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Genetics

ट्रांसक्रिप्शन प्रारंभ साइट मैपिंग सुपर-कम इनपुट कैरियर-CAGE का उपयोग कर

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59805
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Institute of Clinical Sciences, Faculty of Medicine, Imperial College London, 2MRC London Institute of Medical Sciences, 3Sars International Centre for Marine Molecular Biology, University of Bergen

Summary

जीन अभिव्यक्ति के कैप विश्लेषण (CAGE) MRNA 5'ends के जीनोम व्यापक मात्रात्मक मानचित्रण के लिए एक विधि है आरएनए polymerase द्वितीय प्रतिलेखन एक एकल न्यूक्लिओटाइड संकल्प पर शुरू साइटों पर कब्जा करने के लिए. यह कार्य एक निम्न-इनपुट (SLIC-CAGE) प्रोटोकॉल का वर्णन करता है उच्च-गुणवत्ता वाले लायब्रेरीज़ के उत्पादन के लिए कुल आरएनए की मात्रा का उपयोग कर।

Abstract

जीन अभिव्यक्ति (CAGE) का कैप विश्लेषण एक विधि आरएनए पॉलिमरेज II प्रतिलेखन प्रारंभ साइटों (TSSs) के एकल न्यूक्लिओटाइड संकल्प का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। TSSs की सटीक पहचान कोर प्रमोटरों की पहचान और खोज को बढ़ाती है। इसके अलावा, सक्रिय enhancers द्विदिश प्रतिलेखन दीक्षा के हस्ताक्षर के माध्यम से पता लगाया जा सकता है. यहाँ वर्णित सुपर कम इनपुट वाहक-CAGE (SLIC-CAGE) प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल है. केज प्रोटोकॉल का यह SLIC अनुकूलन कृत्रिम रूप से एक इन विट्रो लिखित आरएनए वाहक मिश्रण है कि ब्याज के नमूने में जोड़ा जाता है के उपयोग के माध्यम से आरएनए राशि में वृद्धि से आरएनए नुकसान को कम करता है, इस प्रकार कुल नैनोग्राम-मात्रा से पुस्तकालय की तैयारी को सक्षम करने आरएनए (अर्थात, हजारों कोशिकाएं)। वाहक अपेक्षित डीएनए पुस्तकालय टुकड़ा लंबाई वितरण mimics, जिससे पूर्वाग्रह है कि एक समरूप वाहक की बहुतायत के कारण हो सकता है को नष्ट करने. प्रोटोकॉल के अंतिम चरणों में, वाहक homing endonucleases के साथ गिरावट के माध्यम से निकाल दिया जाता है और लक्ष्य लायब्रेरी परिलक्षित होता है। लक्ष्य नमूना पुस्तकालय गिरावट से संरक्षित है, के रूप में homing endonuclease मान्यता साइटों लंबे हैं (18 और 27 बीपी के बीच), यूकैरियोटिक जीनोम में उनके अस्तित्व की संभावना बहुत कम कर रही है. अंतिम परिणाम अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए तैयार एक डीएनए पुस्तकालय है। प्रोटोकॉल में सभी चरणों, अनुक्रमण करने के लिए, 6 दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है. वाहक तैयारी एक पूरा काम दिन की आवश्यकता है; हालांकि, इसे बड़ी मात्रा में तैयार किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए रखा जा सकता है। एक बार अनुक्रम, पढ़ता जीनोम व्यापक एकल न्यूक्लिओटाइड संकल्प TSSs प्राप्त करने के लिए संसाधित किया जा सकता है. TSSs कोर प्रमोटर या बढ़ाने की खोज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जीन विनियमन में अंतर्दृष्टि प्रदान. प्रमोटरों के लिए एकत्रित हो जाने के बाद, डेटा का उपयोग 5'केंद्रित अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के लिए भी किया जा सकता है।

Introduction

जीन अभिव्यक्ति का कैप विश्लेषण (CAGE) एक विधि है जो आरएनए पॉलिमरेज II प्रतिलेखन प्रारंभ स्थलों (TSSs)1के एकल न्यूक्लिओटाइड संकल्प जीनोम-वाइड मैपिंग के लिए प्रयोग किया जाता है। इसकी मात्रात्मक प्रकृति भी 5'अंत केंद्रित अभिव्यक्ति रूपरेखा की अनुमति देता है. टीएसएसएस (लगभग 40 बीपी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम) के आस-पास के क्षेत्र मुख्य प्रवर्तक हैं और भौतिकस्थान का प्रतिनिधित्व करते हैं जहां आरएनए पॉलिमरेज II और सामान्य प्रतिलेखन कारक बांधते हैं (पहले 2,3) की समीक्षा की जाती है। TSSs के सटीक स्थानों पर जानकारी कोर प्रमोटर खोज के लिए और प्रमोटर गतिशीलता की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, के रूप में सक्रिय enhancers द्विदिश प्रतिलेखन के हस्ताक्षर प्रदर्शन, CAGE डेटा भी बढ़ाने की खोज और बढ़ाने गतिशीलता4की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. CAGE पद्धति हाल ही में अपने व्यापक आवेदन और इस तरह के ENCODE5,modenCODE6,और FANTOM परियोजनाओं7के रूप में उच्च प्रोफ़ाइल अनुसंधान परियोजनाओं में उपयोग के कारण लोकप्रियता में वृद्धि हुई है. इसके अलावा, टीएसएस जानकारी भी स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतक भेद करने के लिए महत्वपूर्ण साबित हो रहा है, के रूप में रोग विशेष TSSs नैदानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकताहै 8.

हालांकि TSS मानचित्रण के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं (केज, RAMPAGE, STRT, नैनोCAGE, नैनोCAGE-XL, ओलिगो-कैपिंग), हम और दूसरों को हाल ही में पता चला है कि CAGE झूठी सकारात्मक की कम से कम संख्या के साथ सच TSS पर कब्जा करने के लिए सबसे निष्पक्ष तरीकाहै 9 , 10. हाल ही में CAGE प्रोटोकॉल, NAnT-iCAGE11,TSS प्रोफाइलिंग के लिए सबसे निष्पक्ष प्रोटोकॉल है, क्योंकि यह प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग कर के लिए छोटे टैग करने के लिए टुकड़े काटने से बचा जाता है और पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग नहीं करता है। NANT-iCAGE प्रोटोकॉल की एक सीमा शुरू सामग्री की एक बड़ी राशि के लिए आवश्यकता है (उदाहरण के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए कुल आरएनए के 5 डिग्री)। विशिष्ट, जैविक रूप से प्रासंगिक प्रश्नों का उत्तर देने के लिए, प्रारंभिक सामग्री की इतनी उच्च मात्रा प्राप्त करना अक्सर असंभव होता है (उदाहरण के लिए, FACS-sorted कोशिकाओं या प्रारंभिक भ्रूण चरणों के लिए)। अंत में, अगर NANT-iCAGE सफल होता है, डीएनए पुस्तकालय सामग्री के केवल 1-2 एनजी प्रत्येक नमूने से उपलब्ध है, जिससे प्राप्त अनुक्रमण गहराई सीमित.

कुल आरएनए के केवल नैनोग्राम का उपयोग करके TSS प्रोफाइलिंग को सक्षम करने के लिए, हमने हाल ही में सुपर-कम इनपुट कैरियर-CAGE10 (SLIC-CAGE, चित्र1) विकसित किया है। SLIC-CAGE उच्च जटिलता पुस्तकालयों को प्राप्त करने के लिए कुल आरएनए के केवल 10 एनजी की आवश्यकता है। हमारे प्रोटोकॉल ध्यान से डिजाइन सिंथेटिक आरएनए वाहक ब्याज की आरएनए करने के लिए आरएनए सामग्री की कुल 5 डिग्री ग्राम प्राप्त करने के लिए जोड़ा पर निर्भर करता है. सिंथेटिक वाहक लंबाई वितरण में लक्ष्य डीएनए पुस्तकालय mimics संभावित पूर्वाग्रहों कि अतिरिक्त में समरूप अणुओं के कारण हो सकता है से बचने के लिए. वाहक का अनुक्रम दो कारणों से एस्चेरीचिया कोली ल्यूसिल-tRNA सिंथेटेज जीन (तालिका 1) के अनुक्रम पर आधारित है। सबसे पहले, अंतिम पुस्तकालय में वाहक के किसी भी बचे हुए, भले ही अनुक्रम, एक यूकैरियोटिक जीनोम के लिए नक्शा नहीं होगा. दूसरा, के रूप में ई. कोलाई एक मध्यरागी प्रजाति है, इसके गृह व्यवस्था जीन SLIC-CAGE के लिए उपयुक्त तापमान रेंज के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. वाहक अनुक्रम भी वाहक आरएनए अणुओं से व्युत्पन्न डीएनए के विशिष्ट गिरावट की अनुमति देने के लिए समापन endonuclease मान्यता साइटों के साथ एम्बेडेड है. लक्ष्य, नमूना व्युत्पन्न पुस्तकालय बरकरार रहता है, के रूप में homing endonuclease मान्यता साइटों लंबे हैं (मैं-CeuI - 27 bp; I-SceI - 18 bp) और सांख्यिकीय रूप से यूकैरियोटिक जीनोम में पाए जाने की संभावना नहीं है। वाहक की विशिष्ट गिरावट और आकार बहिष्करण द्वारा टुकड़े को हटाने के बाद, लक्ष्य पुस्तकालय पीसीआर प्रवर्धित और अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए तैयार है। प्रारंभिक आरएनए राशि (1-100 एनजी) के आधार पर, 13-18 पीसीआर प्रवर्धन चक्र के बीच की आवश्यकता होने की उम्मीद है। प्रत्येक नमूना प्रति डीएनए की अंतिम राशि 5-50 एनजी के बीच होती है, जो बहुत गहरी अनुक्रमण के लिए पर्याप्त सामग्री देती है। कुल आरएनए के केवल 1-2 एनजी का उपयोग करते समय, सही TSSका पता लगाया जा सकता है; हालांकि, पुस्तकालयों कम जटिलता के होने की उम्मीद कर रहे हैं. अंत में, के रूप में SLIC-CAGE nANT-iCAGE प्रोटोकॉल11पर आधारित है, यह अनुक्रमण से पहले अप करने के लिए आठ नमूनों के मल्टीप्लेक्सिंग सक्षम बनाता है।

Protocol

1. कैरियर की तैयारी

  1. इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए डीएनए टेम्पलेट्स की तैयारी
    1. प्रत्येक पीसीआर टेम्पलेट के लिए पीसीआर मिश्रण को 41 डिग्री सेल्सियस पानी के संयोजन से तैयार करें, 5x HF बफर के 20 डिग्री एल, 2.5 एमएम डीएनटीपी के 8 $L, 10 डिग्री एम अद्वितीय फॉरवर्ड प्राइमर के 10 एल (पीसीआरजेडजीएन5-एफ1, टेबल 2; प्राइमर को भंग कर दिया जाता है और पानी में पतला किया जाता है) , 2 एनजी/जेडएल टेम्पलेट प्लाज्मिड के 10 डिग्री एल जिसमें सिंथेटिक वाहक जीन और 1 डिग्री एल फुशन पॉलिमरेज होता है। पाइपिंग द्वारा पीसीआर मिश्रण मिलाएं। सभी 10 टेम्पलेट्स के लिए एक मास्टर मिश्रण एक बार में तैयार किया जा सकता है (11 प्रतिक्रियाओं के लिए तैयारी).
    2. प्रत्येक 10 डिग्री रिवर्स प्राइमर के 10 डिग्री एल के लिए पीसीआर मिश्रण के 90 $L जोड़ें (PCR$N6]r1-r10, तालिका 2)। पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
    3. पीसीआर निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके टेम्पलेटबढ़ाना: 60 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, (98 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 s, 30 s के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 30 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस) 35 चक्र, 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    4. पीसीआर-एम्पलीकृत डीएनए टेम्पलेट्स का जेल शोधन
      1. एक 1% agarose जेल तैयार (कम पिघल agarose की सिफारिश की है).
      2. मात्रा को कम करने के लिए, पीसीआर अभिक्रिया मिश्रण को कम-मध्यम ताप (30-40 डिग्री सेल्सियस) पर निर्वात संकेन्द्रक का उपयोग करके 100 र्ल से 20 डिग्री सेल्सियस तक कुल आयतन पर ध्यान केंद्रित करें।
      3. 6x लोडिंग डाई के 6 डिग्री एल जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण, और जेल पर लोड. प्रयुक्त विद्युतफोरोसिस टैंक (5-10 टधधक) के लिए उपयुक्त वोल्टता पर 1x TAE बफर में 30 मिनट के लिए इलेक्ट्रोफोरोसिस चलाएँ। समानांतर में एक 100 बीपी या 1,000 बीपी डीएनए सीढ़ी चलाते हैं.
      4. एक साफ स्केलपेल का उपयोग करना, लक्ष्य पीसीआर उत्पाद युक्त जेल स्लाइस आबकारी. अतिरिक्त agarose जेल से बचें. एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर पीसीआर उत्पादों को शुद्ध (निर्माता के निर्देशों के अनुसार)।
        नोट: A260/A230 डीएनए के अनुपात agarose जैल से अलग आम तौर पर कम कर रहे हैं (0.1-0.3). अपेक्षित लक्ष्य उत्पाद और पक्ष उत्पाद चित्र 2Aमें दिखाए गए हैं। 100 डिग्री सेल्सियस पीसीआर अभिक्रियाओं से अपेक्षित पैदावार 1ण्2-3 ग्राम है। अधिक उपज प्राप्त करने के लिए अभिक्रियाओं को बढ़ाया जा सकता है।
  2. वाहक अणुओं के इन विट्रो प्रतिलेखन में
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार टी 7 आरएनए पॉलिमरेज का उपयोग करते हुए इन विट्रो में ट्रैंक्रिप वाहक आरएनए। 10-20 डिग्री सेल्सियस अभिक्रियाओं की स्थापना कीजिए (अनुशंसित किट सारणी में है) ।
    2. आरएनए शुद्धि किट का उपयोग करके इन विट्रो लिखित आरएनए को शुद्ध करें। DNase मैं निर्माता के मानक निर्देशों का पालन का उपयोग कर समाधान में डीएनए पाचन सेट, और पानी के 50 डिग्री एल में आरएनए को दूर. एल्यूशन की उपज बढ़ाने के लिए, सेंट्रीफ्यूगेशन से पहले 5 मिनट के लिए कॉलम में पानी छोड़ दें।
      नोट: कॉलम की अधिकतम बाइंडिंग क्षमता से अधिक न होने का ध्यान रखें (सामग्री तालिका में उल्लिखित किट में क्षमता 100 ग्राम तक है)। पीसीआर टेम्पलेट्स से अपेक्षित उपज 1-10 (1 kbp से 200 बीपी लंबाई में) है 25-50 g से 10 $L इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं में. वाहक अणुओं का एक बड़ा स्टॉक प्राप्त करने के लिए प्रतिक्रियाओं को बढ़ाया जा सकता है।
  3. इन विट्रो लिखित वाहक आरएनए अणुओं की कैपिंग
    1. कैपिंग मिश्रण को 10x कैपिंग बफर के 2 डिग्री एल, 1 0 एमएल 10 एमएम GTP, 2 एम एम एसएएम एसएएम (ताजा पतला) का 1 डिग्री एल, और वाहक आरएनए प्रति वैक्सीनिंग एंजाइम का 1 डिग्री एल के संयोजन से कैपिंग मिश्रण तैयार करें।
    2. कुल मात्रा के 15 डिग्री सेल्सियस में प्रत्येक वाहक अणु के 10 डिग्री ग्राम तक मिलाएं और 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए विकृती। द्वितीयक संरचना निर्माण को रोकने के लिए तुरंत बर्फ पर रखें।
    3. विकृत वाहक आरएनए को कैपिंग मिश्रण के 5 डिग्री सेल्सियस के साथ मिलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. आरएनए शुद्धि किट का उपयोग कर छाया हुआ आरएनए अणुओं को शुद्ध करें - निर्माता के क्लीन-अप प्रोटोकॉल का पालन करें। 30 डिग्री सेल्सियस पानी में एल्यूट आरएनए। एल्यूशन की उपज बढ़ाने के लिए, सेंट्रीफ्यूगेशन से पहले 5 मिनट के लिए कॉलम में पानी छोड़ दें।
      नोट: microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एकाग्रता उपाय. अपेक्षित A260/A280 अनुपात है और A260/ ध्यान दें कि कुछ आरएनए नमूनों A260/A230 के लिए 1.3-2 के बीच हो सकता है. अनकप्ड आरएनए का उपयोग करते समय अपेक्षित उपज 9-10 ग्राम छाया हुआ आरएनए है।
  4. सारणी 3में वर्णित राशियों को मिलाकर छाया हुआ और अनकप्ड वाहक का मिश्रण तैयार कीजिये। ट्यूब flicking द्वारा अच्छी तरह से मिक्स और microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एकाग्रता को मापने.
    नोट: यदि वाहक की एक उच्च एकाग्रता रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में फिट करने के लिए आवश्यक है (नीचे देखें), वाहक मिश्रण कम मध्यम तापमान पर वैक्यूम concentrator का उपयोग कर केंद्रित किया जा सकता है (30-35 डिग्री सेल्सियस) वांछित अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने तक. चरण 2-14 Murata एट अल द्वारा रिपोर्ट मानक NAnT-iCAGE प्रोटोकॉल से संशोधित कर रहे हैं11

2. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

  1. आर टी प्राइमर के 1 डिग्री एल (2.5 एमएम टीसीटी-एन6 को पानी में घोलकर, अनुक्रम के लिए अनुपूरक सारणी 1) को देखें, ब्याज की कुल आरएनए की 10 एनजी और वाहक मिश्रण के 4,990 एनजी ( तालिका3) एक कम बाध्यकारी पीसीआर प्लेट में कुल मात्रा के 10 डिग्री एल में। ट्यूब flicking द्वारा मिक्स.
    नोट: यदि नमूना आरएनए रिवर्स प्रतिलेखन के लिए बहुत पतला है (नीचे देखें), यह वाहक की उचित राशि के साथ गठबंधन, वैक्यूम concentrator का उपयोग कर ध्यान केंद्रित करने के लिए 9 $L कुल मात्रा, और जोड़ें 1 $L RT प्राइमर. वाहक अर्ल जोड़ने, कुल में आरएनए के 5 डिग्री ग्राम तक पहुँचने के लिए नमूना हानि से बचाता है.
  2. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर चरण 2.1 से मिश्रण गर्मी, और तुरंत बर्फ पर जगह renaturation को रोकने के लिए.
  3. रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) मिश्रण की तैयारी.
    1. प्रत्येक नमूने के लिए पानी के 6.1 डिग्री एल (RNase- और DNase मुक्त), 5x पहली-स्ट्रेंड बफर के 7.6 $L, 0.1 M DTT के 1.9 $L, 1 $L के 1 $L dNTPs, 7.6 के L trehalose/sorbitol मिश्रण (Murata et al al.11में नुस्खा देखें) और 3.8 प्रतिलिपि देखें 6[सामग्री की तालिका)। ट्यूब flicking द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
  4. आर.एन.ए., वाहक और आरटी प्राइमर (कुल मात्रा 38 डिग्री सेल्सियस) के 10 डिग्री एल के साथ पीसीआर ट्यूब में आरटी मिश्रण के 28 डिग्री एल जोड़ें। पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: यह मिश्रण ट्रेहलोस/sorbitol के कारण अत्यधिक चिपचिपा होता है। प्रत्यक्ष रूप से समरूप होने तक मिलाएं।
  5. निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करएक थर्मल साइकिल में इनक्यूबेट: 30 s के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 60 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  6. CDNA का शुद्धि:RNA संकर SPRI चुंबकीय मोती का उपयोग कर
    1. आरटी मिश्रण के 38 डिग्री सेल्सियस (नमूने अनुपात 1.8:1) के लिए अनुशंसित RNAse- और DNase मुक्त SPRI मोती के 68.4 $L जोड़ें( सामग्री की तालिकादेखें)। कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए पाइपिंग और इनक्यूबेट द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर मोती अलग. supernatant त्यागें और 70% इथेनॉल के 200 $ L के साथ दो बार मोती धोने (ताजा तैयार).
      नोट: इथेनॉल मिश्रण के बिना मोती के लिए जोड़ा जाता है और जब ट्यूब चुंबकीय स्टैंड पर है। जोड़ा इथेनॉल तुरंत हटा दिया जाता है. यह नमूना नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में washes के दौरान किसी भी मोती खोने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए देखभाल.
    3. जबकि ट्यूब चुंबकीय स्टैंड पर अभी भी है, इथेनॉल के सभी निशान हटा दें. इथेनॉल की बूंदों को हटाया जा सकता है और एक P10 पिपेट का उपयोग कर ट्यूब से बाहर धकेल दिया. मनकों को सूखने न दें।
    4. मोती के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गरम पानी के 42 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और ऊपर और नीचे 60x पाइपिंग द्वारा नमूना elute।
      नोट: सावधान रहें कि पाइपिंग द्वारा फोमिंग न करें क्योंकि इससे फोम में मोतियों (यानी, बाध्य नमूना) की हानि हो सकती है।
    5. इथेनॉल की मात्रा का पता लगाने के वाष्पीकरण की अनुमति देने के लिए ढक्कन के बिना 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    6. 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर मोती अलग और एक नई थाली के लिए supernatant हस्तांतरण.
      नोट: मनका कैरीओवर से परहेज करते हुए नमूना हानि को रोकने के लिए सभी supernatant पुनः प्राप्त करने की कोशिश करो. पिछले नमूना बूंदों को पाने के लिए P10 pipette का प्रयोग करें.

3. ऑक्सीकरण

  1. शुद्ध आरटी प्रतिक्रिया में 1 एम NaOAc (पीएच 4.5) के 2 $L जोड़ें। पाइपिंग द्वारा मिक्स, 250 mM NaIO4 के 2 $L जोड़ें और फिर से मिश्रण.
  2. 45 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट. प्रकाश से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट को कवर करें।
  3. पीएच को बेअसर करने के लिए ऑक्सीकरण मिश्रण में ट्रास-एचसीएल (पीएच 8-5) का 16 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  4. शुद्ध ऑक्सीकरण cDNA: आरएनए संकर SPRI चुंबकीय मोती का उपयोग कर. एसपीआरआई मोती के 108 डिग्री सेल्सियस ऑक्सीकरण मिश्रण (1.8:1 मोती नमूना अनुपात) के 60 डिग्री सेल्सियस में जोड़ें। शुद्धि को दोहराएँ जैसा कि चरण 2.6.1-2.6.6 में वर्णित है। 42 डिग्री सेल्सियस पानी का उपयोग कर37 डिग्री सेल्सियस पहले से गरम किया गया।
    नोट: ताजा करें 250 m NaIO4 जोड़कर 18.7 डिग्री सेल्सियस पानी प्रति 1 मिलीग्राम NaIO4. NaIO4 प्रकाश के प्रति संवेदनशील है; इसलिए, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ या एक प्रकाश प्रतिरोधी ट्यूब में कवर एक ट्यूब में समाधान रखने के लिए।

4. बायोटिनिलेशन

  1. शुद्ध ऑक्सीकरण नमूना युक्त ट्यूब में 1 एम NaOAc (पीएच 6.0) के 4 डिग्री एल जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिश्रण।
  2. प्रकाश से बचने के लिए एक थर्मल साइकिलर में 23 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए पाइपटिंग और इनक्यूबेट द्वारा 10 एमएम बायोटिन समाधान के 4 डिग्री एल जोड़ें।
    नोट: बायोटिन घोल को 13.5 एमएल के साथ 50 मिलीग्राम बायोटिन मिलाकर तैयार करें। एकल उपयोग alicots बनाओ और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।
  3. SPRI चुंबकीय मोती का उपयोग कर biotinylated CDNA: RNA संकर शुद्ध करें। 2-प्रोपेनोल के 12 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिश्रण करें। SPRI मोती के 108 $L जोड़ें (1.8:1 मोती नमूना अनुपात करने के लिए) और चरण 2.6.1-2.6.6 में वर्णित के रूप में शुद्धि दोहराएँ. 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गरम पानी के 42 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करElute।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है, और नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए.

5. RNase मैं पाचन

  1. RNase मैं प्रत्येक नमूने के प्रति RNase मैं (10 यू/ पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
  2. प्रत्येक शुद्ध नमूना (कुल में 45 डिग्री सेल्सियस) के लिए मिश्रण के 5 डिग्री एल जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पाइपिंग और इनक्यूबेट द्वारा मिक्स करें।

6. स्ट्रेप्टाविडिन बीड्स की तैयारी

  1. प्रत्येक नमूने के लिए, स्ट्रेप्टाविडिन मोती घोल के 30 डिग्री एल को 20 मिलीग्राम/एमएल टीआरएनए के 0.38 डिग्री एल के साथ मिलाएं। 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट और ट्यूब flicking द्वारा हर 5 मिनट मिश्रण.
    नोट: बोतल को फ़्लिक करके पाइपिंग से पहले स्ट्रेप्टाविडिन मोती घोल को अच्छी तरह से पुन: स्लनिलंबित करें। TRNA समाधान Murata एट अल11 के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए
  2. चुंबकीय स्टैंड पर 2-3 मिनट के लिए मोतियों को अलग करें। अति-नाटेकर निकालें।
  3. बफर ए के 15 डिग्री एल में resssssuspended द्वारा मोती धो 2-3 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर मोती अलग और supernatant हटा दें. धोने को दोहराएँ और supernatant हटा दें.
  4. बफ़र ए के 105 डिग्री एल में मोती को पुन: निलंबित करें और टीआरए नए के 20 मिलीग्राम/एमएल के 0ण्19 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: मोती का उपयोग करने से पहले ताजा तैयार किया जाना चाहिए. RNase मैं पाचन के दौरान मोती की तैयारी शुरू करो. कई नमूनों के लिए एक एकल ट्यूब में एक साथ मोती तैयार करते हैं।

7. कैप-ट्रैपिंग

  1. नमूना जिल्द
    1. तैयार streptavidin मोती के 105 $L RNase मैं इलाज नमूना के 45 डिग्री एल करने के लिए जोड़ें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पाइपिंग और इनक्यूबेट द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। हर 10 मिनट में पाइपिंग द्वारा मिक्स करें।
    2. चुंबकीय स्टैंड पर 2-3 मिनट के लिए मोतियों को अलग करें। अति-नाटेकर निकालें।
  2. कपड़े धोने मोती
    1. धोने बफर ए के 150 डिग्री एल जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मोती को फिर से निलंबित करें। 2-3 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर मोती अलग करें और सुपरनेंट को हटा दें।
    2. धोने बफर बी के 150 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मोती को फिर से निलंबित करें। 2-3 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर मोती अलग करें और सुपरनेंट को हटा दें।
    3. धोने बफर सी के 150 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मोती को फिर से निलंबित करें। 2-3 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर मोती अलग करें और सुपरनेंट को हटा दें।
      नोट: बफर्स बी और सी को 37 डिग्री सेल्सियस तक पहले से गरम किया जाना चाहिए। धोने बफ़र्स ए, बी, और सी के लिए व्यंजनों के रूप में Murata एट अल में वर्णित हैं11
  3. सी डी ए ए रिलीज
    1. 1x RNase मैं बफर 10x RNase मैं बफर के 6.5 डिग्री एल के साथ पानी की 58.5 डिग्री सेल्सियस मिश्रण द्वारा 1x RNase मैं बफर तैयार करें।
    2. 1x RNase मैं बफर के 35 डिग्री एल में मोती को पुन: निलंबित करें। 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और सीडीएएनए के पुन: सहयोग को रोकने के लिए 2 मिनट के लिए बर्फ पर सीधे स्थानांतरण। बर्फ के लिए स्थानांतरण के दौरान lids पकड़ो के रूप में वे दबाव का निर्माण के कारण पॉप बंद हो सकता है.
    3. एक चुंबकीय स्टैंड पर 2-3 मिनट के लिए मोती अलग और एक नई प्लेट के लिए supernatant हस्तांतरण.
    4. 1x RNase मैं बफर के 30 $L में मोती को पुन: निलंबित करें। 2-3 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर मोती अलग करें और सुपरनेंट को पहले एकत्र किए गए सुपरनेटेंट को स्थानांतरित करें (एल्यूटेड cDNA की कुल मात्रा लगभग 65 डिग्री सेल्सियस होनी चाहिए)।

8. RNA द्वारा हटाने RNase एच और RNase मैं पाचन

  1. प्रति नमूना, गठबंधन 2.4 पानी की एल, 10x RNase मैं बफर के 0.5 डिग्री एल, RNase एच के 0.1 $L, और RNase I के 2 $L.
  2. जारी CDNA नमूने के 65 डिग्री एल करने के लिए मिश्रण के 5 डिग्री एल जोड़ें और pipeting द्वारा मिश्रण. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  3. SPRI चुंबकीय मोती का उपयोग कर RNase पाचन मिश्रण से CDNA शुद्ध. SPRI मोती के 126 डिग्री एल गिरावट प्रतिक्रिया के 70 डिग्री एल करने के लिए जोड़ें और पाइपटिंग द्वारा मिश्रण। 2.6.1-2.6.6 में SPRI मोती शुद्धि के लिए वर्णित के रूप में शुद्धि चरणों का पालन करें. एल्यूट में वर्णित 37 डिग्री सेल्सियस पर 42 डिग्री सेल्सियस जल का उपयोग किया गया है।
  4. तैयारी RNase मैं 10x RNase मैं बफर और RNase I के 0.5 $L के 4.5 डिग्री एल के संयोजन के द्वारा मिश्रण.
  5. शुद्ध cDNA नमूने के 40 डिग्री एल करने के लिए RNase मिश्रण के 5 डिग्री एल जोड़ें. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पाइपिंग और इनक्यूबेट द्वारा मिक्स करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रुको।
  6. SPRI चुंबकीय मोती का उपयोग कर नमूना शुद्ध. SPRI मोती के 81 डिग्री एल गिरावट प्रतिक्रिया के 45 डिग्री एल करने के लिए जोड़ें और पाइपटिंग द्वारा मिश्रण। 2.6.1-2.6.6 में SPRI मोती शुद्धि के लिए वर्णित के रूप में शुद्धि चरणों का पालन करें. एल्यूट में 42 डिग्री सेल्सियस जल का उपयोग किया गया है जैसा कि वर्णित है।

9. 5' लिंकर का लिगेशन

  1. निर्वात संकेन्द्रक का उपयोग करके शुद्ध cDNA नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस तक केंद्रित करें। तापमान को 30-35 डिग्री सेल्सियस पर रखें। एक पिपेट का उपयोग कर मात्रा का परीक्षण करें। यदि नमूना पूर्णता के लिए सूख गया है, पानी के 4 डिग्री एल जोड़कर भंग.
    नोट: यह नमूना हानि को रोकने के लिए पूर्णता के लिए सुखाने से बचने के लिए बेहतर है।
  2. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित नमूना इनक्यूबेट करें और तुरंत 2 मिनट के लिए बर्फ पर जगह renaturation को रोकने के लिए। ट्यूबों को स्थानांतरित करते समय ढक्कनों को होल्ड करें क्योंकि दबाव निर्माण के कारण ढक्कन पॉप-ऑफ हो सकते हैं।
  3. 5 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 डिग्री एम 5' लिंकर के 4 डिग्री एल इनक्यूबेट और तुरंत 2 मिनट के लिए बर्फ पर जगह renaturation को रोकने के लिए।
  4. नमूने के 4 डिग्री एल के साथ 2.5 डिग्री एम 5' linker के 4 डिग्री एल मिक्स करें।
    नोट: 5' लिंकर को अनुपूरक तालिका2, अनुपूरक तालिका 3, अनुपूरक तालिका4 और अनुपूरक तालिका 5के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए। उपयोग करने से पहले 100 एमएम NaCl का उपयोग कर के लिए एक 2.5 डिग्री एम एकाग्रता के लिए 10 डिग्री एम 5' लिंकर को पतला करें।
  5. मिश्रित 5' linker और नमूना करने के लिए लिगेशन premix के 16 डिग्री एल जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) और नमूना pipeting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण. 16 एच के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  6. SPRI चुंबकीय मोती का उपयोग कर लिगेशन मिश्रण को शुद्ध करें। SPRI मोती के 43.2 $L जोड़ें और चरणों का पालन करें 2.1.1.2.6.6. एल्यूट जैसा कि 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गरम किए गए 42 डिग्री सेल्सियस जल का उपयोग करके वर्णित किया गया है।
  7. स्थानांतरित supernatant (1.8:1 मोती नमूना अनुपात करने के लिए) के लिए SPRI मोती के 72 डिग्री एल जोड़कर चरण 9.6 में किया शुद्धि दोहराएँ।
    नोट: 5' linkers बारकोड जो अनुक्रमण से पहले आठ नमूनों की पूलिंग की अनुमति देता है होते हैं (आठ trinucleotide बारकोड उपलब्ध हैं, के रूप में Murata एट अल11 और अनुपूरक तालिका 1में वर्णित).

10. 3' लिंकर का लिगेशन

  1. शुद्ध नमूने को शून्य संकेन्द्रक का उपयोग करते हुए 4 डिग्री सेल्सियस पर ध्यान केंद्रित कीजिए जैसा कि चरण 9-1 में वर्णित है।
  2. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित नमूना इनक्यूबेट करें और तुरंत 2 मिनट के लिए बर्फ पर जगह renaturation को रोकने के लिए। ट्यूबों को स्थानांतरित करते समय ढक्कनों को होल्ड करें क्योंकि दबाव निर्माण के कारण ढक्कन बंद हो सकते हैं।
  3. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 डिग्री एम 3' लिंकर के 4 डिग्री एल इनक्यूबेट और तुरंत 2 मिनट के लिए बर्फ पर जगह renaturation को रोकने के लिए।
  4. केंद्रित नमूने के 4 डिग्री एल के लिए 2.5 $M 3' linker के 4 डिग्री एल जोड़ें.
  5. लिगिंग प्रीमिक्स के 16 डिग्री एल जोड़ें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। 16 एच के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  6. SPRI चुंबकीय मोती का उपयोग कर लिगेशन मिश्रण को शुद्ध करें। SPRI मोती के 43.2 $L जोड़ें और चरणों का पालन करें 2.1.1.2.6.6. एल्यूट जैसा कि 42 डिग्री सेल्सियस पानी का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस तक पहले से गरम किया गया है।
    नोट: 3' लिंकर अनुपूरक तालिकाओं 6 और पूरक तालिका 7के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए। 100 एमएम NaCl का उपयोग कर एक 2.5 डिग्री मीटर एकाग्रता के लिए 10 डिग्री एम 3' लिंकर को पतला करें।

11. डिफॉस्फोरिलेशन

  1. एसएपी मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस जल, 10x एसएपी बफर के 5 डिग्री एल, और एसएपी एंजाइम के 1 डिग्री एल के संयोजन से तैयार करें।
  2. निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग करते हुए थर्मोसाइकिलर में SAP मिश्रण के 10 $L जोड़ें (कुल मात्रा 50 डिग्री सेल्सियस) और इनक्यूबेट करें: 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।

12. 3' लिंकर ऊपरी स्ट्रैंड की गिरावट Uracil विशिष्ट चीरा एंजाइम का उपयोग

  1. यूरेसिल विशिष्ट वियोग एंजाइम के 2 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) dephosphorylated नमूना करने के लिए, निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग कर thermocycler में pipeting और इनक्यूबेट द्वारा मिश्रण: 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, और तुरंत 2 मिनट के लिए बर्फ पर जगह खंडित ऊपरी किनारा के reannealing को रोकने के.
  2. SPRI चुंबकीय मोती के 93.6 डिग्री सेल्सियस को 52 डिग्री सेल्सियस मिश्रण में जोड़कर अभिक्रिया मिश्रण को शुद्ध करें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिला लें। शुद्धि चरण दोहराएँ 2.6.1.1.2.6.6. जैसा कि वर्णित 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गरम किया गया 42 डिग्री सेल्सियस पानी के साथ एल्यूट।

13. दूसरा स्ट्रैंड संश्लेषण

  1. दूसरा किनारा संश्लेषण मिश्रण तैयार करें (मात्रा प्रति प्रति नमूना व्यक्त कर रहे हैं) 10x डीएनए पॉलिमरेज प्रतिक्रिया बफर के 5 डिग्री एल के संयोजन के द्वारा, 2 $L पानी की, 1 $L 10 m dNTPs के, 1 $L के 5 0 डिग्री एम NNT-iCAGE दूसरा किनारा प्राइमर (क्रम अनुपूरक तालिका मेंहै 1 ) और डी के 1 डिग्री एल एनए एक्सोनक्लेस-न्यूकमेज़ (सामग्री की तालिकामें अनुशंसित पॉलिमरेज देखें)।
  2. शुद्ध नमूना करने के लिए मिश्रण के 10 डिग्री एल जोड़ें और pipeting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण (कुल मात्रा 50 डिग्री सेल्सियस है). निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग कर थर्मल साइकिल में इनक्यूबेट: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।

14. Exonuclease I का उपयोग करके दूसरा स्ट्रैंड संश्लेषण प्राइमर की गिरावट

  1. दूसरी किनारा संश्लेषण मिश्रण करने के लिए Exonuclease मैं के 1 $L जोड़ें. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पाइपिंग और इनक्यूबेट द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़े हुए हैं।
  2. SPRI चुंबकीय मोती के 91.8 डिग्री एल को जोड़कर डबल फंसे डीएनए को शुद्ध करें एक्सोनकुलेज आई-उपचारित नमूने के 51 डिग्री सेल्सियस में। 2.6.1.1-2.6.6 में वर्णित शुद्धिकरण चरणों को दोहराएँ. और वर्णित के अनुसार 42 डिग्री सेल्सियस जल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम किया जाता है।
  3. शून्य संकेंद्रक का उपयोग करके नमूने को 15 डिग्री सेल्सियस तक केंद्रित करें जैसा कि चरण 9-1 में वर्णित है।

15. गुणवत्ता और मात्रा नियंत्रण

  1. केंद्रित नमूनों में से 1 जेडएल का उपयोग करें और एक डीएनए गुणवत्ता विश्लेषक पर एक उच्च संवेदनशीलता डीएनए चिप चलाते हैं। अपेक्षित प्रोफ़ाइल/मात्रा चित्र 3में प्रस्तुत की गई है।

16. कैरियर गिरावट के पहले दौर

  1. पानी के 2 डिग्री सेल्सियस, 10x प्रतिबंध एंजाइम बफर के 2 डिग्री एल, मैं-SceI के 1 डिग्री एल, और मैं-CeuI के 1 डिग्री एल के संयोजन के द्वारा गिरावट मिश्रण तैयार करें।
  2. अवक्रमण मिश्रण के 6 डिग्री सेल्सियस को संकेंद्रित नमूने के 14 डिग्री सेल्सियस में जोड़ें और पाइपटिंग द्वारा मिश्रण करें। 3 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और उसके बाद 20 मिनट निष्क्रियकरण 65 डिग्री सेल्सियस पर और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  3. SPRI चुंबकीय मोती का उपयोग कर गिरावट मिश्रण को शुद्ध करें। निम्नीकरण मिश्रण की मात्रा बढ़ाने के लिए 5 डिग्री सेल्सियस जल जोड़ें और SPRI मोती के 45 डिग्री सेल्सियस (1.8:1 मोती नमूना अनुपात में) जोड़ें. 2.6.1-2.6.6 चरणों में वर्णित शुद्धि दोहराएँ। और 42 डिग्री सेल्सियस पानी के साथ elute 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम.
  4. चरण 9-1 में वर्णित कुल आयतन के 42 डिग्री सेल्सियल से 20 डिग्री सेल्सियस तक एल्यूटेड नमूने को ध्यान में रखिए।

17. गिरावट स्तर का नियंत्रण और पीसीआर प्रवर्धन चक्र की संख्या का निर्धारण

  1. पूरे पुस्तकालयों (एडेप्टर मिश्रण) बढ़ाना के लिए QPCR मिश्रण तैयार करें। 3.8 डिग्री सेल्सियस पानी का मिश्रण, 5 [L के QPCR premix (2x), 0.1 [L के 10 ]M adapteror]f1 प्राइमर (5'-AATGATACCGACCACCGA-3'), और 0.1 $L के 10M adapter]r1 प्राइमर (5'-CAAGAGACGGCATACGA-3') प्रत्येक नमूने के लिए (पूर्व की सिफारिश की सामग्री की तालिका देखें).।
  2. 9 $L के साथ खंड 16.4 से नमूना के 1 $L के साथ मिश्रण और pipeting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण.
  3. वाहक (वाहक मिश्रण) से व्युत्पन्न डीएनए बढ़ाना के लिए QPCR मिश्रण तैयार करें। पानी के 3.8 डिग्री एल, 5 $L के UPCR premix (2x), 0.1 $l के 10 [M वाहक]f1 प्राइमर (5'-GCGCAGCTTCGCTATAAC-3'), और प्रत्येक नमूने के लिए 10 डिग्री एम एडेप्टर-r1 प्राइमर के 0.1 डिग्री एल
  4. चरण 16.4 से नमूने के 1 $L के साथ QPCR वाहक मिश्रण के 9 $L का मिश्रण और pipeting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण.
  5. सेट क्यूपीसीआर कार्यक्रम: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस (95 डिग्री सेल्सियस 20 s के लिए, 20 s के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस) दोहराया 40x, साधन-विशिष्ट विकृतीकरण वक्र (65-95 डिग्री सेल्सियस) के बाद, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    नोट: पानी के साथ नमूने की जगह एक नकारात्मक नियंत्रण तैयार करें.

18. पीसीआर लक्ष्य पुस्तकालय के प्रवर्धन

  1. पानी के 6 डिग्री एल के संयोजन के द्वारा पीसीआर प्रवर्धन मिश्रण तैयार, 0.5 $L के 10 डिग्री सेल्सियस adapter$f1 प्राइमर, 10 के 0.5 $L ]L]r1 प्राइमर और पीसीआर premix के 25 $L (2x). pipeting द्वारा मिक्स (अनुशंसित पीसीआर premix के लिए सामग्री की तालिका देखें).
  2. पीसीआर मिश्रण के 32 डिग्री सेल्सियस को चरण 16.4 से नमूने के 18 डिग्री सेल्सियस तक जोड़ें। पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. पीसीआर प्रवर्धन सेट करें: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, (98 डिग्री सेल्सियस के लिए 20 s, 15 s के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस) 12-18 चक्र, 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    नोट: PCR चक्र की सटीक संख्या QPCR परिणामों द्वारा निर्धारित किया जाता है और अनुकूलक प्राइमर मिश्रण के साथ प्राप्त Ct मान से संबंधित है (पीसीआर चक्र की संख्या Ct मान के बराबर है).
  4. प्रवर्धित प्रतिदर्श के 50 प्र.ल में स्प्रि चुंबकीय मनकों की 90 डिग्री ल-उर्बी जोड़कर प्रवर्धित प्रतिदर्श को शुद्ध कीजिए तथा पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिला दीजिए। 2.6.1.1-2.6.6 चरणों में वर्णित शुद्धिकरण चरणों को दोहराएँ। और वर्णित जल के 42 डिग्री एल का उपयोग करके नमूने को पूर्ण करें।

19. कैरियर गिरावट का दूसरा दौर

  1. 16.1-16.3 चरणों को दोहराएँ.
  2. SPRI चुंबकीय मोती का उपयोग कर गिरावट मिश्रण को शुद्ध करें। मात्रा बढ़ाने के लिए नमूना करने के लिए पानी की 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और SPRI मोती के 30 डिग्री एल के साथ मिश्रण (1:1 मोती नमूना अनुपात के लिए). 2.6.1-2.6.6 चरणों में वर्णित शुद्धि दोहराएँ। और वर्णित 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गरम किए गए 42 डिग्री सेल्सियस जल के साथ पूर्ण।
  3. कुल मात्रा के 42 डिग्री सेल्सियस से 30 डिग्री सेल्सियस तक एल्यूटेड नमूने को ध्यान में रखें।

20. पुस्तकालय का आकार चयन

  1. SPRI चुंबकीय मोती के 24 डिग्री एल मिश्रण कदम से नमूना के 30 डिग्री एल के साथ 19.3. (0.8:1 मोती नमूना अनुपात करने के लिए). 2.6.1-2.6.6 चरणों में वर्णित के रूप में शुद्धि चरणों को दोहराएँ. और वर्णित जल के 42 डिग्री एल में नमूने को पूर्ण करें।
  2. चरण 9.1 में वर्णित लगभग 14 $L के लिए नमूना ध्यान केंद्रित करें।

21. गुणवत्ता नियंत्रण

  1. आकार-वितरण का आकलन
    1. उच्च संवेदनशीलता डीएनए चिप पर नमूने के 1 डिग्री एल चलाएँ. अपेक्षित परिणाम चित्र 4में प्रस्तुत किए गए हैं।
      नोट: यदि 200 बीपी से छोटे टुकड़े दिखाई दे रहे हैं (चित्र 4A, Cमें उदाहरण देखें ), आकार चयन (चरण 20.1-20.2) छोटे टुकड़े निकाल दिए जाते हैं जब तक दोहराया जाना चाहिए ( चित्र4B, D)। आमतौर पर आकार चयन का एक अतिरिक्त दौर पर्याप्त है. छोटे टुकड़े की मात्रा गंभीर है , तो (चित्र 4Cमें के रूप में), मोती-से-नमूना अनुपात 0.6:1 करने के लिए कम किया जाना चाहिए।
  2. कैरियर गिरावट गुणवत्ता नियंत्रण
    1. 17.1-17.5 चरणों को दोहराएँ.
      नोट: एचएस डीएनए चिप रन (क्षेत्र विश्लेषण) में अनुमानित पुस्तकालयों की एकाग्रता पर निर्भर करता है, नमूने QPCR से पहले पतला होने की जरूरत है. नमूना हानि से बचने के लिए नमूने के 0ण्5ण्ल का उपयोग कीजिए तथा जल में 100-500x को पतला किया जा सकता है (1-20 प्रग/एल अंतिम सांद्रता को कम करना)। अनुकूलक और वाहक मिश्रण के साथ प्राप्त Ct मूल्यों के बीच अपेक्षित अंतर 5-10 है.
  3. पुस्तकालय परिमाणीकरण
    1. 1x TE के 980 डिग्री एल के साथ 100 मिलीग्राम/एमएल लैम्बडा डीएनए मानक के 20 डिग्री एल मिश्रण द्वारा lambda डीएनए मानक के काम कमजोर पड़ने तैयार (डीएनए परिमाणीकरण किट में प्रदान की 20x TE को कम करके तैयार). लैम्ब्डा डीएनए का फैलाव -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. पूरक सारणी 8के अनुसार पतला लैम्बडा मानक और 1x ते मिलाकर लैंबडा डीएनए मानक धारावाहिक कमजोर करना तैयार करें।
      नोट: उच्च सटीकता के लिए, यह सभी ट्यूबों के लिए 1x TE बफर के 100 डिग्री एल जोड़ने के लिए और पतला Lambda की मात्रा के अनुसार आवश्यक के रूप में 1x TE मात्रा को दूर करने के लिए सिफारिश की है जोड़ा जा करने के लिए। पुस्तकालय के 1 डिग्री सेल्सियस से अधिक का उपयोग न करें; इस माप के लिए 384 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग की सिफारिश की है.

Representative Results

यह रिपोर्ट कुल आरएनए सामग्री शुरू करने के नैनोग्राम से अनुक्रमण के लिए तैयार पुस्तकालयों प्राप्त करने के लिए पूर्ण SLIC-CAGE प्रोटोकॉल का वर्णन करता है (चित्र1)। सिंथेटिक आरएनए वाहक मिश्रण प्राप्त करने के लिए, पहले, पीसीआर वाहक टेम्पलेट्स तैयार करने की आवश्यकता है और पीसीआर साइड उत्पादों को खत्म करने के लिए जेल-शुद्ध (चित्र 2A)। प्रत्येक PCR टेम्पलेट (कुल में दस) एक आम आगे का उपयोग करके निर्मित है, लेकिन एक अलग रिवर्स प्राइमर (तालिका2), सिंथेटिक आरएनए वाहक के आकार परिवर्तनशीलता को सक्षम करने के लिए पीसीआर टेम्पलेट के विभिन्न लंबाई के लिए अग्रणी. एक बार शुद्ध, पीसीआर टेम्पलेट्स वाहक अणुओं के इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए उपयोग किया जाता है. एक एकल आरएनए वाहक उत्पाद की उम्मीद है अगर टेम्पलेट्स जेल शुद्ध कर रहे हैं (चित्र 2Bमें प्रतिनिधि जेल विश्लेषण देखें). वाहक की तैयारी की जरूरत के आधार पर upscaled किया जा सकता है, और जब तैयार, मिश्रित और भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए.

पीसीआर प्रवर्धन के 16-18 चक्र के साथ संयुक्त नमूना कुल आरएनए (10 एनजी) की सिफारिश की न्यूनतम राशि का उपयोग करना, उच्च जटिलता SLIC-CAGE पुस्तकालयों प्राप्त किया जा सकता है. अंतिम पुस्तकालय को अत्यधिक बढ़ाना आवश्यक पीसीआर चक्रों की संख्या उपयोग किए गए कुल इनपुट आरएनए की मात्रा पर निर्भर करती है (चक्रों की अपेक्षित संख्या तालिका 4में प्रस्तुत की जाती है )।

अवक्रमण के पहले दौर के बाद, में QPCR परिणाम (चरण 17), Ct मान के बीच अपेक्षित अंतर adaptor-f1 या carrier-f1 प्राइमर का उपयोग कर प्राप्त 1-2 है, Ct मान के साथ प्राप्त के साथ adapteror-f1 से कम carrier$f1.

अंतिम पुस्तकालय में टुकड़ा लंबाई का वितरण 700-900 बीपी के औसत टुकड़ा आकार के साथ 200-2,000 बीपी के बीच है (जैवविश् लेषक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके क्षेत्र विश्लेषण के आधार पर, चित्रा 4B,D)। चित्र 4क,सीमें प्रस्तुत छोटे टुकड़ों को आकार-निष्कर्ष (चरण 20-21) के अतिरिक्त दौरों द्वारा हटाया जाना है। इन छोटे टुकड़े पीसीआर प्रवर्धन कलाकृतियों और नहीं लक्ष्य पुस्तकालय हैं. ध्यान दें कि अनुक्रमण प्रवाह कोशिकाओं पर छोटे टुकड़े बेहतर क्लस्टर और अनुक्रमण समस्याओं का कारण हो सकता है।

प्रति नमूने प्राप्त पुस्तकालय सामग्री की अपेक्षित राशि 5-50 एनजी के बीच है। काफी कम मात्रा प्रोटोकॉल के दौरान नमूना हानि का संकेत कर रहे हैं. यदि प्राप्त कम मात्रा अनुक्रमण के लिए पर्याप्त है (2-3 पूल्ड पुस्तकालयों की एनजी की जरूरत है), पुस्तकालयों कम जटिलता का हो सकता है (नीचे देखें).

अनुक्रमण मशीन के आधार पर, प्रवाह कक्ष पर लोड की गई लायब्रेरी की मात्रा ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता हो सकती है. एक Illumina HiSeQ 2500 का उपयोग करना, लोड हो रहा है 8-12 pM SLIC-CAGE पुस्तकालयों औसत 150-200 मिलियन पढ़ता है पर देता है, के साथ gt; 80% के साथ गुणवत्ता स्कोर गुजर Q30 दहलीज के रूप में.

प्राप्त पढ़ता तो संदर्भ जीनोम करने के लिए मैप कर रहे हैं [के लिए 50 बीपी पढ़ता है, Bowti212 डिफ़ॉल्ट पैरामीटर है कि बीज अनुक्रम (22 bp) प्रति शून्य बेमेल की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है]. अपेक्षित मानचित्रण क्षमता कुल आरएनए इनपुट राशि पर निर्भर करती है और इसे सारणी 5में प्रस्तुत किया जाता है। विशिष्ट मैप किए गए रीड्स को फिर आर ग्राफिकल और सांख्यिकीय कंप्यूटिंग वातावरण13 में लोड किया जा सकता है और कैगर (बायोकंडक्टर पैकेज14)का उपयोग करके संसाधित किया जा सकता है। पैकेज शब्दचित्र का पालन करने के लिए आसान है और विस्तार से मैप किए गए डेटा के कार्यप्रवाह और प्रसंस्करण बताते हैं। पुस्तकालय जटिलता का एक आसान दृश्य नियंत्रण प्रमोटर चौड़ाई का वितरण है, के रूप में कम जटिलता पुस्तकालयों कृत्रिम रूप से संकीर्ण प्रमोटरों होगा (चित्र 5A, SLIC-CAGE पुस्तकालय कुल आरएनए के 1 एनजी से व्युत्पन्न, विवरण के लिए पिछले देखें प्रकाशन10). हालांकि, यहां तक कि कम जटिलता SLIC-CAGE पुस्तकालयों सच CTSSs की पहचान की अनुमति, कमके लिए वैकल्पिक तरीकों की तुलना में अधिक परिशुद्धता के साथ /

Figure 1
चित्र 1: SLIC-CAGE प्रोटोकॉल में चरण। कुल आरएनए सामग्री के 5 डिग्री ग्राम को प्राप्त करने के लिए नमूना आरएनए वाहक मिश्रण के साथ मिलाया जाता है। cDNA रिवर्स प्रतिलेखन के माध्यम से संश्लेषण किया जाता है और टोपी सोडियम periodate का उपयोग कर ऑक्सीकरण है. ऑक्सीकरण बायोटिन हाइड्रैज़ाइड का उपयोग करके कैप में बायोटिन के लगाव की अनुमति देता है। बायोटिन एमआरएनए के 3 के अंत से जुड़ा होता है, क्योंकि यह सोडियम पीरियडेट का उपयोग करके ऑक्सीकृत भी होता है। MRNA से biotin को खत्म करने के लिए: अधूरा संश्लेषित cDNA के साथ और MRNA के 3 "सिरों से cDNA संकर, नमूने RNase I. cDNA कि MRNA के 5 "अंत तक पहुँच के साथ इलाज कर रहे हैं तो streptavidin चुंबकीय मोती पर आत्मीयता शुद्धि द्वारा चुना जाता है ( टोपी-ट्रैपिंग)। cDNA के रिलीज के बाद, 5 [- और 3]-linkers ligated हैं. पुस्तकालय अणुओं है कि वाहक से उत्पन्न I-SceI और मैं-CeuI homing endonucleases और टुकड़े SPRI चुंबकीय मोती का उपयोग कर हटा रहे हैं का उपयोग कर निम्नीकृत कर रहे हैं. पुस्तकालय तो पीसीआर प्रवर्धित है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र2: वाहक पीसीआर टेम्पलेट्स और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्ट्स में वाहक के प्रतिनिधि जेल-विश्लेषण। (ए) कैरियर पीसीआर टेम्पलेट्स जेल शुद्धि से पहले: पहले अच्छी तरह से 1 kbp मार्कर, वाहक पीसीआर टेम्पलेट्स 1, 1-10 द्वारा पीछा किया जाता है. (बी) इन विट्रो ट्रांसक्रिप्ट्स में कैरियर: पहले अच्छी तरह से 1 kbp मार्कर, वाहक प्रतिलिपि 1-10 द्वारा पीछा किया जाता है. लोडिंग से पहले 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्म करके कैरियर ट्रांसक्रिप्ट्स को विकृत किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि डीएनए गुणवत्ता (उच्च संवेदनशीलता डीएनए चिप) वाहक गिरावट के पहले दौर से पहले SLIC-CAGE का पता लगाने. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि डीएनए गुणवत्ता (उच्च संवेदनशीलता डीएनए चिप) पीसीआर प्रवर्धन के बाद SLIC-CAGE पुस्तकालयों के निशान. (क) SLIC-CAGE पुस्तकालय है कि छोटे टुकड़े को हटाने के लिए अतिरिक्त आकार चयन की आवश्यकता है. (बी) SLIC-CAGE पुस्तकालय नमूना अनुपात करने के लिए 0.6x SPRI मोती का उपयोग कर आकार चयन के बाद। (ग) कम उत्पादन राशि का SLIC-CAGE पुस्तकालय जिसके लिए छोटे खंड को हटाने के लिए आकार-चयन की आवश्यकता होती है। (घ) SLIC-CAGE पुस्तकालय कम उत्पादन राशि के आकार चयन के बाद नमूना अनुपात करने के लिए 0.6:1 SPRI मोती का उपयोग कर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: SLIC-CAGE लायब्रेरी का सत्यापन। (क) SLIC-CAGE पुस्तकालयों में टैग क्लस्टर अंतराक्वान्तक चौड़ाई का वितरण 1, 5, या 10 एनजी से एस सेरेविएसिया कुल आरएनए के लिए तैयार किया गया है, और एस सेरेविएसियन कुल आरएनए के 5 ग्राम से तैयार एनएनटी-आईसीएजेड पुस्तकालय में। 1 ng SLIC-CAGE लायब्रेरी में संकीर्ण टैग क्लस्टर की एक उच्च मात्रा इसकी कम जटिलता इंगित करता है। (B) एस सेरेविएस एसएलआईसी-केज पुस्तकालयों में सीटीएसएस पहचान के लिए आरओसी वक्र। सभी एस cerevisiae nAnT-iCAGE CTSSs एक सच्चे सेट के रूप में इस्तेमाल किया गया. (ग ) एस सेरेविसे नैनोकैज पुस्तकालयों में सीटीएसएस पहचान के लिए आरओसी वक्र। सभी एस cerevisiae nAnT-iCAGE CTSSs एक सच्चे सेट के रूप में इस्तेमाल किया गया. ROC घटता की तुलना से पता चलता है कि SLIC-CAGE दृढ़ता से CTSS पहचान में नैनोCAGE outperforms. ArrayExpress E-MTAB-6519 से डेटा का उपयोग किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: वाहक सिंथेटिक जीन का अनुक्रम. मैं-SceI साइटों बोल्ड और बैंगनी रंग में इलैलिककिया कर रहे हैं, और मैं-CeuI मान्यता साइटों हरे हैं. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

वाहक रिवर्स प्राइमर 5'-3' पीसीआर उत्पाद लंबाई /
1 PCR$N6]r1: NNNNNCTACGTCGCAGACGAATT 1034
२ PCR$N6]r2: NNNNGTAGATCGTTGAGCTGC 966
3 PCR$N6]r3: NNNNNCACTGCGGGATCTTATCG 889
4 PCR$N6]r4: NNNNNGCCCGATAACTGTTCGT 821
5 PCR$N6]r5: NNNNNAGTTGACCGCAGAGTTC 744
6 PCR$N6]r6: NNNNNGTGAATTTGTTCCCA 676
7 PCR$N6]r7: NNNNCTCGGCTCCAGTCATAAC 599
8 PCR$N6]r8: NNNNTACGCGATGTGTCGTAC 531
9 PCR$N6]r9: NNNNACCCGCGCCCCGCAGG 454
10 PCR$N6]r10: NNNNCAGGACGTTTTGCCCAGCA 386
* फॉरवर्ड प्राइमर सभी वाहक टेम्पलेट्स के लिए एक ही है। रेखांकित T7 प्रमोटर अनुक्रम है. PCR$GN5]f1: TAATACGACTATATAGNNNCAGCGCTA

तालिका 2: वाहक टेम्पलेट प्रवर्धन के लिए प्राइमर. आगे प्राइमर सभी वाहक टेम्पलेट्स के लिए एक ही है. रेखांकित T7 प्रमोटर अनुक्रम है. PCR$GN5]f1: TAATACGACTACTAGNNNCAGCGCTA. भिन्न रिवर्स प्राइमर का उपयोग करना, पीसीआर टेम्पलेट्स और इसलिए भिन्न लंबाई के वाहक RNAs का उत्पादन कर रहे हैं.

वाहक लंबाई अनकैप्ड/जेड छाया हुआ/
1 1034 3.96 0.45
२ 966 8.36 0.95
3 889 4.4 0.5
4 821 6.6 0.75
5 744 4.4 0.5
6 676 3.08 0.35
7 599 4.4 0.5
8 531 3.96 0.45
9 454 2.64 0.3
10 386 2.2 0.25

तालिका 3: आरएनए वाहक मिश्रण. वाहक मिश्रण के कुल 49 $g में 0.3-1 kbp: uncapped - 44 $g, छाया हुआ - 5 $g.

कुल आरएनए इनपुट / पीसीआर चक्र
1 एन.जी. 18
2 एन.जी. 17
5 एनजी 16
10 एनजी 15-16
25 एनजी 14-15
50 एनजी 13-15
100 एनजी 12-14

तालिका 4: नमूना कुल आरएनए इनपुट की निर्भरता में पीसीआर चक्र की अपेक्षित संख्या। चक्रकी अनुमानित संख्या Saccharomyces cerevisiae, Drosophila मेलेनोगैस्टर, और musculus कुल आरएनए का उपयोग कर प्रदर्शन प्रयोगों पर आधारित है।

कुल आरएनए इनपुट/ % समग्र मैप किया गया % विशिष्ट रूप से मैप किया गया % वाहक
1 एन.जी. 30 20-30 30
2 एन.जी. 60 20-50 10
5 एनजी 60-70 40-60 5-10
10 एनजी 60-70 40-60 5-10
25 एनजी 65-80 40-70 0-5
50 एनजी 65-80 40-70 0-3
100 एनजी 70-85 40-70 0-2

तालिका 5: अपेक्षित मानचित्रण दक्षता और कुल आरएनए इनपुट राशि की निर्भरता में. लगभग संख्या प्रस्तुत कर रहे हैं और Saccharomyces cerevisiae और Musculus कुल आरएनए का उपयोग कर प्रदर्शन प्रयोगों के आधार पर.

Discussion

सफल SLIC-CAGE पुस्तकालय की तैयारी के लिए, यह नमूना अधिशोषण के कारण नमूना हानि को रोकने के लिए कम बाध्यकारी युक्तियाँ और ट्यूब का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. सुपरनेंट की पुनर्प्राप्ति से संबंधित सभी चरणों में, पूरे नमूना मात्रा को पुनर्प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है। प्रोटोकॉल एकाधिक चरण है, के रूप में निरंतर नमूना हानि असफल लायब्रेरी के लिए लीड करेगा।

यदि CAGE (nANT-iCAGE) नियमित रूप से नहीं किया गया है, यह विभिन्न इनपुट मात्रा के साथ SLIC-CAGE परीक्षण करने के लिए सबसे अच्छा है (10 एनजी, 20 एनजी, 50 एनजी, 100 एनजी, 200 एनजी) एक ही कुल आरएनए नमूना के और NANT-iCAGE पुस्तकालयों कि आरएनए कुल के 5 डिग्री का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं की तुलना करें। यदि nAnT-iCAGE लायब्रेरी असफल है (प्रति नमूना प्राप्त डीएनए लायब्रेरी के 0.5-1 ng से कम), SLIC-CAGE काम करने के लिए संभावना नहीं है, और नमूना हानि को कम से कम करने की आवश्यकता है।

उच्च गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों को सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम जो अकेप्ड अवक्रमित आरएनए या आरएनए से रहित है, अनुभाग 7 में वर्णित कैप-ट्रैपिंग है। यह अत्यधिक महत्वपूर्ण है कि streptavidin मोती अच्छी तरह से धोने बफ़र्स में resuspended रहे हैं और धोने बफ़र्स अगले धोने कदम या cDNA के हल करने के लिए जारी रखने से पहले हटा रहे हैं.

वाहक अवक्रमण के पहले दौर के बाद QPCR से परिणाम adaptor-f1 और carrier-f1 प्राइमर के उपयोग के बीच कोई अंतर नहीं दिखाते हैं, तो प्रोटोकॉल जारी रखने के लिए अभी भी अनुशंसित है। वाहक अवक्रमण के दूसरे दौर के बाद, Ct मानों में अंतर पांच से कम है, तो वाहक अवक्रमण के तीसरे दौर की सिफारिश की है। हम आवश्यक गिरावट का एक तीसरा दौर कभी नहीं मिला है, और अगर ऐसा होता है, यह homing endonuclease शेयरों को बदलने की सिफारिश की है.

पीसीआर प्रवर्धन के अतिरिक्त दौर प्रोटोकॉल के लिए जोड़ा जा सकता है यदि प्राप्त पुस्तकालय की अंतिम राशि अनुक्रमण के लिए पर्याप्त नहीं है। पीसीआर प्रवर्धन तो अनुक्रमण के लिए पर्याप्त सामग्री उपज के लिए आवश्यक प्रवर्धन चक्र की न्यूनतम संख्या के साथ सेट किया जा सकता है, आकार चयन में बचा नहीं जा सकता है कि खाते में नमूना हानि लेने. शुद्धि या आकार चयन SPRI चुंबकीय मोती का उपयोग कर तो प्रदर्शन किया जाना चाहिए जब तक सभी छोटे (lt;200 bp) टुकड़े हटा रहे हैं (यदि आवश्यक हो, नमूना अनुपात के लिए 0.6:1 मोती का उपयोग करें), और पुस्तकालय Picogreen का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए.

पुस्तकालयों एकल अंत या युग्मित अंत मोड में अनुक्रम किया जा सकता है. युग्मित अंत अनुक्रमण का उपयोग करना, प्रतिलिपि isoforms के बारे में जानकारी प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, के रूप में रिवर्स प्रतिलेखन एक यादृच्छिक प्राइमर का उपयोग किया जाता है (TCT-N6, N6 एक यादृच्छिक hexamer जा रहा है), अनुक्रम से जानकारी 3'-अंत अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (UMI) पीसीआर डुप्लिकेट पतन. पीसीआर प्रवर्धन चक्र की एक मध्यम संख्या के रूप में प्रयोग किया जाता है (अप करने के लिए 18), UMIs का उपयोग पहले अनावश्यक पाया गया है.

प्रोटोकॉल के कोर के रूप में nAnT-iCAGE11पर निर्भर करता है, SLIC-CAGE आठ बारकोड का उपयोग करता है। इसलिए, आठ से अधिक नमूने multiplexing वर्तमान में समर्थित नहीं है। इसके अलावा, दोनों SLIC-CAGE और NANT-iCAGE 200 बीपी से कम RNAs पर कब्जा करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं, के रूप में प्रोटोकॉल AMPure XP मोती के साथ आकार बहिष्कार के माध्यम से linkers और PCR कलाकृतियों को दूर करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं.

SLIC-CAGE कुल आरएनए सामग्री के नैनोग्राम का उपयोग कर प्रतिलेखन दीक्षा शुरू साइटों मानचित्रण के लिए केवल निष्पक्ष कम-इनपुट एकल-न्यूक्लिओटाइड संकल्प विधि है। वैकल्पिक विधियाँ कैप-ट्रैपिंग के बजाय बारकोड कैप्ड आरएनए के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस की टेम्पलेट स्विचिंग गतिविधि पर निर्भर करती हैं (उदा., NanoCAGE15 और NanoPARE16)। टेम्पलेट स्विचन के कारण, इन विधियों में टीएसएस का पता लगाने में अनुक्रम-विशिष्ट पूर्वाग्रहों का प्रदर्शन होता है, जिससे झूठी सकारात्मक टीएसएसएस की संख्या में वृद्धि हुई है और वास्तविक टीएसएसएस9,10की संख्या में कमी आई है।

Disclosures

निम्नीकरणीय वाहक आरएनए/डीएनए के लिए एक पेटेंट भरा गया है।

Acknowledgments

इस काम को बी एल और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी) कोर फंडिंग (एमसी-A652-5QA10) को सम्मानित वेलकम ट्रस्ट अनुदान (106954) द्वारा समर्थित किया गया था। एन सी EMBO दीर्घकालिक फैलोशिप (EMBO ALTF 1279-2016) द्वारा समर्थित किया गया था; ई. पी. चिकित्सा अनुसंधान परिषद ब्रिटेन द्वारा समर्थित किया गया था; बी एल चिकित्सा अनुसंधान परिषद ब्रिटेन (एमसी यूपी 1102/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-propanol, Bioultra, for molecular biology, ≥99.5% Sigma-Aldrich 59304-100ML-F Used in RNAclean XP purification.
3' linkers Sequences are described in Murata et al. 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3'linkers is described in the supplementary of this protocol.
5' linkers Sequences are described in Murata et al. 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5'linkers is described in the supplementary of this protocol.
Agencourt AMPure XP, 60 mL Beckman Coulter A63881 Purification of DNA
Agencourt RNAClean XP Kit Beckman Coulter A63987 Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.
Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips Axygen (available through Corning) PCR-0208-CP-C Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).
Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps Axygen (available through Corning) PCR-02CP-C Caps for PCR plates.
Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube Axygen (available through Corning) MCT-150-L-C Low-binding 1.5 mL tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.
Axygen 96 well no skirt PCR microplate Axygen (available through Corning) PCR-96-C Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples
Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits Agilent To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)
Biotin (Long Arm) Hydrazide Vector laboratories SP-1100 Biotinylation/tagging
Cutsmart buffer NEB Restriction enzyme buffer
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase NEB M0259S Second strand synthesis
DNA Ligation Kit, Mighty Mix Takara 6023 Used for 5' and 3'-linker ligation
dNTP mix (10 mM each) ThermoFisher Scientific 18427013 dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)
Dynabeads M-270 Streptavidin Invitrogen 65305 Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher Scientific 12321D Magnetic stand for 1.5 mL tubes - used to prepare Streptavidin beads.
DynaMag-96 Side Skirted Magnet ThermoFisher Scientific 12027 Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.
Ethanol, BioUltra, for molecular biology, ≥99.8% Sigma-Aldrich 51976-500ML-F Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.
Exonuclease I (E. coli) NEB M0293S Leftover primer degradation
Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS NEB B7025S agarose gel loading dye
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England Biolabs E2040S Kit for carrier in vitro transcription
Horizontal electrophoresis apparatus purification of carrier DNA templates from agarose gels
I-Ceu NEB R0699S Homing endonuclease used for carrier degradation.
I-SceI NEB R0694S Homing endonuclease used for carrier degradation.
KAPA HiFi HS ReadyMix (2x) Kapa Biosystems (Supplied by Roche) KK2601 PCR mix for target library amplification
KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x Kapa Biosystems (Supplied by Roche) KK4600 qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles
Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 µL, 1-20 µL, 20-200 µL) Gilson Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.
Microplate reader For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.
nuclease free water ThermoFisher Scientific AM9937 Or any nuclease (DNase and RNase) free water
PCR thermal cycler incubation steps and PCR amplficication
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F530S DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 Purification of carrier PCR templates from agarose gels.
qPCR machine determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent ThermoFisher Scientific P11495 Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder NEB N0551S DNA ladder
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder NEB N0550S DNA ladder
Ribonuclease H Takara 2150A Digestion of RNA after cap-trapping.
RNase ONE Ribonuclease Promega M4261 Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free VWR AAJ63669-AK Or any nuclease (DNase and RNase) free solution
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free Or any nuclease (DNase and RNase) free solution
Sodium periodate Sigma-Aldrich 311448-100G Oxidation of vicinal diols
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 μL, Graduated Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) Z719390-960EA Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1,000 μL , Graduated Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) Z719463-1000EA Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 μL , Graduated Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) Z719412-960EA Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 μL , Graduated Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) Z719447-960EA Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
SpeedVac Vacuum Concentrator concentrating samples in various steps to lower volume
SuperScript III Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 18080044 Used for reverse transcription (1st CAGE step)
Trehalose/sorbitol solution Preparation is described in Murata et al. 2014.
Tris-HCl, 1 M aq.soln, pH 8.5 1 M solution, DNase and RNase free
tRNA (20 mg/mL) tRNA solution. Preparation is described in Murata et al. 2014.
UltraPure Low Melting Point Agarose ThermoFisher Scientific 16520050 Or any suitable pure low-melt agarose.
USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific) 78390500UN
USER Enzyme NEB M5505S Degradation of 3'linker's upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme
Vaccinia Capping System NEB M2080S Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules
Wash buffer A Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.
Wash buffer B Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.
Wash buffer C Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.

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References

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Cvetesic, N., Pahita, E., Lenhard,… More

Cvetesic, N., Pahita, E., Lenhard, B. Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE. J. Vis. Exp. (148), e59805, doi:10.3791/59805 (2019).

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