Summary
Her beskriver vi en simpel Konfokal billedbehandlings metode for at visualisere in situ-lokalisering af celler, der udskiler cytokininterferon gamma i murine sekundære lymfoide organer. Denne protokol kan udvides til visualisering af andre cytokiner i forskellige væv.
Abstract
Cytokiner er små proteiner udskilt af celler, medierer celle-celle kommunikation, der er afgørende for effektiv immunrespons. Et karakteristisk træk ved cytokiner er deres pleiotropisme, da de produceres af og kan påvirke et væld af celletyper. Som sådan er det vigtigt at forstå, ikke kun hvilke celler der producerer cytokiner, men også i hvilket miljø de gør det, for at definere mere specifikke Therapeutics. Her beskriver vi en metode til at visualisere cytokinproduktion in situ efter bakteriel infektion. Denne teknik er afhængig af billeddannelse cytokinproducerende celler i deres oprindelige miljø ved Konfokal mikroskopi. For at gøre det, er vævs sektioner plettet for markører af flere celletyper sammen med en cytokinbejdser. Nøglen til denne metode, cytokinsekretion blokeres direkte in vivo før høst væv af interesse, giver mulighed for påvisning af cytokin, der ophobes inde i producerende celler. Fordelene ved denne metode er flere. For det første bevares det mikromiljø, hvor cytokiner produceres, som i sidste ende kan oplyse om de signaler, der kræves for cytokinproduktionen og de celler, der berøres af disse cytokiner. Desuden giver denne metode en indikation af placeringen af cytokin-produktionen in vivo, da den ikke er afhængig af kunstig in vitro-stimulering af de producerende celler. Det er dog ikke muligt samtidig at analysere cytokin downstream-signalering i celler, der modtager cytokin. På samme måde svarer de observerede cytokinsignaler kun til det tidsvindue, hvor cytokinsekretionen blev blokeret. Mens vi beskriver visualisering af cytokin interferon (IFN) gamma i milten efter muse infektion af de intracellulære bakterier Listeria monocytogenes, denne metode kunne potentielt tilpasses til visualisering af enhver cytokin i de fleste organer.
Introduction
Orkestratering af et effektivt immunrespons mod et patogen kræver kompleks integration af signaler, der vises af en række immunceller, som ofte spredes mellem organismen. For at kommunikere, producerer disse celler små opløselige proteiner med flere biologiske funktioner, der fungerer som immunomodulatorer ved hjælp af cytokiner. Cytokiner kontrol celle rekruttering, aktivering og spredning og dermed er kendt for at være centrale aktører i fremme af immunrespons1. Effektive immunrespons kræver, at cytokiner frigives i et meget organiseret spatiotemporale mønster, der forbinder bestemte celler for at fremkalde specifikke signaler. Det er derfor afgørende at studere cytokinproduktionen og dens signalering in situ under hensyntagen til det mikromiljø, hvor cytokiner produceres.
Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) er en gram-positiv intracellulær bakterie, der anvendes som en prime model til at studere immunresponser på intracellulære patogener i mus. En cytokin, IFN gamma (IFNγ) produceres hurtigt, inden for 24 timer efter L. monocytogenes infektion. Det er nødvendigt for patogen clearance, som mus slået ud for IFNγ er meget modtagelige for L. monocytogenes infektion2. IFNγ er pleiotropic og produceres af flere celler efter infektion3. Mens IFNγ produceret af Natural Killer (NK) celler er påkrævet for direkte anti-bakteriel aktivitet4, ifnγ fra andre kilder har vist sig at have andre funktioner. Faktisk, vi og andre for nylig konstateret, at ifnγ produceret af CD8 + T celler har en specifik funktion i direkte regulerer T Celledifferentiering5,6,7. Som sådan, at forstå, hvilke celler producerer IFNγ (og i hvilket mikromiljø) er afgørende for at dissekere sin funktion.
Den mest almindeligt forekommende teknik til undersøgelse af cytokin-produktionen er afhængig af intracellulær cytokinfarvning analyseret af flowcytometri. Denne metode giver mulighed for samtidig påvisning af flere cytokiner kombineret med celleoverflade markører i en enkelt prøve, hvilket giver et yderst nyttigt værktøj til at studere cytokinproduktion. Men ved hjælp af ovennævnte teknik indebærer at miste enhver geografisk information. Desuden er cytokindetektion ofte afhængig af in vitro re-stimulation for at muliggøre cytokindetektion. Som sådan analyseres kapaciteten af en given celle til fremstilling af en cytokin, og den er ikke nødvendigvis korrelerer med den faktiske cytokinsekretion in situ. Andre metoder bruger reporter mus, som fluorescerende protein udtryk korrelerer med cytokintransskription og giver mulighed for visualisering på et enkelt celleniveau8. Selv om denne metode kan spore cytokin transkription in situ, der er et begrænset antal cytokin-reporter mus til rådighed. Desuden kan transskription, oversættelse og sekretion undertiden være uforbundne, og fluorescerende proteiner har en anden halveringstid end cytokin de rapporterer, hvilket gør denne metode undertiden ikke tilstrækkelig for in situ cytokin visualisering.
Her beskriver vi en metode til visualisering af in situ-cytokinproduktion ved Konfokal mikroskopi ved enkelt celle opløsning. Denne teknik muliggør visualisering af den cellulære kilde og omgivende niche i vævet. Denne protokol beskriver specifikt visualisering af IFNγ produktion i milten af L. monocytogenes inficerede mus, med fokus her på ifnγ produktion af NK celler og antigen specifikke CD8+ T celler. Det kan dog udvides og tilpasses til karakterisering af enhver cytokinproduktion i forbindelse med andre situationer, hvor cytokiner produceres, såsom infektion, inflammation eller autoimmune sygdomme, så længe den målrettede cytokin kan bevares i celler af intracellulær protein transport hæmmer.
Protocol
Alle forsøg med mus var i enighed med den britiske lov om videnskabelige procedurer af 1986.
1. adoptiv overførsel af antigene-specifikke CD8+ T celler i mus
- Isoler ægalbumin (OVA)-specifikke CD8+ T-celler (Oti), der udtrykker grønt fluorescerende protein (Oti-gfp) eller rødt fluorescerende protein (Oti-RFP) fra lymfeknude suspension af T-celle receptor Transgene mus9,10 ved hjælp af en mus CD8+ T Cell isolation kit som pr. fremstilling instruktioner. Forbered cellesuspensionen ved at smadre lymfeknuder ved hjælp af en sprøjte stempel, som tidligere beskrevet11.
- Overfør OTI-GFP-eller OTI-RFP-celler (3 x 106 celler) til C57BL/6 Wild type-mus-modtagere ved intravenøs injektion som beskrevet af Cahalan, et al.12. Brug mus, der typisk er 6 – 12 ugers alderen.
Bemærk: Dette trin er valgfrit og kræves kun til sporing af antigen specifikke CD8+ T-celler.
2. Listeria monocytogenes infektion
- Udvid L. monocytogenes genetisk modificerede til Express OVA (LM-OVA)13 til en eksponentiel fase af vækst i bouillon hjerte infusion ved 37 °c under blid agitation indtil OD600 når 0,08 – 0,1, som tidligere beskrevet i reference 14.
- Injicer 100 μL (maks. volumen = 200 μL) af 0,1 – 0,5 LD50 LM-OVA fortyndet i fosfat-bufferet saltvand (PBS) ved intravenøs injektion med en 29 G insulin sprøjte i C57BL/6 Wild type-mus-modtagere, der bærer OTI-gfp-eller OTI-RFP-celler, når det er angivet.
Bemærk: I vores hænder svarer 0,1 x LD50 LM-OVA til 2 x 104 KOLONIDANNENDE enheder (CFU). L. monocytogenes genetisk modificeret til Express OVA bruges til at aktivere de tidligere overførte OTI CD8+ T- celler, men andre stammer af L. monocytogenes kan anvendes.
3. behandling med Brefeldin A (BFA) for at blokere Cytokinsekretionen
- Injicer 250 μg BFA i 200 μL PBS intraperitonealt 6 timer før muse ofring ved hjælp af en 29 G insulin sprøjte.
Bemærk: Lyofiliseret BFA er først resuspenderet i dimethylsulfoxid (DMSO) for at tilberede en koncentration på 25 mg/mL. BFA fortyndes derefter i PBS ved stuetemperatur (RT) for at undgå krystallisering før injektion. Hæmning af cytokinsekretion inducerer akkumulering af IFNγ i celler. Dette er afgørende for cytokindetektion.
4. høst af milten
- Euthanize musene ved hjælp af stigende koncentration af CO2 efterfulgt af livmoderhals dislokation.
Bemærk: Følg den lokale institutions retningslinjer for human eutanasi af mus. - Rense maven med 70% ethanol, lave et snit med en saks til at gøre en 1 – 2 cm skåret gennem huden på venstre flanke af musen, hvor milten er placeret. Foretag forsigtigt et snit i bughinden for at afsløre milten og tage den ud med pincet. Høst milten, at være omhyggelig med ikke at presse det med pincet eller skære det for at undgå at forstyrre milten arkitektur.
5. fiksering af milten med PARAFORMALDEHYD (PFA)
- Klargør fiktionativ opløsning ved at blande 3,75 mL PBS og 3,75 mL af 0,2 M L-lysin. Tilsæt 21 mg natrium m-periodate og bland godt. Tilsæt derefter 2,5 mL 4% PFA og 20 μL 12 N NaOH.
Bemærk: Brug fiktionativ opløsningen samme dag, og kassér overskydende. Opbevar den ikke. Dette fikserings trin er vigtigt, hvis prøven indeholder fluorescerende proteiner som GFP. Brug ikke PFA, der indeholder spor af methanol, da det denaturerede fluorescerende proteiner.
Forsigtig: PFA er giftigt og skal håndteres med forsigtighed. - Nedsænk milten i fiksativ og Fix for mindst 4 h, typisk 16 – 20 h ved 4 °c under blid agitation.
- Opløsningen kasseres, og 5 mL PBS tilsættes 5 min ved RT under forsigtig omrøring.
- PBS udskiftes med 5 mL frisk PBS Inkuber i 1 time ved 4 °C under forsigtig omrøring.
- PBS udskiftes med 5 mL 30% saccharose, Inkuber i 12 – 24 timer.
Bemærk: Denne metode hjælper med at vedligeholde vævet morfologi. Efter inkubation med saccharose opløsning, skal organet synke i bunden af brønden.
6. frysning og skæring
- Læg tøris i en stor beholder, og Anbring en mindre beholder inde med ca. 50 mL ren methanol og nogle få stykker tøris.
- Tør forsigtigt milten på en fnugfri serviet.
- Placer milten inde i en base skimmel, der indeholder en dråbe af optimal skære temperatur (OCT) sammensatte i bunden. Vær omhyggelig med ikke at producere bobler. Tilføj OCT over milten.
- Med tang, deponere basen skimmelsvamp på overfladen af methanol, at sikre, at det ikke rører OLT. frysning vævet så hurtigt som muligt for at minimere artefakter.
- Når den er frosset, Fortsæt med skæring.
Bemærk: Frossen milt kan opbevares ved-80 °C i flere måneder. -
Afsnit vævet ved hjælp af en cryomicrotome.
- Indstil kammertemperaturen på kryostaten til-21 °C. Skær sektioner af den ønskede tykkelse (normalt omkring 10 μm). Denne protokol virker med tykkelser op til 30 μm.
- Saml sektioner på glas mikroskop slides (Se tabellen over materialer) og inspicere visuelt.
Bemærk: Sektioner kan opbevares ved-80 °C i flere måneder.
7. Immunofluorescent farvning
- Lad sektionen komme til RT.
- Tegn en cirkel med en væske blokker (f. eks. PAP pen) rundt om vævs afsnittet. Tegn uden for OLT eller det vil ikke holde.
- Når det er tørret, rehydreres prøven ved at placere PBS på vævs sektionen i 5 minutter.
Bemærk: Den mængde, som er sat på sektionen, afhænger af sektionens størrelse. Vi bruger typisk 100 – 300 μL. Lad ikke sektionerne tørre, når de er rehydreret. - Skyl med PBS mindst to gange for at sikre, at afsnittet er godt overholdt til diaset.
-
Tilføj blokerende løsning til sektionen for at formindske den ikke-specifikke binding af antistoffer.
- Forbered blokering løsning som følger: PBS med 0,1% Triton X100, 2% føtal kalveserum (FCS), 2,5 μg/mL FC receptor blocker (anti-Mouse CD16/32). Tilsæt derefter 2 – 5% normalt serum af arterne for hvert sekundært antistof i farvnings panelet.
Bemærk: Hvis antistoffer er direkte konjugeret/biotinyleret, tilsættes 5% normalt serum af arterne af hvert primært antistof. Hvis et primært antistof og et af de sekundære antistoffer er fra samme art (f. eks. primært antistof, der er forhøjet i kanin-og sekundær kanin-anti-rotte), må de normale serum arter ikke anvendes, da det vil øge baggrunds signalet. - Fjern PBS forsigtigt fra afsnittet ved aspiration, og tilsæt 100 μL af blokerings opløsningen pr. prøve sektion. Der inkubates i et overdækket vådt kammer i mindst 1 time ved RT.
- Forbered blokering løsning som følger: PBS med 0,1% Triton X100, 2% føtal kalveserum (FCS), 2,5 μg/mL FC receptor blocker (anti-Mouse CD16/32). Tilsæt derefter 2 – 5% normalt serum af arterne for hvert sekundært antistof i farvnings panelet.
-
Pletter med primære antistoffer.
- De primære antistoffer fortyndes ved den optimale koncentration i blokerings opløsningen. Den generelle koncentration af udgangspunktets antistof er 5 μg/mL, men den skal optimeres for hvert antistof og væv.
Bemærk: Hvis antistofferne er direkte konjugeret, centrifugeres antistof blandingen ved 17,135 x g (13,500 rpm) i 15 minutter ved 4 °c, før du bruger den. Fluorophorer kan udløse. Dette trin vil pille bundfaldet og dermed forhindre ikke-specifik aflejring af de udfældede antistoffer på diaset. - Udskift blokerings opløsningen med det primære antistof miks for hver prøve.
- Der inkubates i 4 timer ved RT eller overnight (OVN) ved 4 °C i et overdækket vådt kammer.
- De primære antistoffer fortyndes ved den optimale koncentration i blokerings opløsningen. Den generelle koncentration af udgangspunktets antistof er 5 μg/mL, men den skal optimeres for hvert antistof og væv.
-
Udfør vask.
- Forbered vaske buffer ved at tilføje 2% FCS til PBS.
- Vask 4 gange med vaskebuffer: en hurtig (uden inkubation), en for 10 min og to for 5 min. Udfør derefter en endelig vask med PBS i 5 min.
-
Farvning med sekundære antistoffer.
- De sekundære antistoffer af interesse ved den optimale koncentration i blokerings opløsningen fortyndes. Centrifuger blandingen, som beskrevet for de primære antistoffer.
- Fjern den endelige vaskeopløsning. Tilsæt sekundær antistof blandingen oven på afsnittet, og Inkuber 1 – 4 timer ved RT i et overdækket vådt kammer.
- Vask 4 gange med vaskebuffer: en hurtig (uden inkubation), en for 10 min og to for 5 min. Udfør derefter en endelig vask med PBS i 5 min.
- Fjern den endelige vaskeopløsning. PBS kan fordampe, men ikke over tørre afsnittet. Placer en dråbe af monterings mediet oven på prøven, og Placer forsigtigt dækglasset oven på den. Monterings mediet skal genoprette hele afsnittet. Lad det polymerase OVN på RT beskyttet mod lys.
Bemærk: Tegn en cirkel rundt om afsnittet på bagsiden af diaset, før du anvender monterings mediet. Når monterings mediet er påført, kan vævet blive svært at se. - Opbevar diasene i mørke ved 4 °C, indtil de er klar til at blive afbildet.
8. billeddannelse og analyse
- Udføre billeddannelse af farvning med et Konfokal mikroskop.
Bemærk: I denne protokol blev der anvendt et inverteret spektral laser scannings mikroskop (Se tabellen over materialer) sammen med målsætningerne 10x/na 0,40 eller 60x/na 1,4 (til analyse af cytokinsubcellulær lokalisering). Bølgelængder af excitation og emission vises for hver fluoroforet og fluorescerende protein i tabellen over materialer. - Udfør analyse og kvantificering efter behov ved hjælp af billedbehandlingssoftware (f. eks.
Representative Results
IFNγ produceret inden for de første 24 h efter Listeria monocytogenes infektion er afgørende for at kontrollere spredningen af dette patogen. Ved hjælp af denne protokol, kan vi visualisere ikke kun, hvilke celler der producerer IFNγ, men også om de er placeret i et bestemt mikromiljø. For at hjælpe os med at afgrænse arkitekturen i milten, mærkede vi celler, som vides at have særlig placering inden for milten. Mærket F4/80 mærker alle makrofager og fremhæver den røde pulp. Markeringen B220 etiketter B-celler og fremhæver B-celle follikler omkring T-celle zonen. Markeringen CD169 etiketter marginale zone makrofager, omkring den hvide pulp (figur 1). De fleste OTI celler, uanset om de udtrykker IFNγ eller ej, er til stede i den hvide pulp, og som sådan er alle billeder af den hvide pulp, medmindre det er angivet.
Et kritisk skridt i denne protokol er brugen af BFA til at hæmme cytokinsekretionen. Faktisk blev påvisning af IFNγ ved NK-celler stærkt forringet, når mus ikke blev behandlet med BFA (figur 2). Ved hjælp af vores protokol kunne vi finde ud af, at mindst to celletyper producerer IFNγ 24 timer efter infektion — NK-celler og antigen-specifikke CD8+ T-celler (figur 3) — på samme måde som tidligere er blevet fundet af flowcytometry3.
In situ billeddannelse af IFNγ producerende celler afslørede, at IFNγ produktion ikke spredes i hele milten, men koncentreret i diskrete områder (figur 4). Faktisk fandt vi, at T-celler blev aktiveret i hele milten (fremhævet af T-celle clustering), og dette var ikke nødvendigvis korrelerer med IFNγ produktion. En sandsynlig forklaring er, at ifnγ produktion er begrænset til placeringen af de inficerede celler15,16, og T-celle aktivering — repræsenteret ved klyngedannelse — kan understøttes af både inficerede (ifnγ positive) og ikke-inficerede (ifnγ negative) antigen-præsenterer celler. Andre pletter vil være nødvendige for at lokalisere den nøjagtige placering og få en indikation af mekanismen begrænser IFNγ produktion til dette område og dets forhold til antigen overførsel. Interessant, vi fandt, at aktiverede, grupperet, antigen-specifikke T-celler er placeret i hele hvid pulp af milten, men de producerer IFNγ kun i regioner, hvor NK celler er sameksisterende med dem (figur 5). Som sådan, tilstedeværelsen af NK celler afgrænse et specifikt mikromiljø i den hvide pulp, hvor grupperet t celler producerer ifnγ i modsætning til grupperet t celler i den anden del af hvid pulp. Dette tyder på, at T-celle aktivering ikke er tilstrækkelig til at diktere IFNγ produktion på dette tidspunkt.
En anden interessant feature fremhævet af vores protokol er den forskellige sub-cellulære lokalisering af IFNγ i NK versus CD8+ T celler5. Som vist i figur 6, mens ifnγ LOKALISERING i NK celler spredes i CYTOSOL, CD8+ T celler ofte rekruttere ifnγ mod en anden T celle.
Figur 1: markører, som fremhæver milten-arkitekturen. Mus blev inficeret med 2 x 104 CFU LM-OVA og aflives 24 h post infektion. Milten blev forklarende og forarbejdet som beskrevet i protokollen. (A) sektioner blev plettet for NK celler (anti-NCR1 efterfulgt af anti-ged IgG-FITC; grøn), OTI-RFP celler (rød) og makrofager (anti-F4/80-APC; magenta). RP = rød pulp; WP = hvid pulp. Scale bar = 200 μm. (b) sektioner blev plettet for B-celler (anti-B220-Pacific Blue; Blå), OTI-GFP-celler (GFP-signal vist med rødt) og marginale zone-makrofager (anti-CD169-Alexa647; magenta). RP = rød pulp; BF = B celle follikel; TZ = T celle zone. Scale bar = 50 μm. Dette er et repræsentativt billede af 3 uafhængige eksperimenter (N = 4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: BFA-behandling giver mulighed for påvisning af intracellulær IFNγ in situ. Nγ-produktionen er begrænset til specifikke områder i sple-musene blev inficeret med 2 x 104 CFU LM-OVA og behandlet med BFA (A) eller venstre ubehandlet (B) efter 18 h. mus blev aflives 24 h post infektion. Milten blev forklarende og forarbejdet som beskrevet i protokollen. Sektioner blev plettet for NK celler (anti-NCR1 efterfulgt af anti-ged IgG-FITC; grøn), OTI-RFP celler (rød) og IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyan). Skala bjælke = 5 μm. Dette er et repræsentativt billede af NK celle rige områder fra 3 uafhængige eksperimenter (N = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: IFNγ producerende celler i milten. Mus blev inficeret med 2 x 104 CFU LM-OVA, når det er indiceret og behandlet med BFA efter 18 h. mus blev aflives 24 h post infektion. Milten blev forklarende og forarbejdet som beskrevet i protokollen. Sektioner blev plettet for NK celler (anti-NCR1 efterfulgt af anti-ged IgG-FITC; grøn), OTI-RFP celler (rød) og IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyan). A) repræsentativt billede af en milt fra en ikke-inficeret naiv mus for at påvise fravær af ikke-specifik farvning. Hvide linjer afgrænse den hvide pulp. WP = hvid Pulp; RP = rød pulp. (B) repræsentativt billede af hvid Pulp fra milten af en mus inficeret med LM-OVA, viser invasion af NK celler til hvid pulp og produktion af IFNγ af NK celler, OTI celler og ikke-mærkede celler. Billeder er repræsentative for 4 uafhængige eksperimenter (N = 4). Skala stænger = 70 μm (A); og 20 μm (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: IFNγ produktion er begrænset til specifikke områder i milten efter LM-OVA infektion. Mus blev inficeret med 2 x 104 CFU LM-OVA og behandlet med BFA efter 18 h. mus blev aflives 24 h post infektion. Milten blev forklarende og forarbejdet som beskrevet i protokollen. Alle sektioner blev plettet for B-celler (B220-Pacific Blue AB, blå) og IFNγ (anti-IFNγ-biotin efterfulgt af streptavidin-PE; cyan). OTI-GFP-celler (GFP-signal vist med rødt). Cyan linjer svarer til områder med høj IFNγ produktion. Det er repræsentative billeder af 4 uafhængige eksperimenter (N = 4). (A) sektioner blev farves for marginale zone makrofager (anti-CD169-Alexa 647, magenta). Scale bar = 50 μm.B) der blev plettet sektioner for alle makrofager (F4/80). Scale bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: IFNγ produktion af aktiverede OTI-celler forekommer i et specifikt mikromiljø. Mus blev inficeret med 2 x 104 CFU LM-OVA og behandlet med BFA efter 18 h. mus blev aflives 24 h post infektion. Spleens blev forklarende og behandlet som beskrevet i protokollen. Sektioner blev plettet for NK celler (anti-NCR1 efterfulgt af anti-ged IgG-FITC; grøn), OTI-RFP celler (rød) og IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyan). Grønne og røde streger fremhæver henholdsvis NK-og OTI-celle zonerne. Hvid pil indikerer eksempler på T-celle klynger, som ikke producerer IFNγ. Grønne pile eksempler på T-celle klynger, som producerer IFNγ. Scale bar = 100 μm. Dette er et repræsentativt billede af fire uafhængige eksperimenter (N = 4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: subcellulær lokalisering af IFNγ i NK-celler og T-celler. Mus blev inficeret med 2 x 104 CFU LM-OVA og behandlet med BFA efter 18 h. mus blev aflives 24 h post infektion. Milten blev forklarende og forarbejdet som beskrevet i protokollen. Alle sektioner blev plettet for IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyan). Hvide linjer afgrænse cellekanter og hvide pile viser direktionalitet sekretion. Dette er et repræsentativt billede af to uafhængige eksperimenter (N = 5). (A)-OTI-RFP-celler vises med rødt. Scale bar = 5 μm. (B) sektioner blev plettet for NK celler (anti-NCR1 efterfulgt af anti-ged IgG-FITC; grøn. Scale bar = 2 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
I dette manuskript præsenterer vi en metode til at visualisere IFNγ produktion i milten efter L. monocytogenes infektion i mus. Denne protokol er enkel og kan tilpasses til andre væv og cytokinudløsere, men følgende aspekter skal overvejes. Cellerne udskiller ofte hurtigt de cytokiner, de producerer, og cytokiner bliver hurtigt hentet af tilstødende celler. Det er så vanskeligt at påvise cytokiner in situ. En fælles metode til hurtig genoptagelse af cytokin-produktionen er at stimulere cellerne ex vivo efterfulgt af cytokindetektion i medierne ved enzym relateret immunosorbent analyse. I denne sammenhæng går alle oplysninger om den geografiske lokalisering af de cytokinproducerende celler tabt. Desuden afspejler cytokinproduktionen efter genstimulering ikke nødvendigvis, om cytokiner faktisk produceres og udskilles in vivo, men indikerer snarere, at en given cellepopulation har kapacitet til at producere cytokiner. Derfor vil begge metoder give forskellige oplysninger, og man bør overveje, hvilke oplysninger der er mest værdifulde for deres eksperiment.
For at detektere intracellulære cytokiner, bruger vores metode en intracellulær protein transport hæmmer til at fælde cytokiner i cellerne og øge signaldetektering. Det er dog vigtigt at bemærke, at disse inhibitorer påvirker den normale transport af proteiner fra endotel reticulum (re) til Golgi-apparatet og til det sekretoriske vesikelprotein, der hæmmer deres frigivelse, hvilket kan forårsage toksicitet. Som en konsekvens, BFA, eller anden inhibitor, bør anvendes i en kort periode, typisk ikke mere end et par timer. Derfor er det vigtigt at finde den rette balance mellem inhibitor dosis og behandlings tidspunkt for at optimere niveauet af cytokiner fanget inde i cellen uden at forårsage alvorlige cytotoksiske virkninger. Disse variabler kan variere mellem cytokiner og administrationsvej for BFA. I vores infektion model, BFA blev administreret intraperitonealt for at give en hurtig systemisk dispersion, men det kan også leveres intravenøst.
De mest almindeligt anvendte intracellulære protein transport hæmmere er BFA, der anvendes her, og monensin (MN). Disse hæmmere bruges ofte uden forskel til at akkumulere og studere cytokin produktion, men de har små forskelle i deres virkningsmekanismer. MN hæmmer transport af proteiner i Golgi-apparatet og akkumulerer dermed proteiner i Golgi17 , mens BFA forebygger koatomer protein kompleks-i rekruttering, hvilket hæmmer proteinets tilbage bevægelse til endoplasmatiske reticulum (er) og derved fremme akkumulering af cytokiner i ER18. Som sådan, vælge den bedste intracellulære protein transport inhibitor vil afhænge af forskellige faktorer, såsom cytokin at blive opdaget. For eksempel er det blevet påvist i lipopolysaccharid-induceret intracellulær farvning af monocytter, at BFA er mere effektiv til at måle cytokinerne IL-1β, IL-6 og TNF end MN19.
Denne protokol omfatter visualisering af cytokin in situ ved Konfokal mikroskopi, og derfor er der kun et begrænset antal markører, end det kan bruges til at studere de cytokinproducerende celler og deres mikromiljø. Det er også nødvendigt at overveje, at protein transport hæmmere såsom BFA eller MN forstyrrer den normale ekspression af flere proteiner og dermed deres anvendelse, når man studerer den samtidige ekspression af visse aktiverings celleoverflade markører skal gribes an Omhyggeligt. For eksempel blokerer BFA men ikke MN udtrykket af CD69 i murine lymfocytter20. På trods af denne begrænsning giver konfokale Imaging mulighed for subcellulær lokalisering af cytokiner samt retningen af cytokinsekretionen i cellen. De data, der genereres ved hjælp af denne protokol tyder på, at NK-celler har tendens til at udskiller IFN-y i et diffust mønster, mens CD8+ t- celler synes at dirigere IFNγ sekretionen mod andre CD8+ t-celler, der er i direkte interaktion med dem5.
Afslutningsvis, denne protokol er egnet til at visualisere en række cytokiner in situ og identificere producerende celler og deres mikromiljø efter mange udløsere såsom infektion eller autoimmunitet. De indhentede oplysninger er medvirkende til at forstå betydningen af in vivo rumlige orkestrering af forskellige celletyper og cytokin de producerer, nødvendige for en effektiv immunrespons.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Kennedy Institute Imaging Facility personale for teknisk assistance med Imaging. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Kennedy Trust (til A.G.), og bioteknologi og biologisk videnskab Forskningsråd (BB/R015651/1 til A.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brefeldin A | Cambridge bioscience | CAY11861 | |
| Paraformaldehyde | Agar scientific | R1018 | |
| L-Lysin dihydrochloride | Sigma lifescience | L5751 | |
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | |
| D(+)-saccharose | VWR Chemicals | 27480.294 | |
| Precision wipes paper Kimtech science | Kimberly-Clark Professional | 75512 | |
| O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy | VWR Chemicals | 361603E | |
| Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 | Biolegend | 101302 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml |
| Microscope slides - Superfrost Plus | VWR Chemicals | 631-0108 | |
| anti-CD169 - AF647 | Biolegend | 142407 | Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 65 |
| anti-F4/80 - APC | Biolegend | 123115 | Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 660 |
| anti-B220 - PB | Biolegend | 103230 | Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/mL Excitation wavelength: 410 Emission wavelength: 455 |
| anti-IFNg - biotin | Biolegend | 505804 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL |
| anti-IFNg - BV421 | Biolegend | 505829 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL Excitation wavelength: 405 Emission wavelength: 436 |
| anti-Nkp46/NCRI | R&D Systems | AF2225 | Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/mL |
| anti-goat IgG-FITC | Novusbio | NPp 1-74814 | Antibody clone and Concentration used: 1 mg/mL Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
| Streptavidin - PE | Biolegend | 405203 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mL Excitation wavelength: 565 Emission wavelength: 578 |
| Streptavidin - FITC | Biolegend | 405201 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mlL Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Cover glasses 22 mm x 40 mm | Menzel-Glazer | 12352128 | |
| Liquid blocker super PAP PEN mini | Axxora | CAC-DAI-PAP-S-M | |
| Imaris - Microscopy Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Confocal microscope - Olympus FV1200 Laser scanning microscope | Olympus | ||
| Cryostat - CM 1900 UV | Leica | ||
| Base mould disposable | Fisher Scientific UK Ltd | 11670990 | |
| PBS 1x | Life Technologies Ltd | 20012068 | |
| BHI Broth | VWR Brand | 303415ZA | |
| GFP | Excitation wavelength: 484 Emission wavelength: 507 |
||
| RFP | Excitation wavelength: 558 Emission wavelength: 583 |
||
| Insulin syringe, with needle, 29 G | VWR International | BDAM324824 | |
| C57BL/6 wild type mice | Charles River |
References
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Kubota, K., Kadoya, Y. Innate IFN-gamma-producing cells in the spleen of mice early after Listeria monocytogenes infection: importance of microenvironment of the cells involved in the production of innate IFN-gamma. Frontiers in Immunology. 2 (26), (2011).
- Dunn, P. L., North, R. J. Early gamma interferon production by natural killer cells is important in defense against murine listeriosis. Infection and Immunity. 59 (9), 2892-2900 (1991).
- Krummel, M. F., et al. Paracrine costimulation of IFN-gamma signaling by integrins modulates CD8+ T cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), 11585-11590 (2018).
- Curtsinger, J. M., Agarwal, P., Lins, D. C., Mescher, M. F. Autocrine IFN-gamma promotes naive CD8+ T cell differentiation and synergizes with IFN-alpha to stimulate strong function. Journal of Immunology. 189 (2), 659-668 (2012).
- Hosking, M. P., Flynn, C. T., Whitton, J. L. Antigen-specific naive CD8++ T cells produce a single pulse of IFN-gamma in vivo within hours of infection, but without antiviral effect. Journal of Immunology. 193 (4), 1873-1885 (2014).
- Croxford, A. L., Buch, T. Cytokine reporter mice in immunological research: perspectives and lessons learned. Immunology. 132 (1), 1-8 (2011).
- Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8++ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. Journal of Visualized Experiments. (9), 409 (2007).
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. Journal of Visualized Experiments. (7), 265 (2007).
- Pope, C., et al. Organ-specific regulation of the CD8+ T cell response to Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 166 (5), 3402-3409 (2001).
- Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance. Current Protocols in Microbiology. 31, 1-7 (2013).
- Kang, S. J., Liang, H. E., Reizis, B., Locksley, R. M. Regulation of hierarchical clustering and activation of innate immune cells by dendritic cells. Immunity. 29 (5), 819-833 (2008).
- Chang, S. R., et al. Characterization of early gamma interferon (IFN-gamma) expression during murine listeriosis: identification of NK1.1+ CD11c+ cells as the primary IFN-gamma-expressing cells. Infection and Immunity. 75 (3), 1167-1176 (2007).
- Mollenhauer, H. H., Morre, D. J., Rowe, L. D. Alteration of intracellular traffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1031 (2), 225-246 (1990).
- Helms, J. B., Rothman, J. E. Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF. Nature. 360 (6402), 352-354 (1992).
- Schuerwegh, A. J., Stevens, W. J., Bridts, C. H., De Clerck, L. S. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha in monocytes. Cytometry. 46 (3), 172-176 (2001).
- Nylander, S., Kalies, I. Brefeldin A, but not monensin, completely blocks CD69 expression on mouse lymphocytes: efficacy of inhibitors of protein secretion in protocols for intracellular cytokine staining by flow cytometry. Journal of Immunology Methods. 224 (1-2), 69-76 (1999).
