Transkripsjon Start site kartlegging bruke super-lav input carrier-CAGE

Summary

Cap analyse av Gene Expression (CAGE) er en metode for Genova-bred kvantitativ kartlegging av mRNA 5 ' ender å fange RNA polymerase II transkripsjon starte nettsteder på en enkelt-nukleotid oppløsning. Denne arbeide beskriver en lav-input (skive-bur) protokollen for generasjon av høy-kvalitet biblioteker benytter nanogram-beløpene av sum RNA.

Abstract

Cap analyse av genuttrykk (CAGE) er en metode som brukes for nukleotid oppløsning deteksjon av RNA polymerase II transkripsjon Start Sites (TSSs). Nøyaktig påvisning av TSSs forbedrer identifisering og oppdagelse av kjernen arrangører. I tillegg kan aktive enhancers oppdages gjennom signaturer av toveis transkripsjon innvielse. Beskrevet her over er en protokollen for utføre fortreffelig-lav input bærer-bur (skive-bur). Denne skive tilpasningen av CAGE-protokollen minimerer RNA-tap ved å øke RNA-mengden på en kunstig måte ved bruk av en in vitro-basert RNA carrier-miks som legges til i prøven av interesse, slik at biblioteks forberedelser fra nanogram-mengder av total RNA (dvs. tusenvis av celler). Bærebølgen etterligner den forventede DNA-biblioteket fragment lengde distribusjon, og dermed eliminere skjevheter som kan være forårsaket av overflod av en homogen transportør. I de siste stadiene av protokollen, er transportøren fjernet gjennom degradering med homing endonucleases og målet biblioteket er forsterket. Målet sample biblioteket er beskyttet mot degradering, som homing endonuclease anerkjennelse nettsteder er lange (mellom 18 og 27 BP), noe som gjør sannsynligheten for deres eksistens i eukaryote genomer svært lav. Sluttresultatet er et DNA-bibliotek klar for neste generasjons sekvensering. Alle trinnene i protokollen, opptil sekvensering, kan fullføres innen 6 dager. Transportøren krever en hel arbeidsdag; Det kan imidlertid tilberedes i store mengder og holdes frosset ved-80 ° c. En gang i rekkefølge, det leser kan bearbeidet å få Genova-bred enkelt-nukleotid resolution TSSs. TSSs kan brukes for kjernen promoter eller forsterker oppdagelsen, skaffer innblikk i gen reguleringen. Når samlet til arrangører, kan dataene også brukes til 5 '-sentriske uttrykk profilering.

Introduction

Cap analyse av genuttrykk (CAGE) er en metode som brukes for single-nukleotid oppløsning Genova-bred kartlegging av RNA polymerase II transkripsjon Start Sites (TSSs)¹. Dens kvantitative natur tillater også 5 '-end sentriske uttrykk profilering. Regionene rundt TSSs (ca 40 BP oppstrøms og nedstrøms) er kjernen arrangører og representerer den fysiske plasseringen der RNA polymerase II og generell transkripsjon faktorer bind (gjennomgått tidligere^2,3). Informasjon om nøyaktige plasseringer av TSSs kan brukes til kjernen promoter oppdagelse og for overvåking promoter dynamikk. I tillegg, som aktive enhancers utstillingen underskrifter av toveis transkripsjon, kan CAGE data også brukes for Enhancer oppdagelse og overvåking av Enhancer dynamikk⁴. CAGE metodikk har nylig økt i popularitet på grunn av sin brede anvendelse og bruk i høyprofilerte forskningsprosjekter som kode⁵, modENCODE⁶, og FANTOM prosjekter⁷. I tillegg er TSS informasjon også vist seg å være viktig for å skille sunne og syke vev, som sykdom-spesifikke TSSs kan brukes til diagnostiske formål⁸.

Selv om adskillige metoder for TSS kartlegger er anvendelig (bur, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-capping), vi og andre ha i den seneste tid vist det bur er de fleste upartisk metoden å fange avrette TSSs med det minst antallet av false positiv^{9 , 10}. den nylige Cage protokollen, NAnT-iCAGE¹¹, er den mest upartiske protokollen for TSS profilering, som det unngår å kutte fragmenter til korte koder ved hjelp av restriksjon ENZYMER og bruker ikke PCR forsterkning. En begrensning av nAnT-iCAGE-protokollen er behovet for store mengder Start materiale (f.eks. 5 mikrogram totalt RNA for hver prøve). For å besvare spesifikke, biologisk relevante spørsmål, er det ofte umulig å oppnå så store mengder Start materiale (f.eks. for FACS-sorterte celler eller tidlige embryo-etapper). Til slutt, hvis nAnT-iCAGE er vellykket, bare 1-2 ng av DNA bibliotek materiale er tilgjengelig fra hver prøve, og dermed begrense oppnåelig sekvensering dybde.

Å sette i stand TSS profilering benytter bare nanograms av sum RNA, vi har i den seneste tid bebygget fortreffelig-lav input bærer-bur¹⁰ (skive-bur, skikkelsen 1). SKIVE-bur behøver bare 10 ng av sum RNA å få høy innviklet beskaffenhet biblioteker. Vår protokoll baserer på den nøye utformede syntetiske RNA-transportøren, som er lagt til RNA av interesse for å oppnå totalt 5 mikrogram RNA-materiale. Den syntetiske carrier etterligner målet DNA biblioteket i lengde distribusjon for å unngå potensielle skjevheter som kan være forårsaket av homogene molekyler i overkant. Sekvensen av transportøren er basert på sekvensen av Escherichia coli Leucyl-tRNA syntetase genet (tabell 1) av to grunner. Først noen leftover av transportøren i finalen biblioteket, selv om sekvensert, vil ikke kart til en eukaryote Genova. Andre, idet E. coli er en mesofile Art, dens housekeeping gener er optimert for temperaturen omfang passende for skive-bur. Transportøren sekvensen er også integrert med homing endonuclease anerkjennelse nettsteder for å tillate spesifikk degradering av DNA avledet fra transportøren RNA molekyler. Målet, sample-avledet biblioteket forblir intakt, som homing endonuclease anerkjennelse nettsteder er lange (I-CeuI = 27 BP; I-SceI = 18 BP) og statistisk usannsynlig å bli funnet i eukaryote genomer. Etter spesifikk nedbrytning av transportøren og fjerning av fragmenter etter størrelses ekskludering, er målbiblioteket PCR-forsterket og klar for neste generasjons sekvensering. Avhengig av Start RNA-beløpet (1-100 ng) forventes det at mellom 13-18 PCR-forsterknings sykluser er nødvendig. Den endelige mengden av DNA per hver prøve varierer mellom 5-50 ng, gir nok materiale for svært dyp sekvensering. Når du bruker bare 1-2 ng av total RNA, kan true TSSs oppdages; bibliotekene forventes imidlertid å være av lavere kompleksitet. Til slutt, idet skive-bur er basert på det nAnT-iCAGE protokollen¹¹, den setter i multipleksing av til åtte eksemplar tidligere å sekvensering.

Protocol

1. utarbeidelse av flyselskapet

1. Utarbeidelse av DNA-maler for in vitro transkripsjon
   1. Klargjør PCR-miksen for hver PCR-mal ved å kombinere 41 μL av vann, 20 μL av 5x HF-buffer, 8 μL av 2,5 mM dNTPs, 10 μL av 10 μM unike fram primer (PCR_GN5_f1, tabell 2; primere oppløst og fortynnet i vann) , 10 μL av 2 ng/μL mal plasmider som inneholder syntetisk bære gen og 1 μL Phusion polymerase. Bland PCR-miksen etter pipettering. En Master mix for alle 10 maler kan være forberedt på en gang (forberede for 11 reaksjoner).
   2. Tilsett 90 μL av PCR-Mix til 10 μL av hver 10 μM omvendt primer (PCR_N6_r1-R10, tabell 2). Bland med pipettering.
   3. PCR forsterker malene ved hjelp av følgende program: 98 ° c for 60 s, (98 ° c for 10 s, 50 ° c for 30 s, 72 ° c for 30 s) 35 sykluser, 72 ° c i 10 min, hold ved 4 ° c.
   4. Gel rensing av PCR-forsterket DNA maler
      1. Forbered en 1% agarose gel (lavt smelte agarose anbefales).
      2. For å redusere volumet, konsentrere PCR-reaksjonsblandinger fra 100 til 20 μL total volum ved bruk av vakuum konsentratoren ved lav-middels temperatur (30 – 40 ° c).
      3. Tilsett 6 μL av seks ganger lasting fargestoff, bland godt, og belastningen på gel. Kjør elektroforese i 30 minutter i 1x TAE-buffer ved spenningen som passer for den brukte elektroforese tanken (5 – 10 V/cm). Parallelt kjøre en 100 BP eller 1 000 BP DNA stigen.
      4. Ved hjelp av en ren skalpell, avgiftsdirektoratet den gel skiver som inneholder målet PCR produktet. Unngå overflødig agarose gel. Rens PCR-produkter ved hjelp av et gel Extraction Kit (i henhold til produsentens instruksjoner).
         Merk: A260/A230 prosenter av DNA isolert fra agarose gels er vanligvis lav (0,1 – 0,3). Forventet mål produkt og side produkter er vist i figur 2a. Forventet avkastning fra 100 μL PCR-reaksjoner er 1.2 – 3 μg. reaksjoner kan skaleres opp for å få en høyere avkastning.
2. Transkripsjon av transportør molekyler i vitro
   1. Transkribere carrier RNA in vitro ved hjelp av T7 RNA-polymerase i henhold til produsentens anvisninger. Sett opp 10 – 20 μL-reaksjoner (anbefalt sett er i materialfortegnelsen).
   2. Rens in vitro-RNA-en med et RNA rensesett. Sette opp DNA fordøyelsen i løsning ved hjelp DNase jeg følger produsentens standardinstruksjoner, og eluere RNA i 50 til vann. For å øke eluering yield, la vannet i kolonnen i 5 min før sentrifugering.
      Merk: Vær forsiktig så du ikke overskrider maksimal bindings kapasitet for kolonnene (i settet som er nevnt i innholdsfortegnelsen, er kapasiteten opptil 100 mikrogram). Den forventede avkastningen fra PCR-maler 1 – 10 (1 KBP til 200 BP i lengde) er 25 – 50 μg fra 10 μL in vitro-transkripsjon reaksjoner. Reaksjoner kan skaleres opp for å få et større lager av transportør molekyler.
3. Capping av in vitro-bærer RNA-molekyler
   1. Klargjør capping Mix ved å kombinere 2 μL 10x capping buffer, 1 μL av 10 mM GTP, 1 μL av 2 mM SAM (fersk fortynnet), og 1 μL av Vaccinia capping enzym per transportør RNA.
   2. Bland opptil 10 mikrogram hvert transportør molekyl i 15 μL av total volum og denaturere i 10 minutter ved 65 ° c. Plasser på isen umiddelbart for å hindre sekundær struktur dannelse.
   3. Bland denaturert carrier RNA med 5 μL av capping mix og ruge for 1 h ved 37 ° c.
   4. Rens avkortet RNA molekyler ved hjelp av en RNA rensing kit-følg produsentens opprydding protokollen. Eluere RNA i 30 μL vann. For å øke eluering yield, la vannet i kolonnen i 5 min før sentrifugering.
      Merk: Mål konsentrasjonen ved hjelp av microvolume spektrofotometer. Forventet A260/A280-forhold er > 2 og A260/A230 er > 2. Merk at for noen RNA-prøver kan A260/A230 være mellom 1,3 – 2. Forventet avkastning ved bruk av 10 mikrogram uncapped RNA er 9 – 10 μg av avkortet RNA.
4. Forbered blandingen av avkortet og uncapped transportør ved å kombinere beløpene beskrevet i tabell 3. Bland godt ved å sveipe røret og måle konsentrasjonen ved hjelp av microvolume spektrofotometer.
   Merk: Hvis en høyere konsentrasjon av transportøren er nødvendig for å passe i omvendt transkripsjon reaksjon (se nedenfor), kan bære blandingen være konsentrert ved hjelp av vakuum konsentratoren ved lav-middels temperatur (30-35 ° c) til å nå ønsket endelig konsentrasjon. Trinn 2 – 14 er modifisert fra standard nAnT-iCAGE protokoll rapportert av Murata et al.¹¹

2. omvendt transkripsjon

1. Kombiner 1 μL av RT primer (2,5 mM TCT-N6 oppløst i vann, for sekvens se supplerende tabell 1), 10 ng av total RNA av interesse og 4 990 ng av carrier mix (tabell 3) i 10 μL av total volum i en lav-bindende PCR plate. Bland ved å sveipe røret.
   Merk: Hvis eksempel-RNA-en er for utvannet for omvendt transkripsjon (se nedenfor), Kombiner den med riktig mengde av transportøren, konsentrat ved hjelp av vakuum konsentratoren til 9 μL total volum, og tilsett 1 μL av RT-primer. Hvis du legger til bære jarlen for å nå 5 mikrogram RNA totalt, unngår du tap av prøver.
2. Varm opp blandingen fra trinn 2,1 ved 65 ° c i 5 min, og plasser på isen umiddelbart for å forhindre tilbake.
3. Forbered av omvendt transkripsjon (RT) mix.
   1. For hvert utvalg kombineres 6,1 μL vann (RNase-og DNase-fri), 7,6 μL av 5x første-strand buffer, 1,9 μL av 0,1 M DTT, 1 μL 10 mM dNTPs, 7,6 μL av trehalose/Sorbitol mix (se oppskriften i Murata et al.¹¹) og 3,8 μL av anbefalt revers transkriptase (se < c 6 > tabell med materialer). Bland godt ved å sveipe røret.
4. Tilsett 28 μL av RT-blandingen i PCR-slangen med 10 μL RNA-, transportør-og RT-primer (total volum 38 μL). Bland godt av pipettering.
   Merk: Blandingen er svært tyktflytende på grunn av trehalose/Sorbitol. Bland til synlig homogen.
5. Ruge i en termisk cycler ved bruk av følgende program: 25 ° c i 30 s, 50 ° c for 60 min. og hold ved 4 ° c.
6. Rensing av cDNA: RNA-hybrider ved hjelp av SPRI magnetiske perler
   1. Tilsett 68,4 μL av de anbefalte RNAse-og DNase-frie SPRI-perlene (se tabell over materialer) til 38 ΜL av RT-miksen (perler til prøve forholdet 1,8:1). Bland godt med pipettering og ruge i 5 min ved romtemperatur (RT).
   2. Skill perlene på et magnetisk stativ i 5 min. kast supernatanten og vask perlene to ganger med 200 μL av 70% etanol (fersk tilberedt).
      Merk: Etanol tilsettes til perlene uten å blande og mens røret er på det magnetiske stativet. Den ekstra etanol er umiddelbart fjernet. Forsiktighet bør utvises for ikke å miste noen perler under vask da det kan føre til prøve tap.
   3. Mens røret fortsatt er på det magnetiske stativet, Fjern alle spor av etanol. Dråper av etanol kan fjernes og skyves ut av røret ved hjelp av en P10 pipette. Ikke la perlene tørke.
   4. Tilsett 42 μL av vann forvarmet til 37 ° c til perlene og eluere prøven ved å pipettering opp og ned 60x.
      Merk: Vær forsiktig så du ikke forårsake skummende av pipettering som det kan føre til tap av perler (dvs. bundet prøve) i skummet.
   5. Ruge ved 37 ° c i 5 min uten lokk for å tillate fordampning av spormengder etanol.
   6. Skill perlene på et magnetisk stativ i 5 min og Overfør supernatanten til en ny tallerken.
      Merk: Prøve å gjenerverve alle supernatanten å forhindre eksemplar forlis stund unngår perlen carryover. Bruk P10 pipette for å få den siste prøven dråper.

3. oksidasjon

1. Tilsett 2 μL 1 M NaOAc (pH 4,5) i renset RT-reaksjonen. Bland med pipettering, tilsett 2 μL av 250 mM NaIO₄ og bland igjen.
2. Ruge på isen i 45 min. dekkplaten med aluminiumsfolie for å unngå lys.
3. Tilsett 16 μL av Tris-HCl (pH 8,5) i oksidasjon Mix å nøytralisere pH.
4. Rens oksidert cDNA: RNA-hybrider ved hjelp av SPRI magnetiske perler. Tilsett 108 μL av SPRI-perler til 60 μL av oksidasjons miksen (1,8:1 perler i prøve forholdet). Gjenta rensing som beskrevet i trinn 2.6.1 – 2.6.6. Eluere ved hjelp av 42 μL av vann forvarmet til 37 ° c.
   Merk: Tilbered nylaget 250 mM NaIO₄ ved å tilsette 18,7 μL vann per 1 mg NaIO₄. NaIO₄ er lysfølsom; derfor holder løsningen i et rør dekket med aluminiumsfolie eller i et lett-motstandsdyktig rør.

4. Biotinylation

1. Tilsett 4 μL av 1 M NaOAc (pH 6,0) i røret som inneholder renset oksidert prøve og bland med pipettering.
2. Tilsett 4 μL av 10 mM biotin-oppløsning, bland med pipettering og ruge for 2 timer ved 23 ° c i en termisk cycler for å unngå lys.
   Merk: Klargjør biotin løsningen ved å blande 50 mg biotin med 13,5 mL DMSO. Gjør engangsbruk alikvoter og Frys ved-80 ° c.
3. Rens biotinylated cDNA: RNA-hybrider ved hjelp av SPRI magnetiske perler. Tilsett 12 μL av 2-propanol og bland med pipettering. Tilsett 108 μL av SPRI-perler (1,8:1 perler i prøve forholdet) og gjenta rensingen som beskrevet i trinn 2.6.1 – 2.6.6. Eluere ved hjelp av 42 μL av vann forvarmet til 37 ° c.
   Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her, og prøver frosset ved-80 ° c.

5. RNase jeg Ddigestion

1. Forbered RNase jeg blander ved å blande 4,5 μL av 10x RNase I buffer med 0,5 μL av RNase I (10 U/μL) per hver prøve. Bland med pipettering.
2. Tilsett 5 μL av blandingen i hvert enkelt renset utvalg (45 μL totalt). Bland med pipettering og ruge i 30 min ved 37 ° c.

6. utarbeidelse av Streptavidin perler

1. For hvert utvalg, bland 30 μL av streptavidin perler slurry med 0,38 μL av 20 mg/mL tRNA. Ruge på isen i 30 min og bland hver 5 min ved å sveipe røret.
   Merk: Resuspend den streptavidin perler slurry godt før pipettering ved å sveipe flasken. TRNA-løsningen skal være forberedt i henhold til Murata et al.¹¹
2. Skill perlene på det magnetiske stativet i 2 – 3 min. Fjern supernatanten.
3. Vask perlene med blanding i 15 μL av buffer A. Skill perlene på det magnetiske stativet i 2 – 3 min og fjern supernatanten. Gjenta vasken og fjern supernatanten.
4. Resuspend av perlene i 105, μL av buffer A og tilsett 0,19 μL av 20 mg/mL tRNA. Bland godt av pipettering.
   Merk: Perlene bør tilberedes friskt før bruk. Start utarbeidelse av perlene under RNase jeg fordøyelsen. For flere prøver forberede perlene sammen i et enkelt rør.

7. Cap-overlapping

1. Eksempel på binding
   1. Tilsett 105 μL av tilberedte streptavidin perler til 45 μL av RNase I-behandlet prøve. Bland godt med pipettering og ruge ved 37 ° c i 30 min. bland med pipettering hver 10 min.
   2. Skill perlene på det magnetiske stativet i 2 – 3 min. Fjern supernatanten.
2. Vaske perler
   1. Tilsett 150 μL av vaskebuffer A og resuspend perlene ved pipettering. Skill perlene på det magnetiske stativet i 2 – 3 min og fjern supernatanten.
   2. Tilsett 150 μL av vaskebuffer B og resuspend perlene med pipettering. Skill perlene på det magnetiske stativet i 2 – 3 min og fjern supernatanten.
   3. Tilsett 150 μL av vaskebuffer C og resuspend perlene ved pipettering. Skill perlene på det magnetiske stativet i 2 – 3 min og fjern supernatanten.
      Merk: Buffere B og C skal være forvarmet til 37 ° c. Oppskrifter for vaske buffere A, B og C er som beskrevet i Murata et al.¹¹
3. cDNA utgivelse
   1. Forbered 1x RNase I buffer ved å blande 58,5 μL av vann med 6,5 μL av 10x RNase jeg buffer.
   2. Resuspend av perlene i 35 μL av 1x RNase i buffer. Ruge ved 95 ° c i 5 min og Overfør direkte på isen i 2 min for å hindre reassociation av cDNA. Hold lokkene under overføring til isen som de kan pop-off på grunn av press bygge opp.
   3. Skill perlene for 2 – 3 min på et magnetisk stativ og Overfør supernatanten til en ny tallerken.
   4. Resuspend perlene i 30 μL av 1x RNase jeg buffer. Skill perlene på det magnetiske stativet i 2 – 3 min og Overfør supernatanten til den tidligere innsamlede supernatanten (total volum på eluert cDNA bør være ca. 65 μL).

8. RNA fjerning av RNase H og RNase jeg fordøyelse

1. Per prøve, Kombiner 2,4 μL av vann, 0,5 μL av 10x RNase i buffer, 0,1 μL av RNase H, og 2 μL av RNase I.
2. Tilsett 5 μL av miksen til 65 μL av den frigitte cDNA prøven og bland med pipettering. Ruge ved 37 ° c i 15 min og hold ved 4 ° c.
3. Rens cDNA fra RNase fordøyelsen Mix bruker SPRI magnetiske perler. Tilsett 126 μL av SPRI-perler til 70 μL av nedbrytning reaksjon og bland med pipettering. Følg rensing trinn som beskrevet for SPRI perler rensing i 2.6.1-2.6.6. Eluere ved hjelp av 42 μL av vann forvarmet til 37 ° c som beskrevet.
4. Forbered RNase jeg blander ved å kombinere 4,5 μL av 10x RNase jeg buffer og 0,5 μL av RNase I.
5. Tilsett 5 μL av RNase Mix til 40 μL av renset cDNA-prøven. Bland med pipettering og ruge ved 37 ° c i 30 min. Hold ved 4 ° c.
6. Rens prøven med SPRI magnetiske perler. Tilsett 81 μL av SPRI-perler til 45 μL av nedbrytning reaksjon og bland med pipettering. Følg rensing trinn som beskrevet for SPRI perler rensing i 2.6.1-2.6.6. Eluere bruker 42 μL vann som beskrevet.

9. ligation av 5 ' linker

1. Konsentrer renset cDNA prøven til 4 μL ved hjelp av vakuum konsentratoren. Behold temperaturen ved 30 – 35 ° c. Test volumet med en pipette. Hvis prøven har tørket til fullstendighet, oppløses ved å tilsette 4 μL vann.
   Merk: Det er bedre å unngå tørking til fullstendighet for å hindre prøve tap.
2. Ruge den konsentrerte prøven ved 95 ° c i 5 min og umiddelbart plass på isen i 2 min for å hindre tilbake. Hold lokkene mens du overfører rørene, da dekslene kan sprette på grunn av oppbygging av trykk.
3. Ruge 4 μL av 2,5 μM 5 ' linker ved 55 ° c i 5 min og umiddelbart plass på isen i 2 min for å hindre tilbake.
4. Bland 4 μL av 2,5 μM 5 ' linker med 4 μL av prøven.
   Merk: Den 5 ' linker skal være forberedt i henhold til supplerende tabell 2, supplerende tabell 3, tilleggs tabell 4, og supplerende tabell 5. Fortynne 10 μM 5 ' linker til en 2,5 μM konsentrasjon med 100 mM NaCl før bruk.
5. Tilsett 16 μL av ligation Premix (se tabell over materialer) til blandet 5 ' linker og prøven og bland godt av pipettering. Ruge ved 16 ° c i 16 h.
6. Rens ligation blandingen ved hjelp av SPRI magnetiske perler. Tilsett 43,2 μL av SPRI-perler og følg trinnene 2.6.1 – 2.6.6. Eluere som beskrevet ved bruk av 42 μL av vann forvarmet til 37 ° c.
7. Gjenta rensingen gjort i trinn 9,6 ved å tilsette 72 μL av SPRI perler til de overførte supernatanten (1,8:1 perler til prøve ratio).
   Merk: 5 ' Linkers inneholder strekkoder som tillater gruppering av opptil åtte prøver før sekvensering (åtte trinucleotide strekkoder er tilgjengelige, som beskrevet i Murata et al.¹¹ og supplerende tabell 1).

10. ligation av 3 ' linker

1. Konsentrer renset prøven til 4 μL ved hjelp av vakuum konsentratoren som beskrevet i trinn 9,1.
2. Ruge den konsentrerte prøven ved 95 ° c i 5 min og umiddelbart plass på isen i 2 min for å hindre tilbake. Hold lokkene mens du overfører rørene, da dekslene kan sprette av på grunn av trykkoppbygging.
3. Ruge 4 μL av 2,5 μM 3-linker ved 65 ° c i 5 min og umiddelbart plass på isen i 2 minutter for å forhindre tilbake.
4. Tilsett 4 μL av 2,5 μM 3-kobling til 4 μL av konsentrert prøve.
5. Tilsett 16 μL av ligation Premix og bland godt med pipettering. Ruge ved 16 ° c i 16 h.
6. Rens ligation blandingen ved hjelp av SPRI magnetiske perler. Tilsett 43,2 μL av SPRI-perler og følg trinnene 2.6.1 – 2.6.6. Eluere som beskrevet ved bruk av 42 μL av vann forvarmet til 37 ° c.
   Merk: De 3 ' linker skal være forberedt i henhold til supplerende tabeller 6 og supplerende tabell 7. Fortynne 10 μM 3 ' linker til en 2,5 μM konsentrasjon med 100 mM NaCl.

11. defosforylering

1. Forbered SAP-miksen ved å kombinere 4 μL vann, 5 μL av 10x SAP-buffer og 1 μL av SAP-enzym.
2. Tilsett 10 μL av SAP-miks i den renset ligaturer prøven (totalt volum 50 μL) og ruge i thermocycler ved hjelp av følgende program: 37 ° c i 30 min, 65 ° c i 15 min, og hold ved 4 ° c.

12. degradering av 3 ' linker Upper strand bruke Uracil spesifikke forbrukeravgift enzym

1. Tilsett 2 μL av uracil spesifikke forbruker-enzym (se tabell over materialer) til dephosphorylated prøven, bland med pipettering og ruge i thermocycler ved hjelp av følgende program: 37 ° c i 30 min, 95 ° c i 5 min, og sett umiddelbart på isen i 2 minutter til forhindre reannealing av den fragmenterte øvre tråden.
2. Rens reaksjonsblandingen ved å tilsette 93,6 μL av SPRI magnetiske perler til den 52 μL-blandingen og bland godt med pipettering. Gjenta rensing trinn 2.6.1-2.6.6. Eluere med 42 μL av vann forvarmet til 37 ° c som beskrevet.

13. andre strand syntese

1. Forbered den andre tråd syntese mix (volumene uttrykkes per prøve) ved å kombinere 5 μL av 10x DNA polymerase reaksjonsbuffer, 2 μL vann, 1 μL av 10 mM dNTPs, 1 μL av 50 μM nAnT-iCAGE andre strand primer (sekvensen er i supplerende tabell 1) og 1 μL av D NA exonuclease-mangelfull polymerase (se anbefalt polymerase i tabell over materialer).
2. Tilsett 10 μL av blandingen i renset prøven og bland godt med pipettering (total volum er 50 μL). Ruge i den termiske cycler ved hjelp av følgende program: 95 ° c i 5 min, 55 ° c i 5 min, 72 ° c i 30 min, og hold ved 4 ° c.

14. nedbrytning av andre strand syntese primer bruke Exonuclease jeg

1. Tilsett 1 μL av Exonuclease i til den andre strand syntese blanding. Bland godt med pipettering og ruge ved 37 ° c i 30 min, etterfulgt av å holde ved 4 ° c.
2. Rens dobbelt strandet DNA ved å tilsette 91,8 μL av SPRI magnetiske perler til 51 μL av Exonuclease I-behandlet prøve. Gjenta rensing trinn beskrevet i 2.6.1-2.6.6. og eluere med 42 μL vann forvarmet til 37 ° c som beskrevet.
3. Konsentrer prøven ved hjelp av vakuum konsentratoren til 15 μL, som beskrevet i trinn 9,1.

15. kvalitets-og antalls kontroll

1. Bruk 1 μL av konsentrert prøver og Kjør en høy følsomhet DNA-chip på en DNA kvalitets analysator. Forventet profil/antall er presentert i Figur 3.

16. første runde av carrier degradering

1. Klargjør ned brytnings blandingen ved å kombinere 2 μL vann, 2 μL av 10x Begrensnings enzym buffer, 1 μL av I-SceI og 1 μL av I-CeuI.
2. Tilsett 6 μL av degradering blandingen til 14 μL av konsentrert prøve og bland med pipettering. Ruge ved 37 ° c i 3 h etterfulgt av 20 min deaktivering ved 65 ° c og hold ved 4 ° c.
3. Rens fornedrelse blandingen ved hjelp av SPRI magnetiske perler. Tilsett 5 μL vann for å øke volumet av nedbrytning mix og tilsett 45 μL av SPRI perler (1,8:1 perler til prøve ratio). Gjenta rensing som beskrevet i trinn 2.6.1 – 2.6.6. og eluere med 42 μL vann forvarmet til 37 ° c.
4. Konsentrer den eluert prøven fra 42 μL til 20 μL av det totale volumet som beskrevet i trinn 9,1.

17. kontroll av ned brytnings nivå og fastsettelse av antall PCR forsterkning sykluser

1. Forbered qPCR mix for å forsterke hele bibliotekene (adapter Mix). Kombiner 3,8 μL av vann, 5 μL av qPCR Premix (2x), 0,1 μL av 10 μM adaptor_f1 primer (5 '-AATGATACGGCGACCACCGA-3 '), og 0,1 μL av 10 μM adaptor_r1 primer (5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 ') for hver prøve (se tabell over materialer for anbefalt qPCR Premix).
2. Kombiner 9 μL av qPCR-adapter bland med 1 μL prøve fra trinn 16,4 og bland godt med pipettering.
3. Forbered qPCR mix for å forsterke DNA avledet fra transportøren (carrier Mix). Kombiner 3,8 μL av vann, 5 μL av qPCR Premix (2x), 0,1 μL av 10 μM carrier_f1 primer (5 '-GCGGCAGCGTTCGCTATAAC-3 '), og 0,1 μL av 10 μM adaptor_r1 primer for hver prøve
4. Kombiner 9 μL av qPCR carrier Mix med 1 μL av prøven fra trinn 16,4 og bland godt av pipettering.
5. Sett qPCR program: 95 ° c i 3 min (95 ° c for 20 s, 60 ° c for 20 s, 72 ° c i 2 min) gjentatt 40x, etterfulgt av instrument spesifikk denaturering kurve (65 – 95 ° c), og hold ved 4 ° c.
   Merk: Forbered en negativ kontroll ved å erstatte prøven med vann.

18. PCR forsterkning av målbiblioteket

1. Klargjør PCR-forsterkningen ved å kombinere 6 μL vann, 0,5 μL av 10 μM adaptor_f1-primer, 0,5 μL av 10 μM adaptor_r1-primer og 25 μL av PCR-Premix (2x). Bland med pipettering (se tabell over materialer for den anbefalte PCR-Premix).
2. Tilsett 32 μL av PCR-blandingen til 18 μL av prøven fra trinn 16,4. Bland godt av pipettering.
3. Angi PCR-forsterkning: 95 ° c i 3 min, (98 ° c i 20 s, 60 ° c i 15 s, 72 ° c i 2 min) 12-18 sykluser, 72 ° c i 2 min og hold ved 4 ° c.
   Merk: Det nøyaktige antallet PCR-sykluser bestemmes av qPCR-resultatene og tilsvarer CT-verdien som oppnås med adapter primer mix (antall PCR-sykluser er lik CT-verdien).
4. Rens den forsterkede prøven ved å tilsette 90 μL av SPRI magnetiske perler til 50 μL av den forsterkede prøven og bland godt med pipettering. Gjenta rensing trinnene beskrevet i trinn 2.6.1-2.6.6. og eluere prøven med 42 μL vann som beskrevet.

19. andre runde av carrier degradering

1. Gjenta trinn 16.1 – 16.3.
2. Rens fornedrelse blandingen ved hjelp av SPRI magnetiske perler. Tilsett 10 μL vann i prøven for å øke volumet og bland med 30 μL av SPRI-perler (1:1 perler til prøve forholdet). Gjenta rensing som beskrevet i trinn 2.6.1 – 2.6.6. og eluere med 42 μL av vann forvarmet til 37 ° c som beskrevet.
3. Konsentrer den eluert prøven fra 42 μL til 30 μL av totalt volum.

20. valg av bibliotek størrelse

1. Bland 24 μL av SPRI magnetiske perler med 30 μL av prøven fra trinn 19,3. (0,8:1 perler til prøve ratio). Gjenta rensing trinnene som beskrevet i trinn 2.6.1-2.6.6. og eluere prøven i 42 μL vann som beskrevet.
2. Konsentrer prøven til ca. 14 μL, som beskrevet i trinn 9,1.

21. kvalitetskontroll

1. Vurdering av størrelse-distribusjon
   1. Kjør 1 μL av prøven på DNA-brikken med høy følsomhet. Forventet resultat er presentert i Figur 4.
      Merk: Hvis fragmenter som er kortere enn 200 BP er synlige (se eksempel i figur 4a, C), bør størrelsesvalg (trinn 20.1 – 20.2) gjentas til de korte fragmentene fjernes (figur 4b, D). Vanligvis er en ekstra runde med størrelsesvalg nok. Dersom mengden av korte fragmenter er alvorlig (som i figur 4c), bør perlene-til-prøve-forholdet reduseres til 0,6:1.
2. Kvalitetskontroll for bærebølge
   1. Gjenta trinn 17.1 – 17.5.
      Merk: Avhengig av konsentrasjonen av bibliotekene anslått i HS DNA chip Run (region analyse), prøvene må fortynnes før qPCR. Bruk 0,5 μL av prøven for å unngå prøve tap og fortynne 100 – 500x i vann (fortynne til 1 – 20 PG/μL sluttkonsentrasjon). Forventet forskjell mellom CT-verdier oppnådd med adapter og transportør blanding er 5 – 10.
3. Bibliotek kvantifisering
   1. Klargjør arbeids fortynning av lambda DNA-standarden ved å blande 20 μL av 100 mg/mL lambda DNA-standard med 980 μL av 1x TE (Forbered ved å fortynne 20x TE i DNA kvantifisering settet). Fortynning av lambda-DNA kan oppbevares ved-20 ° c.
   2. Klargjør standard serie fortynninger for lambda-DNA ved å blande den fortynnede lambda-standarden og 1x TE i henhold til supplerende tabell 8.
      Merk: For høyere nøyaktighet anbefales det å legge til 100 μL av 1x TE-buffer i alle rør og fjerne 1x TE-volum som kreves per volum av den fortynnede lambda som skal legges til. Ikke bruk mer enn 1 μL av biblioteket; Bruk av 384 brønn plater for denne målingen anbefales.

Representative Results

Denne rapportere beskriver det i sin helhet skive-bur protokollen for innhenter sekvensering-klar biblioteker fra nanograms av igangsetting sum RNA materiale (skikkelsen 1). For å få tak i syntetisk RNA carrier-blanding må PCR bære maler forberedes og gel-renset for å eliminere PCR side produkter (figur 2a). Hver PCR-mal (ti i alt) produseres ved hjelp av en felles fremover, men en annen omvendt primer (tabell 2), som fører til ulike LENGDER av PCR-malen for å muliggjøre Størrelsesvariasjon av syntetiske RNA-bærere. Når de er renset, brukes PCR-maler til in vitro-transkripsjon av transportør molekylene. Det forventes et enkelt RNA transportør produkt hvis malene er gel-renset (se representativ gel-analyse i figur 2b). Utarbeidelse av transportøren kan være oppskalert avhengig av behovet, og når forberedt, blandet og frosset på-80 ° c for fremtidig bruk.

Benytter det anbefalt minimal beløpet av eksemplar sum RNA (10 ng) kombinert med 16-18 kretsløpene av PCR forsterkning, høy kompleksitet skive-bur biblioteker kan utrette. Antall PCR-sykluser som kreves for å forsterke det endelige biblioteket er sterkt avhengig av mengden av total input RNA brukt (forventet antall sykluser er presentert i Tabell 4).

Etter den første runden av fornedrelse, i qPCR resultater (trinn 17), den forventede forskjellen mellom CT verdier innhentet ved hjelp av adaptor_f1 eller carrier_f1 primer er 1-2, med CT verdier innhentet med adaptor_f1 lavere enn med carrier_f1.

Fordelingen av fragment lengder i det endelige biblioteket er mellom 200-2000 BP med gjennomsnittlig fragment størrelsen på 700-900 BP (basert på regionen analyse ved hjelp Bioanalyzer programvare, figur 4b, D). Kortere fragmenter, som presentert i figur 4a, C, må fjernes ved ekstra runder med størrelses ekskludering (trinn 20-21). Disse korte fragmenter er PCR forsterkning gjenstander og ikke målet biblioteket. Legg merke til at kortere fragmenter klyngen bedre på sekvensering flytceller og kan forårsake sekvensering problemer.

Den forventede mengden bibliotek materiale innhentet per prøve er mellom 5-50 ng. Betydelig lavere beløp er en indikasjon på prøve tap under protokollen. Hvis den oppnådde lave mengden er nok for sekvensering (2-3 ng av de samlede bibliotekene er nødvendig), bibliotekene kan være av lavere kompleksitet (se nedenfor).

Avhengig av sekvensering maskinen, kan mengden av biblioteket som er lastet inn i strømningscellen må optimaliseres. Benytter en Illumina HiSeq 2500, lessing 8-12 pM skive-bur biblioteker gir i gjennomsnitt 150-200 million leser, med > 80% av leser forbikjøring kvalitet snes Q30 idet terskel.

De oppnådde leser blir deretter kartlagt til referansen Genova [for 50 BP leser, Bowtie2¹² kan brukes med standard parametre som tillater null uoverensstemmelser per frø sekvens (22 BP)]. Den forventede kartleggings effektiviteten avhenger av det totale RNA-beløpet og presenteres i tabell 5. Den unikt kartlagt leser kan deretter lastes inn i R grafisk og statistisk datamiljø¹³ og behandlet ved hjelp CAGEr (Bioconductor pakke¹⁴). Pakke scenen er enkel å følge og forklarer arbeidsflyten og behandlingen av de tilordnede dataene i detalj. En enkel visuell kontroll av biblioteket kompleksitet er fordelingen av promoter bredde, som lav kompleksitet bibliotekene vil ha kunstig smale arrangører (figur 5a, skive-Cage biblioteket stammer fra 1 ng av total RNA, for detaljer se tidligere publikasjon¹⁰). Imidlertid, aften det lav-innviklet beskaffenhet skive-bur biblioteker tillate legitimasjonen av avrette CTSSs, med betydelig nøyaktighet enn alternativ metoder for lav/medium-input TSS kartlegger (skikkelsen 5B, C).

Figur 1: Skritt inne det skive-bur protokollen. Eksempel RNA blandes med RNA-stativet for å oppnå 5 mikrogram totalt RNA-materiale. cDNA er syntetisert gjennom omvendt transkripsjon og hetten er oksidert ved hjelp av natrium periodate. Oksidasjon tillater festing av biotin til hetten ved hjelp av biotin hydrazide. Biotin blir festet til mRNA ' s 3 ' end, så det er også oksidert bruker natrium periodate. For å eliminere biotin fra mRNA: cDNA hybrider med ufullstendig syntetisert cDNA og fra 3 ' endene av mRNA, prøvene er behandlet med RNase I. cDNA som nådde 5 ' slutten av mRNA er deretter valgt av affinitet rensing på streptavidin magnetiske perler ( Cap-fangst). Etter utgivelsen av cDNA, 5 '-og 3 ′-Linkers er ligaturer. Biblioteket molekyler som stammer fra transportøren er degradert ved hjelp av I-SceI og I-CeuI homing endonucleases og fragmentene fjernes ved hjelp av SPRI magnetiske perler. Biblioteket er da PCR forsterket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: representativ gel-analyse av transportør PCR maler og carrier in vitro transkripsjoner. (A) carrier PCR maler før gel rensing: den første brønnen inneholder 1 KBP markør, etterfulgt av carrier PCR maler 1, 1-10. (B) carrier in vitro transkripsjoner: den første brønnen inneholder 1 KBP markør, etterfulgt av Carrier transkripsjoner 1-10. Bære transkripsjoner ble denaturert ved oppvarming i 5 min ved 95 ° c før lasting. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: REPRESENTATIVE DNA kvalitet (høy følsomhet DNA chip) spor av skive-Cage før første runde av carrier degradering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: REPRESENTATIVE DNA kvalitet (høy følsomhet DNA chip) spor av skive-Cage bibliotekene etter PCR forsterkning. (En) skive-bur bibliotek det behøver i tillegg størrelse-utvalg for flytting av kort fragmenter. (B) skive-bur bibliotek etter størrelse-utvalg bruker 0,6 x SPRI perler å prøve ratio. (C) skive-bur bibliotek av lavere produksjon beløpet det behøver størrelse-utvalg for flytting av kort fragment. (D) skive-Cage bibliotek med lavere output beløp etter størrelse-valg ved hjelp av 0,6:1 SPRI perler å prøve ratio. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: Godkjenningen av skive-bur biblioteker. (A) distribusjon av tag Cluster interquantile bredder i skive-Cage biblioteker utarbeidet fra 1, 5, eller 10 ng av S. CEREVISIAE total RNA, og i nAnT-iCAGE biblioteket utarbeidet fra 5 μg av S. cerevisiae total RNA. En stor mengde av smal tag klynger inne det 1 ng skive-bur bibliotek viser dens lav innviklet beskaffenhet. (B) Roc KURVER for CTSS identifikasjon i S. CEREVISIAE skive-Cage bibliotekene. Alle S. cerevisiae NAnT-iCAGE CTSSs ble brukt som et ekte sett. (C) Roc KURVER for CTSS identifisering i S. cerevisiae nanoCAGE biblioteker. Alle S. cerevisiae NAnT-iCAGE CTSSs ble brukt som et ekte sett. Sammenligningen av ROC kurvene viser det skive-bur kraftig overgår nanoCAGE inne CTSS legitimasjonen. Data fra ArrayExpress E-MTAB-6519 ble brukt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: sekvensen av det syntetiske genet. I-SceI nettsteder er fet og kursiv i lilla, og I-CeuI anerkjennelser nettsteder er grønne. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Carrier	omvendt primer 5 '-3 '		PCR produkt lengde/BP
1	PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT		1034 for alle
2	PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC		966 for alle
3	PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG		889 for alle
4	PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT		821 for alle
5	PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC		744 for alle
6	PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA		676 for alle
7	PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC		599 for alle
8	PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC		531 for alle
9	PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG		454 for alle
10	PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA		386 for alle
	* Forward primer er den samme for alle carrier maler. Understreket er T7 promoter sekvensen. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA

Tabell 2: primere for carrier mal forsterkning. Forward primer er den samme for alle carrier maler. Understreket er T7 promoter sekvensen. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA. Ved hjelp av ulike omvendt grunning, PCR maler og dermed bærer RNAs av ulik lengde er produsert.

Carrier	Lengde	uncapped/μg	avkortet/μg
1	1034 for alle	3,96 for alle	0,45 for alle
2	966 for alle	8,36 for alle	0,95 for alle
3	889 for alle	4,4 for alle	0,5 for alle
4	821 for alle	6,6 for alle	0,75 for alle
5	744 for alle	4,4 for alle	0,5 for alle
6	676 for alle	3,08 for alle	0,35 for alle
7	599 for alle	4,4 for alle	0,5 for alle
8	531 for alle	3,96 for alle	0,45 for alle
9	454 for alle	2,64 for alle	0,3 for alle
10	386 for alle	2,2 for alle	0,25 for alle

Tabell 3: RNA bære mix. Totalt 49 μg av bære blandingen 0,3-1 KBP: uncapped = 44 μg, avkortet = 5 μg.

Totalt RNA-/ng	PCR-sykluser
1 ng av	18
2 ng med	17
5 ng og	16
10 ng	15-16 for alle
25 ng	14-15 for alle
50 av ng	13-15 for alle
100 av ng	12-14 for alle

Tabell 4: Forventet antall PCR-sykluser i avhengighet av prøve total RNA-inngang. Omtrentlig antall sykluser er basert på eksperimenter utført ved hjelp av Saccharomyces cerevisiae, Drosophila Melanogaster, og mus laboratoriemusmusculus total RNA.

Total RNA-inngang/ng	% samlet kartlagt	% entydig tilordnet	% transportør
1 ng av	30	20-30 for alle	30
2 ng med	60 for alle	20-50 for alle	10
5 ng og	60-70 for alle	40-60 for alle	5-10 for alle
10 ng	60-70 for alle	40-60 for alle	5-10 for alle
25 ng	65-80 for alle	40-70 for alle	0-5 for alle
50 av ng	65-80 for alle	40-70 for alle	0-3 for alle
100 av ng	70-85 for alle	40-70 for alle	0-2 for alle

Tabell 5: forventet kartlegging effektivitet og i avhengighet av total RNA input beløp. Omtrentlige tall presenteres og basert på eksperimenter utført ved hjelp av Saccharomyces cerevisiae og mus laboratoriemusmusculus total RNA.

Discussion

For heldig skive-bur bibliotek forberedelser, det er en betenkelig å bruk lav-innbindingen drikkepenger og rør å forhindre eksemplar forlis på grunn av prøve absorpsjon. I alle trinn som involverer henting av supernatanten, anbefales det å gjenopprette entiresample volum. Etter hvert som protokollen har flere trinn, vil kontinuerlig prøve tap føre til mislykkede biblioteker.

Hvis bur (nAnT-iCAGE) har ikke blitt utført rutinemessig, det er en best å test skive-bur med annerledes input beløpene (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) av det likt sum RNA eksemplar og sammenligne med nAnT-iCAGE biblioteker det er ferdig benytter 5 μg av sum RNA. Hvis det nAnT-iCAGE bibliotek er mislykket (mindre enn 0.5-1 ng av det DNA bibliotek oppnådd per eksemplar), skive-bur er usannsynlig å arbeide, og eksemplar forlis nødvendig å bli minimere.

Et kritisk skritt for å sikre høy kvalitet biblioteker blottet for uncapped degradert RNA eller rRNA er hetten-fangst som er beskrevet i punkt 7. Det er svært viktig at de streptavidin perlene er grundig resuspendert i vaske buffere og at vaske buffere er fjernet før du fortsetter til neste vasketrinn eller eluering av cDNA.

Hvis resultatene fra qPCR etter første runde av carrier degradering viser ingen forskjell mellom bruk av adaptor_f1 og carrier_f1 primere, fortsetter protokollen er fortsatt anbefalt. Hvis du etter den andre runden av bærebølgen degradering, er forskjellen i CT-verdier mindre enn fem, en tredje runde av carrier degradering anbefales. Vi har aldri funnet en tredje runde med degradering nødvendig, og hvis det skjer, er det anbefalt å erstatte homing endonuclease bestandene.

Flere runder med PCR-forsterkning kan legges til protokollen hvis det endelige beløpet for biblioteket som innhentes, ikke er nok for sekvensering. PCR forsterkning kan deretter stilles inn med minimalt antall forsterknings sykluser som trengs for å gi nok materiale til sekvensering, ta hensyn til prøve tap som ikke kan unngås i størrelsesvalg. Rensing eller størrelsesvalg ved hjelp av SPRI magnetiske perler bør deretter utføres inntil alle små (< 200 BP) fragmenter er fjernet (hvis nødvendig, bruk 0,6:1 perler til prøve ratio), og biblioteket skal være kvantifisert med Picogreen.

Biblioteker kan være i rekkefølge i enkelt-eller par ende modus. Ved å bruke grupperte sekvenser, kan informasjon om transkripsjon isoformene fås. I tillegg, som omvendt transkripsjon utføres ved hjelp av en tilfeldig primer (TCT-N₆, N₆ å være en tilfeldig heksamer), informasjon fra det sekvensert 3 '-end kan brukes som unike molekylære identifikatorer (UMI) å kollapse PCR duplikater. Som et moderat antall PCR forsterkning sykluser brukes (opp til 18), bruk av UMIs har tidligere funnet å være unødvendig.

Idet kjernen av protokollen avhenger av nAnT-iCAGE¹¹, skive-bur bruker åtte strekkoder. Derfor støttes ikke multipleksing mer enn åtte prøver for øyeblikket. Dessuten, begge to skive-bur og nAnT-iCAGE er ikke egnet til fanger RNAs kortere vei enn 200 BP, idet protokollene er beregnet på fjerne Linkers og PCR artefakter igjennom størrelse-utelukkelse med AMPure XP perler.

SKIVE-bur er det bare saklig lav-input enkelt-nukleotid resolution metoden for kart transkripsjon innvielsen starte steder benytter nanograms av sum RNA materiale. Alternative metoder er avhengige av den omvendte transkriptase for mal veksling til strekkode som er avkortet med RNA i stedet for cap-overtrykk (f.eks. NanoCAGE¹⁵ og NanoPARE¹⁶). På grunn av mal veksling viser disse metodene sekvens spesifikke bias i TSSs deteksjon, noe som fører til økt antall falske positive TSSs og reduserte antall sanne TSSs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-propanol, Bioultra, for molecular biology, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	59304-100ML-F	Used in RNAclean XP purification.
3' linkers			Sequences are described in Murata et al. 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3'linkers is described in the supplementary of this protocol.
5' linkers			Sequences are described in Murata et al. 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5'linkers is described in the supplementary of this protocol.
Agencourt AMPure XP, 60 mL	Beckman Coulter	A63881	Purification of DNA
Agencourt RNAClean XP Kit	Beckman Coulter	A63987	Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.
Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips	Axygen (available through Corning)	PCR-0208-CP-C	Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).
Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps	Axygen (available through Corning)	PCR-02CP-C	Caps for PCR plates.
Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube	Axygen (available through Corning)	MCT-150-L-C	Low-binding 1.5 mL tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.
Axygen 96 well no skirt PCR microplate	Axygen (available through Corning)	PCR-96-C	Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples
Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits	Agilent		To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)
Biotin (Long Arm) Hydrazide	Vector laboratories	SP-1100	Biotinylation/tagging
Cutsmart buffer	NEB		Restriction enzyme buffer
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase	NEB	M0259S	Second strand synthesis
DNA Ligation Kit, Mighty Mix	Takara	6023	Used for 5' and 3'-linker ligation
dNTP mix (10 mM each)	ThermoFisher Scientific	18427013	dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)
Dynabeads M-270 Streptavidin	Invitrogen	65305	Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.
DynaMag-2 Magnet	ThermoFisher Scientific	12321D	Magnetic stand for 1.5 mL tubes - used to prepare Streptavidin beads.
DynaMag-96 Side Skirted Magnet	ThermoFisher Scientific	12027	Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.
Ethanol, BioUltra, for molecular biology, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	51976-500ML-F	Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.
Exonuclease I (E. coli)	NEB	M0293S	Leftover primer degradation
Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS	NEB	B7025S	agarose gel loading dye
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England Biolabs	E2040S	Kit for carrier in vitro transcription
Horizontal electrophoresis apparatus			purification of carrier DNA templates from agarose gels
I-Ceu	NEB	R0699S	Homing endonuclease used for carrier degradation.
I-SceI	NEB	R0694S	Homing endonuclease used for carrier degradation.
KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)	Kapa Biosystems (Supplied by Roche)	KK2601	PCR mix for target library amplification
KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x	Kapa Biosystems (Supplied by Roche)	KK4600	qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles
Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 µL, 1-20 µL, 20-200 µL)	Gilson		Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.
Microplate reader			For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.
nuclease free water	ThermoFisher Scientific	AM9937	Or any nuclease (DNase and RNase) free water
PCR thermal cycler			incubation steps and PCR amplficication
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	F530S	DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	Purification of carrier PCR templates from agarose gels.
qPCR machine			determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent	ThermoFisher Scientific	P11495	Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	NEB	N0551S	DNA ladder
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N0550S	DNA ladder
Ribonuclease H	Takara	2150A	Digestion of RNA after cap-trapping.
RNase ONE Ribonuclease	Promega	M4261	Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free	VWR	AAJ63669-AK	Or any nuclease (DNase and RNase) free solution
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free			Or any nuclease (DNase and RNase) free solution
Sodium periodate	Sigma-Aldrich	311448-100G	Oxidation of vicinal diols
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 μL, Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719390-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1,000 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719463-1000EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719412-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719447-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
SpeedVac Vacuum Concentrator			concentrating samples in various steps to lower volume
SuperScript III Reverse Transcriptase	ThermoFisher Scientific	18080044	Used for reverse transcription (1st CAGE step)
Trehalose/sorbitol solution			Preparation is described in Murata et al. 2014.
Tris-HCl, 1 M aq.soln, pH 8.5			1 M solution, DNase and RNase free
tRNA (20 mg/mL)			tRNA solution. Preparation is described in Murata et al. 2014.
UltraPure Low Melting Point Agarose	ThermoFisher Scientific	16520050	Or any suitable pure low-melt agarose.
USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)	Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)	78390500UN
USER Enzyme	NEB	M5505S	Degradation of 3'linker's upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme
Vaccinia Capping System	NEB	M2080S	Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules
Wash buffer A			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.
Wash buffer B			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.
Wash buffer C			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.