Summary
Burada, duvar ikincil lenfoid organlarda sitokin Interferon gama salgılama hücrelerin içinde situ lokalizasyonu görselleştirmek için basit bir Konfokal görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. Bu protokol, farklı dokularda diğer sitokinlerin görselleştirilmesi için uzatılabilir.
Abstract
Sitokinler, hücreler tarafından salgılanan küçük proteinlerdir, etkili immün tepkiler için önemli olan hücre hücresi iletişimlerini aracılık eder. Sitokinlerin bir özelliği, onlar tarafından üretilen ve hücre türlerinin çok sayıda etkileyebilir gibi onların pleiotropism olduğunu. Bu nedenle, sadece hangi hücrelerin sitokinleri üretirken değil, aynı zamanda daha spesifik terapilerinin tanımlanması için hangi ortamda yaptıklarını anlamak önemlidir. Burada, bakteriyel enfeksiyonun ardından situ içindeki sitokin üretimini görselleştirmenin bir yöntemini tarif ediyoruz. Bu teknik, Konfokal mikroskopiye göre kendi ortamlarında görüntüleme sitokin üreten hücrelere dayanır. Bunu yapmak için, doku bölümleri bir sitokin lekesi ile birlikte birden fazla hücre türlerinin belirteçleri için lekelenmiş. Bu yöntemin anahtarı, sitokin salgılanması, üretim hücrelerinin içinde birikmiş sitokin tespiti için izin, ilgi doku hasat önce doğrudan vivo engellenir. Bu yöntemin avantajları birden fazla. İlk olarak, sitokinlerin üretildiği mikroortam korunur, bu da sitokin üretimi için gerekli sinyalleri ve bu sitokinlerden etkilenen hücreler hakkında bilgi verebilir. Buna ek olarak, bu yöntem, üretim hücrelerinin yapay in vitro yeniden stimülasyon güvenmez olarak, in vivo sitokin üretiminin konumu bir göstergesi verir. Ancak, sitokin alan hücrelerde sitokin akım sinyalizasyon aynı anda analiz etmek mümkün değildir. Benzer şekilde, görülen sitokin sinyalleri yalnızca sitokin salgısı engellendiği zaman penceresine karşılık gelir. Biz hücre içi bakteri Listeria monocytogenes tarafından fare enfeksiyonu aşağıdaki dalak sitokin interferon (IFN) gama görselleştirme açıklayan iken, bu yöntem potansiyel olarak herhangi bir sitokin görselleştirme adapte olabilir çoğu organ.
Introduction
Bir patojene karşı etkili bir bağışıklık tepkisi düzenlemek, genellikle organizma arasında dağınık olan çeşitli immün hücreler tarafından görüntülenen sinyallerin karmaşık entegrasyonunu gerektirir. İletişim kurmak için bu hücreler, sitokinlerin adlı immünomodülatör olarak hareket eden birden fazla biyolojik fonksiyon ile küçük çözünür proteinler üretir. Sitokinler kontrol hücresi işe alma, aktivasyon ve proliferasyon ve dolayısıyla bağışıklık yanıtlarını promosyon anahtar oyuncular olduğu bilinmektedir1. Etkili immün tepkiler belirli sinyalleri teşvik etmek için belirli hücreleri bağlayan çok organize zamanmekansal desen serbest bırakmak için sitokinlerin gerektirir. Bu nedenle, sitokin üretimini ve situ içinde sinyalizasyon incelemek için çok önemlidir, dikkate alan hangi ksinlerin üretilen mikroçevre.
Ümit çakır (L. monocytogenes), farelerde hücre içi patojenlere bağışıklık yanıtlarının incelenmesi için bir asal model olarak kullanılan gram-pozitif hücre içi bir bakteridir. Bir sitokin, ıFN Gama (IFNγ) hızlı bir şekilde üretilir, L. monocytogenes enfeksiyonu sonrasında 24 saat içinde. Patojen boşluğu için gereklidir, farelerin IFNγ için yıkması L. monocytogenes enfeksiyon2' ye son derece duyarlıdır. Ifnγ pleiotropik ve enfeksiyon aşağıdaki birden fazla hücre tarafından üretilen3. Doğal katil (NK) hücreleri tarafından üretilen IFNγ doğrudan anti-bakteriyel aktivite için gereklidir4, diğer kaynaklardan ıfnγ diğer işlevlere sahip olduğu gösterilmiştir. Gerçekten de, biz ve diğerleri son zamanlarda bu ifnγ, CD8 + t hücreleri tarafından üretilen doğrudan T hücre farklılaşma5,6,7düzenleyen belirli bir işlevi vardır bulundu. Bu nedenle, hangi hücrelerin ıfnγ (ve hangi microenvironment) üretmek anlama fonksiyonunu incelemek için çok önemlidir.
Sitokin üretimini incelemek için en yaygın teknik, Akış sitometrisi tarafından analiz edilen hücre içi sitokin boyama üzerine dayanır. Bu yöntem, tek bir örnek içinde hücre yüzey işaretçileri ile birlikte birden fazla sitokinlerin eşzamanlı olarak algılanmasını sağlar, sitokin üretimini incelemek için son derece yararlı bir araç sağlamaktadır. Ancak, yukarıda belirtilen tekniği kullanarak herhangi bir uzamsal bilgi kaybetme anlamına gelir. Ayrıca, sitokin tespiti genellikle sitokin tespitini sağlamak için in vitro Re-stimulasyona dayanır. Bu nedenle, belirli bir hücrenin kapasitesi bir sitokin üretmek için analiz edilir ve mutlaka situ içinde gerçek sitokin salgılanması ile ilişkilendirmez. Diğer yöntemler, floresan protein ifadesinin sitokin transkripsiyonu ile ilişkili olduğu ve tek hücreli seviye8' de görselleştirmeye izin veren muhabir fareler kullanır. Bu yöntem situ içinde sitokin transkripsiyonu izleyebilse de, sınırlı sayıda sitokin muhabiri fareler mevcuttur. Buna ek olarak, transkripsiyon, çeviri ve salgılanma bazen bağlantısız olabilir, ve floresan proteinleri onlar rapor sitokin daha farklı bir yarı ömrü var, bu yöntem bazen situ sitokin görselleştirme için yeterli değil yapma.
Burada, tek hücreli çözünürlükte Konfokal mikroskopiye göre situ sitokin üretimini görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik doku içinde hücresel kaynak ve çevreleyen niş görselleştirme sağlar. Bu protokol özellikle L. monocytogenes enfekte fareler DALAĞıNDA, NK hücreleri ve antijen spesifik CD8+ T hücreleri tarafından ifnγ üretime odaklanan ınγ üretiminin görselleştirilmesini açıklar. Ancak, herhangi bir sitokin üretiminin karakterize edilmesi, sitokinlerin enfeksiyon, inflamasyon veya otoimmün hastalıklar gibi üretildiği diğer durumlar bağlamında, hedeflenen sittoin hücrelerde tutulabileceği sürece genişletilebilir ve uyarlanabilir hücre içi protein taşıma inhibitörü tarafından.
Protocol
Fareler ile ilgili tüm deneyler 1986 INGILTERE bilimsel prosedürler Yasası ile anlaşma vardı.
1. farelerde antijenik spesifik CD8+ T hücrelerinin evlatlık transferi
- İzole ovalbumin (ova)-spesifik CD8+ t hücreleri (OTI) yeşil floresan proteini (Oti-Gfp) veya kırmızı floresan proteini (Oti-RFP) T-Cell reseptör transjenik farelerin lenf nodından süspansiyondan, fare kullanarak9,10 , Üretim talimatlarına göre CD8+ T hücre yalıtım kiti. Daha önce11açıklandığı gibi, bir şırınga pistonlu kullanarak lenf nodları smashing tarafından hücre süspansiyonu hazırlayın.
- OTI-GFP veya OTı-RFP hücreleri (3 x 106 hücre) içine C57BL/6 vahşi tip fare alıcılarına İntravenöz enjeksiyon ile aktararak cahalan, ve ark.12. Genellikle 6-12 hafta yaş fareler kullanın.
Not: Bu adım isteğe bağlıdır ve yalnızca antijen özgü CD8+ T hücrelerini izlemek için gereklidir.
2. Listeria monocytogenes enfeksiyon
- Genişletme L. monocytogenes genetik olarak değiştirilmiş ova (LM-ova)13 , suyu kalp infüzyonunda büyüme bir üstel faz için 37 °c ' de yumuşak ajitasyon altında od600 ulaştığında 0.08 – 0.1, daha önce referans olarak açıklanan 14oldu.
- 100 μL (maksimum hacim = 200 μL) ile 0.1 – 0.5 LD50 lm-ova fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile intravenöz enjeksiyon Ile 29 G insülin şırıngası kullanılarak seyreltilmiş, C57BL/6 vahşi tip fare alıcılarına, OTı-Gfp veya OTı-RFP hücrelerine eklenerek enjekte edilir.
Not: Bizim elimizde, 0,1 x LD50 lm-ova 2 x 104 koloni şekillendirme birimlerine (CFU) karşılık gelir. L. monocytogenes genetik olarak değiştirilmiş ova daha önce aktarılan OTı CD8+ T hücrelerini etkinleştirmek Için kullanılır, ancak L. monocytogenes diğer suşları kullanılabilir.
3. Brefeldin A ile tedavi (BFA) blok sitokin salgılanması
- Bir 29 G insülin şırıngası kullanarak fare fedakarlığı yapmadan önce 6 h PBS 200 μL 'de 250 μg BFA enjekte edilir.
Not: Lyophilized BFA ilk dimetil sülfoxid (DMSO) 25 mg/mL konsantrasyon stok hazırlamak için resuspended. BFA daha sonra enjeksiyon öncesinde kristalizasyon önlemek için oda sıcaklığında (RT) PBS seyreltilir. Sitokin salgılanması inhibisyonu hücrelerde IFNγ birikimi indükler. Bu sitokin tespiti için çok önemlidir.
4. dalak hasat
- CO2 ' nin yükselen konsantrasyonunu kullanarak fareler ötenize, servikal dislocation izledi.
Not: Fare insancıl ötenazi için yerel kurum kurallarını izleyin. - % 70 etanol ile karın temizleyin, dalağın bulunduğu fare sol kanadında cilt üzerinden 1-2 cm kesim yapmak için makas ile bir kesi yapmak. Dalak ortaya çıkarmak ve cımbız ile dışarı çıkarmak için dikkatlice peritonumda bir kesi yapmak. Dalak hasat, forseps ile sıkmak için dikkatli olmak ya da dalak mimarisi bozmamak için keserek.
5. Paraformaldehyde (PFA) ile dalağın fikyasyonu
- 3,75 mL PBS ve 3,75 mL 0,2 M L-lizin karıştırılarak fixatif solüsyonu hazırlayın. 21 mg sodyum m-periodate ekleyin ve iyi karıştırın. Sonra 2,5 mL 4% PFA ve 20 μL 12 N NaOH ekleyin.
Not: Aynı gün düzeltme çözümünü kullanın ve fazlalığını atın. Saklama. Örnek GFP gibi floresan proteinleri içeriyorsa, bu sabitleme adımı önemlidir. Floresan proteinlere göre, metanol izleri içeren PFA kullanmayın.
Dikkat: PFA toksik ve dikkatli ele alınmalıdır. - Yumuşak ajitasyon altında 4 °C ' de genellikle 16 – 20 h, en az 4 h için düzeltme ve düzeltmede dalağı taşın.
- Fixatif solüsyonu atın ve 5 mL PBS ekleyin
- PBS 'yi 5 mL 'Lik taze PBS ile değiştirin 1 h 'de 4 °C ' de nazik ajitasyon altında.
- PBS 'yi 5 mL% 30 sukroz ile değiştirin, 12 – 24 saat boyunca inküye yapın.
Not: Bu yöntem doku morfolojisi korumaya yardımcı olur. Sukroz çözeltisi ile kuluçga sonra, organ kuyunda altında lavabo gerekir.
6. donma ve bölümleme
- Büyük bir yuvaya Kuru buz koyun ve yaklaşık 50 mL saf metanol ve kuru buz birkaç parça içeren içinde daha küçük bir kap yerleştirin.
- Dalağı, tüy bırakmayan bir temizlikteki yavaşça kurutun.
- Alt kısmında optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşik bir damla içeren bir baz kalıp içine dalak yerleştirin. Herhangi bir kabarcıklar üretmek için dikkatli olun. Dalak üzerinde OCT ekleyin.
- Forseps ile, metanol yüzeyinde baz kalıp mevduat, bu OCT dokunmaz emin olun. kalıpları en aza indirmek için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde doku donma.
- Dondurulduğunda, bölümleme ile devam edin.
Not: Frozen dalak birkaç ay boyunca-80 °C ' de tutulabilir. -
Bir cryomicrotome kullanarak doku bölümü.
- Kriyostat üzerindeki oda sıcaklığını-21 °C ' ye ayarlayın. İstenilen kalınlıkta (genellikle 10 μm civarında) kesitler. Bu protokol 30 μm ' ye kadar kalınlıklarla çalışır.
- Cam mikroskop slaytları üzerine bölümler toplayın ( malzeme tablosunabakın) ve görsel olarak inceleyin.
Not: Bölümler birkaç ay boyunca-80 °C ' de tutulabilir.
7. immünofluorescent boyama
- Bölümün RT 'ye gelmesini bekleyin.
- Doku bölümünün etrafında sıvı engelleyici (örn. PAP Pen) ile bir daire çizin. EKIM dışında Draw veya sopa olmayacaktır.
- Bir kez kurutulur, 5 dakika boyunca doku bölümüne PBS yerleştirerek örnek rehidrat.
Not: Bölüme koymak birim bölümün boyutuna bağlıdır. Genellikle 100 – 300 μL kullanırız. Onlar rehydrated kez bölümler kuru izin vermeyin. - Bölümün slaytta iyi yapışıp kalmadığından emin olmak için PBS ile en az iki kez durulayın.
-
Antikorların spesifik olmayan bağlayıcılığı azaltmak için bölüme engelleme çözümü ekleyin.
- Engelleme çözümünü aşağıdaki gibi hazırlayın: 0,1% Triton X100,% 2 fetal buzağı serumu (FCS), 2,5 μg/mL FC reseptör engelleyici (Anti-Mouse CD16/32) ile PBS. Sonra boyama panelinin her ikincil antikor türünün 2 – 5% normal serum ekleyin.
Not: Antikorlar doğrudan konjuated/biotinylated ise, her birincil antikor türlerinin% 5 normal serum ekleyin. Birincil antikor ve ikincil antikorlardan biri aynı türden (örn., tavşan ve ikincil tavşan Anti-sıçan yükseltilmiş primer antikor), arka plan sinyali artacak gibi normal serum türlerini kullanmayın. - PBS 'i aspirasyon ile bölümden yavaşça çıkarın ve örnek bölüm başına engelleme çözeltisi 100 μL ekleyin. RT 'de en az 1 saat boyunca kapalı bir ıslak odada inküye yapın.
- Engelleme çözümünü aşağıdaki gibi hazırlayın: 0,1% Triton X100,% 2 fetal buzağı serumu (FCS), 2,5 μg/mL FC reseptör engelleyici (Anti-Mouse CD16/32) ile PBS. Sonra boyama panelinin her ikincil antikor türünün 2 – 5% normal serum ekleyin.
-
Primer antikorlar ile leke.
- Engelleme solüsyonundaki optimum konsantrasyonda primer antikorları seyreltin. Genel başlangıç noktası antikor konsantrasyonu 5 μg/mL 'dir, ancak her bir antikor ve doku için optimize edilmelidir.
Not: Antikorlar doğrudan konjuge ise, kullanmadan önce 17,135 x g (13,500 rpm) içinde 15 dakika için antikor karışımı Santrifüjü. Fluorophores çökelebilir. Bu adım, çökeltme ve böylece slayt üzerinde çöktürülmüş antikorların spesifik olmayan birikimi önlemek Pelet olacaktır. - Engelleme çözümünü her örnek için birincil antikor karışımı ile değiştirin.
- Kapalı bir ıslak odada 4 °C ' de RT veya gece (OVN) ' da dört saat boyunca inküye yapın.
- Engelleme solüsyonundaki optimum konsantrasyonda primer antikorları seyreltin. Genel başlangıç noktası antikor konsantrasyonu 5 μg/mL 'dir, ancak her bir antikor ve doku için optimize edilmelidir.
-
Yıkama yapın.
- PBS 'ye% 2 FCS ekleyerek yıkama tamponunu hazırlayın.
- Yıkama tampon ile 4 kez yıkayın: bir hızlı (kuluçsuz), bir 10 dakika ve iki 5 dakika için. Sonra 5 dakika boyunca PBS ile son yıkama gerçekleştirin.
-
İkincil antikorlarla boyama.
- Engelleme çözümünde optimum konsantrasyonda ilgi ikincil antikorları seyreltmeli. Primer antikorlar için açıklandığı gibi karışımı Santrifüjü.
- Son yıkama çözümünü çıkarın. İkincil antikor karışımını bölümün üstüne ekleyin ve kapalı bir ıslak odada RT 'de 1 – 4 h için inküye yapın.
- Yıkama tampon ile 4 kez yıkayın: bir hızlı (kuluçsuz), bir 10 dakika ve iki 5 dakika için. Sonra 5 dakika boyunca PBS ile son yıkama gerçekleştirin.
- Son yıkama çözümünü çıkarın. PBS 'nin Buharlık yapmasına izin verin ama bölümü fazla kurutmayın. Montaj ortamının bir damlası numunenin üstüne yerleştirin ve kapak camını dikkatle üzerine yerleştirin. Montaj ortamı tüm bölümü kurtarmalıdır. RT ışık korumalı OVN polimeraz edelim.
Not: Montaj ortamını uygulamadan önce slaytın ters tarafındaki bölümün etrafında bir daire çizin. Montaj ortamı uygulandıktan sonra doku görmek zor hale gelebilir. - Görüntüye hazır olana kadar slaytları 4 °C ' de karanlıkta saklayın.
8. görüntüleme ve analiz
- Bir Konfokal mikroskop ile boyama görüntüleme gerçekleştirin.
Not: Bu protokolde, bir ters spektral lazer tarama mikroskop kullanılmış ( malzeme tablosunabakın), birlikte hedefleri 10X/na 0,40 veya 60x/na 1,4 (sitokin alt hücresel yerelleştirme analizi için). Malzeme tablosundaher fluorophore ve floresan protein için uyarma ve emisyon dalga boyları görüntülenir. - Görüntü işleme yazılımı (örn., Imaris veya Fiji) kullanılarak gerekli analiz ve ölçüme göre gerçekleştirin.
Representative Results
Listeria monocytogenes enfeksiyonu sonrasında ilk 24 saat Içinde üretilen IFNγ, bu patojenin yayılmasını kontrol etmek için önemlidir. Bu protokolü kullanarak, yalnızca hangi hücrelerin ınγ üretmekte olduğunu değil, aynı zamanda belirli bir mikroortamda bulunup bulunmadığını da görselleştirebiliriz. Dalağın mimarisini tanımamıza yardımcı olmak için, dalak içinde belirli bir konuma sahip olduğu bilinen hücreler etiketlenmiştir. Belirteç F4/80 tüm makrofajlar Etiketler ve kırmızı hamuru vurgular. Marker b220 B hücreleri Etiketler ve T hücre bölgesi çevreleyen B hücre folikülleri vurgular. Marker CD169 beyaz hamuru çevreleyen marjinal bölge makrofajlar, Etiketler (Şekil 1). Çoğu OTı hücreleri, onlar ıfnγ ya da ifade olsun, beyaz selüloz mevcut ve gibi, tüm görüntüleri bu beyaz hamuru vardır, belirtilmedikçe.
Bu protokolde bir kritik adım sitokin salgılanmasını inhibe BFA kullanımı. Gerçekten de, fare BFA ile tedavi edilmediği zaman NK hücreleri tarafından IFNγ tespiti büyük ölçüde bozulmuştur (Şekil 2). Bizim protokol kullanarak, biz en az iki hücre türleri ınγ üretmek bulabiliriz 24 enfeksiyon sonra h-NK hücreleri ve antijen özgü CD8+ T hücreleri (Şekil 3) — benzer şekilde daha önce akış sitometri tarafından bulundu ne3.
Ifnγ üreten hücrelerin içinde situ görüntüleme, ınγ üretiminin dalak boyunca yayıldığını, ancak gizli alanlara yoğunlaştığını ortaya koydu (Şekil 4). Gerçekten de, T hücrelerinin dalak boyunca aktif olduğunu bulduk (T hücresi kümeleme ile vurgulanır), ve bu mutlaka IFNγ üretimiyle ilişkilendirmedi. Bir olası açıklama ifnγ üretim virüslü hücrelerin konumu ile sınırlı olduğunu15,16, ve T Hücre aktivasyonu — kümeleme tarafından temsil — hem enfekte (ifnγ pozitif) ve non-virüslü tarafından desteklenebilir (ifnγ negatif) antijen sunan hücreler. Diğer lekeleri tam konumunu belirlemek ve bu alana IFNγ üretim ve antijen aktarımı ile ilişkisi kısıtlayarak mekanizması bir göstergesi almak için gerekli olacaktır. İlginçtir ki, aktif, kümelenmiş, antijen spesifik T hücrelerinin dalağın beyaz hamuru boyunca bulunduğunu bulduk, ancak sadece NK hücrelerinin onlarla birlikte bulunduğu bölgelerde IFNγ üretiyorlar (Şekil 5). Bu nedenle, NK hücrelerinin varlığı beyaz selüloz, kümelenmiş T hücrelerinin beyaz selüloz diğer bölümünde kümelenmiş T hücreleri aksine ıfnγ üretmek belirli bir mikroortam delineates. Bu, T hücresi aktivasyonunun bu zaman noktasında IFNγ üretimini dikte etmek için yeterli olmadığını göstermektedir.
Bizim protokol tarafından vurgulanan bir başka ilginç özelliği de farklı alt hücresel lokalizasyonu ıfnγ NK karşı CD8+ T hücreler5. Şekil 6' da görüldüğü gıbı, NK hücrelerinde ifnγ lokalizasyonu siterde YAYıLıRKEN, CD8+ t hücreleri genellikle başka bir T hücresine doğru ifnγ işe.
Şekil 1: dalak mimarisini vurgulayan işaretler. Fareler 2 x 104 CFU lm-ova ile enfekte edildi ve 24 h sonrası enfeksiyon ötenize. Dalak açıklayıcı ve protokolde açıklandığı gibi işlenir. (A) bölümler NK hücreleri için lekelenmiş edildi (ANTI-NCR1 takip Anti-keçi IgG-fitc; yeşil), OTI-RFP hücreleri (kırmızı) ve makrofajlar (Anti-F4/80-APC; Magenta). RP = kırmızı selüloz; WP = beyaz selüloz. Ölçek çubuğu = 200 μm. (b) bölümler b hücreleri için lekelenmiş (Anti-b220-Pasifik mavisi; Mavi), OTı-GFP hücreleri (GFP sinyal kırmızı gösterilen) ve marjinal bölge makrofajlar (Anti-CD169-Alexa647; Magenta). RP = kırmızı selüloz; BF = B hücreli folikül; TZ = T hücre bölgesi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu 3 bağımsız deneylerin temsili bir görüntüdür (N = 4). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: BFA tedavisi, hücre Içi IFNγ in situ tespiti için izin verir. Nγ üretim sple belirli alanlara sınırlıdır fare ile enfekte edildi 2 x 104 CFU lm-ova ve BFA ile tedavi (A) veya tedavi edilmemiş sol (B) sonra 18 h. fareler ötenize edildi 24 h sonrası enfeksiyon. Dalak açıklayıcı ve protokolde açıklandığı gibi işlenir. Bölümler NK hücreler için lekelenmiş edildi (Anti-NCR1 takip Anti-keçi IgG-FITC; yeşil), OTI-RFP hücreleri (kırmızı) ve IFNγ (Anti-IFNγ-BV421; Cyan). Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu 3 bağımsız deneyler (N = 3) NK hücre açısından zengin alanların temsili bir görüntüdür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: ınγ dalağında hücreler üretiyor. Fareler ile bulaşmış 2 x 104 CFU lm-ova belirtildiğinde ve BFA ile tedavi edildikten sonra 18 h. fareler 24 saat sonrası enfeksiyon ötenize edildi. Dalak açıklayıcı ve protokolde açıklandığı gibi işlenir. Bölümler NK hücreler için lekelenmiş edildi (Anti-NCR1 takip Anti-keçi IgG-FITC; yeşil), OTI-RFP hücreleri (kırmızı) ve IFNγ (Anti-IFNγ-BV421; Cyan). (A) bir dalak bir un-enfekte naif fare IFNγ spesifik olmayan boyama yokluğunda göstermek için temsili görüntü. Beyaz çizgiler beyaz hamuru betimlemek. WP = beyaz hamuru; RP = kırmızı selüloz. (B) LM-ova tarafından enfekte bir fare dalakından beyaz hamuru temsilcisi görüntü, beyaz Selüloz ve NK hücreleri tarafından ıfnγ ÜRETIMI için NK hücrelerinin işgali gösteren, OTI hücreleri ve olmayan etiketlenmiş hücreler. Görseller 4 bağımsız deneyden (N = 4) temsilcisidir. Ölçek çubukları = 70 μm (A); ve 20 μm (B). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: ınγ üretimi, LM-ova enfeksiyonunun ardından dalak belirli alanlara sınırlıdır. Fareler 2 x 104 CFU lm-ova ile enfekte edildi ve 18 saat sonra BFA ile tedavi edildi. fareler 24 saat sonrası enfeksiyon öteneden edildi. Dalak açıklayıcı ve protokolde açıklandığı gibi işlenir. Tüm bölümler B hücreleri (b220-Pacific Blue AB, mavi) ve IFNγ (Anti-IFNγ-biotin takip streptavidin-PE; Cyan) için lekelenmiş edildi. OTı-GFP hücreleri (GFP sinyali kırmızı renkte gösterilir). Mavi çizgiler yüksek IFNγ üretiminin alanlarına karşılık gelir. Bu 4 bağımsız deneylerin temsili görüntüler (N = 4). (A) bölümler marjinal bölge macrofajlar için lekelenmiş (ANTI-CD169-Alexa 647, Magenta). Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) bölümler tüm makrofajlar (F4/80) için lekelendiler. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 5: aktıf OTI hücreleri tarafından IFNγ üretimi belirli bir mikroortamda oluşur. Fareler 2 x 104 CFU lm-ova ile enfekte edildi ve 18 saat sonra BFA ile tedavi edildi. fareler 24 saat sonrası enfeksiyon öteneden edildi. Spleens açıklayıcı ve protokolde açıklandığı gibi işlenir. Bölümler NK hücreler için lekelenmiş edildi (Anti-NCR1 takip Anti-keçi IgG-FITC; yeşil), OTI-RFP hücreleri (kırmızı) ve IFNγ (Anti-IFNγ-BV421; Cyan). Yeşil ve kırmızı çizgiler sırasıyla NK ve OTı hücre bölgelerini vurgulamaktadır. Beyaz ok ıfnγ üretmiyor T hücre kümeleri örnekleri gösterir. Inγ üreten T hücre kümeleri yeşil oklar örnekleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu dört bağımsız deneylerin temsili bir görüntüdür (N = 4). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: NK hücrelerinde ve T hücrelerinde ıfnγ alt hücresel lokalizasyonu. Fareler 2 x 104 CFU lm-ova ile enfekte edildi ve 18 saat sonra BFA ile tedavi edildi. fareler 24 saat sonrası enfeksiyon öteneden edildi. Dalak açıklayıcı ve protokolde açıklandığı gibi işlenir. Tüm bölümler IFNγ (Anti-IFNγ-BV421; Cyan) için lekelendiler. Beyaz çizgiler hücre kenarları ve beyaz oklar betimlemek salgılanması yönlülük gösterir. Bu iki bağımsız deneylerin temsili bir görüntüdür (N = 5). (A)-OTI-RFP hücreleri kırmızı renkte gösterilir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (B) bölümler NK hücreleri için lekelenmiş (ANTI-NCR1 tarafından takip Anti-keçi ıGG-fitc; yeşil. Ölçek çubuğu = 2 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Discussion
Bu yazıda, farelerde L. monocytogenes enfeksiyonunun ardından dalak Içinde IFNγ üretimini görselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol basittir ve diğer dokular ve sitokin Tetikleyiciler adapte edilebilir, ancak aşağıdaki yönleri dikkate alınmalıdır. Hücreler genellikle hızla ürettikleri sitokinleri salgılar ve sitokinler komşu hücreler tarafından hızla toplanır. Situ içindeki sitokinlerin tespit edilmesi çok zordur. Sitokin üretimini hızla yeniden başlatmak için ortak bir yöntem, enzime bağlı İmmünosorbent assay ile medyada sitokin algılama takip hücreler ex vivo yeniden uyarmak için. Bu bağlamda, sitokin üreten hücrelerin uzamsal lokalizasyonu hakkında herhangi bir bilgi kaybolur. Ayrıca, yeniden stimülasyon sonrasında sitokin üretimi, sitokinlerin aslında üretilen ve salgılanmış olup olmadığını yansıtmaz, ancak belirli bir hücre nüfusunun sitokinleri üretmek için kapasitesini gösterir. Bu nedenle, her iki yöntem de farklı bilgiler sağlayacaktır ve bir deneme için hangi bilgilerin en değerli olduğunu düşünmelisiniz.
Hücre içi sitokinlerini tespit etmek için, yöntemimiz hücrelerin içindeki sitokinleri tuzağa düşürmek ve sinyal algılamasını artırmak için bir hücre içi protein taşıma inhibitörü kullanır. Ancak, bu inhibitörler proteinleri endotel retikulum (Re) Golgi aparatından normal taşıma etkiler ve salgın vezikül onların serbest zarar, hangi toksisite neden olabilir dikkat etmek önemlidir. Sonuç olarak, BFA veya diğer inhibitör, kısa bir süre için, genellikle birkaç saatten fazla kullanılmalıdır. Bu nedenle, ciddi sitotoksisik etkilere neden olmadan hücrenin içinde sıkışmış sitokinlerin seviyesini optimize etmek için inhibitör dozu ve tedavi süresi arasında doğru dengeyi bulmak önemlidir. Bu değişkenler sitokinler ve BFA için yönetim rotası arasında farklılık gösterebilir. Enfeksiyon modelimizde, BFA hızlı bir sistemik dağılım sağlamak için intraperitoneal yönetiliyordu, ancak aynı zamanda intravenöz olarak da teslim edilebilir.
En yaygın kullanılan hücre içi protein taşıma inhibitörleri BFA, burada kullanılan, ve monensin (MN). Bu inhibitörler genellikle sitokin üretimini birikmek ve incelemek için belirsiz bir şekilde kullanılır, ancak eylem mekanizmalarında hafif farklılıklar vardır. MN, Golgi cihazında proteinlerin taşınmasını inhibe eder, dolayısıyla Golgi17 ' de proteinleri birikir, BFA ise coatomer proteinlerinin kompleks-I işe alınmasını önler, proteinlerin endoplazmik retikulum 'a retrograd hareketini inhibe eder (er) ve böylece ER18' de sitokinlerin birikmesini teşvik eder. Bu nedenle, en iyi hücre içi protein taşıma inhibitörü seçimi farklı faktörlere bağlı olacaktır, tespit edilecek sitokin gibi. Örneğin, monositlerin lipopolysaccharide kaynaklı hücre içi boyayırken, BFA 'nın Il-1β, IL-6 ve TNF 'yi MN19' dan daha ölçmek için daha verimli olduğunu göstermiştir.
Bu protokol, cytokin 'in situ içinde, Konfokal mikroskopi ile görselleştirilmesini içerir ve bu nedenle sitokin üreten hücreleri ve mikroortamlarını incelemek için kullanılabilir olandan sadece sınırlı sayıda marker vardır. Aynı zamanda, BFA veya MN gibi protein taşıma inhibitörlerinin çeşitli proteinlerin normal ifadesini rahatsız etmesini ve dolayısıyla belirli aktivasyon hücresi yüzey işaretleyicilerinin eşzamanlı ifadesinin incelenmesi sırasında kullanımı konusunda dikkat edilmesi gerekir Dikkatle. Örneğin, BFA ama MN blokları CD69 murine lenfositler20ifade. Bu sınırlamalara rağmen, konfeti görüntüleme, sitokinlerin alt hücresel lokalizasyonunu ve hücre içindeki sitokin salgılanması yönünü sağlar. Bu protokol kullanılarak oluşturulan veriler, NK hücrelerinin bir differe desen IFN-y salgılaşmaya eğilimindedir önerirken CD8+ t hücreleri gıbı diğer CD8+ t hücrelere karşı ifnγ salgılanmasını doğrudan görünüyor onlarla doğrudan etkileşim5.
Sonuç olarak, bu protokol situ içinde çeşitli sitokinlerin görselleştirmek ve enfeksiyon veya otoimmünite gibi birçok Tetikleyiciler aşağıdaki hücreler ve mikroçevre üreten tanımlamak için uygundur. Elde edilen bilgiler, etkili bir bağışıklık tepkisi için gerekli olan farklı hücre türlerinin ve ürettikleri sitokinin in vivo uzamsal orkestrasyonun önemini anlamak için önemlidir.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz görüntüleme ile teknik yardım için Kennedy Enstitüsü görüntüleme tesisi personeli teşekkür ederiz. Bu çalışma Kennedy Trust (A.G.) ve Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BB/R015651/1 için A.G.) tarafından hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brefeldin A | Cambridge bioscience | CAY11861 | |
| Paraformaldehyde | Agar scientific | R1018 | |
| L-Lysin dihydrochloride | Sigma lifescience | L5751 | |
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | |
| D(+)-saccharose | VWR Chemicals | 27480.294 | |
| Precision wipes paper Kimtech science | Kimberly-Clark Professional | 75512 | |
| O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy | VWR Chemicals | 361603E | |
| Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 | Biolegend | 101302 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml |
| Microscope slides - Superfrost Plus | VWR Chemicals | 631-0108 | |
| anti-CD169 - AF647 | Biolegend | 142407 | Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 65 |
| anti-F4/80 - APC | Biolegend | 123115 | Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 660 |
| anti-B220 - PB | Biolegend | 103230 | Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/mL Excitation wavelength: 410 Emission wavelength: 455 |
| anti-IFNg - biotin | Biolegend | 505804 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL |
| anti-IFNg - BV421 | Biolegend | 505829 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL Excitation wavelength: 405 Emission wavelength: 436 |
| anti-Nkp46/NCRI | R&D Systems | AF2225 | Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/mL |
| anti-goat IgG-FITC | Novusbio | NPp 1-74814 | Antibody clone and Concentration used: 1 mg/mL Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
| Streptavidin - PE | Biolegend | 405203 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mL Excitation wavelength: 565 Emission wavelength: 578 |
| Streptavidin - FITC | Biolegend | 405201 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mlL Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Cover glasses 22 mm x 40 mm | Menzel-Glazer | 12352128 | |
| Liquid blocker super PAP PEN mini | Axxora | CAC-DAI-PAP-S-M | |
| Imaris - Microscopy Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Confocal microscope - Olympus FV1200 Laser scanning microscope | Olympus | ||
| Cryostat - CM 1900 UV | Leica | ||
| Base mould disposable | Fisher Scientific UK Ltd | 11670990 | |
| PBS 1x | Life Technologies Ltd | 20012068 | |
| BHI Broth | VWR Brand | 303415ZA | |
| GFP | Excitation wavelength: 484 Emission wavelength: 507 |
||
| RFP | Excitation wavelength: 558 Emission wavelength: 583 |
||
| Insulin syringe, with needle, 29 G | VWR International | BDAM324824 | |
| C57BL/6 wild type mice | Charles River |
References
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Kubota, K., Kadoya, Y. Innate IFN-gamma-producing cells in the spleen of mice early after Listeria monocytogenes infection: importance of microenvironment of the cells involved in the production of innate IFN-gamma. Frontiers in Immunology. 2 (26), (2011).
- Dunn, P. L., North, R. J. Early gamma interferon production by natural killer cells is important in defense against murine listeriosis. Infection and Immunity. 59 (9), 2892-2900 (1991).
- Krummel, M. F., et al. Paracrine costimulation of IFN-gamma signaling by integrins modulates CD8+ T cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), 11585-11590 (2018).
- Curtsinger, J. M., Agarwal, P., Lins, D. C., Mescher, M. F. Autocrine IFN-gamma promotes naive CD8+ T cell differentiation and synergizes with IFN-alpha to stimulate strong function. Journal of Immunology. 189 (2), 659-668 (2012).
- Hosking, M. P., Flynn, C. T., Whitton, J. L. Antigen-specific naive CD8++ T cells produce a single pulse of IFN-gamma in vivo within hours of infection, but without antiviral effect. Journal of Immunology. 193 (4), 1873-1885 (2014).
- Croxford, A. L., Buch, T. Cytokine reporter mice in immunological research: perspectives and lessons learned. Immunology. 132 (1), 1-8 (2011).
- Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8++ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. Journal of Visualized Experiments. (9), 409 (2007).
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. Journal of Visualized Experiments. (7), 265 (2007).
- Pope, C., et al. Organ-specific regulation of the CD8+ T cell response to Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 166 (5), 3402-3409 (2001).
- Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance. Current Protocols in Microbiology. 31, 1-7 (2013).
- Kang, S. J., Liang, H. E., Reizis, B., Locksley, R. M. Regulation of hierarchical clustering and activation of innate immune cells by dendritic cells. Immunity. 29 (5), 819-833 (2008).
- Chang, S. R., et al. Characterization of early gamma interferon (IFN-gamma) expression during murine listeriosis: identification of NK1.1+ CD11c+ cells as the primary IFN-gamma-expressing cells. Infection and Immunity. 75 (3), 1167-1176 (2007).
- Mollenhauer, H. H., Morre, D. J., Rowe, L. D. Alteration of intracellular traffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1031 (2), 225-246 (1990).
- Helms, J. B., Rothman, J. E. Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF. Nature. 360 (6402), 352-354 (1992).
- Schuerwegh, A. J., Stevens, W. J., Bridts, C. H., De Clerck, L. S. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha in monocytes. Cytometry. 46 (3), 172-176 (2001).
- Nylander, S., Kalies, I. Brefeldin A, but not monensin, completely blocks CD69 expression on mouse lymphocytes: efficacy of inhibitors of protein secretion in protocols for intracellular cytokine staining by flow cytometry. Journal of Immunology Methods. 224 (1-2), 69-76 (1999).
