Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Enkelt celle screening metode til udvælgelse og nyttiggørelse af antistoffer med ønskede karakteristika fra beriget menneskelig hukommelse B cellepopulationer

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59809
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1World Without Disease Accelerator, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson, 2Janssen Prevention Center, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson

Summary

BSelex metode til at identificere og genvinde individuelle antigen-specifikke antistoffer fra humant perifert blod mononukleære celler kombinerer flow cytometri med enkelt celle PCR og kloning.

Abstract

Det humane antistof repertoire repræsenterer en stort set uudnyttet kilde til potentielle terapeutiske antistoffer og nyttige biomarkører. Mens de nuværende beregningsmetoder, såsom Next Generation sekventering (NGS), giver enorme datasæt om antistof repertoiret på sekvens niveau, er funktionelle data nødvendige for at identificere, hvilke sekvenser der er relevante for et bestemt antigen eller sæt af Antigener. Her beskriver vi en metode til at identificere og genvinde individuelle antigen-specifikke antistoffer fra perifert blod mononukleære celler (PBMCs) fra en menneskelig bloddonor. Denne metode udnytter en Initial berigelse af modne B-celler og kræver en kombination af fænotypiske celle markører og fluorescently-mærket protein for at isolere IgG Memory B-celler via flow cytometri. Den tunge og lette kæde variabel regioner er derefter klonede og re-screenet. Selvom det er begrænset til Memory B-celle rummet, udnytter denne metode flowcytometri til at afhøre millioner af B-celler og returnerer parrede tunge og lette kæde sekvenser fra en enkelt celle i et format, der er klar til ekspression og bekræftelse af specificitet. Antistoffer genvundet med denne metode kan overvejes for terapeutisk potentiale, men kan også forbinde specificitet og funktion med bioinformatiske tilgange til at vurdere B-celle repertoire inden for enkeltpersoner.

Introduction

Antistoffer er en voksende klasse af terapeutiske molekyler, og det eksisterende B-celle repertoire i ethvert menneske er en potentiel kilde til sådanne antistoffer. Når inddrives fra en menneskelig donor, de kræver ingen tilpasning eller "humanisering", skridt, der er nødvendige for antistoffer genereret i andre dyre systemer. Der findes flere metoder til identifikation og isolering af humane antistoffer, herunder B-celle aktivering og-spredning1, immortalization via EBV-transformation2,3og generering af hybridom celle-cellelinjer4 ,5. Men alle disse metoder kræver omfattende cellekultur til at screene og inddrive antigen-specifikke antistoffer. Information om human antistof repertoire er blevet stærkt udvidet med udviklingen af Next Generation sekventering (NGS) teknologi, gør det muligt at identificere massive mængder af individuelle sekvenser til stede i donor prøver. Da NGS giver et agnostisk overblik over alle tilstedeværende sekvenser, er det dog ikke muligt at identificere og isolere antigen specifikke antistoffer, især ikke i tilfælde af sjældne eller lavfrekvente antistoffer.

Formålet med "BSelex" metode er at identificere antigen-specifikke antistoffer fra cirkulerende perifert blod mononukleære celler i menneskelige donorer, og isolere og genvinde sekvenser af disse antistoffer til yderligere analyse. Denne metode udnytter flow cytometri og celle sortering til at drage fordel af B-celle receptoren (BCR) udtrykt på overfladen af Memory B-celler. Millioner af B-celler kan screenes for antigen-specificitet via flowcytometri, før de mere lavgennemløbs molekylær biologi metoder påbegyndes. Det er ikke muligt at identificere parret tunge og lette kæder i de fleste NGS-metoder, som analyserer celle sekvenser i bulk. I den metode, vi beskriver her, er cellerne isoleret enkeltvis, og parret genopretning af både tunge og lette kæde sekvenser er muligt, hvilket giver mulighed for direkte kloning og ekspression af den fulde IgG.

Protocol

Brugen af prøver fra humane frivillige fulgte protokoller godkendt af Scripps Research Institute institutions Review Board. Informeret samtykke blev indhentet fra donorerne forud for bloddonation.

1. klargøring af reagens

  1. Mononukleære celler i perifert blod (PBMCs)
    1. Genoprette perifert blod mononukleære celler fra normale menneskelige donorer af Ficoll-plaque plus isolation. Cryopreserve ved 50.000.000 celler/mL i 90% føtal bovint serum (FBS) og 10% dimethylsulfoxid (DMSO). Cellerne fryses ved-80 °C og overføres til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
  2. Mærkning Target antigen peptider til sortering
    1. Generere eller opnå peptider, der er specifikke for målproteinet (op til 70 rester lang) med en Terminal biotin.
    2. Etiket 4 nmol af hvert enkelt biotinyleret peptid med streptavidin kovalent fastgjort til PE (R-phycoerythrin) eller APC (allophycocyanin) i separate rør. Forbered ved hjælp af et molært forhold på 9:1 peptid til streptavidin (SA), med en endelig koncentration på ca. 3,2 μM for SA-PE og 5,7 μM SA-APC. Forbered biotin tetramers som en negativ kontrol.
    3. Hver peptid blandes natten over, i mørke, ved 4 °C med langsom blanding.
    4. Fjern ubundet fluoroforet ved at passere mærkede peptider gennem mikrokolonner, der indeholder polyacrylamid perler.
    5. Opbevar peptidtetramers i op til 2 måneder ved 4 °C.

2. celle sortering

  1. Mindst 1 time op til 16 timer før CD22 + isolation, tø donor PBMCs og lad det hvile ved 37 °C.
    1. Fjern hætteglassene med frosne Pbmc'er fra fryseren og Overfør straks til et 37 °C vandbad. Når hætteglassene er næsten optøede, skal de overføres til arbejdsområdet.
    2. Indholdet af hvert hætteglas overføres til et 50 mL rør, der indeholder forvarmet medium (holder donorerne adskilt). Tilsæt medium til en endelig volumen på 50 mL. Bland forsigtigt indholdet.
    3. Centrifugeres ved 370 x g i 6 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten, resuspension cellerne i 15 mL RPMI komplet medium og udføre en celletal.
    4. Juster celle koncentrationen til 2,0 x 107 celler/ml med rpmi komplet medium, og Overfør cellerne til en T75 kolbe eller større og inkuber ved 37 °c i mindst 1 time og op til 16 timer for at tillade restitueringstiden for optøede celler.
    5. Saml cellerne (hvis ønsket samles) og centrifugeres ved 370 x g i 6 minutter ved 4 °c. Kassér supernatanten og resuspension cellerne i 5 mL iskoldt MACS buffer (PBS, pH 7,6 indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA), Bring til 50 mL med MACS buffer og Udfør en celletal.
    6. Cellerne centrifugeres ved 400 x g i 7 minutter ved 4 °c.
    7. Isoler CD22+ B- cellerne ved et positivt valg via Optag på CD22 mikroperler. Brug MACS buffer til alle skyller. Tælle og centrifugeres 400 x g i 7 minutter ved 4 °c. Det forventede opsving er 5-10% af den samlede PBMC-population.
    8. Resuspension celler på 40.000.000 per mL FACS buffer (Tris buffer, pH 8,0 indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA) og fortsætte med celle farvning af donorer individuelt eller som en pulje.
  2. Pletter celler til hukommelse B celle sortering
    1. Fjern en alikvot af celler til flowcytometer opsætning og kompensation for hver af de anvendte fluorophorer. Medtag ikke-farvede celler som et kontrolelement.
    2. Den endelige farvnings volumen beregnes for det antal CD22+ celler, som er opnået (farvning 2.000.000 pr. 100 μl).
    3. Tilføj ekstracellulære markører for B-celler (CD19-PerCP-CY 5.5), IgG (IgG-FITC) og hukommelsesrummet (CD27-PECy7) som pr. fabrikanternes fortyndings anbefalinger, og bland forsigtigt. Aliquot 107 celler i et 1,5 ml rør for den negative kontrol og overføre de resterende celler til en 15 ml rør.
    4. Tilsæt det dobbelte mærkede biotin-SA tetramers til det negative kontrolrør ved en endelig koncentration på 36 nM hver for PE og APC ganget med antallet af peptider i sorterings røret og Bring volumenet til 0,5 mL endelig med FACS buffer (f. eks. 10 peptider x 36 nM = 360 nM).
    5. Tilsæt peptidtetramerne til sorterings røret ved 36 nM hver for PE og APC og Bring cellerne til 2x106 pr. 100 ΜL med TBS buffer. Inkuber ved 4 °C i mørke og med blid rotation i 30-60 min.
    6. Vask 2x ved 4 °C, 400 x g, 7 min, og fjern en alikvot for at tælle før den sidste vask. Filtrer cellerne ved hjælp af 5 mL filter hætteglas. Tilsæt DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) plet til 0,3 μM endelig koncentration lige før sortering som en markør for celle membran integritet.
  3. Enkelt celle sortering via flowcytometri
    1. Forbered 48 brønde af 96-brønd PCR plader til sortering.
      1. Forbered en masterblanding: (2 μL 10x RT buffer, 0,5 μL Rnasehæmmer, 7,5 μL sterilt PCR-grade vand) pr. prøve. Aliquot 10 μL pr. brønd, dæksel og opbevares ved 4 °C, indtil de er klar til sortering.
    2. Kør den negative kontrol på celle sortering, analysere hele prøven.
      1. Indstil flow flowcytometri Gates til at isolere de relevante cellepopulationer for enkelt celle sortering.
        1. Plot FSC område vs SSC område og sæt Gate R1 til at isolere lymfocytter.
        2. Plot FSC højde vs FSC bredde og sæt Gate R3 for at udelukke FSC doublets.
        3. Plot SSC højde vs SSC bredde og sæt Gate R4 at udelukke SSC doublets.
        4. Plot SSC højde vs DAPI og sæt Gate R5 at isolere levende celler (DAPI-).
        5. Plot IgG vs CD19 og Indstil Gate R6 til at isolere IgG+ B-celler (CD19+ IgG+).
        6. Plot IgG vs CD27 og Indstil Gate R7 til at vælge Memory B-celler (CD27høj).
        7. Plot antigen-PE (AG-PE) vs antigen-APC (AG-APC) og set Gate R8 som en AG-PE+/AG-APC+ kvadrant med et lavt antal hændelser i den dobbelte positive port.
    3. Indsaml et lige antal hukommelsesceller fra antigen-positive (AG+) prøven til bestemmelse af signal til støj.
    4. Sorter enkeltceller med fænotype CD19+ CD27+ AG-PE+ AG-APC+ (Gate R8) i forberedte 96-brønd-PCR-plader.
    5. Cover plader med aluminiums tape puder, centrifuge i 1 min ved 400 x g, og opbevares ved-80 °C for fremtidig kloning.

3. kloning af enkeltceller

  1. Omvendte transkriptionsreaktioner
    1. Fjern den enkelt B-celle sorterings plade fra 80 °C. Tø på is i 2 min. Drej pladen i 2 min ved 3.300 x g for at samle indholdet i bunden af brøndene, før du åbner.
    2. Forbered en dNTP/buffer Master Mix med 10% non-ionisk rengøringsmiddel og oligo (dT) som den omvendte primer. Tilsæt enzym mix til hver brønd, der indeholder den enkelte celle og Bland ikke.
    3. Inkuber 5 min ved 65 °C. Tilsæt enzym Master Mix indeholdende 100 mM DTT, RNase inhibitor, og reverse transkriptase enzym til at bringe samlede volumen til 20 μL. Inkuber 10 min ved 50 °C, derefter 10 min ved 80 °C.
    4. Overførsel til is før start af PCR trin
  2. Indlejrede PCR-reaktioner i flere trin
    1. Brug separate indlejrede PCR-reaktioner anvendes til forstærkning af tung kæde (HC) og lyskæde (LC).
    2. For første runde af PCR amplifikation (trin I), brug en pulje af fremad primere og en enkelt omvendt primer til at forstærke HC og LC variable regioner i separate PCR reaktioner (figur 2). Ved design vil puljen af Forward primere forstærke en stor procentdel af kimcelle Leader (L)-sekvenser, og den omvendte primer er specifik for downstream-konstante regioner i hver kæde, herunder både Kappa (κ) og lambda (λ) for lette kæder16.
      1. Brug 2,5 μL cDNA-produkt som skabelon for hver PCR-reaktion (trin I). Tilsæt primere til den endelige reaktions koncentration på 1 μM for hver. Dobbelt 10x polymerase buffer til 2x koncentration, bringe den endelige volumen til 25 μL per reaktion. Kør HC PCR-reaktioner ved hjælp af [94 °C/4 min; 94 °C/15 s, 55 °C/20 s, 68 °C/60 s; 68 °C/3 min] for 50 cyklusser. Kør LC PCR-reaktioner ved hjælp af [98 °C/4 min; 98 °C/15 s, 72 °C/20 s, 72 °C/60 s; 72 °C/3 min] for 50 cyklusser.
    3. Brug 2,5 μL af Step I-produktet som skabelon for hver (trin II) PCR-reaktion. Tilføj puljen af Forward primere specifikke for HC og LC (κ og λ) Framework 1 region og en pulje af omvendte primere specifikke for Junction region af hver antistof kæde. Dobbelt 10x polymerase buffer til 2x koncentration, og køre PCR-reaktioner 50 cyklusser hver med de samme parametre som trin I.
    4. Kør de afsluttede PCR-reaktioner på 1% agopstået gel for at visualisere positive forstærknings hits. Gendan parrede amplikoner (både tung og let kæde fra samme celle) og Isoler via gel ekstraktion. Bestemmelse af DNA-fragment koncentration via OD260 for nøjagtige ligations mix-beregninger.
    5. Kombiner gendannede tunge og lyse kæde fragmenter med en linker fragment og udtrykket vektor backbone ved hjælp af en 4-fragment ligering reaktion ved hjælp af en kommerciel kit.
    6. Omdanne ligering reaktioner til kemisk kompetente bakterier ved hjælp af en kommerciel kit. Når de er belagt på antibiotika plader, tilsættes 4 mL vækstmedier (med antibiotika) til den resterende Transformations kultur og Inkuber 37 °C natten over ved 250 rpm. Dette er "ligation mix kultur."
    7. Forbered miniprep DNA fra overnight ligering mix kulturer ved hjælp af en kommerciel kit, og bestemme den resulterende plasmid DNA-koncentration.

4. ELISA-skærm til bekræftelse af antigen-specificitet

  1. Transfect 10 μg miniprep-DNA med kationisk lipid-baseret reagens i 10 mL suspension 293 celler, og Inkubér i 3-4 dage ved 37 °C (8% CO2) under rotation ved 125 rpm. Til høst, centrifuge kultur 10 min ved 1.000 x g og inddrive afklaret medier.
    1. Mål IgG koncentrationen i Supernatanterne via affinitet til protein A.
    2. Test hver IgG (i supernatant) ved 20 μg/mL ved enzym-forbundet adsorbent assay (ELISA) mod de enkelte peptider, der anvendes til sorteringen, fanget på en streptavidin plade eller actin som en negativ kontrol. Brug en ged anti-humant peroxidase sekundært antistof mod humant IgG Fab til at detektere rekombinante kloner. Efter subtraktion af baggrund er OD > 0,5 defineret som skærm positiv.
    3. Bekræft positive hits på skærmen ved at udføre en ekstra ELISA ved hjælp af fortyndinger af IgG supernatanten for at generere en koncentrationskurve, der starter ved 20 μg pr. mL, og afbilde mod OD for hvert antigen, der viser reaktivitet i den indledende skærm ELISA.

Representative Results

Denne metode dækker en flertrinsproces til isolering af antigen specifikke antistoffer fra humane donorer. I de repræsentative data vist her, celler blev inkuberet med en pulje af fluorescently-mærket peptider, der repræsenterer flere forskellige domæner af Tau protein, herunder fosforylerede peptider til efterligne formodede fosforylering sites. Disse peptider blev brugt som "agn" til at identificere celler, der er reaktive med Tau epitopes (s) af interesse. Som forberedelse til sortering blev et panel af fluorescently-mærkede fænotypiske markører brugt til at identificere forskellige cellepopulationer inden for den berigede B-cellepopulation. En række cytometri-porte blev udtænkt for at isolere målhukommelsen B-cellerne (figur 1). Lymfocytter blev isoleret baseret på deres Cellestørrelse og granularitet ved hjælp af Forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) plots i flowcytometri6,7. Efter udelukkelse af flere celler ("doublets") og døde celler, tillod fænotypiske markører adskillelse af IgG + Memory B-celler via IgG, CD19 (B- celle) og CD27 (hukommelse). I denne fremgangsmåde fordeler CD27-mærket sig ikke i to diskrete populationer, så de øverste 45% af CD27+ udtrykker celler er inkluderet til den endelige port. Endelig, celler dobbelt-positive for både APC og PE fluorophores distribuere i øverste højre kvadrant af gating grafen, hvilket indikerer reaktivitet til begge mærkede versioner af peptider. De celler, der faldt inden for den tegnede port blev isoleret og sorteret i individuelle brønde af en 96-brønd plade. Brugen af antigen med to forskellige mærker øger signal-til-støj-forholdet og reducerer antallet af falske positiver i den efterfølgende molekylærbiologiske proces. De sorteres celler repræsenterede omkring 0,1% af hukommelsen B-celler i den endelige port, og 0,001% af startcellen prøve.

Den første aflæsning af enkelt celle kloning er bekræftelse af forstærkning af de respektive tunge og lette variable kæder (figur 2). Da der ønskes parret genvinding af begge amplikoner, evalueres PCR-reaktionerne side om side på agrose gel, og matchede par er fjernet fra gelen og DNA-fragmenter ekstraheret. Typisk effektivitet af amplifikation er 30-50% tung kæde og 50-70% lys (Kappa) kæde. Inddrivelse af parrede amplikoner er normalt mellem 25-40% effektivitet. Disse effektivitetsgevinster varierer mellem donor puljer, og de repræsentative data (figur 3) er et eksempel på meget effektiv forstærkning fra 24 enkeltceller (42% parret opsving). Efter IgG-kloning transfteres IgG-udtryks vektoren i humane embryonale nyre (HEK-293) suspension celler, som bruges til at maksimere udtryk. Brugen af serumfrit medium reducerer kontaminerende proteiner fra det rekombinante antistof prep og medvirker til at minimere støjen i efterfølgende bindende analyser. De gendannede antistoffer screenes mod det oprindelige panel af Tau peptider og scorede for reaktivitet af ELISA (figur 4). En Initial tærskel på OD = 0,5 over baggrunden bruges til at indikere positiv antigen reaktivitet, og β-actin protein anvendes som kontrol for ikke-specifik binding. Hvis flow cytometri og sortering trin bruger en blandet pulje af peptider, screening ELISA er det første skridt i devoluting specifikke reaktiviteter af de gendannede IgGs. Tre af de 10 iggs-analyseret demonstrerede reaktivitet mod fosforyleret cbtau 22,1 peptid, og en var reaktiv over for ikke-phosphoryleret cbtau 27.1 (figur 4A). Yderligere bekræftelse blev udført ved hjælp af en koncentrationskurve for de samme rekombinante antistof prøver i forhold til de peptider, der blev identificeret i den indledende skærm, og et yderligere peptid som en negativ kontrol (figur 4B). For hvert positivt hit blev en individuel plasmid-klon isoleret fra den transformerede pulje og bekræftet igen af den samme ELISA-metode. Kun klon 34 er vist de præsenterede data, og mens reaktivitet til ikke-fosforyleret CBTAU 27.1 blev bekræftet, blev der også observeret lavere affinitets binding med fosforyleret 27,1 peptid (figur 4C).

Figure 1
Figur 1 : Isolering af antigen-reaktive enkeltceller via flowcytometri. A) det viste er et repræsentativt observationsområde, hvor lymfocyt populationen var indeholdt i den tegnede port. B) porte baseret på fremad-og side scatter (FSC-højde v FSC-bredde (R3) SSC-højde v SSC-bredde (R4)) blev brugt til at udelukke doublets. Kun celler inden for tegnede porte blev evalueret i efterfølgende observationsområder. DAPI+ celler blev betragtet som døde og ekskluderede (R5). I dette eksperiment blev 3,7 x 107 "levende" celler afhørt. Størstedelen af de levende celler var B-celler (CD19+), og IgG+- celler (4,66%) blev isoleret fra denne population (R6). De øverste 43,2% af CD27+-udtrykte hukommelsesceller blev inkluderet i markerings porten (R7). (C) kvadrant 2 (Q2) indeholdt celler reaktive til begge mærkede antigener (PEPTID-APC v PEPTID-PE), og disse celler blev sorteret og genvundet individuelt til en 96-brønd plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : PCR amplifikation genopretter IgG Heavy og Light variable sekvens til kloning. (A) både tunge (VH) og lette (VK eller VL) kæde variable områder genvindes ved hjælp af indlejrede PCR-reaktioner. Step I primere forstærker fremad fra den indfødte leder sekvens og tilbage fra i den konstante region. Flere pile repræsenterer en pulje på mellem 7-12 Primers, som bruges til at sikre bred dækning af mulige germlines. Trin II primere er indlejret, specifikke for de ekstreme ender af den variable åbne læse ramme, og tilføje sekvens til enderne af amplikoner, der er homologe til tilstødende sekvens i ekspressions vektoren. (B) linker består af den konstante lyskæde (CK eller CL), efterfulgt af den tunge kæde promotor og en ikke-Native signal peptid sekvens. Amplicons, linker, og plasmid backbone er samtidig ligeret via overlappende homologe sekvens genereret under trin II PCR amplifikation, og isoleret som en intakt plasmid. De rekombinante tunge og lette kæder i den endelige ekspressions vektor drives af uafhængige (og identiske) CMV-promotorer og oversættes som særskilte proteiner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : IgG Heavy og Light variable kæde amplikoner gendannes fra enkeltceller. De indlejrede PCR-reaktioner (trin II) blev direkte indlæst på 1% agopstået gel og visualiseret. Tunge kæde (H) og Kappa lyskæde (L) PCR-reaktioner fra samme celle blev indlæst i tilstødende brønde, så parrede amplikoner blev let observeret. Vellykkede tunge og lyskæde produkter er omtrent 400 BP og 350 BP hhv. Vellykket inddrivelse af parrede amplikoner er angivet med en (*). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Antigen specificiteten bekræftes af rekombinante Igg'er. Plasmider indeholdende de genvundne tunge og lette kæde sekvenser transficeret i hek celler til udtryk. Efter fire dage vurderes rekombinant antistoffer for genaktivitet af ELISA. A) IgG-koncentrationen i de afklarede medier blev målt og fortyndet til 20 μg/ml. Puljen af peptider anvendt til sortering blev individuelt vurderet ved hjælp af 40 pmol pr brønd i streptavidin plader. Alle IgGs blev testet i dobbelte brønde. B) kloner, der viste OD450 måling > 0,5, blev revurderet (kloner #32, #34, #35) ved hjælp af 1:5 fortyndingstrin mod peptiderne, som blev identificeret på skærmen. (C) når bekræftet som et hit, en enkelt plasmid klon blev isoleret fra klon #34 transformerede ligationer, transfected, og genbekræftet af Elisa. Det samme blev gjort for kloner #32 og #35 (data ikke vist). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den metode, der præsenteres her kombinerer flow flowcytometri og enkelt celle kloning, og de metoder, vi beskriver her, vi er baseret på metoder, der tidligere er udviklet af Tiller og kolleger11. Deres arbejde beskriver genopretning og kloning af monoklonale antistoffer for at studere B-celle repertoiret hos mennesker på niveau med individuelle celler. Vi har tilpasset de vigtigste komponenter i deres proces for at muliggøre genvinding af antigen-specifikke monoklonale antistoffer fra en population af Memory B-celler, herunder multi-step forstærknings-primer-strategien. Den største ændring er tilføjelsen af mærket antigen "agn". Der er foretaget yderligere tilpasninger af den offentliggjorte protokol, herunder (men ikke begrænset til) ændring af kloning vektor backbone i et enkelt udtryk plasmid, yderligere primer dækning af kimcelle repertoire (både Leader sekvens og Framework 1), transfektering af suspension HEK293 celler for højere ekspression, og brugen af high fidelity polymeraser under PCR amplifikation.

For de metoder, der er beskrevet her, er de mest kritiske trin tæt på overgangen mellem flowcytometri og enkelt celle kloning. For det første er den korrekte placering af sorteret enkeltceller i pladen afgørende. Indstilling af drop-delay korrekt på sorteringen er et vigtigt skridt. Miljømæssige faktorer, såsom lav luftfugtighed, skal også tages i betragtning, som vi har fundet vores opsving effektivitetsgevinster falde betydeligt, medmindre en statisk pistol bruges på målet sortering plader. Efter celleplacering centrifugeres pladerne for at sikre, at cellerne har kontaktet de 10 μL buffer i bunden af brøndene. Alle disse foranstaltninger er afgørende for den molekylære biologi portion at blive en succes. Hvis betingelserne er sub-optimale for den omvendte transkriptionsreaktion af en enkelt celle, kan PCR amplifikation af selv β-actin være vanskelig. Styrken af den præsenterede metode er evnen til at afhøre millioner af celler og kun sortere dem, der matcher antigen reaktivitet kriterier mod antigen valg. Dette kræver, at signal til støj-forholdet er så højt som muligt, hvilket sker ved at optimere agn koncentrationer før sortering. Dual-mærket agn bruges til at reducere inddrivelse af falsk-positive celler, som kan opstå, hvis en af fluorophores har høj baggrund. Ved hjælp af mere end én antigen agn kan gøre signalet: støj optimering vanskeligere, men evnen til at afhøre flere peptider samtidigt er en anden fordel ved denne metode.

Når genvindingseffektiviteten er lav, bruges et sæt indlejrede β-actin primere til at bekræfte, at Template cDNA er til stede. Ulempen ved denne fremgangsmåde er, at det er svært at afgøre, om der ikke var nogen celle til stede i brønden eller omvendt transkriptionsreaktion mislykkedes, hvilket gjorde fejlfinding vanskelig. Lejlighedsvis vil det modsatte forekomme, og effektivitetsgevinsterne er højere end forventet. Den typiske opsving for tung kæde er mellem 30-45% og lette kæder er højere, mellem 40-60%. Hver PCR-reaktion (trin I & II) bruger 50 cyklusser til at forstærke fra en enkelt celle. Det høje antal af samlede cyklusser gør også denne metode modtagelig for kontaminering. Sekvensanalyse af amplikoner kan bruges til at afgøre, om et forurenende stof er blevet indført, eller en usædvanlig høj nyttiggørelse sats er blevet lovligt opnået.

Nytten af denne metode til at inddrive indfødte menneskelige antistoffer mod et antigen af valg har flere væsentlige begrænsninger. For det første kan kun opløselige proteiner, der kan mærkes, anvendes som "agn" for strømnings cytometri. For de sorter, der præsenteres i de repræsentative resultater, brugte vi en række syntetiserede overlappende peptider fra Tau protein, da det viste sig vanskeligt at bruge hele proteinet. Brugen af lineære peptider er sandsynligvis ikke optimal, da det kan begrænse identifikationen af antistoffer mod ikke-lineære eller strukturelle epitoper. Men vi var i stand til at identificere flere unikke antistoffer mod Tau, og disse er i øjeblikket undergår yderligere evaluering8,9. En anden begrænsning er den lave gennemløb af molekylær biologi opsving og kloning af IgGs. Den indledende sorterings strategi giver mulighed for screening af millioner af celler, men den efterfølgende molekylærbiologiske behandling består af flere etaper. Løbende optimering indsats for at indarbejde nyere teknologier, såsom Gibson assembly10 har strømlinet flere trin, men flaskehalsen forbliver kloning individuelle tunge og lette kædelspar.

Metoden "bselex" udnytter BCR udtrykt på overfladen af Memory B-celler til at identificere celler, der viser antigen reaktivitet, og derefter genvinde disse individuelle celler via flow flowcytometri11,12. På grund af denne afhængighed af BCR, er metoden begrænset til hukommelsen B celle rummet, og ikke fange antistof udskilning celler (ASCs) såsom plasmablaster. Men, denne fremgangsmåde kan være fordelagtigt at inddrive et bredere repertoire af antigen-specifikke immunoglobiner i forhold til ASCs. Influenza vaccinations undersøgelser viser, at mens reaktive ASC'er kan domineres af et lille antal ekspanderede B-celle kloner, er den antigen specifikke hukommelse B-cellepopulation sjældent klonal12. T-celle receptoren (TCR) på overfladen af T-celler besidder ligheder med B-celle receptoren i genarrangement og rekombination for at maksimere mangfoldigheden. Enkelt celle tilgange svarende til, hvad der er beskrevet i den metode, der præsenteres her er blevet udviklet til vurdering af T-celle repertoire, herunder nyttiggørelse og enkelt celle kloning af alpha og beta kæder13. Imidlertid kræver TCR-genkendelse, at peptider præsenteres af MHC-molekyler, hvilket tilføjer signifikant kompleksitet til den mærkede agn tilgang for at identificere peptidspecifikke T-celler. I modsætning til B-celler gennemgår T-celler ikke affinitets modning af hele variabel regionen, så identifikation af den korte CDR3-region og nogle ledsage sekvens er alt, hvad der kræves til identifikation og rekonstitution. Endelig beskriver denne metode identifikationen af IgG-molekyler ved hjælp af flowcytometri, men det er også muligt at anvende alternative fænotypiske markører til at identificere B-celler af forskellige isotyper.

I øjeblikket er der udviklet metoder til at forbinde den enorme mængde data indsamlet fra næste generations sekvensering med funktionel analyse af antigen specificitet, men disse metoder er stadig ved at blive raffineret. På trods af sine begrænsninger er den metode, der er beskrevet her, blevet anvendt til at identificere antistoffer med potentiel terapeutisk værdi for både infektiøse og ikke-smitsomme sygdomme8,14og15og udgør en pålidelig tilgang til at inddrive relevante antigen-specifikke IgGs fra mennesker, uden omfattende manipulation af B-celler eller omfattende cellekultur.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Lucy Chammas, Martha Costa, Julie Kim, Nancy Heredia og Jeremy Macedo for den omfattende afprøvning af mange metodeændringer og raffinement af den nuværende BSelex platform.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter MoFlo cell sorting
Biotinylated peptides New England Peptide Cell sorting "bait"
Micro Bio-spin P30 gel column BioRad #7326223
Streptavidin (R-PE) Thermo Scientific SA10041
Streptavidin (APC) Thermo Scientific S32362
CD22 MicroBeads, human  Miltenyi #130-046-401
LS columns Miltenyi #130-042-401
Pre separation filters  Miltenyi #130-041-407
PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 BD Biosciences BD#340951
PE-Cy7 mouse anti-human CD27  BD Biosciences #560609
FITC mouse anti-human IgG BD Biosciences #560952
DAPI Life Technologies #D21490
RNaseOUT Life Technologies #10777-019
Bovine serum albumin, Fraction V Sigma #A4503
RPMI media Hyclone #SH30096.01
HI FBS (Fetal bovine serum) Invitrogen #10082147
Mastercycler Gradient Eppendorf Model #6325 PCR machine
PCR 96-well plates Phenix MPS-500
PCR Plate mats Phenix SMX-PCR96
Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix Clontech #639125
Superscript IV First-strand synthesis system Invitrogen #18091050
Phusion High Fidelity Polymerase Thermo Scientific F-531-L
Platinum polymerase Invitrogen #10966108
Nuclease-free water QIAGEN #129114
Oligonucleotide primers IDT assorted Primers for all PCR steps
Gel Extraction Kit QIAGEN #28706
PCR Purification kit QIAGEN #28106
Miniprep Kit QIAGEN #27106
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5520S Gibson assembly
Expi293 Expression Media Invitrogen #A14351-01
ExpiFectamine 293 Transfection Kit Invitrogen #A14525
Opti-MEM Media Invitrogen #31985070
CO2 incubator (Multitron)
Octet RED384 System Pall/ Forte Bio
Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates Thermo Scientific #15500
Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area Corning #3690
Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody Jackson Labs #109-036-097
Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody Jackson Labs #115-035-072
SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component)  KPL #52-00-03
TMB Stop Solution KPL #50-85-06

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs. Journal of Immunology. 197 (10), 4163-4176 (2016).
  2. Corti, D., Lanzavecchia, A. Broadly neutralizing antiviral antibodies. Annual Review of Immunology. 31, 705-742 (2013).
  3. Steinitz, M., Klein, G., Koskimies, S., Makel, O. EB virus-induced B lymphocyte cell lines producing specific antibody. Nature. 269 (5627), 420-422 (1977).
  4. Bloom, A. D., Nakamura, F. T. Establishment of a tetraploid, immunoglobulin-producing cell line from the hybridization of two human lymphocyte lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2689-2692 (1974).
  5. Olsson, L., Kaplan, H. S. Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (9), 5429-5431 (1980).
  6. Lechner, J., et al. Alterations in Circulating Immune Cells in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. Scientific Reports. 5, 16754 (2015).
  7. Loken, M. R., Brosnan, J. M., Bach, B. A., Ault, K. A. Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry. Cytometry. 11 (4), 453-459 (1990).
  8. Pascual, G., et al. Immunological memory to hyperphosphorylated tau in asymptomatic individuals. Acta Neuropathologica. 133 (5), 767-783 (2017).
  9. van Ameijde, J., et al. Enhancement of therapeutic potential of a naturally occurring human antibody targeting a phosphorylated Ser(422) containing epitope on pathological tau. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 59 (2018).
  10. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  11. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. Journal of Immunological Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  12. Wrammert, J., et al. Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus. Nature. 453 (7195), 667-671 (2008).
  13. Han, A., Glanville, J., Hansmann, L., Davis, M. M. Linking T-cell receptor sequence to functional phenotype at the single-cell level. Nature Biotechnology. 32 (7), 684-692 (2014).
  14. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
  15. Jones, H. G., et al. Structural basis for recognition of the central conserved region of RSV G by neutralizing human antibodies. PLoS Pathogens. 14 (3), 1006935 (2018).
  16. Janssen Vaccines & Prevention B.B. US patent. , U.S. Patent Application No. 20170210787, Published July 27, 2017 (2017).

Tags

Immunologi og infektion B celle repertoire B celle receptor enkelt celle kloning celle sortering antistof opdagelse B celle kloning hukommelse B celle tung kæde lyskæde
Enkelt celle screening metode til udvælgelse og nyttiggørelse af antistoffer med ønskede karakteristika fra beriget menneskelig hukommelse B cellepopulationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perry, S. T., Keogh, E., Morton, M., … More

Perry, S. T., Keogh, E., Morton, M., Koudstaal, W., Pascual, G. Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations. J. Vis. Exp. (150), e59809, doi:10.3791/59809 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter