaten worden weergegeven in Figuur 4.
      Opmerking: Als fragmenten die korter zijn dan 200 BP zichtbaar zijn (zie voorbeeld in figuur 4a, C), moet de grootte selectie (stappen 20.1 – 20.2) worden herhaald totdat de korte fragmenten worden verwijderd (figuur 4b, D). Gewoonlijk is één extra ronde van grootte selectie genoeg. Als de hoeveelheid korte fragmenten ernstig is (zoals in figuur 4c), moet de kralen-naar-sample ratio worden verlaagd tot 0,6:1.
2. Vervoerder degradatie kwaliteitscontrole
   1. Herhaal de stappen 17.1 – 17.5.
      Opmerking: Afhankelijk van de concentratie van de bibliotheken geschat in de HS DNA-chip run (regio analyse), de monsters moeten worden verdund voorafgaand aan qPCR. Gebruik 0,5 µ L van de steekproef om steekproef verlies te vermijden en 100 te verdunnen-500x in water (Verdun aan 1 – 20 PG/µ L definitieve concentratie). Verwacht verschil tussen de CT-waarden verkregen met adapter en vervoerder mix is 5 – 10.
3. Kwantificering van bibliotheek
   1. Bereid de werkende verdunning van de Lambda DNA-standaard door het mengen van 20 µ L van 100 mg/mL Lambda DNA-standaard met 980 µ L van 1x TE (bereiden door verdunning van 20x TE voorzien in de DNA-kwantificatie Kit). Verdunning van het Lambda-DNA kan worden opgeslagen bij-20 °C.
   2. Bereid de standaard seriële verdunningen van lambda DNA voor door de verdunde Lambda-norm en 1x TE mengen volgens aanvullende tabel 8.
      Opmerking: Voor een hogere nauwkeurigheid, is het raadzaam om 100 µ L van 1x te buffer toe te voegen aan alle buizen en verwijder 1x TE volume zoals vereist per volume van de verdunde Lambda te worden toegevoegd. Gebruik niet meer dan 1 µ L van de bibliotheek; het gebruik van 384 goed platen voor deze meting wordt geadviseerd.

Representative Results

Dit rapport beschrijft het volledige SLIC-CAGE protocol voor het verkrijgen van sequencing-klaar bibliotheken van nanograms van beginnend totaal RNA materiaal (Figuur 1). Om de synthetische de drager mengeling van RNA te verkrijgen, eerst, moeten PCR drager malplaatjes worden voorbereid en gel-gezuiverd om PCR zij producten (Figuur 2a) te elimineren. Elke PCR-sjabloon (tien in totaal) wordt geproduceerd met behulp van een gemeenschappelijke voorwaartse, maar een andere omgekeerde primer (tabel 2), wat leidt tot verschillende lengtes van de PCR-sjabloon om de grootte variabiliteit van synthetische RNA dragers mogelijk te maken. Zodra gezuiverd, PCR worden de malplaatjes gebruikt voor in vitro transcriptie van de drager molecules. Een enkele RNA Carrier product wordt verwacht als de sjablonen zijn gel-gezuiverd (Zie representatieve gel-analyse in Figuur 2b). De voorbereiding van de vervoerder kan worden opgeschaald, afhankelijk van de noodzaak, en wanneer bereid, gemengd en bevroren bij-80 °C voor toekomstig gebruik.

Gebruikend de geadviseerde minimale hoeveelheid steekproef totaal RNA (10 ng) die met 16-18 cycli van PCR versterking wordt gecombineerd, kunnen de hoge ingewikkeldheid SLIC-kooi bibliotheken worden bereikt. Aantal PCR cycli die worden vereist om de definitieve bibliotheek te vergroten hoogst hangt van de hoeveelheid totale gebruikte input RNA af (het verwachte aantal cycli wordt voorgesteld in lijst 4).

Na de eerste ronde van degradatie, in qPCR resultaten (stap 17), het verwachte verschil tussen de CT-waarden verkregen met behulp van adaptor_f1 of carrier_f1 primer is 1-2, met CT-waarden verkregen met adaptor_f1 lager dan bij carrier_f1.

De verdeling van de fragment lengtes in de definitieve bibliotheek is tussen 200-2000 BP met de gemiddelde fragment grootte van 700-900 BP (gebaseerd op de regio analyse met behulp van bioanalyzer software, figuur 4b, D). Kortere fragmenten, zoals voorgesteld in figuur 4a, C, moeten worden verwijderd door extra rondes van grootte-uitsluiting (stappen 20-21). Deze korte fragmenten zijn PCR versterkings artefacten en niet de doelbibliotheek. Merk op dat kortere fragmenten cluster beter op de sequencing flow cellen en kan leiden tot sequencing problemen.

De verwachte hoeveelheid bibliotheekmateriaal verkregen per monster is tussen 5-50 ng. Significant lagere bedragen zijn indicatief voor monster verlies tijdens het protocol. Als de verkregen lage hoeveelheid genoeg is voor sequencing (2-3 ng van de gebundelde bibliotheken nodig is), kunnen de bibliotheken van lagere complexiteit (zie hieronder).

Afhankelijk van de sequencing machine, kan de hoeveelheid van de bibliotheek geladen op de flow cel moet worden geoptimaliseerd. Met behulp van een verlichtings HiSeq 2500, het laden van 8-12 pM SLIC-CAGE bibliotheken geeft gemiddeld 150-200 miljoen keer gelezen, met > 80% van de leest het passeren van de kwaliteit score Q30 als drempel.

De verkregen leest worden vervolgens in kaart gebracht om de referentie genoom [voor 50 BP leest, Bowtie2¹² kan worden gebruikt met standaard parameters die het mogelijk maken nul mismatches per zaad sequentie (22 BP)]. Verwachte mapping efficiency is afhankelijk van de totale RNA input bedrag en worden gepresenteerd in tabel 5. De uniek in kaart gebrachte leest kan dan worden geladen in R grafische en statistische computing omgeving¹³ en verwerkt met behulp van Cager (Bioconductor pakket¹⁴). Het pakket vignet is eenvoudig te volgen en verklaart de workflow en de verwerking van de toegewezen gegevens in detail. Een gemakkelijke visuele controle van de bibliotheek ingewikkeldheid is de distributie van de breedte van de promotor, aangezien de laag-ingewikkeldheid bibliotheken kunstmatig smalle promotors zullen hebben (figuur 5a, SLIC-kooi bibliotheek die uit 1 ng van totaal RNA wordt afgeleid, voor details zie vorige publicatie¹⁰). Echter, zelfs de lage-complexiteit SLIC-CAGE bibliotheken kunnen identificatie van echte CTSSs, met meer precisie dan alternatieve methoden voor low/medium-input TSS mapping (Figuur 5b, C).

Figuur 1: Stappen in het SLIC-Cage protocol. Het monster RNA wordt gemengd met de de drager mengeling van RNA om 5 µ g van het totale materiaal van RNA te bereiken. cDNA wordt gesynthetiseerd door omgekeerde transcriptie en de dop is geoxideerd met behulp van natrium periodate. Oxidatie maakt bevestiging van biotine aan de dop met behulp van biotine Hydrazide. Biotine wordt gehecht aan de mRNA 3 ′ einde, want het is ook geoxideerd met behulp van natrium periodate. Om Biotine van mRNA te elimineren: de hybriden van cDNA met onvolledig samengestelde cDNA en van 3 ′ einden van mRNA, worden de steekproeven behandeld met ASE I. cDNA dat bereikte het eind van 5 ′ van mRNA dan door affiniteit reiniging op streptavidin magnetische parels wordt geselecteerd ( Cap-trapping). Na versie van cDNA, zijn 5 ′-en 3 ′-linker afgebonden. De bibliotheek moleculen die voortkomen uit de drager worden gedegradeerd gebruikend I-SceI en I-CeuI het besturen beperkingsendonucleases en de fragmenten worden verwijderd gebruikend SPRI magnetische parels. De bibliotheek wordt dan PCR versterkt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: representatieve gel-analyse van vervoerder PCR templates en carrier in vitro transcripten. (A) PCR van de drager malplaatjes voorafgaand aan de reiniging van het gel: de eerste put bevat de 1 KBP teller, gevolgd door drager PCR malplaatjes 1, 1-10. (B) vervoerder in vitro transcripten: de eerste goed bevat de 1 KBP marker, gevolgd door vervoerder transcripten 1-10. De transcripten van de drager werden gedenatureerd door voor 5 min bij 95 °C voorafgaand aan lading te verwarmen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: representatieve DNA-kwaliteit (hoge gevoeligheid DNA-chip) trace van SLIC-Cage voorafgaand aan de eerste ronde van de vervoerder degradatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: representatieve DNA-kwaliteit (hoge gevoeligheid DNA-chip) sporen van SLIC-Cage bibliotheken na PCR versterking. (A) SLIC-Cage bibliotheek die extra grootte-selectie voor verwijdering van korte fragmenten vereist. (B) SLIC-Cage bibliotheek na grootte-selectie gebruikend 0.6 x SPRI parels aan steekproef verhouding. (C) SLIC-kooi bibliotheek van lager output bedrag dat grootte-selectie voor verwijdering van kort fragment vereist. (D) SLIC-kooi bibliotheek van lager output bedrag na grootte-selectie gebruikend 0.6:1 SPRI parels aan steekproef verhouding. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Validatie van SLIC-Cage bibliotheken. (A) distributie van tag cluster interquantile breedtes in SLIC-Cage bibliotheken bereid uit 1, 5, of 10 ng van s. CEREVISIAE totaal RNA, en in de nAnT-iCAGE bibliotheek bereid van 5 µ g van s. cerevisiae totaal RNA. Een hoge hoeveelheid smalle markerings clusters in de 1 ng SLIC-kooi bibliotheek wijst op zijn lage ingewikkeldheid. (B) Roc krommen voor CTSS identificatie in S. CEREVISIAE SLIC-Cage bibliotheken. Alle S. cerevisiae NAnT-iCAGE CTSSs werden gebruikt als een echte set. (C) Roc krommen voor CTSS identificatie in S. cerevisiae nanoCAGE bibliotheken. Alle S. cerevisiae NAnT-iCAGE CTSSs werden gebruikt als een echte set. De vergelijking van ROC krommen toont aan dat SLIC-CAGE sterk overtreft nanoCAGE in CTSS identificatie. Gegevens van ArrayExpress E-MTAB-6519 werd gebruikt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Tabel 1: opeenvolging van het synthetische gen van de drager. I-SceI sites zijn vet en cursief in paars, en I-CeuI erkenningen sites zijn groen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Vervoerder	omgekeerde primer 5 '-3 '		PCR de lengte van het product/BP
1	PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT		1034
2	PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC		966
3	PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG		889
4	PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT		821
5	PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC		744
6	PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA		676
7	PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC		599
8	PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC		531
9	PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG		454
10	PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA		386
	* Voorwaarts primer is hetzelfde voor alle Carrier templates. Onderstreept is de volgorde van de promotor. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA

Tabel 2: primers voor Carrier template versterking. Voorwaarts primer is hetzelfde voor alle Carrier templates. Onderstreept is de volgorde van de promotor. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA. Gebruikend verschillende omgekeerde inleidingen, PCR malplaatjes en vandaar drager ASE van verschillende lengte worden geproduceerd.

Vervoerder	Lengte	niet-afgedekte/µ g	afgetopt/µ g
1	1034	3,96	0,45
2	966	8,36	0,95
3	889	4,4	0,5
4	821	6,6	0,75
5	744	4,4	0,5
6	676	3,08	0,35
7	599	4,4	0,5
8	531	3,96	0,45
9	454	2,64	0,3
10	386	2,2	0,25

Tabel 3: RNA Carrier mix. In totaal 49 µ g van de vervoerder mix 0.3-1 KBP: unaftoped = 44 µ g, afgetopt = 5 µ g.

Totaal RNA input/ng	PCR cycli
1 ng	18
2 ng	17
5 ng	16
10 ng	15-16
25 ng	14-15
50 ng	13-15
100 ng	12-14

Tabel 4: Verwacht aantal PCR cycli in afhankelijkheid van steekproef totale input van RNA. Het geschatte aantal cycli is gebaseerd op experimenten die worden uitgevoerd gebruikend Saccharomyces cerevisiae, fruitvliegje melanogaster, en Mus musculus totaal RNA.

Totaal RNA input/ng	% totaal toegewezen	% uniek toegewezen	% Carrier
1 ng	30	20-30	30
2 ng	60	20-50	10
5 ng	60-70	40-60	5-10
10 ng	60-70	40-60	5-10
25 ng	65-80	40-70	0-5
50 ng	65-80	40-70	0-3
100 ng	70-85	40-70	0-2

Tabel 5: verwachte mapping efficiency en afhankelijkheid van Total RNA input bedrag. Geschatte aantallen worden gepresenteerd en gebaseerd op experimenten uitgevoerd met behulp van Saccharomyces cerevisiae en Mus musculus Total RNA.

Discussion

Voor succesvolle SLIC-CAGE bibliotheek voorbereidingen, is het essentieel om lage-bindende uiteinden en buizen te gebruiken om steekproef verlies te verhinderen toe te schrijven aan steekproef adsorptie. In alle stappen met betrekking tot het ophalen van de bovendrijvende, is het raadzaam om het entiresample volume terug te vorderen. Aangezien het protocol meerdere stappen heeft, zal het continue steekproef verlies leiden tot mislukte bibliotheken.

Als CAGE (nAnT-iCAGE) niet routinematig is uitgevoerd, het is best om SLIC-CAGE met verschillende input bedragen (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) van de zelfde totale steekproef van RNA te testen en te vergelijken met de bibliotheken van nAnT-iCAGE die gebruikend 5 µ g van totaal RNA worden voorbereid. Als de bibliotheek nAnT-iCAGE niet succesvol is (minder dan 0.5-1 ng van de bibliotheek van DNA die per steekproef wordt verkregen), is de SLIC-kooi onwaarschijnlijk om te werken, en steekproef verlies moet worden geminimaliseerd.

Een kritieke stap om de bibliotheken van uitstekende kwaliteit te verzekeren verstoken van niet afgetopte gedegradeerd RNA of rRNA is GLB-overlapping die in sectie 7 wordt beschreven. Het is zeer belangrijk dat de streptavidin kralen grondig worden opgehangen in het wassen buffers en dat de wassen buffers worden verwijderd voorafgaand aan de voortzetting van de volgende wassen stap of elutie van cDNA.

Als de resultaten van de qPCR na de eerste ronde van de vervoerder degradatie tonen geen verschil tussen het gebruik van adaptor_f1 en carrier_f1 primers, voortzetting van het protocol is nog steeds aanbevolen. Als na de tweede ronde van de vervoerder degradatie, het verschil in CT-waarden is minder dan vijf, een derde ronde van de vervoerder degradatie wordt aanbevolen. We hebben nooit gevonden een derde ronde van degradatie nodig, en als het zich voordoet, is het raadzaam om de besturen endonuclease voorraden te vervangen.

De extra rondes van PCR versterking kunnen aan het protocol worden toegevoegd als het definitieve bedrag van de verkregen bibliotheek niet genoeg voor het rangschikken is. PCR de versterking kan dan met minimaal aantal versterkings cycli worden geplaatst nodig om genoeg materiaal voor het rangschikken op te leveren, rekening houdend met steekproef verlies dat niet in grootte selectie kan worden vermeden. Reiniging of grootte selectie met behulp van SPRI magnetische kralen moet vervolgens worden uitgevoerd totdat alle kleine (< 200 BP) fragmenten worden verwijderd (indien nodig, gebruik 0.6:1 kralen naar sample ratio), en de bibliotheek moet worden gekwantificeerd met behulp van Picogreen.

Bibliotheken kunnen worden gesequenced in de modus voor eenmalige of gekoppelde einden. Met behulp van gepaarde-einde sequencing, informatie over transcript isovormen kan worden verkregen. Daarnaast, als omgekeerde transcriptie wordt uitgevoerd met behulp van een willekeurige primer (TCT-N₆, n₆ is een willekeurige hexamer), informatie van de gesequenced 3 '-end kan worden gebruikt als unieke MOLECULAIRE Identifiers (Umi) om PCR duplicaten instorten. Aangezien een gematigd aantal PCR versterkings cycli (tot 18) wordt gebruikt, is het gebruik van UMIs eerder gevonden onnodig te zijn.

Aangezien de kern van het Protocol zich op nAnT-iCAGE¹¹baseert, gebruikt SLIC-Cage acht barcodes. Daarom is multiplexing meer dan acht monsters momenteel niet ondersteund. Bovendien zijn zowel SLIC-CAGE als nAnT-iCAGE niet geschikt voor het vangen van ASE korter dan 200 BP, aangezien de protocollen worden ontworpen om linker en PCR artefacten door grootte te verwijderen-uitsluiting met AMPure XP parels.

SNEETJE-kooi is het uitsluitend onbevooroordeeld loeien-invoer-single-nucleotide voornemen werkwijze voor kartering transcriptie initiatie voorsprong terreinen using nanograms van totaal RNA materiaal. Alternatieve methoden vertrouwen op de template switching activiteit van de omgekeerde transcriptase naar barcode afgetopte RNA in plaats van Cap-trapping (bijv., NanoCAGE¹⁵ en NanoPARE¹⁶). Wegens malplaatje het schakelen, vertonen deze methodes opeenvolging-specifieke biases in TSSs opsporing, die tot verhoogde aantallen van valse positieve TSSs en verminderde aantallen van ware TSSs^9,10leidt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-propanol, Bioultra, for molecular biology, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	59304-100ML-F	Used in RNAclean XP purification.
3' linkers			Sequences are described in Murata et al. 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3'linkers is described in the supplementary of this protocol.
5' linkers			Sequences are described in Murata et al. 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5'linkers is described in the supplementary of this protocol.
Agencourt AMPure XP, 60 mL	Beckman Coulter	A63881	Purification of DNA
Agencourt RNAClean XP Kit	Beckman Coulter	A63987	Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.
Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips	Axygen (available through Corning)	PCR-0208-CP-C	Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).
Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps	Axygen (available through Corning)	PCR-02CP-C	Caps for PCR plates.
Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube	Axygen (available through Corning)	MCT-150-L-C	Low-binding 1.5 mL tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.
Axygen 96 well no skirt PCR microplate	Axygen (available through Corning)	PCR-96-C	Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples
Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits	Agilent		To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)
Biotin (Long Arm) Hydrazide	Vector laboratories	SP-1100	Biotinylation/tagging
Cutsmart buffer	NEB		Restriction enzyme buffer
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase	NEB	M0259S	Second strand synthesis
DNA Ligation Kit, Mighty Mix	Takara	6023	Used for 5' and 3'-linker ligation
dNTP mix (10 mM each)	ThermoFisher Scientific	18427013	dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)
Dynabeads M-270 Streptavidin	Invitrogen	65305	Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.
DynaMag-2 Magnet	ThermoFisher Scientific	12321D	Magnetic stand for 1.5 mL tubes - used to prepare Streptavidin beads.
DynaMag-96 Side Skirted Magnet	ThermoFisher Scientific	12027	Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.
Ethanol, BioUltra, for molecular biology, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	51976-500ML-F	Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.
Exonuclease I (E. coli)	NEB	M0293S	Leftover primer degradation
Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS	NEB	B7025S	agarose gel loading dye
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England Biolabs	E2040S	Kit for carrier in vitro transcription
Horizontal electrophoresis apparatus			purification of carrier DNA templates from agarose gels
I-Ceu	NEB	R0699S	Homing endonuclease used for carrier degradation.
I-SceI	NEB	R0694S	Homing endonuclease used for carrier degradation.
KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)	Kapa Biosystems (Supplied by Roche)	KK2601	PCR mix for target library amplification
KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x	Kapa Biosystems (Supplied by Roche)	KK4600	qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles
Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 µL, 1-20 µL, 20-200 µL)	Gilson		Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.
Microplate reader			For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.
nuclease free water	ThermoFisher Scientific	AM9937	Or any nuclease (DNase and RNase) free water
PCR thermal cycler			incubation steps and PCR amplficication
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	F530S	DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	Purification of carrier PCR templates from agarose gels.
qPCR machine			determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent	ThermoFisher Scientific	P11495	Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	NEB	N0551S	DNA ladder
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N0550S	DNA ladder
Ribonuclease H	Takara	2150A	Digestion of RNA after cap-trapping.
RNase ONE Ribonuclease	Promega	M4261	Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free	VWR	AAJ63669-AK	Or any nuclease (DNase and RNase) free solution
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free			Or any nuclease (DNase and RNase) free solution
Sodium periodate	Sigma-Aldrich	311448-100G	Oxidation of vicinal diols
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 μL, Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719390-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1,000 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719463-1000EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719412-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719447-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
SpeedVac Vacuum Concentrator			concentrating samples in various steps to lower volume
SuperScript III Reverse Transcriptase	ThermoFisher Scientific	18080044	Used for reverse transcription (1st CAGE step)
Trehalose/sorbitol solution			Preparation is described in Murata et al. 2014.
Tris-HCl, 1 M aq.soln, pH 8.5			1 M solution, DNase and RNase free
tRNA (20 mg/mL)			tRNA solution. Preparation is described in Murata et al. 2014.
UltraPure Low Melting Point Agarose	ThermoFisher Scientific	16520050	Or any suitable pure low-melt agarose.
USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)	Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)	78390500UN
USER Enzyme	NEB	M5505S	Degradation of 3'linker's upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme
Vaccinia Capping System	NEB	M2080S	Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules
Wash buffer A			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.
Wash buffer B			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.
Wash buffer C			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.