Summary
هنا، نقوم بوصف طريقة تصوير بؤرية بسيطة لتصور التوطين في الموقع للخلايا التي تفرز غاما الإنترفيرون السيتوكين في الأعضاء اللمفاوية الثانوية المورين. يمكن توسيع هذا البروتوكول لتصور السيتوكينات الأخرى في الأنسجة المتنوعة.
Abstract
السيتوكينات هي بروتينات صغيرة تفرزها الخلايا، وتوسط الاتصالات الخلية الخلية التي هي حاسمة للاستجابات المناعية الفعالة. إحدى خصائص السيتوكينات هي الجنبية، كما أنها تنتج من قبل ويمكن أن تؤثر على العديد من أنواع الخلايا. على هذا النحو، من المهم أن نفهم ليس فقط الخلايا التي تنتج السيتوكينات، ولكن أيضا في البيئة التي يفعلون ذلك، من أجل تحديد علاجات أكثر تحديدا. هنا، ونحن نصف طريقة لتصور إنتاج السيتوكين في الموقع بعد العدوى البكتيرية. تعتمد هذه التقنية على تصوير الخلايا المنتجة للسيتوكين في بيئتها الأصلية عن طريق الفحص المجهري البؤري. للقيام بذلك، يتم تلوين أقسام الأنسجة لعلامات من أنواع الخلايا متعددة جنبا إلى جنب مع وصمة عار السيتوكين. مفتاح هذه الطريقة، يتم حظر إفراز السيتوكين مباشرة في الجسم الحي قبل حصاد أنسجة الاهتمام، مما يسمح للكشف عن السيتوكين التي تراكمت داخل الخلايا المنتجة. مزايا هذا الأسلوب متعددة. أولاً، يتم الحفاظ على البيئة الدقيقة التي يتم فيها إنتاج السيتوكينات، والتي يمكن أن تبلغ في نهاية المطاف عن الإشارات المطلوبة لإنتاج السيتوكين والخلايا المتأثرة بتلك السيتوكينات. وبالإضافة إلى ذلك، يعطي هذا الأسلوب مؤشرا على موقع إنتاج السيتوكين في الجسم الحي، كما أنها لا تعتمد على إعادة تحفيز الخلايا المنتجة في المختبر. ومع ذلك، فإنه ليس من الممكن في وقت واحد تحليل إشارات السيتوكين المصب في الخلايا التي تتلقى السيتوكين. وبالمثل، فإن إشارات السيتوكين التي لوحظت لا تتوافق إلا مع النافذة الزمنية التي تم خلالها حظر إفراز السيتوكين. في حين أننا نصف التصور من السيتوكين إنترفيرون (IFN) غاما في الطحال بعد عدوى الماوس من قبل البكتيريا داخل الخلايا الليستيريا monocytogenes، يمكن أن يكون هذا الأسلوب يحتمل أن تتكيف مع التصور من أي السيتوكين في معظم الأعضاء.
Introduction
تنسيق استجابة مناعية فعالة ضد مسببات الأمراض يتطلب التكامل المعقد للإشارات التي تعرضها مجموعة متنوعة من الخلايا المناعية التي غالبا ما تنتشر بين الكائن الحي. من أجل التواصل، تنتج هذه الخلايا بروتينات صغيرة قابلة للذوبان مع وظائف بيولوجية متعددة تعمل كمعناتي يسمى السيتوكينات. Cytokines السيطرة على تجنيد الخلايا، وتفعيل وانتشار وبالتالي من المعروف أن تكون اللاعبين الرئيسيين في تعزيز الاستجابات المناعية1. تتطلب الاستجابات المناعية الفعالة إطلاق السيتوكينات في نمط spatiotemporal منظم جداً يربط خلايا محددة للحث على إشارات محددة. ولذلك، من الأهمية بمكان دراسة إنتاج السيتوكين وإشاراته في الموقع، مع مراعاة البيئة الدقيقة التي يتم فيها إنتاج السيتوكينات.
الليستيريا أحادية الخلايا (L. monocytogenes)هو بكتيريا داخل الخلايا إيجابية الجرام تستخدم كنموذج رئيسي لدراسة الاستجابات المناعية لمسببات الأمراض داخل الخلايا في الفئران. يتم إنتاج واحدة السيتوكين، IFN غاما (IFNγ) بسرعة، في غضون 24 ساعة بعد عدوى L. monocytogenes. فمن الضروري لإزالة مسببات الأمراض، والفئران خرج لIFNγ هي عرضة للغايةللعدوى L. monocytogenes 2. IFNγ هو pleiotropic وتنتجها خلايا متعددة بعد العدوى3. في حين أن IFNγ التي تنتجها الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) مطلوبة للنشاط المباشر المضاد للبكتيريا4، فقد ثبت IFNγ من مصادر أخرى أن لديها وظائف أخرى. في الواقع، وجدنا نحن وآخرين مؤخرا أن IFNγ التي تنتجها خلايا CD8 + T لديه وظيفة محددة في تنظيم مباشرة T خلية التمايز5،6،7. وعلى هذا النحو، فإن فهم الخلايا التي تنتج هافنج (والبيئة الدقيقة) أمر بالغ الأهمية لتشريح وظيفتها.
التقنية الأكثر شيوعا لدراسة إنتاج السيتوكين يعتمد على تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا التي تم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. تسمح هذه الطريقة بالكشف المتزامن عن السيتوكينات المتعددة جنبا إلى جنب مع علامات سطح الخلية داخل عينة واحدة، وتوفير أداة مفيدة للغاية لدراسة إنتاج السيتوكين. ومع ذلك، فإن استخدام التقنية المذكورة أعلاه يعني فقدان أي معلومات مكانية. وبالإضافة إلى ذلك، غالباً ما يعتمد الكشف عن السيتوكين على إعادة التحفيز في المختبر لتمكين الكشف عن السيتوكين. على هذا النحو ، يتم تحليل قدرة خلية معينة لإنتاج السيتوكين ، وأنها لا ترتبط بالضرورة مع إفراز السيتوكين الفعلي في الموقع. طرق أخرى استخدام الفئران مراسل الذي يرتبط التعبير البروتين الفلورسنت مع النسخ السيتوكين ويسمح للتصور على مستوى خلية واحدة8. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن تتبع النسخ السيتوكين في الموقع، وهناك عدد محدود من الفئران السيتوكين مراسل المتاحة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون النسخ والترجمة وإفراز في بعض الأحيان غير مرتبطة، والبروتينات الفلورية لها نصف عمر مختلف من السيتوكين أنها تقرير، مما يجعل هذه الطريقة في بعض الأحيان غير كافية لالتصور السيتوكين في الموقع.
هنا، ونحن نصف طريقة لتصور في الموقع إنتاج السيتوكين عن طريق الفحص المجهري البؤري في قرار خلية واحدة. هذه التقنية تمكن من تصور المصدر الخلوي ومحراب المحيطة داخل الأنسجة. يصف هذا البروتوكول على وجه التحديد التصور لإنتاج IFNγ في طحال الفئران المصابة L. monocytogenes، مع التركيز هنا على إنتاج IFNγ بواسطة خلايا NK ومستضد CD8+ T خلايا محددة. ومع ذلك، فإنه يمكن تمديدها وتكييفها مع توصيف أي إنتاج السيتوكين في سياق الحالات الأخرى التي يتم فيها إنتاج السيتوكينات مثل العدوى أو الالتهاب أو أمراض المناعة الذاتية، طالما يمكن الاحتفاظ السيتوكين المستهدف في الخلايا بواسطة مثبطات نقل البروتين داخل الخلايا.
Protocol
وكانت جميع التجارب التي شملت الفئران متفقة مع قانون الإجراءات العلمية في المملكة المتحدة لعام 1986.
1. نقل التبني من CD8 المضادة للجيناتمحددة + الخلايا T في الفئران
- عزل ovalbumin (OVA) محددة CD8+ T الخلايا (OTI) التعبير عن البروتين الفلورسنت الأخضر (OTI-GFP) أو بروتين الفلورسنت الأحمر (OTI-RFP) من تعليق العقدة الليمفاوية من الفئران المعدلة وراثيا مستقبلات الخلايا T9،10 باستخدام الماوس CD8+ T مجموعة عزل الخلية وفقا لتعليمات التصنيع. إعداد تعليق الخلية عن طريق تحطيم الغدد الليمفاوية باستخدام الغطاس حقنة، كما سبق وصفه11.
- نقل خلايا OTI-GFP أو OTI-RFP (3 x 106 خلايا) إلى C57BL/6 متلقي الفئران من النوع البري عن طريق الحقن الوريدي كما هو موضح من قبل Cahalan وآخرون12. استخدم الفئران التي عادة ما تكون من 6-12 أسبوع من العمر.
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ومطلوبة فقط لتعقب خلايا CD8+ T الخاصة بمستضد.
2. عدوى الليستيريا أحادية الخلايا
- توسيع L. monocytogenes المعدلة وراثيا للتعبير عن OVA (LM-OVA)13 إلى مرحلة أسية من النمو في ضخ القلب المرق في 37 درجة مئوية تحت التحريض لطيف حتى OD600 يصل 0.08-0.1، كما سبق وصفه في إشارة 14.
- حقن 100 ميكرولتر (الحد الأقصى لحجم = 200 ميكرولتر) من 0.1-0.5 LD50 LM-OVA المخففة في محلول الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) عن طريق الحقن الوريدي باستخدام حقنة الأنسولين 29 G، إلى C57BL/6 المتلقين الفئران نوع البرية تحمل OTI-GFP أو OTI-RFP الخلايا عند الإشارة إليها.
ملاحظة: في أيدينا، 0.1 × LD50 LM-OVA يتوافق مع 2 × 104 وحدات تشكيل مستعمرة (CFU). L. يتم استخدام الجينات الأحادية المعدلة وراثيا للتعبير عن OVA لتنشيط خلايا OTI CD8+ T المنقولة سابقا، ولكن يمكن استخدام سلالات أخرى من L. monocytogenes.
3. العلاج مع بريفيلدين A (BFA) لمنع إفراز السيتوكين
- حقن 250 ميكروغرام من BFA في 200 درجة مئوية من PBS intraperitoneally 6 ح قبل التضحية الماوس باستخدام حقنة الأنسولين 29 G.
ملاحظة: ويُعيد أولاً تعليق البواك اللايفيل في أكسيد السلفونيك (DMSO) لإعداد مخزون من تركيز قدره 25 ملغم/مل. ثم يتم تخفيف BFA في PBS في درجة حرارة الغرفة (RT) لتجنب التبلور قبل الحقن. تثبيط إفراز السيتوكين يحفز تراكم IFNγ في الخلايا. هذا أمر بالغ الأهمية للكشف عن السيتوكين.
4. حصاد الطحال
- قتل الفئران باستخدام ارتفاع تركيز ثاني أكسيد الكربون2 تليها خلع عنق الرحم.
ملاحظة: اتبع المبادئ التوجيهية للمؤسسة المحلية للقتل الرحيم الإنساني للفئران. - تطهير البطن مع الإيثانول 70٪، وجعل شق مع مقص لجعل 1-2 سم قطع من خلال الجلد على الجناح الأيسر من الماوس، حيث يقع الطحال. قم بعمل شق بعناية في الطالمكشوفة لفضح الطحال وإخراجه مع ملاقط. حصاد الطحال، والحرص على عدم الضغط عليه مع ملقط أو قطع لتجنب تعطيل الهندسة المعمارية الطحال.
5. تثبيت الطحال مع البارافورمالهايد (PFA)
- إعداد الحل المثبت عن طريق خلط 3.75 مل من PBS و 3.75 مل من 0.2 M L-يسين. إضافة 21 ملغ من الصوديوم م-periodate وتخلط جيدا. ثم إضافة 2.5 مل من 4٪ PFA و 20 درجة مئوية من 12 N هيدروكسيد الصوديوم.
ملاحظة: استخدم الحل المثبت في نفس اليوم وتجاهل الزائدة. لا تخزنه. هذه الخطوة التثبيت مهم إذا كانت العينة تحتوي على بروتينات الفلورسنت مثل GFP. لا تستخدم PFA التي تحتوي على آثار الميثانول، كما أنه تشوه البروتينات الفلورية.
تحذير: PFA سامة ويجب التعامل معها بحذر. - غمر الطحال في المثبت وإصلاح لمدة لا تقل عن 4 ساعة، وعادة 16-20 ساعة في 4 درجة مئوية تحت التحريض لطيف.
- تجاهل الحل المثبت وإضافة 5 مل من PBS لمدة 5 دقائق في RT تحت التحريض لطيف.
- استبدال PBS مع 5 مل من احتضان PBS الطازجة لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية تحت التحريض لطيف.
- استبدل الـ PBS بـ 5 مل من السكروز بنسبة 30%، وحضانة لمدة 12-24 ساعة.
ملاحظة: تساعد هذه الطريقة في الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة. بعد الحضانة مع محلول السكروز ، يجب أن يغرق الجهاز في الجزء السفلي من البئر.
6. التجميد والقسم
- وضع الثلج الجاف في وعاء كبير ووضع وعاء أصغر داخل تحتوي على حوالي 50 مل من الميثانول النقي وعدد قليل من قطع من الجليد الجاف.
- جفف الطحال بلطف على مسحة خالية من الوبر.
- ضع الطحال داخل قالب قاعدة يحتوي على قطرة من درجة الحرارة المثلى (OCT) مركب في الجزء السفلي. يجب الحرص على عدم إنتاج أي فقاعات. إضافة OCT على الطحال.
- مع ملقط، إيداع العفن قاعدة على سطح الميثانول، والتأكد من أنه لا تلمس OCT. تجميد الأنسجة في أسرع وقت ممكن للحد من القطع الأثرية.
- عندما يتم تجميده، والمضي قدما في القسم.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالطحال المجمد عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر. -
قسم الأنسجة باستخدام ميكروتومي كريوميكروم.
- تعيين درجة حرارة الغرفة على cryostat ينبغي أن -21 درجة مئوية. قطع أقسام من سمك المطلوب (عادة حوالي 10 ميكرومتر). يعمل هذا البروتوكول مع سمك تصل إلى 30 درجة مئوية.
- جمع المقاطع على الشرائح المجهر الزجاج (انظر جدولالمواد) وفحص بصريا.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالأقسام عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
7. تلطيخ الفلورسنت المناعي
- السماح للقسم أن يأتي إلى RT.
- رسم دائرة مع مانع السائل (على سبيل المثال، قلم PAP) حول قسم الأنسجة. رسم خارج OCT أو أنها لن عصا.
- مرة واحدة وقد جفت، إعادة ترطيب العينة عن طريق وضع PBS على قسم الأنسجة لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: تعتمد وحدة التخزين التي تم وضعها على القسم على حجم المقطع. نحن عادة ما نستخدم 100-300 درجة مئوية. لا تدع المقاطع تجف بمجرد إعادة ترطيبها. - شطف مع PBS مرتين على الأقل لضمان أن يتم الالتزام جيدا القسم إلى الشريحة.
-
إضافة حل حظر إلى المقطع لتقليل ربط غير محدد للأجسام المضادة.
- إعداد حل حجب على النحو التالي: PBS مع 0.1٪ تريتون X100، 2٪ مصل الساق الجنينية (FCS)، 2.5 ميكروغرام / مل Fc مستقبلات مانع (مكافحة الماوس CD16/32). ثم يضاف 2-5٪ المصل الطبيعي من الأنواع من كل الأجسام المضادة الثانوية من لوحة تلطيخ.
ملاحظة: إذا كانت الأجسام المضادة مترافقة مباشرة/ biotinylated، إضافة 5٪ المصل الطبيعي من الأنواع من كل الأجسام المضادة الأولية. إذا كان الجسم المضاد الأولي وأحد الأجسام المضادة الثانوية من نفس النوع (على سبيل المثال، الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في الأرنب والأرنب الثانوي المضادة للفئران)، لا تستخدم أنواع المصل العادية لأنها سوف تزيد من إشارة الخلفية. - قم بإزالة PBS بلطف من القسم حسب الطموح وأضف 100 لتر من محلول الحظر لكل مقطع عينة. الحضانة في غرفة رطبة مغطاة لمدة لا تقل عن 1 ساعة في RT.
- إعداد حل حجب على النحو التالي: PBS مع 0.1٪ تريتون X100، 2٪ مصل الساق الجنينية (FCS)، 2.5 ميكروغرام / مل Fc مستقبلات مانع (مكافحة الماوس CD16/32). ثم يضاف 2-5٪ المصل الطبيعي من الأنواع من كل الأجسام المضادة الثانوية من لوحة تلطيخ.
-
وصمة عار مع الأجسام المضادة الأولية.
- تخفيف الأجسام المضادة الأولية في التركيز الأمثل في حل حظر. تركيز الأجسام المضادة نقطة البداية العامة هو 5 ميكروغرام / مل، ولكن ينبغي أن يكون الأمثل لكل الأجسام المضادة والأنسجة.
ملاحظة: إذا كانت الأجسام المضادة مترافقة مباشرة، فإن الطرد المركزي يُمزج الأجسام المضادة عند 17.135 × ز (13.500 دورة في الدقيقة) لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية قبل استخدامها. الفلوروفورس يمكن أن يعجل. هذه الخطوة سوف بيليه الرواسب وبالتالي منع ترسب غير محددة من الأجسام المضادة عجلت على الشريحة. - استبدال حل حظر مع مزيج الأجسام المضادة الأساسية لكل عينة.
- الحضانة لمدة 4 ساعات في RT أو بين عشية وضحاها (OVN) في 4 درجة مئوية في غرفة رطبة مغطاة.
- تخفيف الأجسام المضادة الأولية في التركيز الأمثل في حل حظر. تركيز الأجسام المضادة نقطة البداية العامة هو 5 ميكروغرام / مل، ولكن ينبغي أن يكون الأمثل لكل الأجسام المضادة والأنسجة.
-
قم بالغسيل.
- إعداد مخزن الغسيل المؤقت عن طريق إضافة 2% FCS إلى PBS.
- اغسل 4 مرات مع مخزن الغسيل: واحد سريع (بدون حضانة)، واحد لمدة 10 دقائق واثنين لمدة 5 دقائق. ثم إجراء غسل النهائي مع PBS لمدة 5 دقائق.
-
تلطيخ مع الأجسام المضادة الثانوية.
- تخفيف الأجسام المضادة الثانوية ذات الفائدة عند التركيز الأمثل في محلول الحظر. الطرد المركزي المزيج، كما هو موضح للأجسام المضادة الأولية.
- قم بإزالة حل الغسيل النهائي. أضف مزيج الأجسام المضادة الثانوي أعلى القسم واحتضنه لمدة 1-4 ساعة في RT في غرفة رطبة مغطاة.
- اغسل 4 مرات مع مخزن الغسيل: واحد سريع (بدون حضانة)، واحد لمدة 10 دقائق واثنين لمدة 5 دقائق. ثم إجراء غسل النهائي مع PBS لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة حل الغسيل النهائي. السماح لPBS تتبخر ولكن لا الإفراط في تجفيف القسم. وضع قطرة من المتوسطة تصاعد على رأس العينة ووضع بعناية الزجاج غطاء على أعلى منه. يجب على وسيط ة التركيب استرداد القسم بأكمله. السماح لها بولميراز OVN في RT محمية من الضوء.
ملاحظة: ارسم دائرة حول القسم على الجانب العكسي من الشريحة قبل تطبيق وسيط التركيب. بمجرد تطبيق وسيلة التركيب، قد يصبح من الصعب رؤية الأنسجة. - تخزين الشرائح في الظلام عند 4 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للصورة.
8. التصوير والتحليل
- إجراء تصوير للتلطيخ مع المجهر البؤري.
ملاحظة: وفي هذا البروتوكول، استُخدم مجهر مسح بالليزر الطيفي المقلوب (انظر جدولالمواد)، إلى جانب الأهداف 10x/NA 0.40 أو 60x/NA 1.4 (لتحليل توطين السيتوكين الفرعي الخلوي). يتم عرض أطوال موجية من الإثارة والانبعاثات لكل بروتين فلوروفور وفلورسنت في جدول المواد. - إجراء التحليل والقياس الكمي حسب الاقتضاء باستخدام برامج معالجة الصور (مثل إيماريس أو فيجي).
Representative Results
IFNγ المنتجة في أول 24 ساعة بعد عدوى الليستيريا أحادية الخلايا أمر بالغ الأهمية للسيطرة على انتشار هذا الممرض. باستخدام هذا البروتوكول، يمكننا تصور ليس فقط الخلايا التي تنتج IFNγ ولكن أيضا ما إذا كانت موجودة في بيئة صغيرة محددة. لمساعدتنا في تحديد بنية الطحال، وصفنا الخلايا المعروفة أن لها موقع معين داخل الطحال. علامة F4/80 تسميات جميع الضامة ويسلط الضوء على اللب الأحمر. علامة B220 تسميات الخلايا B ويسلط الضوء على بصيلات الخلايا B المحيطة منطقة الخلية T. علامة CD169 تسميات الضامة المنطقة الهامشية،المحيطة اللب الأبيض (الشكل 1). معظم خلايا OTI، سواء كانت تعبر عن IFNγ أم لا، موجودة في اللب الأبيض وعلى هذا النحو، جميع الصور هي تلك التي من اللب الأبيض، ما لم يذكر.
خطوة حاسمة واحدة في هذا البروتوكول هو استخدام BFA لمنع إفراز السيتوكين. في الواقع، كان الكشف عن IFNγ من قبل خلايا ناغورني كاراباخ ضعفت إلى حد كبير عندما لم يتم التعامل مع الفئران مع BFA (الشكل2). باستخدام بروتوكولنا، يمكن أن نجد أن اثنين على الأقل من أنواع الخلايا تنتج IFNγ 24 ساعة بعد العدوى - خلايا NK وCD8+ الخلايا T محددة مستضد (الشكل3)- على غرار ما تم العثور عليه سابقا عن طريق قياس التدفق الخلوي3.
في الموقع كشف التصوير من الخلايا المنتجة IFNγ أن إنتاج IFNγ لا ينتشرفي جميع أنحاء الطحال، ولكن تتركز في مناطق سرية (الشكل 4). في الواقع، وجدنا أن الخلايا T تم تفعيلها في جميع أنحاء الطحال (أبرزها تجميع الخلايا T)، وهذا لم يرتبط بالضرورة مع إنتاج IFNγ. أحد التفسيرات المحتملة هو أن إنتاج IFNγ يقتصر على موقع الخلايا المصابة15و16وتنشيط الخلايا T - ممثلة بالتجميع - يمكن أن يكون مدعوماً من قبل كل من المصابين (IFNγ إيجابية) وغير المصابة (IFNγ سلبية) الخلايا التي تقدم مستضد. وسوف تكون هناك حاجة إلى بقع أخرى لتحديد الموقع الدقيق والحصول على إشارة إلى الآلية التي تقيد إنتاج IFNγ إلى هذه المنطقة وعلاقتها بنقل المستضد. ومن المثير للاهتمام، وجدنا أن الخلايا T المنشطة، مجمعة، مستضد محددة تقع في جميع أنحاء اللب الأبيض للطحاللكنها تنتج IFNγ فقط في المناطق التي تتعايش فيها خلايا NK معهم (الشكل 5). وعلى هذا النحو، فإن وجود خلايا ناغورني كاراباخ يحدد بيئة صغيرة محددة في اللب الأبيض، حيث تنتج الخلايا T المجمعة IFNγ بدلاً من الخلايا T المجمعة في الجزء الآخر من اللب الأبيض. وهذا يشير إلى أن تنشيط الخلية T غير كافية لإملاء إنتاج IFNγ في هذه النقطة الزمنية.
ميزة أخرى مثيرة للاهتمام أبرزها بروتوكولنا هو توطين مختلف sub-cellular من IFNγ في NK مقابل CD8+ T الخلايا5. كما هو موضح في الشكل 6، في حين ينتشر توطين IFNγ في خلايا NK في السيتوسول، CD8+ T الخلايا غالباً ما تجنيد IFNγ نحو خلية T أخرى.
الشكل 1: علامات تسلط الضوء على بنية الطحال. وقد أصيبت الفئران بالعدوى 2 x 104 CFU LM-OVA و24 ساعة بعد العدوى. تم زرع الطحال ومعالجتها كما هو موضح في البروتوكول. (أ) كانت المقاطع ملطخة بخلايا ناغورني كاراباخ (المضادة للNCR1 تليها مكافحة الماعز IgG-FITC؛ الأخضر)، وخلايا OTI-RFP (الأحمر) والضامة (المضادة للF4/80-APC؛ أرجواني). RP = اللب الأحمر; WP = اللب الأبيض. شريط مقياس = 200 درجة مئوية (B) كانت ملطخة أقسام للخلايا B (المضادة للB220 المحيط الهادئ الأزرق; الأزرق)، خلايا OTI-GFP (إشارة GFP تظهر باللون الأحمر) والضامة المنطقة الهامشية (المضادة للCD169-Alexa647؛ أرجواني). RP = اللب الأحمر; BF = بصيلات الخلايا B; TZ = منطقة الخلية T. شريط مقياس = 50 درجة مئوية. هذه صورة تمثيلية لـ 3 تجارب مستقلة (N = 4). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يسمح علاج BFA بالكشف عن IFNγ داخل الخلايا في الموقع. يقتصر إنتاج Nγ على مناطق محددة في الفئران الطحال كانت مصابة 2 × 104 كفو LM-OVA وعولجت مع BFA (A) أو تركت دون علاج (B) بعد 18 ح. تم قتل الفئران 24 ساعة بعد العدوى. تم زرع الطحال ومعالجتها كما هو موضح في البروتوكول. وكانت المقاطع ملطخة بخلايا ناغورني كاراباخ (المضادة للNCR1 تليها مكافحة الماعز IgG-FITC؛ الأخضر)، وخلايا OTI-RFP (الأحمر) وIFNγ (المضادة للIFNγ-BV421؛ سماوي). شريط مقياس = 5 ميكرومتر. هذه صورة تمثيلية للمناطق الغنية بالخلايا في ناغورني كاراباخ من 3 تجارب مستقلة (N = 3). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: IFNγ إنتاج الخلايا في الطحال. وقد أصيبت الفئران بإصابة 2 x 104 CFU LM-OVA عندما أشير إليها وعولجت ببوا بعد 18 ح. تم قتل الفئران 24 ساعة بعد العدوى. تم زرع الطحال ومعالجتها كما هو موضح في البروتوكول. وكانت المقاطع ملطخة بخلايا ناغورني كاراباخ (المضادة للNCR1 تليها مكافحة الماعز IgG-FITC؛ الأخضر)، وخلايا OTI-RFP (الأحمر) وIFNγ (المضادة للIFNγ-BV421؛ سماوي). (أ) صورة تمثيلية لطحال من فأر ساذج غير مصاب لإظهار عدم وجود تلطيخ غير محدد. الخطوط البيضاء تحدد اللب الأبيض. WP = اللب الأبيض؛ RP = اللب الأحمر. (ب) صورة تمثيلية لللب الأبيض من طحال فأر مصاب بـ LM-OVA، يظهر غزو خلايا ناغورني كاراباخ إلى اللب الأبيض وإنتاج IFNγ من قبل خلايا ناغورني كاراباخ، وخلايا OTI والخلايا غير الموسومة. الصور ممثلة من 4 تجارب مستقلة (N = 4). قضبان مقياس = 70 ميكرومتر (A)؛ و20 ميكرومتر (ب). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: يقتصر إنتاج IFNγ على مناطق محددة في الطحال بعد عدوى LM-OVA. وقد أصيبت الفئران بإصابة 2 x 104 CFU LM-OVA وعولجت بBFA بعد 18 ح. تم قتل الفئران 24 ساعة بعد العدوى. تم زرع الطحال ومعالجتها كما هو موضح في البروتوكول. وكانت جميع الأقسام ملطخة بالخلايا باء (B220-Pacific Blue Ab, Blue) وIFNγ (anti-IFNγ-biotin تليها streptavidin-PE; cyan). خلايا OTI-GFP (إشارة GFP تظهر باللون الأحمر). خطوط سماوية تتوافق مع المناطق ذات الإنتاج العالي IFNγ. هذه هي الصور التمثيلية لـ 4 تجارب مستقلة (N = 4). (أ) كانت ملطخة أقسام للماكروفيج المنطقة الهامشية (مكافحة CD169-اليكسا 647، أرجواني). شريط مقياس = 50درجة مئوية (B) كانت ملطخة أقسام لجميع الضامة (F4/80). شريط مقياس = 100 درجة.
الشكل 5: يحدث إنتاج IFNγ بواسطة خلايا OTI المنشطة في بيئة صغيرة محددة. وقد أصيبت الفئران بإصابة 2 x 104 CFU LM-OVA وعولجت بBFA بعد 18 ح. تم قتل الفئران 24 ساعة بعد العدوى. تم زرع الطحال ومعالجتها كما هو موضح في البروتوكول. وكانت المقاطع ملطخة بخلايا ناغورني كاراباخ (المضادة للNCR1 تليها مكافحة الماعز IgG-FITC؛ الأخضر)، وخلايا OTI-RFP (الأحمر) وIFNγ (المضادة للIFNγ-BV421؛ سماوي). وتبرز الخطوط الخضراء والحمراء مناطق الخلايا في ناغورني كاراباخ وأوتي، على التوالي. يشير السهم الأبيض إلى أمثلة من كتل الخلايا T التي لا تنتج IFNγ. السهام الخضراء أمثلة من مجموعات الخلايا T المنتجة IFNγ. شريط مقياس = 100 درجة مئوية. هذه صورة تمثيلية لأربع تجارب مستقلة (N = 4). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: توطين IFNγ في خلايا ناغورني كاراباخ وخلايا T. وقد أصيبت الفئران بإصابة 2 x 104 CFU LM-OVA وعولجت بBFA بعد 18 ح. تم قتل الفئران 24 ساعة بعد العدوى. تم زرع الطحال ومعالجتها كما هو موضح في البروتوكول. وكانت جميع الأقسام ملطخة لIFNγ (المضادة للIFNγ-BV421؛ سماوي). الخطوط البيضاء تحدد حواف الخلايا والسهام البيضاء يظهر اتجاه إفراز. هذه صورة تمثيلية لتجربتين مستقلتين (N = 5). (A) - يتم عرض خلايا OTI-RFP باللون الأحمر. شريط مقياس = 5 ميكرومتر (B) كانت ملطخة أقسام لخلايا ناغورني كاراباخ (المضادة للNCR1 تليها المضادة للماعز IgG-FITC؛ الأخضر. شريط مقياس = 2 ميكرومتر.
Discussion
في هذه المخطوطة، نقدم طريقة لتصور إنتاج IFNγ في الطحال بعد عدوى L. monocytogenes في الفئران. هذا البروتوكول بسيط ويمكن تكييفه مع الأنسجة الأخرى ومشغلات السيتوكين، ولكن يجب النظر في الجوانب التالية. الخلايا في كثير من الأحيان تفرز بسرعة السيتوكينات التي تنتجها، ويتم التقاط السيتوكينات بسرعة من قبل الخلايا المجاورة. ومن الصعب على هذا النحو الكشف عن السيتوكينات في الموقع. وهناك طريقة شائعة لإعادة البدء بسرعة إنتاج السيتوكين هو إعادة تحفيز الخلايا في الجسم الحي السابق تليها الكشف عن السيتوكين في وسائل الإعلام عن طريق اختبار المناعية المرتبطة بالإنزيم. وفي هذا السياق، تُفقد أية معلومات عن التوطين المكاني للخلايا المنتجة للسيتوكين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إنتاج السيتوكين بعد إعادة التحفيز لا يعكس بالضرورة ما إذا كان يتم إنتاج السيتوكينات وإفرازها في الجسم الحي، بل يشير إلى قدرة مجموعة معينة من الخلايا على إنتاج السيتوكينات. ولذلك، فإن كلا الأسلوبين سيوفر معلومات مختلفة، وينبغي للمرء أن ينظر في المعلومات الأكثر قيمة لتجربتهما.
من أجل الكشف عن السيتوكينات داخل الخلايا، تستخدم طريقتنا مثبط نقل البروتين داخل الخلايا لاعتراض السيتوكينات داخل الخلايا وزيادة الكشف عن الإشارة. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن هذه المثبطات تؤثر على النقل الطبيعي للبروتينات من الشبكية البطانية (RE) إلى جهاز غولجي وإلى الحويصلة السرية التي تعوق إطلاقها، والتي يمكن أن تسبب سمية. ونتيجة لذلك، ينبغي استخدام BFA، أو مثبطات أخرى، لفترة قصيرة من الزمن، وعادة ما لا تزيد عن بضع ساعات. وبالتالي، من المهم العثور على التوازن الصحيح بين جرعة المانع ووقت العلاج من أجل تحسين مستوى السيتوكينات المحاصرين داخل الخلية دون التسبب في آثار خطيرة السمية الخلوية. هذه المتغيرات يمكن أن تختلف بين السيتوكينات ومسار الإدارة لBFA. في نموذج العدوى لدينا، تم إدارة BFA داخل اقابي من أجل توفير تشتت الجهازية السريعة، ولكن يمكن أيضا أن يتم تسليمها عن طريق الوريد.
مثبطات نقل البروتين داخل الخلايا الأكثر استخداماً هي BFA، المستخدمة هنا، وmonensin (MN). وغالبا ما تستخدم هذه المثبطات بشكل غير واضح لتراكم ودراسة إنتاج السيتوكين ولكن لديهم اختلافات طفيفة في آليات عملها. MN يمنع نقل البروتينات داخل جهاز غولجي وبالتالي تراكم البروتينات في Golgi17 في حين يمنع BFA بروتين coatomer معقدة-I التوظيف، مما يحول دون حركة الرجعية من البروتينات إلى الشبكية endoplasmic (ER) وبالتالي تعزيز تراكم السيتوكينات في ER18. وعلى هذا النحو، فإن اختيار أفضل مثبط نقل البروتين داخل الخلايا يعتمد على عوامل مختلفة، مثل السيتوكين الذي سيتم اكتشافه. على سبيل المثال، وقد تبين في تلطيخ الخلايا الداخلية التي يسببها lipopolysaccharide من الخلايا الأحادية أن BFA هو أكثر كفاءة لقياس السيتوكينات IL-1β، IL-6 و TNF من MN19.
وينطوي هذا البروتوكول على تصور السيتوكين في الموقع عن طريق الفحص المجهري البؤري، وبالتالي لا يوجد سوى عدد محدود من العلامات مما يمكن استخدامه لدراسة الخلايا المنتجة للسيتوكين وبيئتها الدقيقة. ومن الضروري أيضا أن تنظر في أن مثبطات نقل البروتين مثل BFA أو MN تعكر صفو التعبير الطبيعي للعديد من البروتينات وبالتالي استخدامها عند دراسة التعبير المتزامن لبعض علامات سطح الخلية التنشيط يجب أن اقترب عنايه. على سبيل المثال، BFA ولكن ليس MN كتل التعبير عن CD69 في الخلايا الليمفاوية المورين20. على الرغم من هذا القيد، التصوير البؤري يتيح توطين السيتوكينات دون الخلوية، فضلا عن اتجاه إفراز السيتوكين داخل الخلية. البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول تشير إلى أن خلايا NK تميل إلى إفراز IFN-y في نمط منتشر في حين يبدو أن خلايا CD8+ T لتوجيه إفراز IFNγ نحو خلايا CD8+ T الأخرى التي هي في تفاعل مباشر معهم5.
وفي الختام، فإن هذا البروتوكول مناسب لتصور مجموعة متنوعة من السيتوكينات في الموقع وتحديد الخلايا المنتجة وبيئتها الدقيقة بعد العديد من المحفزات مثل العدوى أو المناعة الذاتية. المعلومات التي تم الحصول عليها مفيدة لفهم أهمية التزامن المكاني في الجسم الحي لأنواع الخلايا المختلفة والسيتوكين التي تنتجها، اللازمة للاستجابة المناعية الفعالة.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر موظفي مرفق التصوير التابع لمعهد كينيدي على المساعدة التقنية في التصوير. وقد تم دعم هذا العمل بمنح من صندوق كينيدي الاستئماني (إلى A.G.)، ومجلس بحوث التكنولوجيا الأحيائية والعلوم البيولوجية (BB/R015651/1 إلى A.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brefeldin A | Cambridge bioscience | CAY11861 | |
| Paraformaldehyde | Agar scientific | R1018 | |
| L-Lysin dihydrochloride | Sigma lifescience | L5751 | |
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | |
| D(+)-saccharose | VWR Chemicals | 27480.294 | |
| Precision wipes paper Kimtech science | Kimberly-Clark Professional | 75512 | |
| O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy | VWR Chemicals | 361603E | |
| Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 | Biolegend | 101302 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml |
| Microscope slides - Superfrost Plus | VWR Chemicals | 631-0108 | |
| anti-CD169 - AF647 | Biolegend | 142407 | Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 65 |
| anti-F4/80 - APC | Biolegend | 123115 | Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 660 |
| anti-B220 - PB | Biolegend | 103230 | Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/mL Excitation wavelength: 410 Emission wavelength: 455 |
| anti-IFNg - biotin | Biolegend | 505804 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL |
| anti-IFNg - BV421 | Biolegend | 505829 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL Excitation wavelength: 405 Emission wavelength: 436 |
| anti-Nkp46/NCRI | R&D Systems | AF2225 | Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/mL |
| anti-goat IgG-FITC | Novusbio | NPp 1-74814 | Antibody clone and Concentration used: 1 mg/mL Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
| Streptavidin - PE | Biolegend | 405203 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mL Excitation wavelength: 565 Emission wavelength: 578 |
| Streptavidin - FITC | Biolegend | 405201 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mlL Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Cover glasses 22 mm x 40 mm | Menzel-Glazer | 12352128 | |
| Liquid blocker super PAP PEN mini | Axxora | CAC-DAI-PAP-S-M | |
| Imaris - Microscopy Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Confocal microscope - Olympus FV1200 Laser scanning microscope | Olympus | ||
| Cryostat - CM 1900 UV | Leica | ||
| Base mould disposable | Fisher Scientific UK Ltd | 11670990 | |
| PBS 1x | Life Technologies Ltd | 20012068 | |
| BHI Broth | VWR Brand | 303415ZA | |
| GFP | Excitation wavelength: 484 Emission wavelength: 507 |
||
| RFP | Excitation wavelength: 558 Emission wavelength: 583 |
||
| Insulin syringe, with needle, 29 G | VWR International | BDAM324824 | |
| C57BL/6 wild type mice | Charles River |
References
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Kubota, K., Kadoya, Y. Innate IFN-gamma-producing cells in the spleen of mice early after Listeria monocytogenes infection: importance of microenvironment of the cells involved in the production of innate IFN-gamma. Frontiers in Immunology. 2 (26), (2011).
- Dunn, P. L., North, R. J. Early gamma interferon production by natural killer cells is important in defense against murine listeriosis. Infection and Immunity. 59 (9), 2892-2900 (1991).
- Krummel, M. F., et al. Paracrine costimulation of IFN-gamma signaling by integrins modulates CD8+ T cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), 11585-11590 (2018).
- Curtsinger, J. M., Agarwal, P., Lins, D. C., Mescher, M. F. Autocrine IFN-gamma promotes naive CD8+ T cell differentiation and synergizes with IFN-alpha to stimulate strong function. Journal of Immunology. 189 (2), 659-668 (2012).
- Hosking, M. P., Flynn, C. T., Whitton, J. L. Antigen-specific naive CD8++ T cells produce a single pulse of IFN-gamma in vivo within hours of infection, but without antiviral effect. Journal of Immunology. 193 (4), 1873-1885 (2014).
- Croxford, A. L., Buch, T. Cytokine reporter mice in immunological research: perspectives and lessons learned. Immunology. 132 (1), 1-8 (2011).
- Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8++ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. Journal of Visualized Experiments. (9), 409 (2007).
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. Journal of Visualized Experiments. (7), 265 (2007).
- Pope, C., et al. Organ-specific regulation of the CD8+ T cell response to Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 166 (5), 3402-3409 (2001).
- Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance. Current Protocols in Microbiology. 31, 1-7 (2013).
- Kang, S. J., Liang, H. E., Reizis, B., Locksley, R. M. Regulation of hierarchical clustering and activation of innate immune cells by dendritic cells. Immunity. 29 (5), 819-833 (2008).
- Chang, S. R., et al. Characterization of early gamma interferon (IFN-gamma) expression during murine listeriosis: identification of NK1.1+ CD11c+ cells as the primary IFN-gamma-expressing cells. Infection and Immunity. 75 (3), 1167-1176 (2007).
- Mollenhauer, H. H., Morre, D. J., Rowe, L. D. Alteration of intracellular traffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1031 (2), 225-246 (1990).
- Helms, J. B., Rothman, J. E. Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF. Nature. 360 (6402), 352-354 (1992).
- Schuerwegh, A. J., Stevens, W. J., Bridts, C. H., De Clerck, L. S. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha in monocytes. Cytometry. 46 (3), 172-176 (2001).
- Nylander, S., Kalies, I. Brefeldin A, but not monensin, completely blocks CD69 expression on mouse lymphocytes: efficacy of inhibitors of protein secretion in protocols for intracellular cytokine staining by flow cytometry. Journal of Immunology Methods. 224 (1-2), 69-76 (1999).
