Summary
Aqui, nós descrevemos um método confocal simples da imagem latente para visualizar a localização in situ das pilhas que secretoras a gama do interferon do citocinas em órgãos lymphoid secundários murino. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de outras citocinas em diversos tecidos.
Abstract
As citocinas são pequenas proteínas secretadas por células, mediando as comunicações celulares que são cruciais para respostas imunes efetivas. Uma característica das citocinas é o seu pleiotropismo, como eles são produzidos por e podem afetar uma infinidade de tipos de células. Como tal, é importante compreender não só quais células estão produzindo citocinas, mas também em que ambiente o fazem, a fim de definir terapêutica mais específica. Aqui, nós descrevemos um método para visualizar in situ da produção do citocinas que segue a infecção bacteriana. Esta técnica baseia-se em células produtoras de citocinas de imagem em seu ambiente nativo por microscopia confocal. Para fazer isso, as seções de tecido são manchadas para marcadores de vários tipos de células, juntamente com uma mancha de citocinas. Chave para este método, a secreção de citocinas é bloqueada diretamente in vivo antes de colher o tecido de interesse, permitindo a detecção da citocina que se acumulou dentro das células produtoras. As vantagens desse método são múltiplo. Em primeiro lugar, o microambiente no qual as citocinas são produzidas é preservada, o que poderia, em última análise, informar sobre os sinais necessários para a produção de citocinas e as células afetadas por essas citocinas. Além, este método dá uma indicação da posição da produção do citocinas in vivo, porque não confia na reestimulação in vitro artificial das pilhas produzindo. No entanto, não é possível analisar simultaneamente a sinalização a jusante de citocinas em células que recebem a citocina. Da mesma forma, os sinais de citocinas observados correspondem apenas ao tempo-janela durante o qual a secreção de citocinas foi bloqueada. Quando nós descrevemos a visualização da gama do interferon do citocinas (IFN) no spleen que segue a infecção do rato pelas bactérias intracelular Listeria monocytogenes, este método poderia potencial ser adaptado à visualização de toda a citocina em a maioria dos órgãos.
Introduction
Orquestrar uma resposta imune eficiente contra um patógeno requer integração complexa de sinais exibidos por uma variedade de células imunes que muitas vezes são dispersas entre o organismo. A fim de se comunicar, essas células produzem pequenas proteínas solúveis com múltiplas funções biológicas que atuam como imunomoduladores denominados citocinas. Citocinas controlam o recrutamento de células, ativação e proliferação e, portanto, são conhecidos por serem os principais intervenientes na promoção das respostas imunes1. Respostas imunes efetivas exigem que as citocinas sejam liberadas em um padrão espaciotemporal muito organizado que conecta células específicas para induzir sinais específicos. Portanto, é crucial estudar a produção de citocinas e sua sinalização in situ, levando em conta o microambiente no qual as citocinas são produzidas.
Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) é uma bactéria intracelular Gram-positiva usada como um modelo principal para estudar respostas imunes a patógenos intracelulares em camundongos. Uma citocina, IFN gama (IFNγ) é produzida rapidamente, dentro de 24 h após a infecção por L. monocytogenes . É necessário para a depuração do patógeno, como camundongos nocauteado para IFNγ são altamente suscetíveis à infecção por L. monocytogenes 2. IFNγ é pleiotrópico e produzido por múltiplas células após a infecção3. Quando o IFNγ produzido por pilhas naturais do assassino (NK) for exigido para a atividade anti-bacteriana direta4, o IFNγ de outras fontes foi mostrado para ter outras funções. De fato, nós e outros recentemente descobrimos que o IFNγ produzido por células t CD8 + tem uma função específica em regular a diferenciação de células t5,6,7. Como tal, compreender quais células produzem IFNγ (e em que microambiente) é crucial para dissecar sua função.
A técnica mais comum para o estudo da produção de citocinas baseia-se na coloração intracelular de citocinas analisadas pelo fluxo cytometry. Este método permite a detecção simultânea de múltiplas citocinas combinadas com marcadores de superfície celular dentro de uma única amostra, proporcionando uma ferramenta extremamente útil para estudar a produção de citocina. No entanto, usando a técnica acima mencionada implica a perda de qualquer informação espacial. Além disso, a detecção de citocinas geralmente depende de re-estimulação in vitro para permitir a detecção de citocinas. Como tal, a capacidade de uma determinada célula para produzir uma citocina é analisada, e não necessariamente correlaciona-se com a secreção de citocinas real in situ. Outros métodos usam camundongos de repórter para os quais a expressão de proteínas fluorescentes se correlaciona com a transcrição da citocinas e permite a visualização em um nível de célula única8. Embora este método possa controlar a transcrição do citocinas in situ, há um número limitado de ratos do citocinas-repórter disponíveis. Além disso, a transcrição, tradução e secreção podem, por vezes, ser desligadas, e as proteínas fluorescentes têm uma meia-vida diferente da citocinas que relatam, tornando este método às vezes não é adequado para visualização de citocinas in situ.
Aqui, nós descrevemos um método para visualizar a produção in situ do citocinas pela microscopia confocal na definição da única pilha. Esta técnica permite a visualização da fonte celular e do nicho circundante dentro do tecido. Este protocolo descreve especificamente a visualização da produção de IFNγ no baço de camundongos infectados por L. monocytogenes , concentrando-se aqui na produção de IFNγ por células NK e células T CD8+ específicas do antígeno. No entanto, pode ser estendido e adaptado à caracterização de qualquer produção de citocinas no contexto de outras situações em que são produzidas citocinas, como infecção, inflamação ou doenças auto-imunes, desde que a citocina direcionada possa ser mantida nas células por inibidor de transporte proteico intracelular.
Protocol
Todos os experimentos envolvendo camundongos estavam de acordo com a lei de procedimentos científicos do Reino Unido de 1986.
1. transferência adoptiva de células T CD8+ específicas antigénicas em ratinhos
- Isolar ovalbumina (óvulos)-células t CD8+ específicas (OTI) expressando proteína verde fluorescente (OTI-GFP) ou proteína vermelha fluorescente (OTI-RFP) a partir da suspensão linfonodal de camundongos transgênicos do receptor de células t9,10 usando um mouse Jogo da isolação da pilha de CD8+ T como por instruções da manufatura. Prepare a suspensão celular esmagando os gânglios linfáticos usando um êmbolo da seringa, como descrito anteriormente11.
- Transfira as células OTI-GFP ou OTI-RFP (3 x 106 células) para C57Bl/6 receptores de camundongos Wild Type por injeção intravenosa, conforme descrito por Cahalan, et al.12. Use camundongos que são tipicamente 6 – 12 semana de idade.
Nota: Esta etapa é opcional e só é necessária para rastrear células T CD8+ específicas do antígeno.
2. infecção por Listeria monocytogenes
- Expandir L. monocytogenes geneticamente modificados para expressar OVA (LM-OVA)13 para uma fase exponencial de crescimento em infusão de coração de caldo a 37 ° c agitação suave até que o OD600 atinja 0,08 – 0,1, conforme descrito anteriormente em referência a 14.
- Injete 100 μL (volume máximo = 200 μL) de 0,1 – 0,5 LD50 LM-ova diluído em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) por injecção intravenosa utilizando uma seringa de insulina de 29 G, em C57Bl/6 ratos de tipo selvagem que ostentam células Oti-GFP ou Oti-RFP quando indicado.
Nota: Em nossas mãos, 0,1 x LD50 LM-ova corresponde a 2 x 104 unidades formadoras de Colônia (CFU). L. monocytogenes geneticamente modificados para expressar ova é usado para ativar as células T de IOT CD8+ previamente transferidas, mas outras cepas de l. monocytogenes podem ser usadas.
3. tratamento com brefeldin A (BFA) para bloquear a secreção de citocina
- Injetar 250 μg de BFA em 200 μL de PBS via intraperitoneal 6 h antes do sacrifício do rato utilizando uma seringa de insulina de 29 G.
Nota: O BFA liofilizado é primeiro ressuspensão em dimetil sulfóxido (DMSO) para preparar o estoque de 25 mg/mL de concentração. A BFA é então diluída em PBS à temperatura ambiente (RT) para evitar a cristalização antes da injeção. A inibição da secreção de citocinas induz o acúmulo de IFNγ nas células. Isto é crucial para a deteção do citocinas.
4. colhendo o baço
- Eutanizar os camundongos usando a concentração crescente de CO2 seguido de luxação cervical.
Nota: Siga as diretrizes da instituição local para a eutanásia humana de camundongos. - Limpe o abdômen com 70% de etanol, faça uma incisão com uma tesoura para fazer um corte de 1 a 2 cm através da pele no flanco esquerdo do mouse, onde o baço está localizado. Faça com cuidado uma incisão no peritônio para expor o spleen e para tirá-lo com tweezers. Colher o baço, sendo cuidadoso para não apertá-lo com fórceps ou cortá-lo para evitar perturbar a arquitetura do baço.
5. fixação do baço com paraformaldeído (PFA)
- Prepare a solução fixativa misturando 3,75 mL de PBS e 3,75 mL de 0,2 M L-lisina. Adicionar 21 mg de sódio m-periodate e misture bem. Em seguida, adicione 2,5 mL de PFA de 4% e 20 μL de NaOH de 12 N.
Nota: Use a solução fixativa no mesmo dia e descarte o excesso. Não o guarde. Esta etapa de fixação é importante se a amostra contiver proteínas fluorescentes como a GFP. Não use PFA contendo vestígios de metanol, pois desnatura proteínas fluorescentes.
Atenção: O PFA é tóxico e deve ser manuseado com precaução. - Submergir o baço no fixador e fixar por um mínimo de 4 h, tipicamente 16 – 20 h a 4 ° c agitação suave.
- Descarte a solução fixativa e adicione 5 mL de PBS por 5 min em RT agitação suave.
- Substitua o PBS por 5 mL de um PBS fresco incubar por 1 h a 4 ° c agitação suave.
- Substitua o PBS por 5 mL de sacarose a 30%, incubar por 12 – 24 h.
Nota: Este método ajuda a manter a morfologia do tecido. Após a incubação com solução de sacarose, o órgão deve afundar na parte inferior do poço.
6. congelamento e seccionamento
- Coloque o gelo seco em um grande receptáculo e coloque um recipiente menor dentro contendo cerca de 50 mL de metanol puro e alguns pedaços de gelo seco.
- Seque suavemente o baço numa limpeza sem fiapos.
- Coloc o spleen dentro de um molde baixo que contem uma gota do composto o melhor da temperatura de corte (OCT) na parte inferior. Tenha cuidado para não produzir bolhas. Adicione OCT sobre o baço.
- Com fórceps, deposite o molde baixo na superfície do metanol, certificando-se de que não toca no OCT. congelando o tecido o mais rapidamente possível para minimizar artefatos.
- Quando estiver congelado, prossiga com o corte.
Nota: O baço congelado pode ser mantido a-80 ° c por vários meses. -
Corte o tecido usando um cryomicrotome.
- Ajuste a temperatura da câmara no criostat deve a-21 ° c. Corte seções da espessura desejada (geralmente em torno de 10 μm). Este protocolo funciona com espessuras de até 30 μm.
- Colete seções em lâminas de microscópio de vidro (veja a tabela de materiais) e inspecione visualmente.
Nota: As seções podem ser mantidas em-80 ° c por diversos meses.
7. coloração imunofluorescente
- Permita que a seção venha para RT.
- Desenhe um círculo com um bloqueador de líquido (por exemplo, caneta PAP) ao redor da seção de tecido. Desenhe fora da OCT ou não vai ficar.
- Uma vez que secou, rehidrate a amostra coloc PBS na seção do tecido por 5 minutos.
Nota: O volume colocado na seção depende do tamanho da seção. Normalmente utilizamos 100 – 300 μL. Não deixe secar as secções uma vez que são rehidratadas. - Enxague com PBS pelo menos duas vezes para garantir que a seção está bem aderida ao slide.
-
Adicione a solução de bloqueio à seção para diminuir a ligação não específica de anticorpos.
- Prepare a solução de bloqueio como segue: PBS com 0,1% Triton X100, 2% soro de bezerro fetal (FCS), 2,5 μg/mL receptor FC bloqueador (anti-mouse CD16/32). Em seguida, adicione 2 – 5% de soro normal das espécies de cada anticorpo secundário do painel de coloração.
Nota: Se os anticorpos forem diretamente conjugados/biotinilados, adicione 5% de soro normal das espécies de cada anticorpo primário. Se um anticorpo primário e um dos anticorpos secundários são da mesma espécie (por exemplo, anticorpo primário levantado em coelho e coelho secundário anti-Rat), não use a espécie sérica normal, uma vez que irá aumentar o sinal de fundo. - Remova delicadamente o PBS da seção pela aspiração e adicione 100 μL da solução de obstrução por a seção da amostra. Incubar em uma câmara molhada coberta por um mínimo de 1 h em RT.
- Prepare a solução de bloqueio como segue: PBS com 0,1% Triton X100, 2% soro de bezerro fetal (FCS), 2,5 μg/mL receptor FC bloqueador (anti-mouse CD16/32). Em seguida, adicione 2 – 5% de soro normal das espécies de cada anticorpo secundário do painel de coloração.
-
Mancha com anticorpos primários.
- Diluir os anticorpos primários na concentração óptima na solução de bloqueio. A concentração de anticorpos de ponto de partida geral é de 5 μg/mL, mas deve ser otimizada para cada anticorpo e tecido.
Nota: Se os anticorpos forem diretamente conjugados, centrifugue a mistura de anticorpos a 17,135 x g (13,500 rpm) durante 15 min a 4 ° c antes de utilizá-la. Fluoróforos podem precipar. Esta etapa aglomerará os precipitados e impedirá desse modo a deposição não específica dos anticorpos precipitados na corrediça. - Substitua a solução de bloqueio com a mistura de anticorpos primários para cada amostra.
- Incubar por 4 h no RT ou durante a noite (OVN) a 4 ° c em uma câmara molhada coberta.
- Diluir os anticorpos primários na concentração óptima na solução de bloqueio. A concentração de anticorpos de ponto de partida geral é de 5 μg/mL, mas deve ser otimizada para cada anticorpo e tecido.
-
Realize a lavagem.
- Prepare o tampão de lavagem adicionando 2% de FCS a PBS.
- Lave 4 vezes com tampão de lavagem: um rápido (sem incubação), um por 10 min e dois por 5 min. Em seguida, realize uma lavagem final com PBS por 5 min.
-
Coloração com anticorpos secundários.
- Diluir os anticorpos secundários de interesse na concentração óptima na solução de bloqueio. Centrifugue a mistura, como descrito para os anticorpos primários.
- Retire a solução de lavagem final. Adicione a mistura de anticorpos secundários no topo da secção e incubar por 1 – 4 h na RT numa câmara húmida coberta.
- Lave 4 vezes com tampão de lavagem: um rápido (sem incubação), um por 10 min e dois por 5 min. Em seguida, realize uma lavagem final com PBS por 5 min.
- Retire a solução de lavagem final. Permita que o PBS evate mas não seque demasiado a seção. Coloque uma gota do meio de montagem em cima da amostra e coloque cuidadosamente o vidro de cobertura em cima dela. O meio de montagem deve recuperar toda a seção. Deixe-a polimerase OVN em RT protegida da luz.
Nota: Desenhe um círculo em torno da seção no verso do slide antes de aplicar o suporte de montagem. Uma vez que o meio de montagem é aplicado, o tecido pode tornar-se difícil de ver. - Armazene os slides no escuro a 4 ° c até estar pronto para a imagem.
8. imagem e análise
- Realize a imagem latente da mancha com um microscópio confocal.
Nota: Neste protocolo, utilizou-se um microscópio de varredura a laser espectral invertido (ver tabela de materiais), juntamente com os objetivos 10x/na 0,40 ou 60x/na 1,4 (para análise da localização subcelular de citocinas). Comprimentos de onda de excitação e emissão são exibidos para cada fluoróforo e proteína fluorescente na tabela de materiais. - Realize análises e quantificação conforme exigido usando o software de processamento de imagem (por exemplo, Imaris ou Fiji).
Representative Results
IFNγ produzido dentro dos primeiros 24 h após a infecção do monocytogenes de Listeria é crítico controlar a propagação deste micróbio patogénico. Usando este protocolo, podemos Visualizar não só quais células estão produzindo IFNγ, mas também se eles estão localizados em um microambiente específico. Para nos ajudar a delinear a arquitetura do baço, rotulamos células conhecidas por ter uma localização particular dentro do baço. O marcador F4/80 rotula todos os macrófagos e destaca a polpa vermelha. O marcador B220 rotula as células B e destaca os folículos de células B em torno da zona de célula T. O marcador CD169 rotula macrófagos de zona marginal, envolvendo a polpa branca (Figura 1). A maioria das células OTI, quer expressem IFNγ ou não, estão presentes na polpa branca e, como tal, todas as imagens são as da polpa branca, a menos que indicado.
Um passo crítico neste protocolo é o uso de BFA para inibir a secreção de citocinas. De fato, a detecção de IFNγ por células NK foi muito prejudicada quando os camundongos não foram tratados com BFA (Figura 2). Usando nosso protocolo, pudemos descobrir que pelo menos dois tipos de células produzem IFNγ 24 h após a infecção — células NK e células T CD8+ específicas do antígeno (Figura 3) — similarmente ao que foi encontrado anteriormente pela citometria de fluxo3.
A imagem latente in situ de células produtoras de IFNγ revelou que a produção de IFNγ não é espalhada por todo o baço, mas concentrada em áreas discretas (Figura 4). De fato, verificou-se que as células T foram ativadas em todo o baço (destacadas pelo agrupamento de células T), e isso não necessariamente se correlacionou com a produção de IFNγ. Uma explicação provável é que a produção de IFNγ é restrita à localização das células infectadas15,16e ativação de célula T — representada por clustering — pode ser suportada por ambos infectados (IFNγ positivo) e não infectados (IFNγ negativo) células apresentadoras de antígeno. Outras manchas serão exigidas para apontar a posição exata e obter uma indicação do mecanismo que restringe a produção de IFNγ a esta área e a sua relação à transferência do antígeno. Curiosamente, verificou-se que as células T ativadas, agrupadas e antígeno-específicas estão localizadas em toda a polpa branca do baço, mas produzem IFNγ somente em regiões onde as células NK estão coexistindo com elas (Figura 5). Como tal, a presença de células NK delinea um microambiente específico na polpa branca, em que as células T agrupadas produzem IFNγ em oposição às células T agrupadas na outra parte da polpa branca. Isso sugere que a ativação da célula T não é suficiente para ditar a produção de IFNγ neste momento.
Outro recurso interessante destacado pelo nosso protocolo é a localização subcelular diferente de IFNγ em NK versus células T CD8+ 5. Como mostrado na Figura 6, enquanto a localização de IFNγ em células NK é difusa no citosol, células t CD8+ muitas vezes recrutar IFNγ para outra célula t.
Figura 1: marcadores destacando a arquitetura do baço. Camundongos foram infectados com 2 x 104 CFU LM-ova e eutanasiado 24 h pós-infecção. O baço foi explantados e processado como descrito no protocolo. (A) as secções foram coradas para células NK (NCR1 seguidas de anti-cabra IgG-FITC; verde), células Oti-RFP (vermelho) e macrófagos (anti-F4/80-APC; magenta). RP = polpa vermelha; WP = polpa branca. Barra de escala = 200 μm. (b) as secções foram coradas para as células B (anti-B220-Pacific Blue; Azul), células OTI-GFP (sinal GFP mostrado em vermelho) e macrófagos marginais da zona (CD169-Alexa647; magenta). RP = polpa vermelha; BF = folículo de células B; TZ = zona de célula T. Barra de escala = 50 μm. Esta é uma imagem representativa de 3 experimentos independentes (N = 4). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: o tratamento com BFA permite a detecção de IFNγ intracelular in situ. A produção de nΓ é restrita a áreas específicas na evpe camundongos foram infectados com 2 x 104 CFU LM-ova e tratados com BFA (A) ou esquerda não tratada (B) após 18 h. camundongos foram eutanasiados 24 h pós-infecção. O baço foi explantados e processado como descrito no protocolo. As seções foram manchadas para as pilhas de NK (NCR1 seguidas pelo anti-cabra IgG-FITC; verde), as pilhas de OTI-RFP (vermelho) e o IFNγ (anti-IFNγ-BV421; ciano). Barra de escala = 5 μm. Esta é uma imagem representativa de áreas ricas em células NK de 3 experimentos independentes (N = 3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: IFNγ produzindo células no baço. Camundongos foram infectados com 2 x 104 CFU LM-OVA quando indicados e tratados com BFA após 18 h. camundongos foram eutanasiados 24 h pós-infecção. O baço foi explantados e processado como descrito no protocolo. As seções foram manchadas para as pilhas de NK (NCR1 seguidas pelo anti-cabra IgG-FITC; verde), as pilhas de OTI-RFP (vermelho) e o IFNγ (anti-IFNγ-BV421; ciano). (A) imagem representativa de um baço de um rato ingênuo não infectado para demonstrar ausência de coloração não específica de IFNγ. As linhas brancas delineiam a polpa branca. WP = polpa branca; RP = polpa vermelha. (B) imagem representativa da polpa branca do baço de um camundongo infectado por LM-ova, mostrando invasão de células NK à polpa branca e produção de IFNγ por células NK, células Oti e células não rotuladas. As imagens são representativas de 4 experimentos independentes (N = 4). Barras de escala = 70 μm (A); e 20 μm (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: a produção de IFNγ é restrita a áreas específicas no baço após a infecção por LM-ova. Camundongos foram infectados com 2 x 104 CFU LM-ova e tratados com BFA após 18 h. camundongos foram eutanasiados 24 h pós-infecção. O baço foi explantados e processado como descrito no protocolo. Todas as secções foram coradas para as células B (B220-Pacific Blue AB, Blue) e IFNγ (anti-IFNγ-biotina seguida de streptavidin-PE; ciano). Células OTI-GFP (sinal GFP mostrado em vermelho). As linhas ciano correspondem a áreas de alta produção de IFNγ. São imagens representativas de 4 experimentos independentes (N = 4). (A) as seções foram manchadas para macrófagos marginais da zona (CD169-Alexa 647, magenta). Barra de escala = 50 μm. (B) as secções foram coradas para todos os macrófagos (F4/80). Barra de escala = 100 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: a produção de IFNγ por células Oti ativadas ocorre em um microambiente específico. Camundongos foram infectados com 2 x 104 CFU LM-ova e tratados com BFA após 18 h. camundongos foram eutanasiados 24 h pós-infecção. Os baços foram explantados e processados como descrito no protocolo. As seções foram manchadas para as pilhas de NK (NCR1 seguidas pelo anti-cabra IgG-FITC; verde), as pilhas de OTI-RFP (vermelho) e o IFNγ (anti-IFNγ-BV421; ciano). Linhas verdes e vermelhas destacam as zonas de células NK e OTI, respectivamente. A seta branca indica exemplos de clusters de células T que não produzem IFNγ. Exemplos de setas verdes de clusters de células T produzindo IFNγ. Barra de escala = 100 μm. Esta é uma imagem representativa de quatro experimentos independentes (N = 4). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: localização subcelular de IFNγ em células NK e células T. Camundongos foram infectados com 2 x 104 CFU LM-ova e tratados com BFA após 18 h. camundongos foram eutanasiados 24 h pós-infecção. O baço foi explantados e processado como descrito no protocolo. Todas as secções foram coradas para IFNγ (anti-IFNγ-BV421; ciano). As linhas brancas delineiam as bordas das células e as setas brancas mostram a direcionalidade da secreção. Esta é uma imagem representativa de dois experimentos independentes (N = 5). (A)-Oti-as células RFP são mostradas em vermelho. Barra de escala = 5 μm. (B) as secções foram coradas para as células NK (anti-NCR1 seguidas de anti-cabra IgG-FITC; verde. Barra de escala = 2 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Neste manuscrito, apresentamos um método para visualizar a produção de IFNγ no baço após infecção por L. monocytogenes em camundongos. Este protocolo é simples e pode ser adaptado a outros tecidos e gatilhos de citocinas, mas os seguintes aspectos devem ser considerados. As células geralmente secretam rapidamente as citocinas que produzem, e as citocinas são rapidamente colhidas por células vizinhas. É tão difícil detectar citocinas in situ. Um método comum para re-iniciar ràpida a produção do citocinas é reestimular as pilhas ex vivo seguidas pela deteção do citocinas nos meios pelo ensaio enzima-lig da imunoabsorção. Neste contexto, qualquer informação sobre a localização espacial das células produtoras de citocinas é perdida. Além disso, a produção de citocinas após a re-estimulação não reflete necessariamente se as citocinas são realmente produzidas e secretadas in vivo, mas sim indica a capacidade de uma determinada população de células para produzir citocinas. Portanto, ambos os métodos fornecerão informações diferentes e um deve considerar quais informações são mais valiosas para seu experimento.
A fim detectar citocinas intracelular, nosso método usa um inibidor intracelular do transporte da proteína para prender citocinas dentro das pilhas e para aumentar a deteção do sinal. Entretanto, é importante notar que esses inibidores afetam o transporte normal de proteínas do retículo endotelial (re) para o aparelho de Golgi e para a vesícula secretora prejudicando sua liberação, o que poderia causar toxicidade. Como consequência, BFA, ou outro inibidor, deve ser usado por um curto período de tempo, normalmente não mais do que algumas horas. Daqui, é importante encontrar o contrapeso direito entre a dose do inibidor e a época do tratamento a fim aperfeiçoar o nível de citocinas prendidos dentro da pilha sem causar efeitos citotóxica sérios. Essas variáveis podem diferir entre as citocinas e a via de administração para o BFA. Em nosso modelo da infecção, o BFA foi administrado via intraperitoneal a fim fornecer uma dispersão sistemática rápida, mas pode igualmente ser entregado intravenosamente.
Os inibidores de transporte de proteínas intracelulares mais comumente usados são BFA, usados aqui e monensina (MN). Estes inibidores são freqüentemente usados indistintamente para acumular e estudar a produção de citocinas, mas eles têm pequenas diferenças em seus mecanismos de ação. MN inibe o transporte de proteínas dentro do aparelho de Golgi, portanto, acumulando proteínas no Golgi17 enquanto BFA previne o recrutamento complexo-I de proteína coatomer, inibindo o movimento retrógrado de proteínas para o retículo endoplasmático (er) e promovendo assim a acumulação de citocinas no er18. Como tal, escolher o melhor inibidor intracelular do transporte da proteína dependerá de fatores diferentes, tais como o citocinas a ser detectado. Por exemplo, tem sido demonstrado na coloração intracelular induzida por lipopolissacarídeos de monócitos que a BFA é mais eficiente para medir as citocinas IL-1 β, IL-6 e TNF que MN19.
Este protocolo envolve a visualização da citocinas in situ por microscopia confocal e, portanto, há apenas um número limitado de marcadores que podem ser usados para estudar as células produtoras de citocinas e seu microambiente. É igualmente necessário considerar que os inibidores do transporte da proteína tais como BFA ou MN perturbam a expressão normal de diversas proteínas e daqui seu uso ao estudar a expressão simultânea de determinados marcadores de superfície da pilha da ativação tem que ser aproximado Cuidadosamente. Por exemplo, BFA, mas não MN bloqueia a expressão de CD69 em linfócitos murinos20. Apesar desta limitação, a imagem latente confocal permite a localização subcelular das citocinas, assim como a direção do secretion da citocinas dentro da pilha. Os dados gerados usando este protocolo sugerem que as pilhas de NK tendem a secretar IFN-y em um teste padrão difuso quando as pilhas de t CD8+ parecerem dirigir a secreção de IFNγ para outras pilhas de t CD8+ que estão na interação direta com elas5.
Para concluir, este protocolo é adequado para visualizar uma variedade de citocinas in situ e identificar células produtoras e seu microambiente após muitos gatilhos, tais como infecção ou autoimunidade. A informação obtida é instrumental para compreender a importância da orquestração espacial in vivo de diferentes tipos de células e da citocina que produzem, necessárias para uma resposta imune eficiente.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Kennedy Institute Imaging Facility pessoal para assistência técnica com imagem. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Kennedy Trust (para A.G.), e do Conselho de pesquisa em biotecnologia e ciências biológicas (BB/R015651/1 a A.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brefeldin A | Cambridge bioscience | CAY11861 | |
| Paraformaldehyde | Agar scientific | R1018 | |
| L-Lysin dihydrochloride | Sigma lifescience | L5751 | |
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | |
| D(+)-saccharose | VWR Chemicals | 27480.294 | |
| Precision wipes paper Kimtech science | Kimberly-Clark Professional | 75512 | |
| O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy | VWR Chemicals | 361603E | |
| Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 | Biolegend | 101302 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml |
| Microscope slides - Superfrost Plus | VWR Chemicals | 631-0108 | |
| anti-CD169 - AF647 | Biolegend | 142407 | Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 65 |
| anti-F4/80 - APC | Biolegend | 123115 | Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 660 |
| anti-B220 - PB | Biolegend | 103230 | Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/mL Excitation wavelength: 410 Emission wavelength: 455 |
| anti-IFNg - biotin | Biolegend | 505804 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL |
| anti-IFNg - BV421 | Biolegend | 505829 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL Excitation wavelength: 405 Emission wavelength: 436 |
| anti-Nkp46/NCRI | R&D Systems | AF2225 | Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/mL |
| anti-goat IgG-FITC | Novusbio | NPp 1-74814 | Antibody clone and Concentration used: 1 mg/mL Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
| Streptavidin - PE | Biolegend | 405203 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mL Excitation wavelength: 565 Emission wavelength: 578 |
| Streptavidin - FITC | Biolegend | 405201 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mlL Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Cover glasses 22 mm x 40 mm | Menzel-Glazer | 12352128 | |
| Liquid blocker super PAP PEN mini | Axxora | CAC-DAI-PAP-S-M | |
| Imaris - Microscopy Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Confocal microscope - Olympus FV1200 Laser scanning microscope | Olympus | ||
| Cryostat - CM 1900 UV | Leica | ||
| Base mould disposable | Fisher Scientific UK Ltd | 11670990 | |
| PBS 1x | Life Technologies Ltd | 20012068 | |
| BHI Broth | VWR Brand | 303415ZA | |
| GFP | Excitation wavelength: 484 Emission wavelength: 507 |
||
| RFP | Excitation wavelength: 558 Emission wavelength: 583 |
||
| Insulin syringe, with needle, 29 G | VWR International | BDAM324824 | |
| C57BL/6 wild type mice | Charles River |
References
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Kubota, K., Kadoya, Y. Innate IFN-gamma-producing cells in the spleen of mice early after Listeria monocytogenes infection: importance of microenvironment of the cells involved in the production of innate IFN-gamma. Frontiers in Immunology. 2 (26), (2011).
- Dunn, P. L., North, R. J. Early gamma interferon production by natural killer cells is important in defense against murine listeriosis. Infection and Immunity. 59 (9), 2892-2900 (1991).
- Krummel, M. F., et al. Paracrine costimulation of IFN-gamma signaling by integrins modulates CD8+ T cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), 11585-11590 (2018).
- Curtsinger, J. M., Agarwal, P., Lins, D. C., Mescher, M. F. Autocrine IFN-gamma promotes naive CD8+ T cell differentiation and synergizes with IFN-alpha to stimulate strong function. Journal of Immunology. 189 (2), 659-668 (2012).
- Hosking, M. P., Flynn, C. T., Whitton, J. L. Antigen-specific naive CD8++ T cells produce a single pulse of IFN-gamma in vivo within hours of infection, but without antiviral effect. Journal of Immunology. 193 (4), 1873-1885 (2014).
- Croxford, A. L., Buch, T. Cytokine reporter mice in immunological research: perspectives and lessons learned. Immunology. 132 (1), 1-8 (2011).
- Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8++ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. Journal of Visualized Experiments. (9), 409 (2007).
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. Journal of Visualized Experiments. (7), 265 (2007).
- Pope, C., et al. Organ-specific regulation of the CD8+ T cell response to Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 166 (5), 3402-3409 (2001).
- Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance. Current Protocols in Microbiology. 31, 1-7 (2013).
- Kang, S. J., Liang, H. E., Reizis, B., Locksley, R. M. Regulation of hierarchical clustering and activation of innate immune cells by dendritic cells. Immunity. 29 (5), 819-833 (2008).
- Chang, S. R., et al. Characterization of early gamma interferon (IFN-gamma) expression during murine listeriosis: identification of NK1.1+ CD11c+ cells as the primary IFN-gamma-expressing cells. Infection and Immunity. 75 (3), 1167-1176 (2007).
- Mollenhauer, H. H., Morre, D. J., Rowe, L. D. Alteration of intracellular traffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1031 (2), 225-246 (1990).
- Helms, J. B., Rothman, J. E. Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF. Nature. 360 (6402), 352-354 (1992).
- Schuerwegh, A. J., Stevens, W. J., Bridts, C. H., De Clerck, L. S. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha in monocytes. Cytometry. 46 (3), 172-176 (2001).
- Nylander, S., Kalies, I. Brefeldin A, but not monensin, completely blocks CD69 expression on mouse lymphocytes: efficacy of inhibitors of protein secretion in protocols for intracellular cytokine staining by flow cytometry. Journal of Immunology Methods. 224 (1-2), 69-76 (1999).
