Summary
هنا، نعرض الإمكانات العلاجية للالعدلات المضادة للأوعية المرتبطة بالورم بعد نقلها إلى الفئران الحاملة للورم. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتعامل مع نشاط العدلات في الجسم الحي السابق ولتقييم وظائفها في الجسم الحي في تطوير الأورام. وهو نموذج مناسب لدراسة العلاجات المناعية المحتملة القائمة على العدلات.
Abstract
مساهمة العدلات في تنظيم تكوين الأورام هو الحصول على مزيد من الاهتمام. هذه الخلايا غير متجانسة، واعتمادا على محيط الورم يمكن أن تمتلك القدرة المؤيدة أو المضادة للورم. واحدة من السيتوكينات الهامة التي تنظم وظائف العدلات في سياق الورم هي نوع I الإنترفيرون. في وجود الإنترفيرون، العدلات اكتساب خصائص مضادة للورم، بما في ذلك السمية الخلوية أو تحفيز الجهاز المناعي. وعلى العكس من ذلك، يؤدي عدم وجود إشارة الإنترفيرون إلى نشاط بارز مؤيد للورم، يتميز بالتحفيز القوي لتكوين الأوعية الدموية الورمي. في الآونة الأخيرة، يمكننا أن نثبت أن الخصائص المؤيدة للأوعية الدموية من العدلات تعتمد على تنشيط النيوتيناميد فوسفوريبوسيلترانسفيراز (NAMPT) إشارة المسار في هذه الخلايا. تثبيط هذا المسار في العدلات المرتبطة بالورم يؤدي إلى النمط الظاهري المضاد للأوعية الدموية قوية. هنا، نقوم بإظهار نموذجنا المنشأ حديثاً الذي يسمح في تقييم الجسم الحي للإمكانات الورمية للالعدلات المرتبطة بالأورام (TANs). قريبا، يمكن عزل العدلات المرتبطة بالأورام المؤيدة للأوعية من الفئران التي تعاني من نقص الإنترفيرون ويعاد استقطابها إلى النمط الظاهري المضاد للأوعية من خلال حجب إشارات NAMPT. ويمكن تقييم النشاط الوعائي لهذه الخلايا في وقت لاحق باستخدام فحص حلقة الأبهر. يمكن نقل TANs المضادة للأوعية إلى متلقي النوع البري الحامل للورم وينبغي مراقبة نمو الورم لمدة 14 يوما. في اليوم 14 يتم التضحية الفئران، وإزالة الأورام وقطع مع تقييم الأوعية الدموية الخاصة بهم. بشكل عام، يوفر بروتوكولنا أداة جديدة لتقييم القدرة الوعائية للخلايا الأولية في الجسم الحي، مثل العدلات المرتبطة بالورم، دون الحاجة إلى استخدام نماذج خط الخلايا الاصطناعية في العدلات. Vc
Introduction
النوع الأول الإنترفيرون (IFNs) تلعب دورا هاما في تحفيز ردود المضيف على الأورام، كما أن عدم وجود نوع I IFN إشارات النتائج في ارتفاع كبير في نمو الورم1. واحدة من الآليات المشاركة في هذه العملية هو تنظيم النشاط الورمي من العدلات المرتبطة بالورم، والتي يتم التحكم فيها من قبل مستعمرة تحفيز عامل 3 مستقبلات (CSF3R) المصب إشارة2. وقد تبين أن عامل تحفيز المستعمرة 3 (CSF3)، أو عامل تحفيز مستعمرة المحببات، لتنشيط الإشارات التي تنطوي على نيكوتيناميد فوسفوريبوسيلترانسفيراز (NAMPT)3،4. NAMPT هو إنزيم الحد من معدل لتوليف الأدينين الدينوكليوتيد نيكوتيناميد, الذي يعزز تحلل الدم وتنظيم إصلاح الحمض النووي, التعبير الجيني, واستجابة الإجهاد تعزيز الخلايا السرطانية البقاء على قيد الحياة وانتشار5. يتم الإفراط في NAMPT في أنواع السرطان متعددة، بما في ذلك القولونوالمستقيم، المبيض، الثدي، المعدة، سرطان البروستاتا والأورام الدبقية 6. NAMPT ضروري ليس فقط للخلايا السرطانية، ولكن أيضا لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا الأخرى الموجودة في الأورام، مثل الخلايا النخاعية - فإنه يدفع تمايزها4،ويمنع المبرمج وتحفيز التعبير عن السيتوكينات متعددة أو مصفوفة الانزيمات المهينة في الضامة7.
يمثل العدلات المرتبطة بالورم المغيرين اتلاف نمو الورم. وظائف تان تعتمد بشدة على توافر نوع IIFN، وهذه السيتوكينات الرئيسية النشاط المضادة للورم من العدلات. على العكس من ذلك، فإن غياب IFNs يدعم تنشيط الورم من هذه الخلايا، وخاصة خصائصها المؤيدة للأوعية الدموية. وبالاتفاق مع ذلك، فإن الفئران التي تعاني من نقص في الشبكات الدولية للأمراض تتطور إلى أورام الأوعية الدموية الأكبر بشكل كبير وأفضل، والتي يتم اختراقها بقوة مع العدلات المؤيدة للأورام/المؤيدة للأوعية الدموية1،2،8، 9،10. والأهم من ذلك، أن هذه النفثالينات المضادة للأوعية تظهر نشاطًا مرتفعًا من NAMPT، مما يشير إلى دورها الأساسي في استقطاب العدلات المؤيد للورم.
استنفاد العدلات باستخدام الأجسام المضادة Ly6G أو تثبيط هجرتهم (CXCR2 الأجسام المضادة) يؤدي إلى انخفاض تكوين الأوعية الدموية الورم, النمو, والنقيل1,8. ومع ذلك, ولدت الأجسام المضادة أحادية النسيلة هي المناعية, ويرتبط إدارتها مع مجموعة من الآثار الجانبية التي تهدد الحياة11. العلاج مع جزيئات صغيرة، مثل مثبطات NAMPT FK866، أن تعدل الورم العدلات، يمكن أن تساعد على تجنب مثل هذه المضاعفات. لسوء الحظ, تثبيط الجهازية الدوائية من NAMPT, بجانب تأثيرها العلاجي على نمو الورم, يؤدي إلى آثار جانبية شديدة بما في ذلك سمية الجهاز الهضمي ونقص الصفيحات. ولذلك، فإن التطبيق المنهجي لمثبطات NAMPT غير ممكن12،13،14.
ولهذا السبب، نقترح هنا بروتوكولاً يتم فيه حظر نشاط حركة عدم الانحياز مباشرة في شبكات الاتصال المحلية المعزولة. ثم يتم نقل هذه العدلات المضادة للورم بالتبني إلى مضيف تحمل الورم. وسيساعد هذا البروتوكول على تجنب الآثار الجانبية السمية النظامية للمركبات، في حين أن تأثيره على الخلايا المستهدفة سيستمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت السلطات التنظيمية على جميع الإجراءات بما في ذلك المواضيع الحيوانية: LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) وRegierungspräsidium Tübingen, Germany. وينبغي أن يتم إجراء جميع التلاعب في ظروف معقمة (تحت غطاء تدفق laminar) باستخدام الكواشف المعقمة والأدوات (المحاقن، مقص، ملقط، مشرط المتاح، أطباق بيتري).
ملاحظة: يظهر المخطط العام للبروتوكول في الشكل 1.
1. إعداد خط الخلايا الميلانينية B16F10
- إعداد الخلايا السالبية السلبية نمت إلى 90٪ أحادية الطبقات confluent (حوالي 10 × 106 خلايا / T75 قارورة) في كامل اسكوف تعديل Dulbecco المتوسطة (IMDMc: IMDM + 10٪ المصل البقري الجنيني (FBS) + 1٪ البنسلين-ستربيثيميسين).
- إزالة المتوسطة، وشطف الخلايا مع الفوسفات المخزنة المالحة المخزنة (PBS). تطبيق 6 مل من محلول مفرزة الخلية التي تحتوي على إنزيمات بروتيوليتيك وعلمة (انظر جدولالمواد)، وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- ضرب قارورة بلطف لتعبئة الخلايا الملتصقة المتبقية من أسفل. جمع تعليق الخلية في أنابيب 15 مل والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 7 دقائق و 20 درجة مئوية.
- إزالة supernatant، وإعادة تعليق بيليه جيدا في 1 مل من PBS. إضافة 14 مل من PBS والطرد المركزي (300 × ز و 20 درجة مئوية لمدة 7 دقائق).
- إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من PBS.
- عد الخلايا ثم إعادة تعليقها إلى تركيز 3 × 106/mL PBS (للخطوة 2) أو 6 × 106/mL PBS (للخطوة 6) للحقن. إبقاء الخلايا على الجليد لمدة أقصاها 30 دقيقة.
2. نموذج الورم المسبب للسرطان في الفئران
- استخدام 10 الإناث Ifnar1-/- الفئران 8-12 أسابيع من العمر التي يتم الاحتفاظ بها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF).
ملاحظة: الفئران الإناث هي الأفضل في نموذج تحت الجلد من نمو الورم، لأن الذكور هم أكثر عدوانية وبالتالي عرضة لمخالفات موقع الورم، مما يؤثر على نمو الورم. - انزعي جلد الفأر على الجناح بماكينة ماكينة نقل كهربائية، وطهر الجلد بأنسجة مبللة بالإيثانول بنسبة 70%.
- جمع خلايا الورم الميلانيني B16F10 أعدت بتركيز 3 × 106/مل PBS (انظر الخطوة 1) في حقنة 1 مل و إبرة 0.4 × 19 ملم. حقن 100 مل من تعليق تحت الجلد.
- خلط الخلايا جيدا قبل كل حقن. استخدام الإبر لا تقل عن 0.4 ملم في القطر كما أن عدم إزعاج الخلايا السرطانية.
- وضع ما يصل إلى 5 الفئران في قفص واحد، والسيطرة على حجم الورم (الطول والعرض والعمق) مع الفرجار لمدة 14 يوما.
ملاحظة: وفقا للوائح الحيوان، يجب أن لا يتجاوز حجم الورم 15 ملم في القطر، وينبغي التضحية الفئران مع أكبر أو نخر / الأورام المفتوحة مسبقا. - في اليوم 14، التضحية الفئران في غرفة CO 2.
- تطهير الجلد مع الإيثانول 70٪ وإزالة الأورام مع مقص وملقط في طبق بيتري معقمة. الحفاظ على الأورام في أنبوب 50 مل في دولبيكو كاملة تعديل النسر المتوسط (DMEMc: DMEM + 10٪ FBS + 1٪ البنسلين-ستربيتوميسين) على الجليد.
3. تان العزلة
- ضع الأورام في لوحات معقمة 6 آبار، 5 أورام لكل بئر. قطع الأورام إلى قطع 2-3 ملم مع مقص معقم.
- هضم مع 1 مل من ديسباس / كولاجيناز D / DNase الأول الحل (0.2 ملغ / 0.2 ملغ / 100 ملغ في 1 مل من DMEMc) لكل ورم. حضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 في حاضنة رطبة، ومزيج مع حقنة 10 مل دون إبرة كل 15 دقيقة 3 مرات.
- لإزالة الألياف غير المهضومة، خلايا الشبكة من خلال مرشحات 100 ميكرومتر في أنابيب 15 مل (بئر واحد لكل مرشح لكل أنبوب). إضافة PBS إلى 15 مل، أنابيب الطرد المركزي في 460 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة supernatant.
- خلايا الحريث مع عازل اللليس (NH4Cl 150 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 0.1 m, pH 7.3, 20 °C) بإضافة 1 مل في كل أنبوب. يُمزج المزيج جيّداً، ويُمزج بين الحل من جميع الأنابيب في أنبوب واحد. وقف رد الفعل بعد 2 دقيقة مع 11 مل من الجليد البارد (4 درجة مئوية) DMEMc.
- الطرد المركزي في 460 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة supernatant. إعادة تعليق بيليه مع 15 مل من PBS الباردة. الطرد المركزي في 460 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة supernatant.
- إعادة تعليق بيليه في 1 مل من PBS. إضافة 3 مل من الأجسام المضادة كتلة Fc (CD16/CD32، المخزون 0.5 ملغ / مل)، وحضانة على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- إضافة الأجسام المضادة: 10 مل من Ly6G-PE (المخزون 0.2 ملغ / مل) و 10 مل من CD11b-APC (المخزون 0.2 ملغ / مل). إضافة 20 مل من 6-دياميدين-2-فينيليندول صبغة الصلاحية (DAPI، مخزون 5 ملغ / مل) وحضانة على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: يمكن استخدام مزيج آخر من الأصباغ صلاحية وكدمات الفلورسنت من الأجسام المضادة. - إضافة PBS تصل إلى 15 مل، الطرد المركزي في 460 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة supernatant.
- إعادة تعليق بيليه في DMEMc إلى تركيز ما يقرب من 10 × 106/ مل، والحفاظ على الجليد.
- فرز CD11b+ Ly6Gمرحبا على قيد الحياة (DAPI-السلبية) العدلات مع فارز الخلية تنشيط الفلورة (استراتيجية gating انظر الشكل 2).
ملاحظة: الحفاظ على أنبوب مع تعليق الخلية وأنبوب مع DMEMc للخلايا فرزها في 4 درجة مئوية. استخدم إعدادات الفرز المثلى التالية: فوهة 70 مم، ومعدل عتبة أقصى 22000 حدث/ثانية ومعدل تدفق 1-3. - تحقق من نقاء العدلات فرزها باستخدام مقياس السيتومتر لنقاء الموصى بها من > 95٪.
- الطرد المركزي فرز العدلات في 460 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة supernatant. إعادة تعليق الخلايا التي تم فرزها في DMEMc إلى تركيز 1 × 106/mL.
ملاحظة: العدد المتوقع من العدلات في ورم واحد 14 يوما B16F10 (10 مم قطر) هو ما يقرب من 3 × 104 الخلايا.
4. تثبيط NAMPT في TANs في المختبر
- إعداد مخزون FK866 (مثبطات NAMPT) في ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) بتركيز نهائي قدره 100 mM.
- فرز البذور العدلات (الخطوة 3.11) في 2 الآبار من لوحة U-أسفل 96 جيدا (1.5 × 105 العدلات / جيدا). إضافة FK866 في التدخل جيدا (التركيز النهائي من 100 nM)، وكمية متساوية من DMEMc مع DMSO في السيطرة بشكل جيد. حضانة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 في حاضنة رطبة.
- الطرد المركزي في 460 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة supernatant. إعادة تعليق في 200 مل من PBS في كل بئر. كرر مرتين.
- الطرد المركزي في 460 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة supernatant. إعادة تعليق في المتوسطة نمو الخلايا البطانية التجارية (تستكمل مع 4 ميكرولتر / مل ملحق نمو الخلايا البطانية، 0.1 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة البشرية المؤتلف، 1 نانوغرام / مل عامل نمو الليفي الأساسية البشرية المؤتلف، 90 ميكروغرام / مل هيبارين و 1 ميكروغرام / مل هيدروكورتيزون) إلى تركيز نهائي من 0.2 × 106 خلايا /مل (في 0.75 مل) (للخطوة 5) أو في PBS إلى التركيز النهائي من 0.6 × 106 خلايا / مل (في 0.25 مل) (للخطوة 6).
5- تقدير الخصائص الوعائية للنفثالينات المضادة للأنسان باستخدام اختبار الحلقة الأبهرية
- تشريح الأبهر الصدري من فأر C57BL/6J (WT). تنظيف وقطع إلى حلقات عرض 0.5 ملم. ضع جميع الحلقات في بئر من لوحة 24 جيدا مع 1 مل من المتوسطة مكملات نمو الخلايا البطانية. حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 في حاضنة رطبة.
ملاحظة: استخدام الشباب (أصغر من 8 أسابيع) الفئران الذكور لتشريح الشريان الأبهرهو الأفضل، لأنها تعطي استجابة وعائية أكثر قوة15. - ملء الآبار من لوحة 96 جيدا مسطحة القاع مع 50 درجة مئوية من مصفوفة غشاء الطابق السفلي الذوبان، والسماح للهلام تعيين لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة الرطبة للسماح للمصفوفة للبلمرة. إعداد ما لا يقل عن 3 آبار لكل شرط.
- تضمين الحلقات في مصفوفة غشاء الطابق السفلي solubilized عن طريق وضع حلقة الأبهر على الجزء العلوي من طبقة مصفوفة صلبة، 1 حلقة في وسط كل بئر. إضافة 50 ميكرولتر أخرى من مصفوفة غشاء الطابق السفلي الذوبان لتغطية كل حلقة.
- ضع اللوحة في حاضنة رطبة بمقدار 37 درجة مئوية، و5% ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة أخرى للسماح ببلمرة طبقة المصفوفة الثانية.
- إضافة 150 مل / جيدا من المتوسطة النمو الخلية البطانية التكميلية المتوسطة و 2X104Ifnar1-/- TANs (التحكم وFK866-المعالجة) (الخطوة 4.4).
- حضانة لوحة لمدة 14 يوما في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 في حاضنة رطبة.
- صورة باستخدام مجهر معيار المرحلة التباين وتقدير التفريع البطانية. ويمكن إجراء التقييم الكمي للبارامترات المورفومترية والمكانية للسفينة بما في ذلك مؤشر المتفرعة تلقائيا باستخدام برنامج معالجة الصور المصمم للصور العلمية.
ملاحظة: يتم تصوير النتائج التمثيلية في الشكل 3.
6. نقل بالتبني من العدلات المعالجة في نموذج الورم اللاجيني
- إعداد خلايا الورم الميلانيني B16F10 (الخطوة 1.6) في PBS بتركيز 6 × 106 خلايا / مل.
- إعداد 2 أنواع من العدلات: العدلات المعالجة FK866 والسيطرة على العدلات غير المعالجة (الخطوة 4.4) في PBS في تركيز 6 × 105 خلايا / مل. مزيج العدلات مع خلايا الورم الميلانيني B16F10 (العدلات النهائية إلى نسبة الخلايا السرطانية 1:10) أن يكون 2 أنواع من خليط الخلايا.
- خذ 10 فئران WT الإناث 8-12 أسابيع من العمر، 5 في كل مجموعة. انزعي الجلد على الجناح بآلة نقل كهربائية، وطهر مع الإيثانول بنسبة 70%.
- حقن 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (الخطوة 6.2) تحت الجلد مع حقنة الأنسولين وإبرة قطرها 0.4 ملم، لكلا المجموعتين من الفئران. ضع 1-5 فئران من نفس المجموعة في قفص واحد.
- في اليوم 2، إعداد 2 أنواع من العدلات: FK866-المعالجة العدلات والسيطرة على العدلات غير المعالجة (الخطوة 4.4) في PBS في تركيز 6 × 105 خلايا / مل. حقن 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (الخطوة 6.4) i.v. في الوريد الذيل مع حقنة الأنسولين وإبرة قطرها 0.4 ملم، لكلا المجموعتين من الفئران. ضع الفئران في القفص
7. قياس نمو الورم، الفحص النسيجي
- مراقبة نمو الورم كل يومين. تقييم حجم الورم مع الفرجار وحساب حجم الورم مع الصيغة V = 4 /3 * * (ح * ث2) / 8 (ح = الارتفاع ، ث = العرض ، العمق = العرض).
- التضحية الفئران في اليوم 14 في غرفة CO 2. إزالة الأورام وقياس أوزان الورم.
- تجميد الأورام في مجمع درجة الحرارة القطع الأمثل في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- إذابة العينات إلى -20 درجة مئوية وإعداد أقسام 5 مم باستخدام cryotome. دع الكريوكوتس يجف لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية. إصلاح المقاطع في -20 درجة مئوية الأسيتون الباردلمدة 2 دقيقة والسماح لها الجافة لمدة 30 دقيقة في 20 درجة مئوية.
- كتلة مع الأجسام المضادة Fc كتلة (CD16/CD32، المخزون 0.5 ملغ / مل 1:500) في PBS لمدة 1 ساعة عند 20 درجة مئوية.
- وصمة عار مع الأرنب المضادة للماوس لامينين غاما الأجسام المضادة (1:1500 في PBS، 200 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة في 20 درجة مئوية. غسل مع PBS ثلاث مرات.
- وصمة عار مع الأجسام المضادة للزعنالثانوية المضادة للأرنب (الأسهم 0.5 ملغ / مل، 1:400 في PBS،)، αSMA المضادة للماوس (1:500 في PBS) و 2 ميكرولتر من DAPI (المخزون 5 ملغ / مل، 1:100 في PBS) في حجم نهائي من 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة. حضانة لمدة 1 ساعة عند 20 درجة مئوية في الظلام. غسل مع PBS ثلاث مرات.
- الشرائح الجافة لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية في الظلام. جبل مع المتوسطة تصاعد اللامائية للميكروسكوب وتغطية مع غطاء. دعيه يجف 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
- إجراء فحص مجهري. قياس الأوعية الدموية عن طريق حساب العدد الإجمالي (منطقة اختياريا) من لامينين+ السفن وعدد (منطقة) SMA+ السفن المتقدمة.
ملاحظة: لإجراء تحليل الصورة، خذ كافة الصور بنفس الظروف (الضوء والتباين والتكبير). في هذه الحالة، يتم إصلاح معلمات المعالجة، وتصبح معالجة الصور تلقائية تمامًا. وترد النتائج التمثيلية في الشكل 4 والشكل 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الإجراء الموضح هنا، تم عزل العدلات Ifnar1-/- من الأورام وعولجت مع مثبطات NAMPT FK866 لمدة 2 ح. تم استخدام Ifnar1 غير المعالجة -/- العدلات كسيطرة. تم تقييم تأثير العلاج باستخدام فحص الحلقة الأبهرية، الذي يعكس الخطوات الرئيسية التي ينطوي عليها تكوين الأوعية الدموية (تدهور المصفوفة، والهجرة، والانتشار، وإعادة التنظيم). يمكننا أن نثبت أن العدلات المعالجة FK866 لديها قدرة منخفضة بشكل ملحوظ لتحفيز تشكيل فرع الأبهر، بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة (الشكل3A،3B). تم حقن العدلات المضادة للأوعية المضادة للأوعية FK866 في الفئران الحاملة للورم (في اليوم 0 الجناح واليوم 2 i.v.). يمكننا أن نلاحظ ضعف كبير في نمو الورم، بالمقارنة مع الفئران حقن مع Ifnar1 غير المعالجة -/- العدلات (الشكل4A،4B). أثبت الفحص النسيجي للأورام المستخرجة القمع الكبير لتكوين الأوعية الدموية في الأورام المعزولة من الفئران المعالجة بالنفثالينات المعالجة بـ FK866، مقارنة بالأمراض التي تم حقنها بـ Ifnar1-/- العدلات غير المعالجة ( الشكل 5 ألف ،B).
الشكل 1 مخطط البروتوكول. الخطوة 1. إعداد خط الخلايا الميلانينية B16F10; 2. نموذج الورم المسبب للسرطان في الفئران؛ 3. عزل TANs من الأورام؛ 4- تثبيط النفثالينات غير المناوبية في النفثالينات في المختبر؛ 5 - تقدير الخصائص الوعائية للنفثالينات المضادة للأنسانات في اختبار الحلقة الأبهرية؛ 6. نقل بالتبني من العدلات المعالجة في نموذج الورم اللاجيني؛ 7. رصد نمو الورم، فحص النسيج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 استراتيجية التجمع لفرز TANs. يتم فرز CD11b+ Ly6Gمرحبا العدلات الحية من الأورام مع نقاء ≥ 95٪. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 قمع الخصائص الوعائية من TANs بعد العلاج FK866. تم تقدير الخصائص الوعائية للIfnar1-/-TANs المعالجة مع FK866 أو مع المتوسطة باستخدام الأورتا رنين التصوّر. تم رصد تشكيل الفرع خلال 14 يوما، يتم عرضالنتائج التمثيلية في اليوم 14 (A). العلاج مع FK866 انخفض بشكل ملحوظ عدد فروعالبطانة (B). وتظهر البيانات كمتوسط، ونطاق بين الأرباع والحد الأدنى، * p<0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 تأخر نمو الورم بعد نقل بالتبني من العدلات FK866 المعالجة. تم تقييم تأثير TANs على نمو الورم. تم عزل TANs، وعولجت مع FK866 وحقنها في الفئران الحاملة للورم كما هو موضح أعلاه. في اليوم 14 تم التضحية الفئران، وإزالة الأورام وتحليلها. Ifnar1-/- تمت مقارنة TANs المعالجة مع FK866 مقابل الضوابط. (أ) تم قياس نمو الورم ، (ب) كتلة الورم و (ج) تم تقدير حجم. وتظهر البيانات كمتوسط، ونطاق بين الأرباع والحد الأدنى، * p<0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 قمع الأوعية الدموية الورم بعد نقل بالتبني من العدلات FK866 المعالجة. تم عزل الأورام كما هو موضح أعلاه (الشكل 4). تم تقييم نضج السفينة باستخدام الأجسام المضادة للSMA (السفن الناضجة) واللامينين المضاد لأشعة غاما (الخلايا البطانية). (أ) يظهر تلطيخ تمثيلي للأورام: SMA (أخضر)، لامينين (أحمر). قضبان الحجم: 50 درجة مئوية. (ب) يتم عرض القياس الكمي للأوعية الدموية الورم بعد نقل بالتبني من TANs المزروعة مع FK866 (الأخضر) أو المتوسطة (الأحمر) البيانات كما متوسط، ومجموعة بين الأرباع والحد الأدنى، * p<0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من التقدم المحرز في علاج السرطان الجراحي والدوائي، لا يزال العلاج الناجح يشكل تحديا. وبما أن الخلايا المناعية معروفة بلعب دور هام في تنظيم نمو الورم، ينبغي إنشاء أساليب جديدة تمنع الورم في هذه الخلايا. هنا نبرهن على نهج جديد لقمع نمو الورم عن طريق نقل بالتبني من العدلات المضادة للأوعية المرتبطة الورم. الاستهداف الانتقائي للإشارات الـ NAMPT المضادة للأوعية في TANs، باستخدام مثبطات FK866، يمنع الآثار الجانبية، التي لوحظت عند العلاج الجهازي FK866.
الجزء الأكثر أهمية من البروتوكول هو الحاجة إلى استخدام العدلات الأولية المعزولة حديثا. العدلات هي خلايا قصيرة الحياة، تخضع للالمبرمج أو تنشيطها أثناء إجراء العزلة. يجب الاحتفاظ بالعدلات المورين في وسائل الإعلام 4 درجة مئوية خلال جميع خطوات العزلة، بما في ذلك فرز الخلايا. وينبغي إجراء عزل العدلات في أقرب وقت ممكن، وينبغي عدم توقف التجربة. استخدام كتلة Fc يسمح الحد من تلطيخ غير محدد من الخلايا مع التعبير عالية مستقبلات Fc، مثل خلايا NK. نوصي أيضا لتقليل عدد الأجسام المضادة الفلورية المترافقة لتبسيط استراتيجية gating وتجنب تفعيل العدلات بسبب ربط الأجسام المضادة.
الخطوة المقيدة للبروتوكول هي عزل العدلات الحية من الأورام بسبب كمية منخفضة نسبيا من هذه الخلايا في الأورام (لا يزيد عن 1٪ من الخلايا الحية واحدة في الورم الميلانيني). قد يكون هذا ممكناً فقط باستخدام الفرز المستند إلى قياس التدفق. في الوقت نفسه ، يجب تجنب استخدام العدلات الدم لهذا البروتوكول بسبب التنظيم الطفيف فقط للتعبير NAMPT ووظائفها المنخفضة ، والتي يتم تغييرها عند وصول أنسجة الورم16. ربما، من أجل استخدام العدلات الدم، ينبغي أن تكون نشطة سابقا باستخدام عوامل النمو المستمدة من الورم.
لتجنب التوديع العدلات ، يقترح العلاج القصير مع FK866 (2-4 ح) ، كما أنه ليس له تأثير على صلاحية TANs ، في حين أن العلاج لفترات طويلة يحفز العدلات المبرمج16. وباختصار، يوضح البروتوكول إمكانية التلاعب في المختبر السابق بالعدلات المضادة للأوعية الدموية لقمع نمو الورم وظيفيا في نموذج الورم الميلانيني للماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم عملنا بمنح من دويتشه كريبسيليف، رقم المنحة: 111647، ومجلس البحوث الألماني (DFG)، رقم المنحة: JA 2461/2-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
