Summary
このプロトコルは、神経活動パターンによって引き起こされる閉ループ刺激のための電気生理学的システムを使用する方法を示す。異なる刺激デバイスに対して簡単に変更できるサンプル Matlab コードも提供されています。
Abstract
閉ループ神経生理学的システムは、神経活動のパターンを使用して刺激を引き起こし、脳活動に影響を与えます。このような閉ループシステムは、すでに臨床応用に見られ、基本的な脳研究のための重要なツールです。特に興味深い最近の開発は、ニューロン活動の特定のパターンが選択されたニューロン群の光学刺激を引き起こすことができるような光遺伝学との閉ループアプローチの統合である。しかし、閉ループ実験用の電気生理学的システムの設定は困難な場合があります。ここでは、単一または複数のニューロンの活性に基づいて刺激をトリガするためのすぐに適用できるMatlabコードが提供される。このサンプル コードは、個々のニーズに基づいて簡単に変更できます。たとえば、サウンド刺激をトリガーする方法と、PC シリアル ポートに接続された外部デバイスをトリガーするように変更する方法を示します。提示されたプロトコルは、動物研究のための一般的なニューロン記録システム(Neuralynx)で動作するように設計されています。閉ループ刺激の実施は、覚醒ラットで実証される。
Introduction
このプロトコルの目的は、神経生理学的実験において閉ループ刺激を実施する方法を実証することです。神経科学における閉ループ実験の典型的なセットアップは、神経活動のオンライン読み出しに基づいて刺激を引き起こすことを含む。これは、順番に、脳活動の変更を引き起こし、したがって、フィードバックループ1、2を閉じます。このような閉ループ実験は、特に光遺伝学と組み合わせることで、研究者がニューロンの特定のサブセットを標的とすることを可能にする標準的なオープンループ設定よりも複数の利点を提供します。例えば、SiegleとWilsonは閉ループ操作を使用して、情報処理におけるセタ振動の役割を研究しました。彼らは、セタ振動の落下段階で海馬ニューロンを刺激することは、上昇期に同じ刺激を適用するよりも行動に異なる影響を及ぼすことを実証した。閉ループ実験は、前臨床試験においてもますます重要になってきています。例えば、複数のてんかん研究は、発作発症時に引き起こされる神経刺激が発作の重症度を減少させる効果的なアプローチであることを示している。また、自動発作検出および治療7の偶発的送達のためのシステムは、8、てんかん患者9、10、11、12において有意な利益を示した。閉ループ方法論の急速な進歩を有する別の応用領域は皮質脳-機械界面を有する神経補綴物の制御である。これは、義足デバイスのユーザーに瞬時にフィードバックを提供することで、精度と機能が大幅に向上するためです。
近年、いくつかの研究室は、閉ループシステム14、15、16、17、18における神経活動および刺激の送達の同時電気記録のためのカスタムシステムを開発した。これらのセットアップの多くは印象的な特性を持っていますが、他のラボで実装することは必ずしも容易ではありません。これは、システムが多くの場合、必要なエレクトロニクスやその他の必要なハードウェアおよびソフトウェア コンポーネントを組み立てるために経験豊富な技術者を必要とするためです。
そこで、神経科学研究における閉ループ実験の採用を容易にするために、本論文は、オープンループ電気生理学的記録セットアップ19、20、21、22を閉ループシステム2、6、23に変換するプロトコルおよびMatlabコードを提供する。このプロトコルは、ニューロン集団記録のための一般的な実験室システムであるデジタルLynx記録ハードウェアで動作するように設計されています。典型的な実験は、以下で構成されています: 1) スパイクデータの5〜20分を記録します。2)ニューロンテンプレートを作成するためのスパイクソート;3)これらのテンプレートを使用して、神経活動パターンのオンライン検出を実行します。4) ユーザー指定のパターンが検出された場合の刺激または実験イベントのトリガ。
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Protocol
ここで説明するすべての手順は、レスブリッジ大学動物福祉委員会によって承認された動物研究プロトコルの下で行われました.
1. 手術
注:神経生理学的記録のためのプローブを移植するために使用される手術手順は、他の出版物24、25、26で提示されている。閉ループ刺激のための手術の正確な詳細は、使用される記録プローブの種類と標的となる脳領域に依存する。しかし、ほとんどの場合、典型的な手術は次のステップで構成されます。
- シリコーンプローブまたは電極アレイを移植するラットを持つケージを手術室に持ち込み、神経活動を記録します。
- 2-2.5%のイソフルランでげっ歯類を麻酔し、ステレオタキシックなフレームで頭を固定します。軽度の触覚刺激25に対する運動反応を観察することにより、手術中に動物が意識不明であることを確認する。
- 手術中の乾燥を最小限に抑えるために、眼軟膏を塗布する。
- 手術部位を剃り、2%クロルヘキシジン溶液と70%イソプロピルアルコールで皮膚を消毒します。
- 電極が埋め込まれた脳領域の頭皮の下にリドカイン(5 mg/kg)を注入する。
- 将来のインプラントの領域にわたって頭皮の切開を行い、メスと綿棒を使用して、露出した頭蓋骨25から骨膜をクリアする。
- インプラント25の構造支持としてアンカーねじ(〜0.5mm)の注入のための頭蓋骨の4-8の穴を開ける。ネジを穴に挿入して頭蓋骨に取り付け、しっかりと固定されていることを確認します。
- 指定した座標で開頭術をドリルし、マイクロドライブ/プローブインプラントを入れ込みます。
注:閉ループ刺激のために記述されたプロトコルは、電極が挿入されている任意の脳領域のために動作します。 - 歯科アクリルを使用して、マイクロドライブ/プローブと必要な電気インタフェースコネクタを頭蓋骨に固定します。歯科用アクリルの量は、インプラントをしっかりと取り付けるのに十分であるべきであるが、周囲の軟部組織25と接触してはならない。
- 手術後、胸骨の再分析25を維持するのに十分な意識を取り戻すまで動物を注意深く監視する。その後の3日間、皮下鎮痛薬(例えばメタカム、1mg/kg)、および感染を予防するための抗生物質(例えばエンロフロキサシン、10mg/kg)を投与する。
注:動物は通常、検査または記録の1週間前に手術から回復するために残されます。
2. ソフトウェアのインストール
注:これは、Windows 10、64ビットバージョンでテストされました。
- データ取得および処理ソフトウェアをインストールします。
- チーター取得システムと対話するライブラリを含むデータ取得システム Cheetah 6.4 (https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control) をインストールします。
- スパイクソートにKlustaKwik27を使用するSpikeSort3D(https://neuralynx.com/software/spikesort-3d)またはその他のソフトウェアをインストールします。オンライン検出ソフトウェアは、KlustaKwik エンジンのクラスター定義を使用します。このソフトウェアは、同じコンピュータ上で実行することも、同じネットワーク上の別のコンピュータで実行することもできます。
- https://neuralynx.com/software/netcom-development-packageからダウンロードできる NetComDevelopmentPackage (https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0) をインストールします。
- Matlab (https://www.mathworks.com/downloads/;コードは Matlab バージョン R2018a でテスト済み)をインストールします。Windows ファイアウォールで Matlab が有効になっていることを確認します。通常、最初の接続中にポップアップが表示されます。
- Matlab アカウントにログインします。ライセンスを選択します。バージョンを選択します。オペレーティング システムを選択します。
- オンライン イベントトリガーのオンライン イベントのライブラリをダウンロードします: https://github.com/leomol/cheetah-interfaceし、ファイルをコンピュータの 'ドキュメント/Matlab' フォルダーに展開します。コードのコピーは、付属の補足資料に記載されています。
3. 初期データ取得
- チーターソフトウェアを使用してデータ取得を開始します。
- テンプレート波形を設定するために、スパイクデータを数分間記録します。
- データ取得を停止し、記録されたデータに対してスパイクソートを実行します。
- スパイクソート3Dを開き、[ファイル|メニュー |[スパイク ファイルを読み込む]をクリックし、記録されたデータを含むフォルダからスパイク ファイルを選択します。
- [クラスタメニュー] をクリックし、[KlustaKwik を使用して自動クラスタ化]をクリックします。
4. 閉ループ実験
- チーターでデータ取得を再開します。
- マラボを開きます。
- クローズドループ.mを開き、[実行]をクリックします。または、Matlab コマンド ウィンドウで ClosedLoop() を実行します。ClosedLoop.m が Matlab パス上にあることを確認します。ユーザーがカスタム関数を使用してすべてのトリガーを呼び出す場合は、代わりに ClosedLoop('コールバック', customFunction) を実行します。
- 最初の記録で定義されたスパイク情報を読み込むには、[読み込み]をクリックし、記録フォルダを参照して、スパイク データ ファイル (.ntt、.nse) の 1 つを選択します。
- プロットされた波形の下にあるチェックボックスをクリックして刺激をトリガーする1つまたは複数のニューロンを選択します。
- [最小一致]テキスト ボックスに整数を入力して、刺激をトリガーするニューロンの最小数を定義します。「ウィンドウ」テキストボックスに数値を入力して、異なる波形に一致するスパイクが共同アクティブと見なされる時間枠を定義します。
- [送信]をクリックして開始します。これは、選択したニューロンのスパイク活動に基づいて、イベント(デフォルトとしてのトーン)のオンライントリガを開始します。
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Representative Results
現場で生まれ育ったフィッシャーブラウンノルウェーのネズミは、実験の前に2週間の取り扱いに習慣がありました。記録ドライブは、前に説明した方法と同様に外科的に移植された、 28、29、30、31、32、33、34.神経信号はデジタル集録システムで32kHzで記録した。ニューロン信号は、最初にユニティゲインワイヤレスヘッドステージで増幅され、次いでゲイン1000で増幅され、600Hz~6,000Hzの間でフィルタリングされたバンドパスが手動で設定された振幅閾値(通常は48~60μV)を超えるニューロンスパイクを自動的に保存し、次いで別個のクラスタに分類した。したがって、各クラスタは、おそらく異なるニューロン27からのスパイクに対応する。このプロトコルのデモンストレーションでは、ラットは植木鉢の上で休んでいましたが、これは行動実験の休憩中になじみのある休息場所でした(図1)。
記録コンピュータの代表的なスクリーンショットを図 2に示します。記録ソフトウェア(左)とMatlabプログラムの同時走行を示し、取得したスパイク波形をリアルタイムで表示します。この Matlab スクリプトは、補足資料に含まれています。定義済みのトリガクラスタからのスパイクが検出されると、Matlab図形ウィンドウ (図 2)に波形が太字の破線で表示され、トーンがトリガーされ、閉ループシステムが提供されます。この閉ループ実験セットアップは、例えば、神経可塑性を研究することを可能にし、そこで神経活動と外部刺激(トーン)を組み合わせることで、それらのニューロンの受容的フィールドに影響を与えることができるかどうかをテストすることができる。
図1:埋め込まれたシリコーンプローブにワイヤレスヘッドステージ(プリアンプと青色のLEDを取り付けたボード)を搭載したラットの写真。プローブは歯科アクリル(ピンクの材料)の下に置かされ、目に見えません。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:記録および閉ループソフトウェアのスクリーンショット左方向のパネルは、データ取得の視覚化と制御に使用されるチーター記録システムの一部であるウィンドウです。画面右側のウィンドウには、説明したソフトウェアを実行している Matlab セッションが表示されます。中央のウィンドウには、定義済みのテンプレートに一致するオンライン検出スパイクの波形が表示されます。そのクラスターに属するスパイクは、提示されたビデオで音をトリガーするために使用されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: データ フローのスケマティック パイプラインこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:刺激遅延のテスト(A) 人工スパイクを生成してからトリガされた信号の時間との間の遅延のヒストグラム。(B) 人工スパイク波形を生成するマイクロプロセッサボードのセットアップの概略図。黒とオレンジの接続は波形のようなRC(0~810mV)を出力し、810μVに電圧を低減する「シグナルマウス」インターフェースを介してヘッドステージに接続され、ブレッドボードの同じカラムに差し込まれたコンポーネントが接続されています(抵抗:110オーム、220オーム、1000オーム、コンデンサ:10μF)。ArduinoはUSB /UARTを介してPCに接続され、Arduinoのスパイクを引き起こし、Arduino回路と集録ソフトウェアAPIの両方からバック信号を受信しました。Arduinoは1000スパイクを生成するように指示されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1: マトラボスクリプト.このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、標準的な神経生理学的記録システムを使用して閉ループ刺激を行う方法を示す。このプロトコルは、コンピュータサイエンスの限られた専門知識を持つ神経科学者が、少ないコストで様々な閉ループ実験を迅速に実施することを可能にします。このような実験は、脳内の因果関係を研究するためにしばしば必要である。
動物を準備し、ソフトウェアをインストールした後(ステップ1&2)、閉ループ実験は2つの別々の段階で構成されています。まず、初期データ集録(ステップ3)は、単一ニューロンの活性に対応するテンプレートを定義するデータを収集する(すなわち、スパイクソート;ステップ 3.5)。第二に、新たに記録されたスパイクがリアルタイムで事前定義されたクラスターに自動的に割り当てられ、スパイクが指定されたニューロンを形成した場合に刺激をトリガする閉ループ刺激(ステップ4)。提示されたMatlabスクリプト(補足資料を参照)は、単一のニューロンの活性および複数の選択されたニューロンの活性に基づいて異なる刺激のトリガを示す。ニューロンは情報をアセンブリとして処理すると考えられているため、後者は特に重要なオプションです(例えば、パケット35、36)。したがって、ニューロン集団パターンに基づく刺激を引き起こすことは、幅広い研究の質問に答える重要なツールである可能性があります。閉ループ制御中のデータ フローを図 3に示します。
このプロトコルデモンストレーションでは、3 kHzトーン刺激を使用しました。この純粋なトーンは、変数「tone0」を変更することで任意の音波形に置き換えることができます。また、スピーカーの代わりに、他の多くのデバイスをコンピュータのオーディオ出力に接続して刺激をトリガーすることもできます。例えば、オーディオ出力は、低周波(20Hz)触覚刺激22を提供するために振動モータを駆動するために使用された。または、Matlab コードを使用して、コンピュータのシリアル ポートに接続されたデバイスに TTL 信号を送信することもできます。これを行うには、'sound()' コマンドを次のコードに置き換えることで実現できます。fopen(obj);Obj。送信する要求 = 'オン' です。このメソッドの実装例は、補足資料(pulse.m を参照) で提供されています。同様に、Matlab を使用して、USB ポートを介して外部デバイスに信号を送信できます。したがって、ここで示すコードを使用すると、ユーザーはさまざまな方法で閉ループトリガーを複数のデバイスに送信できます。
テストでは、ニューロンスパイクとトリガ信号間の時間遅延が約13ミリ秒(最小9ms、最大15ms)であることがわかります。時間遅延の分布を図 4Aに示します。この遅延テストでは、Arduinoを使用して(ヘッドステージを介して)取得システムに人工スパイクを送信しました。遅延は、クローズドループMatlabスクリプトを実行している集録PCからのスパイクとトリガ信号の間の時間として記録されました。スパイクを生成する Arduino セットアップの概略を図 4Bに示します。
ここで紹介するアプローチはソフトウェアで実装されているため、専用のハードウェアを搭載したシステムの時間的な精度で刺激を提供できない場合があります。例えば、TDT(タッカーデイビステクノロジーズ)は、ミリ秒以内に刺激を提供できるスパイクトリガ刺激用システムを提供しています。ただし、ここで紹介する Matlab ソリューションの利点は、Cheetah 記録ハードウェアを所有するユーザーの低コスト、刺激を引き起こすアクティビティ パターンを定義する柔軟性、およびニューロン テンプレートを定義する柔軟性です。さらに、多くの実験では単一ミリ秒の精度は必要なため、このアプローチの実装の容易さは大きな利点を提供する可能性があります。
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Disclosures
著者は、この作品に関連する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この作業は、AL および AG に対する NSERC ディスカバリー許可によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril | Bayer, Mississauga, CA | DIN 02169428 | antibiotic; 50 mg/mL |
| Cheetah 6.4 | NeuraLynx, Tucson, AZ | 6.4.0.beta | Software interfaces for data acquisition |
| Digital Lynx 4SX | NeuraLynx, Tucson, AZ | 4SX | recording equipment |
| Headstage transmitter | TBSI | B10-3163-GK | transmits the neural signal to the receiver |
| Isoflurane | Fresenius Kabi, Toronto, CA | DIN 02237518 | inhalation anesthetic |
| Jet Denture Powder & Liqud | Lang Dental, Wheeling, US | 1230 | dental acrylic |
| Lacri-Lube | Allergan, Markham, CA | DIN 00210889 | eye ointment |
| Lido-2 | Rafter 8, Calgary | DIN 00654639 | local anesthetic; 20 mg/mL |
| Matlab | Mathworks | R2018b | software for signal processing and triggering external events |
| Metacam | Boehringer, Ingelheim, DE | DIN 02240463 | analgesic; 5 mg/mL |
| Netcom | NeuraLynx | v1 | Application Programming Interface (API) that communicates with Cheetah |
| Silicone probe | Cambridge Neurotech | ASSY-156-DBC2 | implanted device |
| SpikeSort 3D | NeuraLynx, Tucson, AZ | SS3D | spike waveform-to-cell classification tools |
| Wireless Radio Receiver | TBSI | 911-1062-00 | transmits the neural signal to the Digital Lynx |
References
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