Summary
在这里,我们展示了抗血管性肿瘤相关中性粒细胞转移到肿瘤小鼠后的治疗潜力。该协议可用于操纵体内的嗜中性粒细胞活性,并随后评估其在体内的肿瘤发展功能。它是研究潜在的中微粒细胞免疫疗法的适当模型。
Abstract
中性粒细胞对肿瘤发生调节的贡献越来越受到重视。这些细胞是异质的,根据肿瘤环境可以具有亲或抗肿瘤的能力。调节肿瘤环境中中性粒细胞功能的重要细胞因子之一是I型干扰素。在干扰素的存在下,嗜中性粒细胞获得抗肿瘤的特性,包括细胞毒性或免疫系统的刺激。相反,缺乏干扰素信号导致突出的亲肿瘤活性,其特征是肿瘤血管生成的强烈刺激。最近,我们可以证明,嗜中性粒细胞的亲血管生成特性取决于这些细胞中烟酰胺磷酸二酯转移酶(NAMPT)信号通路的激活。抑制肿瘤相关中性粒细胞的这一途径导致其强大的抗血管生成表型。在这里 , 我们演示了我们新建立的模型 , 允许在体内评估纵的肿瘤相关中性粒细胞 ( TAN ) 的肿瘤生成潜力。不久,亲血管性肿瘤相关中性粒细胞可以从肿瘤产生干扰素缺乏的小鼠中分离出来,并通过阻断NAMPT信号,重新极化为抗血管生成表型。这些细胞的血管生成活性随后可以使用主动脉环测定进行评估。抗血管生成性TAN可转移到肿瘤携带野生型受体中,肿瘤生长应监测14天。在第一天,14只小鼠被牺牲,肿瘤被切除,并经过血管化评估。总体而言,我们的方案提供了一种新的工具,用于在体内评估原发细胞(如肿瘤相关中性粒细胞)的血管生成能力,而无需使用人工中性粒细胞系模型。Vc
Introduction
I型干扰素(IFN)在刺激宿主对肿瘤反应方面起着重要作用,因为I型IFN信号的缺乏导致肿瘤生长显著升高1。这个过程所涉及的机制之一是肿瘤相关嗜中性粒细胞的肿瘤原生活性的调节,由菌群刺激因子3受体(CSF3R)下游信号2控制。结肠刺激因子3(CSF3),或粒细胞位细胞刺激因子,被证明激活涉及烟酰胺磷酸酯转移酶(NAMPT)3,4的信号。NAMPT是一种控制速率的酶,用于烟酰胺腺苷二核苷酸合成,它增强糖解,调节DNA修复、基因表达和应激反应,促进癌细胞生存和增殖5。NAMPT在多种癌症类型中过度表达,包括结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和胶质瘤6。NAMPT不仅对肿瘤细胞至关重要,而且对肿瘤中存在的多种其他细胞类型(如骨髓细胞)也至关重要,它驱动其分化4,抑制凋亡,刺激多种细胞因子的表达,或巨噬细胞中的基质降解酶7。
肿瘤相关中性粒细胞是肿瘤生长的重要调节剂。TAN功能严重依赖I型IFN可用性,因为这些细胞因子主要抗中性粒细胞的抗肿瘤活性。相反,IFN的缺乏支持这些细胞的肿瘤激活,尤其是其亲血管生成特性。与这一点一致,缺乏IFN的小鼠会发展出明显更大和更好的血管化肿瘤,这些肿瘤被强效与亲肿瘤/亲血管性中性粒细胞1,2,8, 9,10.重要的是,这种亲血管化的TAN显示NAMPT的活性升高,表明它在中性粒细胞的亲肿瘤极化中的重要作用。
使用Ly6G抗体消耗中性粒细胞或抑制其迁移(CXCR2抗体)会导致肿瘤血管生成、生长和转移减少1,8。然而,产生的单克隆抗体是免疫原性的,其管理与一系列危及生命的副作用11相关。使用小分子(如NAMPT抑制剂FK866)进行调节中性粒细胞肿瘤原性的治疗,可以帮助避免此类并发症。不幸的是,NAMPT的药理系统抑制,旁边其对肿瘤生长的治疗作用,导致严重的副作用,包括胃肠道毒性和血小板减少症。因此,NAMPT抑制剂的系统应用是不可行的12,13,14。
因此,我们在此建议一种协议,其中 NAMPT 活动直接在隔离的 AN 中被阻止。这种抗肿瘤中性粒细胞然后被收养转移到肿瘤宿主。该协议将有助于避免化合物的系统性毒性副作用,同时其对靶细胞的影响将持续下去。
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Protocol
所有程序,包括动物主体都已得到监管机构的批准:LANUV(Landesamt für Natur,Umwelt und Verbraucherschutz NRW)和德国的雷吉隆斯普雷西迪·蒂宾根。所有操作应在无菌条件下(在层流罩下)使用无菌试剂和仪器(注射器、剪刀、钳子、一次性手术刀、培养皿)进行。
注:协议的总体方案如图1所示。
1. 制备B16F10黑色素瘤细胞系
- 在完整的Iscove的改性Dulbeco的介质(IMDMc:IMDM = 10%胎儿牛血清(FBS)= 1%青霉素-链霉素)中制备支原体阴性细胞,生长成90%的共通单层(约10 x 106细胞/T75烧瓶)。
- 取出培养基,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞。应用含有蛋白解和胶原蛋白解酶的细胞分离溶液6 mL(见材料表),在37°C孵育2分钟。
- 轻轻敲击烧瓶,从底部调集剩余的粘附细胞。在15 mL管中收集细胞悬浮液,在300 x g下收集离心机7分钟和20°C。
- 去除上清液,并在 1 mL 的 PBS 中重新悬浮颗粒。加入14 mL的PBS和离心机(300 x g和20°C 7分钟)。
- 去除上清液,在 1 mL 的 PBS 中重新悬浮颗粒。
- 计数细胞,并将其重新悬浮到3 x 106/mL PBS(步骤2)或6 x 106/mL PBS(步骤6)的浓度注射。将细胞放在冰上最多30分钟。
2. 小鼠过敏性肿瘤模型
- 使用10只雌性Ifnar1-/- 8-12周大小鼠,这些小鼠在无特定病原体(SPF)条件下保存。
注:雌性小鼠在肿瘤生长的皮下模型中更可取,因为雄性小鼠更具攻击性,因此容易发生肿瘤部位的违规,从而影响肿瘤生长。 - 用电动护身板将鼠标皮肤在侧翼上,用70%乙醇湿纸巾对皮肤进行消毒。
- 在1mL注射器和0.4 x 19 mm针头中收集制备的B16F10黑色素瘤细胞,浓度为3 x 10 6/mL PBS(参见步骤1)。下皮注入100 mL的悬架。
- 每次注射前,将细胞混合。使用直径不小于0.4毫米的针头,以免干扰肿瘤细胞。
- 将最多 5 只小鼠放在一个笼子里,用卡钳控制肿瘤大小(长度、宽度和深度)14 天。
注:根据动物规定,肿瘤大小不应超过15毫米直径,具有较大或坏死/开放肿瘤的小鼠应事先牺牲。 - 第14天,在CO2室中牺牲老鼠。
- 用70%乙醇消毒皮肤,用剪刀和钳子在无菌培养皿中去除肿瘤。将肿瘤保存在50 mL管中,在完全的Dulbeco的改性鹰介质(DMEMc:DMEM = 10% FBS = 1% 青霉素-链霉素)的冰上。
3. TAN 隔离
- 将肿瘤放入无菌的6孔板中,每孔5个肿瘤。用无菌剪刀将肿瘤切成2-3毫米。
- 每个肿瘤的消化液为1 mL的消酶/胶原酶D/DNase I溶液(0.2毫克/0.2毫克/100毫克,DMEMc的1mL)。在37°C下孵育,在潮湿的培养箱中孵育5%的CO2,每15分钟3次与10 mL注射器混合,不带针头。
- 要去除未消化的纤维,通过100μm过滤器将网状细胞放入15 mL管中(每个管每个过滤器一口井)。将PBS加入15 mL,在460 x g下加入离心管,4°C5分钟,并去除上清液。
- 具有溶化缓冲液的溶酶红细胞(NH4Cl 150 mM,KHCO3 10 mM,EDTA 0.1 mM,pH 7.3,20 °C),每管中加入 1 mL。混合好,并将所有管的溶液组合成一个。使用 11 mL 的冷冰 (4 °C) DMEMc 在 2 分钟后停止反应。
- 在460 x g,4°C下离心5分钟,并去除上清液。用 15 mL 的冷 PBS 重新悬浮颗粒。在460 x g,4°C下离心5分钟,并去除上清液。
- 将颗粒悬浮在 PBS 的 1 mL 中。加入3 mL的Fc-block抗体(CD16/CD32,库存0.5毫克/mL),并在冰上孵育15分钟。
- 添加抗体:10 mL 的 Ly6G-PE(库存 0.2 毫克/升)和 10 mL 的 CD11b-APC(库存 0.2 毫克/升/升)。加入20 mL的 6-Diamidin-2-phenyldol 活力染料 (DAPI, 库存 5 mg/mL), 在黑暗中在冰上孵育 30 分钟。
注:可以使用另一种可存活染料和荧光结合抗体的组合。 - 加入PBS高达15 mL,在460 x g下离心,4°C5分钟,并去除上清液。
- 将 DMEMc 中的颗粒重新悬浮到约 10 x 106/mL 的浓度,并保持在冰上。
- 使用荧光激活细胞分拣器对 CD11b进行排序 (Ly6GHi活着 (DAPI 阴性) 嗜中性粒细胞(门控策略参见图 2)。
注:将管与细胞悬浮液和DMEMc管保持在4°C的分拣细胞。使用以下最佳分拣设置:70 mm 喷嘴、最大 22,000 事件/秒阈值和 1-3 流速。 - 使用细胞仪检查已分拣的嗜中性粒细胞的纯度,其推荐纯度为>95%。
- 离心分粒粒细胞在460 x g,4°C5分钟,并去除上清液。将 DMEMc 中的已排序细胞重新悬浮到 1 x 106/mL 的浓度。
注:一个14天B16F10肿瘤(10毫米直径)中中性粒细胞的预期数量约为3 x 104细胞。
4. 体外TAN的NAMPT抑制
- 以100 mM的最终浓度制备二甲基二氧化硫(DMSO)中的FK866(NAMPT抑制剂)库存。
- 种子分类嗜中性粒细胞(步骤3.11)到2孔的96孔U底板(1.5 x 105嗜中性粒细胞/孔)。将 FK866 添加到干预井中(最终浓度为 100 nM),并将具有 DMSO 的同等数量的 DMEMc 添加到控制井中。在37°C下孵育2小时,在潮湿的培养箱中孵育5%CO2。
- 在460 x g,4°C下离心5分钟,并去除上清液。在每个井中重新悬浮在 200 mL 的 PBS 中。重复2次。
- 在460 x g,4°C下离心5分钟,并去除上清液。在商用内皮细胞生长培养基中重新悬浮(辅以4μL/mL内皮细胞生长补充剂,0.1纳克/mL重组人类表皮生长因子,1纳克/mL重组人类基本纤维细胞生长因子,90微克/mL肝素和1μg/mL氢皮质酮)到最终浓度为0.2 x 106细胞/mL(在0.75 mL中)(步骤5)或PBS中,最终浓度为0.6 x 106细胞/mL(在0.25 mL中)(步骤6)。
5. 使用主动脉环测定估计TAN的血管生成特性
- 从雄性C57BL/6J(WT)小鼠中切除胸主塔。清洁并切割成 0.5 mm 宽度的环。将所有环放入24孔板的井中,加1mL补充内皮细胞生长培养基。在潮湿的培养箱中,在37°C、5%CO2下孵育过夜。
注:使用年轻(小于8周)的雄性小鼠进行主骨解剖是可取的,因为它们给出一个更强大的血管生成反应15。 - 用50μL溶解的基底膜基质填充96孔平底板的孔,让凝胶在37°C、5%CO2潮湿培养箱中设置30分钟,使基质聚合。每个条件至少准备 3 口井。
- 通过将环放置在固体基质层顶部,在每个井的中心放置 1 环,将环嵌入溶解的基底膜基质中。再添加50μL的溶解基底膜基质,覆盖每个环。
- 将板置于 37°C、5%CO2潮湿培养箱中再放置 30 分钟,以便第二基质层聚合。
- 添加150 mL/孔补充内皮细胞生长培养基和 2x104Ifnar1-/- AN(控制和FK866处理)(步骤4.4)。
- 在37°C下孵育板14天,在潮湿的培养箱中孵育5%CO2。
- 使用标准相对比显微镜进行成像,并估计内皮分枝。利用为科学图像设计的图像处理程序,可以自动对容器形态和空间参数(包括分支索引)进行定量评估。
注:图3中描述了代表性结果。
6. 异源肿瘤模型中治疗中性粒细胞的采用转移
- 在PBS中制备B16F10黑色素瘤细胞(步骤1.6),浓度为6 x 106细胞/mL。
- 制备2种中性粒细胞:FK866处理的嗜中性粒细胞,在PBS中以6 x105细胞/mL浓度控制未经治疗的中性粒细胞(步骤4.4)。将嗜中性粒细胞与B16F10黑色素瘤细胞(最终嗜中性粒细胞与肿瘤细胞比1:10)混合,以有2种类型的细胞混合物。
- 取10只8-12周大的雌性WT小鼠,每组5只。用电动护身带护身皮肤,用70%乙醇消毒。
- 用胰岛素注射器和直径0.4毫米的针将细胞悬浮液(步骤6.2)分皮注射到两组小鼠。将同一组的1-5只小鼠放在一个笼子里。
- 在第2天,制备2种中性粒细胞:FK866处理的嗜中性粒细胞,并在PBS中以浓度6 x105细胞/mL控制未经治疗的中性粒细胞(步骤4.4)。用胰岛素注射器和直径0.4毫米的针将100μL细胞悬浮液(步骤6.4)i.v.注射到尾静脉,给两组小鼠。把老鼠放回笼子里
7. 肿瘤生长测量,组织学检查
- 每隔一天监测肿瘤的生长情况。使用卡钳评估肿瘤大小,使用公式 V=4/3+(h_w2)/8(h=高、w=宽度、深度= 宽度)计算肿瘤体积。
- 在CO2室第14天牺牲小鼠。去除肿瘤并测量肿瘤重量。
- 在液氮中冷冻最佳切割温度化合物中的肿瘤,并储存在-80°C。
- 将样品解冻至-20°C,并使用冷冻素制备5毫米截面。在20°C下,让冷冻切口干燥30分钟。将部分固定在-20°C冷丙酮中2分钟,并在20°C下干燥30分钟。
- 在PBS中用Fc-block抗体(CD16/CD32,库存0.5毫克/mL 1:500)在20°C下1小时。
- 与兔子抗小鼠拉米宁伽马抗体染色(PBS为1:1500,200μL),在20°C下1小时。用 PBS 清洗三次。
- 在200μL抗体溶液的最终体积中,与二级山羊抗兔抗体(库存0.5毫克/mL,PBS为1:400)、抗小鼠+SMA(PBS为1:500)和2μLDAPI(库存5mg/mL,PBS为1:100)染色。在黑暗中20°C孵育1小时。用 PBS 清洗三次。
- 在黑暗中20°C下干燥滑轨20分钟。安装无水安装介质,用于显微镜和盖板。在 37°C 下干燥 1 小时。
- 进行显微检查。通过计算拉米宁的总数(可选区域)和SMA和发达血管的数量(面积)来量化血管化。
注:要执行图像分析,请在同一条件下(光线、对比度、放大率)拍摄所有图像。在这种情况下,处理参数是固定的,图像处理将完全自动。具有代表性的结果如图4和图 5所示。
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Representative Results
使用此处描述的程序,Ifnar1 -/-嗜中性粒细胞从肿瘤中分离出来,并使用NAMPT抑制剂FK866治疗2小时。 使用主动脉环测定来评估治疗效果,这反映了血管生成(基质退化、迁移、扩散、重组)所涉及的关键步骤。我们可以证明,与未经处理的细胞相比,FK866治疗的嗜中性粒细胞刺激主动脉分支形成的能力显著下降(图3A,3B)。FK866治疗的抗血管性中性粒细胞被分皮注射到肿瘤小鼠中(第0天侧翼和第2天i.v.)。与注射未经治疗的Ifnar1-/-中性粒细胞的小鼠相比,我们可以观察到肿瘤生长严重受损(图4A,4B)。与注射未经治疗的Ifnar1-/-中性粒细胞相比,对提取的肿瘤进行组织学检查证明,从使用FK866治疗的TAN治疗的小鼠分离的肿瘤血管生成显著抑制。图 5A,B)。
图 1.协议的方案。步骤 1。制备B16F10黑色素瘤细胞系;2. 小鼠过敏性肿瘤模型;3. 从肿瘤中分离出TAN;4. 在体外TAN中抑制NAMPT;5. 主动脉环测定中TAN血管生成特性的估计;6. 异源肿瘤模型中治疗中微粒细胞的采用转移;7. 肿瘤生长监测,组织学检查。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.用于 TAN 排序的浇注策略。CD11b= Ly6GHi活中性粒细胞从纯度 +95% 的肿瘤中分类。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.FK866治疗后TAN的血管生成特性抑制。使用大方环测定法估计了使用FK866或介质处理的分类Ifnar1-/-TAN的血管生成特性。分枝在14天内进行了监测,14日当天的代表性结果呈报(A)。FK866治疗显著减少了内皮分枝(B) 的数量。数据显示为中位数、四分位数范围和最小值,[p<0.05。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.FK866治疗中性粒细胞的采用转移后肿瘤生长迟缓。评估了TAN对肿瘤生长的影响。TAN被分离,用FK866治疗,并注射到如上所述的肿瘤小鼠中。当天,14只老鼠被牺牲,肿瘤被切除并进行分析。Ifnar1-/- 比较了使用 FK866 与对照组处理的 TAN。(A) 测量了肿瘤生长, (B) 肿瘤质量估计 .数据显示为中位数、四分位数范围和最小值,[p<0.05。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5.FK866治疗中微粒细胞的采用转移后抑制肿瘤血管化。如上所述,肿瘤被隔离(图4)。使用抗SMA抗体(成熟血管)和抗伽马层蛋白(内皮细胞)评估血管成熟。(A) 肿瘤的代表性染色显示: SMA (绿色), 拉米宁 (红色).刻度条:50 μm。(B) 采用FK866(绿色)或中等(红色)数据的TAN培养后,肿瘤血管化的定量显示为中位数、四分位数范围和最小最大值,即[p<0.05]请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
尽管在外科和药理癌症治疗方面取得了进展,但成功的治疗仍然是一个挑战。由于免疫细胞在调节肿瘤生长方面起着重要作用,因此应建立抑制肿瘤原性的新方法。在这里,我们演示了一种通过抗血管性肿瘤相关中性粒细胞的接受转移来抑制肿瘤生长的新方法。使用FK866抑制剂,选择性地靶向TAN中的亲血管性NAMPT信号,可防止副作用,在全身FK866治疗时观察到副作用。
该协议最关键的部分是需要使用新鲜分离的原发性嗜血杆菌。嗜中性粒细胞是短活细胞,在隔离过程中经历凋亡或被激活。在所有隔离步骤(包括细胞分拣)中,应将嗜中性粒细胞保存在4°C培养基中。应尽快对嗜中性粒细胞进行分离,不应暂停实验。使用Fc-block可以减少具有高Fc受体表达的细胞的不特定染色,如NK细胞。我们还建议尽量减少荧光结合抗体的数量,以简化浇注策略,并避免由于抗体结合而激活中性粒细胞。
该协议的限制步骤是分离活着的嗜中性粒细胞从肿瘤,由于这些细胞在肿瘤中的数量相对较低(不超过黑色素瘤中单活细胞的1%)。这只能通过基于流细胞学的排序。同时,由于NAMPT表达的轻微调节及其功能低下,应避免使用本方案的嗜血者,在肿瘤组织到达16时改变。可能,为了使用血液中性粒细胞,他们以前应该激活使用肿瘤衍生的生长因子。
为了避免中性粒细胞凋亡,建议使用FK866(2-4小时)进行短期治疗,因为它对TAN的生存能力没有影响,而长期治疗会引起中性粒细胞凋亡16。总之,该方案证明了体外操纵抗血管性中性粒细胞在小鼠黑色素瘤肿瘤模型中功能抑制肿瘤生长的潜力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们的工作得到了德国克雷布西尔夫的资助,赠款编号:111647,德国研究理事会(DFG),赠款编号:JA 2461/2-1。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
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