Summary
כאן, אנו מראים פוטנציאל טיפולי של אנטי-אנגיוגנטי הקשורים לגידול נויטרופילים לאחר העברתו לתוך עכברים נושאת הגידול. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לתמרן את פעילות נויטרופילים לשעבר vivo וכתוצאה מכך להעריך את הפונקציונליות שלהם ב vivo בפיתוח גידולים. זהו מודל מתאים ללימודי חיסוני פוטנציאלי מבוססי נויטרופילים.
Abstract
התרומה של נויטרופילים לוויסות של tuמוריגנזה הוא מקבל תשומת לב מוגברת. תאים אלה הם הטרוגנית, ובהתאם לסביבה הגידול יכול להכיל pro-או אנטי גידול קיבולת. אחד של ציטוקינים חשוב הוויסות פונקציות נויטרופילים בהקשר הגידול הם סוג אני הפרעות. בנוכחות של הפרעות, נויטרופילים לצבור תכונות נגד הגידול, כולל הרעלת ציטוקיות או גירוי של המערכת החיסונית. לעומת זאת, העדר אינטרפרון איתות תוצאות בולטים פעילות הגידול, המאופיינת גירוי חזק של אנגיוגנזה הגידול. לאחרונה, אנו יכולים להדגים את התכונות pro-אנגיוגנטי של נויטרופילים תלוי בהפעלה של ניטינאמיד פוספוריבבויואז (NAMPT) איתות בתאים אלה. עיכוב של מסלול זה הקשורים הגידול נויטרופילים מוביל שלהם פנוטיפים חזקים אנטי-אנגיוגנטיים. כאן, אנו להדגים את המודל החדש שלנו מאפשר הערכה vivo של הפוטנציאל הטוריגניים של מניפולציות הגידול משויך נויטרופילים (שיזוף). בתוך זמן קצר, pro-אנגיוגנטי הקשורים הגידול נויטרופילים יכול להיות מבודד מן הגידול הנושאת אינטרפרון-לקויה עכברים ולאחר לתוך הפנטיפים אנטי-אנגיוגנטיים על ידי חסימת של איתות NAMPT. הפעילות האנגיוגנטית של תאים אלה ניתן להעריך לאחר מכן באמצעות שיטת הטבעת של אבי העורקים. השיזוף אנטי-אנגיוגנטי יכול להיות מועבר לתוך הגידול הנושאת מקבלי סוג פראי הגידול צריך להיות מנוטרים עבור 14 ימים. ביום 14 עכברים הם הוקרב, גידולים הוסרו לחתוך עם vascularization שלהם מוערך. בסך הכל, הפרוטוקול שלנו מספק כלי הרומן של vivo הערכת יכולת אנגיוגנטית של תאים ראשוניים, כגון משויך הגידול נויטרופילים, ללא צורך להשתמש במודלים של תאים מלאכותיים נויטרופילים קו. vc
Introduction
הפרעות סוג I (IFNs) לשחק תפקיד חשוב גירוי של תגובות המארחים neoplasias, כמו חוסר סוג אני IFNS איתות תוצאות בצמיחה הגידול מוגבר באופן משמעותי1. אחד המנגנונים המעורבים בתהליך זה הוא הרגולציה של הפעילות הטומורגנית של הגידול, נויטרופילים הקשורים, אשר נשלט על ידי גורם המושבה מגרה 3 קולטן (CSF3R) במורד איתות2. המושבה-גורם מגרה 3 (CSF3), או מושבת גרנבייט גורם מגרה, הוכח להפעיל איתות מעורבים פוספוליאמיד זרחן (nampt)3,4. NAMPT הוא אנזים מגביל שיעור עבור הסינתזה של התיקון הניאודאמיד, אשר משפר את גליקולוליזיס ומווסת את תקן ה-DNA, ביטוי גנים, ותגובת מתח לקידום תאים סרטניים הישרדות והתפשטות5. NAMPT הוא מבוטא יתר על סוגי סרטן מרובים, כולל המעי הגס, השחלות, שד, קיבה, סרטן הערמונית gliomas6. NAMPT הוא חיוני לא רק עבור תאים סרטניים, אלא גם עבור מגוון רחב של סוגי תאים אחרים הנמצאים בגידולים, כגון תאים מיאלואיד-זה כוננים שלהם בידול4, מעכב אפופטוזיס ולעורר ביטוי של ציטוקינים מרובים או אנזימים משפילים מטריקס במקרופאגים7.
הגידול משויך נויטרופילים לייצג מאפטורים חשובים של צמיחת הגידול. פונקציות TAN תלויים מאוד הסוג I IFN זמינות, כמו אלה ציטוקינים הממשלה אנטי סרטניים הפעילות של נויטרופילים. להיפך, היעדר IFNs תומך בהפעלה הטוריגנית של תאים אלה, בעיקר תכונות pro-אנגיוגנטי שלהם. בהסכם עם זה, עכברים לקויה ב-ifns לפתח באופן משמעותי יותר ויותר גידולים vascularized אשר חדרו מאוד עם pro-tumoral/pro-אנגיוגנטי נויטרופילים1,2,8, 9,10. חשוב מכך, כגון שיזוף pro-אנגיוגנטי להראות פעילות מוגבה של NAMPT, מציע את תפקידה העיקרי בפולריזציה הגידול פרו של נויטרופילים.
דלדול של נויטרופילים באמצעות נוגדן Ly6G או עיכוב של הגירה שלהם (CXCR2 נוגדן) תוצאות מופחת אנגיוגנזה הגידול, צמיחה, גרורות1,8. עם זאת, נוגדנים חד-שבטיים שנוצרו הם חיסוני, והממשל שלהם משויך למגוון של תופעות לוואי סכנת חיים11. טיפול עם מולקולות קטנות, כגון NAMPT מעכבי FK866, כי לווסת נויטרופילים tumorio, יכול לעזור כדי למנוע סיבוכים כאלה. למרבה הצער, עיכוב תרופתי מערכתית של NAMPT, ליד ההשפעה הטיפולית שלה על גידול הגידול, מוביל לתופעות לוואי חמורות כולל רעילות מערכת העיכול ו תרומבוציטופניה. לכן, יישום מערכתית של מעכבי nampt אינו אפשרי12,13,14.
מסיבה זו, אנו מציעים כאן פרוטוקול בו הפעילות NAMPT חסומה ישירות בשיזוף מבודד. כגון אנטי הגידול נויטרופילים הם הועברו אז מאומצים לתוך מארח הנושאת גידול. פרוטוקול זה יסייע להימנע תופעות לוואי רעילות מערכתית של תרכובות, בעוד השפעתו על תאי היעד יהיה מתמשך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הללו, כולל נושאי בעלי חיים, אושרו על-ידי רשויות הרגולציה: LANUV (לנדסברג הנאטור, האוולט וורוברצ'רשיץ NRW) ומרגראסנוביץ ' טיבינגן, גרמניה. כל מניפולציות יש לבצע בתנאים סטרילי (תחת כיסוי הזרם למינארי) באמצעות ריאגנטים סטרילי ומכשירים (מזרקים, מספריים, מלקחיים, מנתחים חד פעמיים, מנות פטרי).
הערה: הערכה הכוללת של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
1. הכנת קו תא מלנומה B16F10
- להכין mycoplasma-תאים שליליים גדל 90% שוטפת conאולייר (כ 10 x 106 תאים/T75 בקבוקון) ב-iscove השלם של מדיום שונה של החברה של האדם (imdmc: imdmc + 10% סרום שור עוברי (fbs) +1% פניצילין-סטרפטומיצין).
- הסר את המדיום, ושטוף את התאים עם תמיסת מלח באגירה מפוספז (PBS). החלת 6 מ ל של פתרון התנתקות התא המכיל באנזימים פרוטאנחרדה וקולגן (לראות את הטבלה של חומרים), ו דגירה ב 37 ° c עבור 2 דקות.
- להפיל את הבקבוקון בעדינות כדי להניע תאים חסיד שנותרו מלמטה. לאסוף את ההשעיה התא ב 15 שפופרות mL ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 7 דקות ו-20 ° c.
- הסירו את הסופרנטאנט, והשהה מחדש. את הגלולה ב -1 מ ג של PBS הוסף 14 מ ל של PBS ו צנטריפוגה (300 x g ו 20 ° צ' עבור 7 דקות).
- והשהה מחדש את הגלולה. ב-100 מ ג של PBS
- לספור את התאים, ולהשעות אותם מחדש לריכוז של 3 x 106/ml pbs (עבור השלב 2) או 6 x 106/ml pbs (עבור השלב 6) להזרקה. לשמור על התאים בקרח למקסימום של 30 דקות.
2. מודל הגידול אלוגניים בעכברים
- השתמש 10 נקבה Ifnar1-/- עכברים בן 8-12 שבועות כי נשמרים תחת ספציפי-הפתוגן ללא-המחלה (SPF) תנאים.
הערה: עכברים נקבה עדיפים במודל תת עורית של גידול הגידול, מאז הזכרים הם אגרסיביים יותר ולכן נוטה פרות של אתר הגידול, אשר משפיע על צמיחת הגידול. - לגלח את העור של העכבר על הצלע עם מכונת גילוח חשמלית, ולחטא את העור עם רקמה רטובה עם 70% אתנול.
- לאסוף את תאי מלנומה B16F10 מוכן בריכוז של 3 x 106/mL PBS (לראות את השלב 1) ב 1 מזרק mL ו-0.4 x 19 מ"מ מחט. הכנס 100 mL של תת-עורי ההשעיה.
- מערבבים היטב את התאים לפני כל זריקה. השימוש מחטים לא פחות מ 0.4 מ"מ בקוטר לא להפריע תאים סרטניים.
- מקום עד 5 עכברים בכלוב אחד, ושליטה גודל הגידול (אורך, רוחב ועומק) עם קליבר עבור 14 ימים.
הערה: על פי תקנות בעלי חיים, גודל הגידול לא יעלה על 15 מ"מ קוטר, עכברים עם גידולים גדולים או נמק/פתוח יש להקריב מראש. - ביום 14, להקריב את העכברים בחדר שיתוף2 .
- לחטא את העור עם 70% אתנול ולהסיר גידולים עם מספריים ומלקחיים בצלחת פטרי סטרילית. לשמור על גידולים בצינור 50 mL ב-בינונית מלאה של הנשר שונה של Dulbecco (DMEMc: DMEMC + 10% FBS + 1% פניצילין-סטרפטומיצין) על הקרח.
3. בידוד שיזוף
- מקום גידולים לתוך סטרילי 6-צלחות, 5 גידולים לכל טוב. חותכים גידולים לחתיכות 2-3 מ"מ עם מספריים סטרילית.
- לעכל עם 1 מ ל של dispase/קולגיאז D/DNase אני פתרון (0.2 mg/0.3 mg/100 מ"ג ב 1 מ ל של Dnase) לכל גידול. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2 בחממה לח, ולערבב עם מזרק 10 מ ל ללא מחט כל 15 דקות 3 פעמים.
- כדי להסיר סיבים לא מעוילים, שינוי תאים באמצעות 100 יקרומטר מסננים לתוך 15 שפופרות mL (אחד טוב לכל מסנן לכל שפופרת). הוסף PBS ל 15 מ"ל, צינורות צנטריפוגה ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את הסופרנטאנט.
- Lyse אריתרופוציטים עם מאגר פירוק (NH4Cl 150 MM, khco3 10 מ"מ, Edta 0.1 mm, PH 7.3, 20 ° c) על ידי הוספת 1 mL לתוך כל צינור. מערבבים היטב, ולשלב את הפתרון מכל הצינורות לתוך אחד. להפסיק את התגובה לאחר 2 דקות עם 11 מ ל של קרח קר (4 ° c) DMEMc.
- צנטריפוגה ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה עם 15 מ ל של הקור PBS. צנטריפוגה ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את הסופרנטאנט.
- השהה את הגלולה ב-1 מ ל של PBS. הוסף 3 מ ל של נוגדנים לחסום Fc (CD16/CD32, מלאי 0.5 mg/mL), ו-דגירה על הקרח עבור 15 דקות.
- הוסף נוגדנים: 10 מ ל של Ly6G-PE (מניות 0.2 mg/mL) ו-10 מ ל של CD11b-APC (מניות 0.2 mg/mL). הוסף 20 מ ל של 6-Diamidin-2-פניללינדול לצבוע (DAPI, מלאי 5 מ"ג/mL) ו דגירה על הקרח בחשיכה עבור 30 דקות.
הערה: ניתן להשתמש בשילוב נוסף של צבעי הכדאיות ושל השערים הפלואורסצנטית של נוגדנים. - הוסף את ה-PBS עד 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את הסופרנטאנט.
- השהה מחדש את הגלולה ב-DMEMc לריכוז כ-10 x 106/mL, ושמור על קרח.
- מיין CD11b+ Ly6Ghi בחיים (dapi-שלילי) נויטרופילים עם סדרן התא עם הפעלה פלואורסצנטית (לאחר אסטרטגיה לראות איור 2).
הערה: שמור את השפופרת עם השעיית תא וצינור עם DMEMc עבור תאים ממוינים ב 4 ° c. השתמש בהגדרות מיון אופטימליות הבאות: זרבובית 70 מ"מ, שיעור סף של 22,000 מקסימלית אירועים/שנייה וקצב זרימה של 1-3. - בדוק את הטוהר של נויטרופילים מיון באמצעות cytometer לטוהר מומלץ של > 95%.
- צנטריפוגה מיון נויטרופילים ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את supernatant. השהה מחדש את התאים הממוינים ב-DMEMc לריכוז של 1 x 106/Ml.
הערה: המספר הצפוי של נויטרופילים בגידול 1 14 יום B16F10 (בקוטר 10 מ"מ) הוא כ 3 x 104 תאים.
4. עיכוב NAMPT ב השיזוף בחוץ
- הכנת FK866 (מעכב NAMPT) מניות ב dimethylsulfoxide (DMSO) בריכוז הסופי של 100 מ"מ.
- זרע מיון נויטרופילים (שלב 3.11) לתוך 2 בארות של הצלחת 96-באר U-התחתון (1.5 x 105 נויטרופילים/גם). הוסף FK866 לתוך התערבות היטב (הריכוז הסופי של 100 ננומטר), וכמות שווה של DMEMc עם DMSO לתוך השליטה היטב. דגירה עבור 2 h ב 37 ° צ', 5% CO2 בחממה לח.
- צנטריפוגה ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את הסופרנטאנט. השהה מחדש ב-200 mL של PBS בכל באר. חזור פעמיים.
- צנטריפוגה ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את הסופרנטאנט. השהה מחדש בינונית צמיחה של תא מסחרי בינוני (בתוספת עם 4 μL/mL מוסף צמיחה של תאים, 0.1 ng/mL האדם גורם גידול באפידרמיס, 1 ng/mL רקומביננטי גורם הצמיחה פיברופיצוץ בסיסי, 90 μg/mL ו-1 μg/mL הידרוקורטיזון) לריכוז הסופי של 0.2 x 106 תאים/ml (ב 0.75 mL) (עבור שלב 5) או ב-PBS לריכוז הסופי של 0.6 x 106 תאים/mL (בשנת 0.25 mL) (עבור שלב 6).
5. הערכת תכונות אנגיוגנטי של היזוף באמצעות שיטת הטבעת של אבי העורקים
- לנתח את העורקים הבית החזה מן העכבר זכר C57BL/6J (WT). נקי לחתוך לתוך טבעות רוחב 0.5 מ"מ. הניחו את כל הטבעות בבאר של צלחת של 24 מיל עם 1 מ ל של מדיום צמיחה של תא שיושלם. מודטה לילה ב 37 ° c, 5% CO2 בחממה לח.
הערה: השימוש של צעירים (צעיר מ 8 שבועות) עכברים זכר לניתוח העורקים עדיף, שכן הם נותנים תגובה אנגיוגנטית חזקה יותר15. - למלא את הבארות של 96-ובכן שטוח למטה צלחת עם 50 μL של מטריצה מרתף מסיסות במרתף, תן את הג להגדיר 30 דקות ב 37 ° צ', 5% CO2 חממה לחות כדי לאפשר מטריקס כדי פולימלזציה. הכינו לפחות 3 בארות לכל תנאי.
- להטביע את הטבעות בתוך מטריצת מרתף ממברנה מסיסות על ידי הצבת טבעת אבי העורקים על החלק העליון של שכבת מטריצה מוצק, 1 טבעת במרכז של כל טוב. הוסף עוד 50 μL של מטריצת קרום מרתף מסיסות כדי לכסות כל טבעת.
- מניחים את הצלחת ב 37 ° c, 5 % החממה לחות עבור 30 דקות נוספות כדי לאפשר את הפילמור של שכבת המטריצה השנייה.
- הוסף 150 mL/ובכן של שיושלם בינוני הצמיחה התאים בינונית ו-2x104Ifnar1-/- השיזוף (שליטה FK866 מטופלים) (שלב 4.4).
- מודקת את הצלחת 14 ימים ב 37 ° c, 5% CO2 בחממה לח.
- תמונה בעזרת מיקרוסקופ רגיל משלב הפאזה ומעריכים את הסתעפות האנדותל. הערכה כמותית של כלי ממורמטרי ופרמטרים מרחביים כולל אינדקס הסתעפות ניתן לבצע באופן אוטומטי באמצעות תוכנית עיבוד תמונה המיועדת תמונות מדעיות.
הערה: תוצאות הנציגים מתוארות באיור 3.
6. העברה המאמצת של מטופלים נויטרופילים במודל הגידול allogenic
- להכין תאים B16F10 מלנומה (שלב 1.6) ב PBS בריכוז של 6 x 106 תאים/mL.
- להכין 2 סוגים של נויטרופילים: FK866-מטופלים נויטרופילים ובקרת נויטרופילים מטופל (שלב 4.4) ב PBS בריכוז 6 x 105 תאים/mL. מערבבים נויטרופילים עם תאים B16F10 מלנומה (הסופי נויטרופילים לתאים סרטניים יחס 1:10) יש 2 סוגים של תערובות תאים.
- קח 10 עכברים הנקבה WT 8-12 בן שבועות, 5 בכל קבוצה. לגלח את העור על הצלע עם מכונת גילוח חשמלית, ולחטא עם 70% אתנול.
- הכנס 100 μL של השעיית התא (שלב 6.2) תת-עורי עם מזרק אינסולין ו מחט קוטר 0.4 מ"מ, לשתי קבוצות של עכברים. מניחים 1-5 עכברים מאותה קבוצה בכלוב אחד.
- ביום 2, להכין 2 סוגים של נויטרופילים: FK866-מטופלים נויטרופילים ובקרת נויטרופילים מטופל (שלב 4.4) ב PBS בריכוז 6 x 105 תאים/mL. הכנס 100 μL של השעיית תא (שלב 6.4) עירוי לווריד הזנב עם מזרק אינסולין ומחט קוטר 0.4 מ"מ, לשתי קבוצות של עכברים. מניחים עכברים בחזרה לכלוב.
7. גידול במדידה הצמיחה, בדיקה היסטולוגית
- נטר צמיחת גידול. בכל יום אחר להעריך את גודל הגידול עם קליפרס ולחשב את נפח הגידול עם הנוסחה V = 4/3 * π * (h * w2)/8 (h = גובה, w = רוחב, עומק = רוחב).
- להקריב עכברים ביום 14 בחדר CO2 . להסיר גידולים ולמדוד את משקולות הגידול.
- הקפאת גידולים בתרכובת מיטבית לחיתוך טמפרטורה בחנקן נוזלי, וחנות at-80 ° c.
- הפשרת דגימות ל-20 ° c והכינו סעיפים של 5 מ"מ באמצעות קריוטומה. תנו להקפאה להתייבש. במשך 30 דקות ב -20 ° c לתקן את הסעיפים ב-20 ° c באצטון קר עבור 2 דקות ולתת להם להתייבש 30 דקות ב 20 ° c.
- בלוק עם נוגדנים בבלוק Fc (CD16/CD32, מלאי 0.5 mg/mL 1:500) ב PBS עבור 1 h ב 20 ° c.
- כתם עם ארנב נגד העכבר מלבלב נוגדן גמא (1:1500 ב PBS, 200 μL) עבור 1 h ב 20 ° c. . שטוף עם הPBS 3 פעמים
- כתם עם משני עז אנטי הארנב נוגדן (מניות 0.5 mg/mL, 1:400 ב PBS,), נגד עכבר αSMA (1:500 ב-PBS) ו 2 μL של DAPI (מלאי 5 מ"ג/mL, 1:100 ב-PBS) בנפח הסופי של 200 μL של פתרון נוגדן. מודלת ב-20 ° c בחשיכה. . שטוף עם הPBS 3 פעמים
- שקופיות יבשות למשך 20 דקות ב -20 ° c בחשיכה. הר עם בינוני הרכבה הידרולי עבור מיקרוסקופ וכיסוי עם שמיכות. הרשו לו להתייבש. ב-37 מעלות צלזיוס
- בצע בדיקה מיקרוסופית. לכמת את הvascularization על ידי ספירת המספר הכולל (באופן אופציונלי) של מלמינציה+ כלי קיבול ואת המספר (שטח) של SMA+ כלי מפותח.
הערה: כדי לבצע ניתוח תמונה, בצע את כל התמונות תחת אותם תנאים (אור, ניגודיות, הגדלה). במקרה זה, פרמטרי עיבוד הם קבועים, עיבוד תמונה הופך אוטומטי לחלוטין. תוצאות הנציגה מתוארות באיור 4 ובאיור 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך המתואר כאן, Ifnar1-/- נויטרופילים היו מבודדים גידולים וטופלו עם מעכבי nampt FK866 עבור 2 h. Ifnar1 לא מטופל -/- נויטרופילים שימשו כפקד. את האפקטיביות של הטיפול הוערך באמצעות שיטת הטבעת אבי העורקים, אשר משקף את השלבים העיקריים המעורבים אנגיוגנזה (השפלה מטריקס, הגירה, התפשטות, ארגון מתארגנות). אנחנו יכולים להדגים כי FK866-מטופלים נויטרופילים יש יכולת ירידה משמעותית כדי לעורר את היווצרות ענף אבי העורקים, לעומת תאים לא מטופלים (איור 3a, 3a). FK866 מטופלים אנטי-אנגיוגנטיים נויטרופילים הוזרק תת-עורי לתוך הגידול עכברים הנושאת (ביום 0 האגף והיום 2 העירוי). אנחנו יכולים להתבונן באופן משמעותי צמיחת הגידול, לעומת עכברים הוזרק עם Ifnar1-/- נויטרופילים (איור 4a, 4a). הבדיקה היסטולוגית של גידולים שחולצו הוכיחה את הדיכוי המשמעותי של אנגיוגנזה בגידולים מבודדים מעכברים שטופלו FK866-שיזוף, לעומת אלה הזריקו עם Ifnar1-/- נויטרופילים ( איור 5A , B).
איור 1. . הערכה של הפרוטוקול . צעד ראשון הכנת קו תא מלנומה B16F10; 2. מודל הגידול אלוגניים בעכברים; 3. בידוד של השיזוף מן הגידולים; 4. עיכוב של NAMPT ב השיזוף בחוץ; 5. הערכת תכונות אנגיוגנטי של השיזוף בתוך שיטת הטבעת של אבי העורקים; 6. העברה המאמצת של מטופלים נויטרופילים במודל הגידול allogenic; 7. בקרת גדילה הגידול, בדיקה היסטולוגית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. . מיון אסטרטגיה למיון שיזוף CD11b+ Ly6Gהיי בחיים נויטרופילים ממוינים מגידולים עם טוהר ≥ 95%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. דיכוי תכונות האנגיוגנטי של הFK866 לאחר הטיפול. תכונות אנגיוגנטית של מיון Ifnar1-/-שיזוף שטופלו עם FK866 או עם בינוני הוערך באמצעות שיטת הטבעת של העורקים. היווצרות הענף היה פיקוח במהלך 14 ימים, התוצאות הנציג ביום 14 מוצגים (א). הטיפול בFK866 הופחת באופן משמעותי במספר ענפי האנדותל (B). נתונים מוצגים כחציון, טווח בין-רבעוני ומינימום-max, * p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. פיגור של גידול בגידול לאחר העברה המאמצת של נויטרופילים מטופלים FK866. ההשפעה של השיזוף על. גידול הגידול הוערך השיזוף היו מבודדים, טיפלו בFK866 והזריקו לעכברים הנושאים את הגידול כמתואר לעיל. ביום 14 עכברים הוקרבו, גידולים הוסרו ונותחו. Ifnar1-/- שיזוף שטופלו עם FK866 נגד שליטה השוו. (א) הגידול נמדד, (ב) מסת הגידול ו (ג) גודל המשוער. נתונים מוצגים כחציון, טווח בין-רבעוני ומינימום-max, * p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. הגידול דיכא vascularization לאחר העברה המאמצת של נויטרופילים המטופל FK866. גידולים היו מבודדים כמתואר לעיל (איור 4). התבגרות הספינה הוערך באמצעות נוגדנים נגד SMA (כלי בוגרים) ו אנטי גמא למינציה (תאים אנדותל). (א) כתמים מייצגים של גידולים מוצגים: SMA (ירוק), למינציה (אדום). סרגלי קנה מידה: 50 μm. (ב) כימות הגידול והעברת הגוף לאחר העברה המאמצת של השיזוף מעובדות עם FK866 (ירוק) או בינוני (אדום) נתונים מוצגים כחציון, טווח בין רבעוני ו-min-max, * p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות ההתקדמות בטיפול כירורגי ותרופתי בסרטן, טיפול מוצלח נשאר אתגר. מאז התאים החיסוניים ידועים לשחק תפקיד חשוב בוויסות צמיחת הגידול, שיטות הרומן מעכב tuמגנגניות של תאים כאלה יש להקים. כאן אנו מדגימים גישה הרומן לדכא את צמיחת הגידול באמצעות העברה המאמצת של אנטי-אנגיוגנטי הגידול משויך נויטרופילים. מיקוד סלקטיבי של איתות NAMPT הפרו-אנגיוגנטי היזוף, באמצעות FK866 מעכב, מונע תופעות לוואי, אשר נצפו על טיפול FK866 מערכתית.
החלק הקריטי ביותר של הפרוטוקול הוא הצורך להשתמש מבודדים טריים נויטרופילים הראשי. נויטרופילים הם תאים קצרי חיים, שעברו אפופטוזיס או מופעל במהלך ההליך של בידוד. יש לשמור על הנויטרופילים של מורנה ב -4 מעלות צלזיוס במהלך כל השלבים של בידוד, כולל מיון תאים. בידוד של נויטרופילים יש לבצע בהקדם האפשרי, הניסוי לא צריך להיות הושהה. שימוש של Fc-בלוק מאפשר להקטין את הצביעת לא ספציפית של התאים עם ביטוי הקולטן Fc גבוה, כמו תאים NK. כמו כן, אנו ממליצים למזער את מספר הנוגדנים מצוערים פלורסנט כדי לפשט את אסטרטגיית ה, כדי למנוע הפעלה של נויטרופילים עקב מחייב נוגדנים.
הצעד המגביל של הפרוטוקול הוא הבידוד של בחיים נויטרופילים מפני גידולים בשל כמות נמוכה יחסית של תאים אלה בגידולים (לא יותר מאשר 1% של תאים בחיים בודד מלנומה). זה יכול להיות רק אפשרי באמצעות המיון cy, המבוסס על מיון מבוסס הזרימה. באותו הזמן, השימוש של דם נויטרופילים עבור פרוטוקול זה יש להימנע בשל הרגולציה רק מינורי של ביטוי NAMPT ופונקציונליות נמוכה שלהם, אשר שונה על רקמת הגידול16. ייתכן, על מנת להשתמש ב-דם נויטרופילים, הם צריכים להיות מופעלים בעבר באמצעות גידול מרכיבי הצמיחה נגזר.
כדי למנוע נויטרופילים, טיפול קצר עם FK866 (2-4 h) הוא הציע, כפי שאין לו השפעה על הכדאיות של השיזוף, בעוד טיפול ממושך גורם נויטרופילים ואפופטוזיס16. בסכום, הפרוטוקול מדגים את הפוטנציאל של חוץ גופית לשעבר מניפולציה אנטי-אנגיוגנטיים נויטרופילים כדי פונקציונלית לדכא את צמיחת הגידול במודל הגידול של מלנומה העכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
העבודה שלנו נתמכת על ידי מענקים מחברת דויטשה קהרבשילוב, מספר גרנט: 111647, ומועצת המחקר הגרמנית (DFG), מספר גרנט: JA 2461/2-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
