Summary
אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.
Abstract
רצף הגנום השלם נרחב זיהה מסגרות קריאה פתוחות רבות (ORFs) מתן חלבונים פוטנציאליים רבים. חלבונים אלה עשויים להיות תפקידים חשובים לתא ועלול לפענח תהליכים סלולריים חדשים. בין החלבונים, קינסים הם שחקנים גדולים כפי שהם שייכים לתא איתות מסלולים ויש להם את היכולת לעבור או לבטל תהליכים רבים חיוניים לגורל התא, כגון צמיחת תאים, חלוקה, בידול, תנועתיות, ומוות.
במחקר זה התמקדנו בחלבון קינאז חדש, LIMK2-1. הדגמנו את קיומו על ידי אבן החשופה המערבית באמצעות נוגדן ספציפי. הערכנו את האינטראקציה שלה עם חלבון במעלה הזרם באמצעות ניסויים coimmunoprecipitation. Coimmunoprecipitation היא טכניקה רבת עוצמה מסוגל לזהות את האינטראקציה בין שני חלבונים היעד. זה יכול לשמש גם כדי לזהות שותפים חדשים של חלבון פיתיון. ניתן לטהר את חלבון הפיתיון באמצעות תגית המיועדת לרצף שלו או באמצעות נוגדן המכוון אותו במפורש. מכלולי חלבון אלה עשויים להיות מופרדים על-ידי SDS-PAGE (נתרן Dodecyl סולפט PolyAcrylamide ג'ל) ומזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. Immunoprecipitated LIMK2-1 שימש גם כדי לבחון את פעילותה קינאז בתוך מבחנה על ידי γ [32P] ATP תיוג. שיטת מבוסס-היטב זו עשויה להשתמש במספר רב של מצעים שונים, וניתן להשתמש בגרסאות מוטציה של הפיתיון כדי להעריך את התפקיד של שאריות מסוימים. ההשפעות של סוכני תרופתי עשוי גם להיות מוערך מאז טכניקה זו הן רגישות מאוד כמותית. למרות זאת, הטיפול ברדיואקטיביות. דורש זהירות מיוחדת פעילות קינאז עשויה גם להיות מוערך עם נוגדנים ספציפיים מיקוד קבוצת פוספהו של חומצת האמינו ששונתה. סוגים אלה של נוגדנים אינם זמינים מסחרית עבור כל שאריות פוספהו שונה.
Introduction
במשך עשורים רבים, מסלולי איתות רבים כבר הובהר ואת מעורבותם בתהליכים סלולריים מכריע כגון חלוקת תאים, בידול, תנועתיות, מוות תאים מתוכנת, חסינות ונוירוביולוגיה, הוכח. קינסים לשחק תפקיד משמעותי אלה מסלולים איתות כפי שהם לעתים קרובות מווסת את ההפעלה שלהם או איון פעלה הם חלק מתחמי רב-תכליתי ארעי כי להגיב גירויים חיצוניים1,2,3. מוטציה ודיסרגולציה של קינסים לעיתים קרובות להוביל מחלות בבני אדם, ולכן הם הפכו לאחד מטרות הסמים החשובים ביותר במהלך 40 השנים האחרונות4.
בהקשר זה, חשוב להיות מסוגל לזהות את האינטראקציה של קינאז עם הרגולטורים שלהם במעלה הזרם או מצעים במורד ולזהות שותפים חדשים. טיהור וimmunoprecipitation אהדה הם טכניקות רבות עוצמה לבידוד של מכלולי חלבונים5. חלבון הפיתיון או קינאז עשוי להיות מתויג עם רצף פפטיד מסוים המאפשר שימוש בחרוזים מסחריים בשילוב עם נוגדנים מיקוד הפפטיד. החומר הזה מאפשר הזיית הגדול בניסויים6,7,8. חלבונים אנדוגני עשויים גם להיות immunoprecipitated באמצעות נוגדנים מיקוד ישירות החלבון פיתיון. הנוגדנים יכול להיות מקושרת מקושרת חלבון A או חלבון G agarose חרוזים או פשוט מודבטים עם חרוזים אלה לפני הוספת lysate. מאגרי לליזה חייב להיות ממוטב כדי לאפשר מסיסות חלבונים מבלי לאבד אינטראקציה כדי למנוע השפלה חלבון. החיסרון העיקרי של גישה זו הוא כי האינטראקציה מזוהה על הליזה תאים; לפיכך, אינטראקציות זמניות או חלשות, יחד עם אלה הדורשות הקשר משנה-תאית עלול להיות חסר. טכניקות אחרות עשויות לשמש לעבודה ישירות בתא כגון שיטת הסמיכות הקרבה (PLA)9, ב vivo חוצה קישור-בסיוע לטיהור אהדה (xap)10, ביולומיאנמינציה העברת אנרגיה העברה (ברט) או Förster אנרגיית התהודה העברה (סריג)11,12. יתרה מזאת, הimmunoprecipitation אינו מתאים לקבוע את הקבועים התרמודינמיים של הכריכה, שעליהם טכניקות פיזיות כגון משטח תהודה במשטח, איזותרמי טיטור קלורימטריה או תרמופלאזיס מיקרוסקאלה . 13,14.
פעילות קינאז עשויה להיות מוערך באמצעות טכניקות מרובות. בזאת, אנו התמקדו נוגדנים ספציפיים פוספאו γ [32P] ATP (אדנוזין triphosphate) תיוג. הנוגדנים הספציפיים של פואהו מכוונים לשינוי פוספט של שאריות מסוימים בתוך חלבון. ניתן להשתמש בהם באבן החשופה המערבית או באליסה (השיטה החיסונית המקושרת באמצעות אנזימים) לאחר פירוק תאים, עבור אימונוהיסטוכימיה, וגם על תאים שלמים באמצעות הזרמת cy, או immunofluorescence. החסרונות שלהם עשויים לכלול חוסר ספציפיות, אשר ניתן להעריך באמצעות גרסה מוטציה של חלבון היעד, ושלהם לא להיות זמין מסחרית עבור כל החלבונים. בשנת החוץ γ [32P] תיוג ATP היא חזקה מאוד, שיטה מבוססת היטב ורגישה מאוד15. חלבונים Immunoprecipitated או רקומביננטי ניתן להשתמש, ומצעים שונים עשויים להיבדק. ההשפעות של תרופות ניתן גם להעריך כמו שיטה זו היא כמותית. החיסרון העיקרי שלה הוא כי הרדיואקטיביות הקשורה הגישה דורשת טיפול בזהירות. שיטות חלופיות אפשריות גם על בסיס מדידה של מצעים הפלורסצנט או של פפטיד ומנצלים את המאפיינים של פלורסנט משתנה/זורח על זירחון. שיטות כאלה גם לאפשר תפוקה גבוהה, אשר נדרש, למשל, בהקרנה של מולקולות שעלולות להיות מעכבי פוטנציאליים של קינאז היעד. אכן, הקינסים מייצגים את אחד השיעורים הגדולים ביותר של מטרות הסמים שנרדף על ידי חברות התרופות16.
במחקר זה, אנו מתמקדים LIMK2-1 חלבון (LIMK2-1 מייצג Lin11, Isle1, Mec3 קינאז isoform 2-1). חלבון LIMK2 קינאז תואר לראשונה ב-199517. שלושה איזוצורות של LIMK2 מיוצרים על ידי שחבור חלופיים: LIMK2a, LIMK2b ו LIMK2 -1. כיום, LIMK2-1 תוארה רק ברמת mRNA במחקר אחד18. להלן, אנו מגדירים את החלבון החדש הזה של קינאז ברמה המולקולרית, תוך שימוש בגישות ביוכימיות חזקות. ראשית, אנו להדגים כי LIMK2-1 אכן מסונתז. בדומה לשני עמיתיהם, LIMK2a ו-LIMK2b, היא מקיימת אינטראקציה עם ROCK קינאז במעלה (Rho-חלבון קינאז). אנו מראים LIMK2-1 יש פעילות קינאז על חלבון המיאלין Basic (MBP), אבל לא על קופפלין, המצע קאנוני של LIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה לתא לתרגום מעגל
התראה: יש לבצע את כל השלבים של תרבות התא במעבדה ייעודית, והתאים מניפולציות בתוך ארון מיקרוביולוגי של Class 2.
- זרע HEK-293 (האדם כליה עובריים) תאים ב-Ø 10 ס מ לוחות ב 10 מ ל של DMEM (מדיום הנשרים שונה של Dulbecco) שיושלם עם 10% סרום עגל עוברי. תרבות עבור 3 עד 5 ימים מתחת 5% CO2, ב 37 ° c, עד התאים להגיע ~ 90% המפגש.
- לטפל Ø 10 ס מ לוחות עם קולגן R כדי להגדיל את הדבקה התא לצלחות פלסטיק.
- הוסף 5 מ ל של פתרון של קולגן R, 200-קיפול מדולל במאגר מלוחים פוספט (PBS) ב-Ø 10 ס מ לוחית. כיסוי הנוזל מעל פני השטח כולו של הצלחת.
- דגירה בטמפרטורת החדר עבור לפחות 1 h בתוך הקבינט אבטחה טיחות.
- הסר פתרון קולגן, ולמחוק אותו. הוסף 5 מ ל PBS, להפיץ אותו על פני השטח של הצלחת, להסיר אותו ולהשליך אותו. . חזור על הכביסה פעם אחת
- הוסף 8 מ ל של DMEM בתוספת עם 10% סרום עגל עוברי. שמרו את הצלחות המוכנות. בתוך ארון הביונצרה
- קח את hek-293 צלחות משלב 1.1 בתוך הקבינט אבטחה טיחות. להסיר את המדיום מן הצלחות ולהשליך אותו לפח מלבין ייעודי. הוסף 2 מ ל של DMEM שיושלם, ולשטוף את התאים כדי לנתק אותם באמצעות זרימת של מיקרופיפטה 1 mL, מטפלת כדי להימנע מעשיית קצף.
- לאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל ולהוסיף 4 מ ל של DMEM שיושלם. הומוגון עם פיפטה באורך 10 מ ל, על ידי ליטוף למעלה ולמטה 3 פעמים.
- לקחת 2 מ ל של פתרון זה התא ולהוסיף אותם לוחות מטופלים קולגן המכיל DMEM שיושלם בשלב 1.2.4.
- לגדול 24 שעות בחממה ב 5% CO2 ו 37 ° c. התאים צריכים להיות 50-80% שוטפת בזמן ההעברה.
2. העברה ארעית
- להסיר את המדיום מן הצלחות, להשליך אותו לפח מלבין ייעודי, ולהוסיף 10 מ ל של DMEM שנוספו טרי. הכניסו את הצלחות לתוך החממה ב-37 ° צ' בזמן הכנת תערובת הזיהום.
- בתוך שפופרת 15 מ"ל, להוסיף 450 μL של 10 מ"מ-HCl-היפר-ethylenedinitrilotetraacetic pH 7.5/1 מ"מ EDTA (טריס מעמדים טריס (הידרוקסימתיל), ו EDTA עבור חומצה) פתרון 50 μL של 2.5 M CaCl2 פתרון. מערבבים באמצעות היפוך.
- הוסף 10 μg של ה-DNA פלמינדית (חומצה דיאוקסיריוונקלאית) הכין מתוך הכנת midi על תרבות נוזלית של חיידקים שהפכו עם הפלביניים המסור. מערבבים באמצעות היפוך.
- תחת עצבנות חלקה על מערבולת, להוסיף 500 μL של BES מלוחים באגירה 2x להתרכז (קומפוזיציה: BES, 10.7 g/L, הנאל, 16.0 g/L, Na2hpo4, 0.27 g/l; בס מייצג N, N-Bis (2-הידרוקסיל) -2-עמינח החומצה הגופרתית, N, N-Bis (2-הידרוקסיל) taurine) ירידה איטית בירידה.
- מודטה לפחות 15 דקות (עד 45 דקות) בטמפרטורת החדר בתוך הקבינט אבטחה טיחות. לא מערבולת, לא לערבב! להזיז את הצינורות בזהירות רבה לא להפריע היווצרות מורכבים בין DNA ו סידן פוספט.
- קחו את הצלחות משלב 2.1. לארון הבטיחות הוסף את מכלולי ה-DNA בזהירות רבה, ירידה בירידה, על התאים בכל רחבי המשטח של הצלחת.
- דגירה של 24 עד 72 שעות בחממה ב 37 ° c. בדרך כלל מקסימום ביטוי חלבון הוא הגיע בתוך 48 שעות.
3. לוליזיס
הערה: עבודה על קרח, עם מאגרים קרים כדי למנוע השפלה בחלבון.
- להכין מאגר לפירוק: 50 mM טריס-HCl, pH 7.5, 100 מ"מ מילימטר, 5 מ"מ EDTA, 0.1% טריטון X-100, 50 mM NaF, 10 מ"מ פירופוספט נתרן, 1 מ"מ Na3VO4, 20 מ"מ p-ניטרופניק פוספט, 20 מ"מ β-glycerophosphate, 10 μg/ml aprotinin 0.05 μg/ml חומצה okaidic , 1 μg/mL ליופטין, ו-1 מ"מ PMSF (פנילמתיל פלולוניל פלואוריד). סביב 4 מ ל של מאגר הליזה נדרשים עבור כל צלחת המשגר.
- להסיר צלחות עם תאים מזוהמים מהאינקובטור. . שים אותם על קרח
הערה: משלב זה, ניתן לעבוד על ספסל "רגיל". - הסר את המדיה והתעלם ממנו בזבל מלבין ייעודי.
- לשטוף פעמיים עם 3 מ ל של התאים הקרים: להוסיף 3 מ ל של PBS בצד של ירידה לוחית על ידי ירידה כדי להימנע מניתוק תאים מזוהמים, להתפשט בכל רחבי המשטח של הצלחת, להסיר PBS ולהשליך אותו; חזור על שלב זה פעם נוספת. בסופו של דבר, הסר בזהירות את שאר ה-PBS על ידי הטיית הצלחת כדי למנוע דילול מאגר הליזה לשלב הבא.
- הוסף 500 μL של מאגר לפירוק קר על התאים שטף מנוכר. . תפיץ את זה על פני הצלחת
- מודקון למשך 10 דקות על הקרח. מפעם לפעם (לפחות פעמיים), הפיצו שוב את החוצץ על פני המשטח של הצלחת.
- לגנוז את התאים ולאסוף אותם בצינור מיקרוצנטריפוגה.
- צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c.
- אספו את הסופרנטאנט. בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש שבר זה מקביל לליפוסט (תמצית התא השלם). להיפטר הגלולה אשר מתאים פסולת קרום התא.
- לאסוף סדרת מחלקים של שבר זה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש (סביב 50 μl). שבר זה מקביל ל "השבר הכולל" או "תא ליפוסט" או "תמצית תא שלם" המאפשר ניתוח של חלבונים מוגברים מבוטא על ידי אבן החשופה המערבית.
הערה: בשלב זה ניתן להשתמש בדגימות ישירות לניתוחי כתמי אבן מערביים. מאגר laemmli יש להוסיף למדגם, אשר מחומם אז ב 95 ° c עבור 5 דקות, centrifuged ב 10,000 x g עבור 5 דקות, ו נטען על sds המתאים-עמוד. ניתן לאחסן דגימות גם ב-80 ° c.
4. Immunoprecipitation
- השעיה מחדש בעדינות חרוזים בשילוב עם הנוגדן המתאים: HA (hemagglutinin שפעת האדם), דגל, או GFP (חלבון פלורסנט ירוק) על ידי היפוך חלק.
- חותכים את סופו של קצה 200 μL ממיקרו-פיפטה כדי לאפשר לחרוזים להזין את הקצה. פיפטה את החרוזים למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להרוות את הקצה כדי להבטיח לקחת את הנפח הנכון של חרוזים.
- קח 40 μL של חרוזים בצינור מיקרוצנטריפוגה.
- הוסף 500 μL של טנט (30 mM טריס-HCl pH 7.5, 120 mM הנאקל, 5 מ"מ EDTA, 1% טריטון X-100) מאגר. מערבבים באמצעות היפוך. צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g ב 4 ° c. הסר בזהירות supernatant ולמחוק אותו. הוסף 500 μL של טנט. מודטה לפחות שעה אחת ב -4 ° c על גלגל מסתובב.
הערה: שלב טרום הדגירה ב-טנט מאפשר להפחית אינטראקציות שאינן ספציפיות ולכן כדי להקטין את אות הרקע. - לשטוף את החרוזים פעמיים עם 500 μL של מאגר הליזה.
- צנטריפוגה 2 דקות ב 1,000 x g ב 4 ° c.
- הסר את מאגר הסופרנטנט היטב והשמט אותו.
הערה: שימו לב שלא לשים חרוזים במהלך שלבי הכביסה האלה. - הוסף 500 μL של מאגר הליזה. הומוגון על-ידי היפוך השפופרת.
- חזור על שלבים 4.5.1-4.5.3.
- צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g ב 4 ° c. הסר בזהירות את מאגר הסופרנטאנט והשמט אותו.
- מחרוזת מודטה עם הליפוסט משלב 3.9 במשך 2 עד 4 שעות ב -4 ° c על גלגל מסתובב.
- שטוף immunoprecipitated חרוזים.
הערה: בשלב זה ניתן לשטוף את החרוזים הimmunoprecipitated חמש פעמים עם מאגר הליזה, ולאחר מכן להתחמק עם מאגר Laemmli. ניתן להשתמש באפשרות לניתוח כתמי אבן מערבית או לאחסנו ב-80 ° c. לחילופין, חרוזים ניתן לשטוף פעמיים עם מאגר הליזה ולאחר מכן שלוש פעמים עם מאגר קינאז לבצע γ [32P] ATP תיוג.
5. ניתוח Coimmunoprecipitation
- שטוף immunoprecipitated חרוזים משלב 4.7 עם מאגר הליזה.
- צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° c.
- הסר בזהירות את הסופרנטאנט והשמט אותו.
- הוסף 500 μL של מאגר הליזה. הומוגון על-ידי היפוך השפופרת.
- חזור על הצעדים 5.1.1-5.1.3 ארבע פעמים.
- אלוציה
- צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° c.
- הסר בזהירות את הסופרנטאנט והשמט אותו. הסר את הטיפות האחרונות של סופרנטנט עם מזרק המילטון כדי להימנע משאיפה של החרוזים, ולהשליך את הסופרנטאנט.
- להוסיף 40 μL של מאגר 4x Laemmli (200 mM טריס/HCl pH 6.8, 4% SDS, 40% גליצרול, 0.5 M β-mercaptoethanol, 0.02% ברומרופנול כחול). הומוגון על-ידי הקשה בעדינות על השפופרת.
- דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 10,000 x g בטמפרטורת החדר.
- בעזרת מזרק המילטון, הסר את הסופרנטאנט. ואסוף אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש שבר זה מתייחס למילה "הללויה", העשויה להיות מאוחסנת ב-80 ° c, או מנותח ישירות על-ידי אבן החשופה המערבית.
6. שיטת קינאז
- הכינו את מאגר קינאז: 50 מ"מ HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES מייצג 4-(2-הידרולוקסיל) -1-חומצה פיפראזאנייאנייאנייאניוני, 150 mM הנאקל, 5 מ"מ MgCl2, 5 מ"מ Mgcl2, 50 mm Naoh, 1 מ"מ Na3VO4, 20 מ"מ β-glycerophosphate, 1 μg/mL לוקיטין, ו-1 מ"מ PMSF. סביב 2 מ ל של מאגר קינאז נדרש עבור כל תנאי immunoprecipitation.
- לשטוף immunoprecipitated חרוזים משלב 4.7 פעמיים עם 500 μL של מאגר הליזה.
- צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° c.
- הסר בזהירות את הסופרנטאנט והשמט אותו. הוסף 500 μL של מאגר הליזה. . הומוגון ע י היפוך
- חזור על שלבים ה6.2.1 וה6.2.2.
- שטוף immunoprecipitated חרוזים שלוש פעמים עם 500 μL של מאגר קינאז.
- צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° c.
- הסר בזהירות את הסופרנטאנט והשמט אותו. הוסף 500 μL של מאגר קינאז. . הומוגון ע י היפוך
- חזור על הצעדים 6.3.1 ו-6.3.2 פעמיים.
- צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° c.
- הסר בזהירות את הסופרנטאנט והשמט אותו. הסר את הטיפות האחרונות של סופרנטנט עם מזרק המילטון כדי להימנע משאיפה של החרוזים, ולהשליך את הסופרנטאנט.
- הוסף 40 μL של מאגר קינאז לחרוזי immunoprecipitated. השהה מחדש את החרוזים על-ידי הקשה בעדינות על השפופרת.
- להכין את התערובת עבור γ [32P] ATP תיוג (הנפח הסופי הוא 22.5 μl, להשלים עם מאגר קינאז) בתוך מנעול בטוח-צינור.
- הוסף את הנפח הנדרש של מאגר קינאז כדי להגיע לנפח הסופי של 22.5 μL.
- חותכים את הקצה של 20 Μa של מיקרופיפטה. להשעות את immunoprecipitated חרוזים משלב 6.6 על ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים. לאסוף 10 μL של חרוזים אלה לתוך הצינור בטוח לנעול.
- הוסף ATP מ 10 μM פתרון מניות כדי להגיע 50 mM של ריכוז הפינאלה. על פי מספר המדגם שטופלו, דילול של פתרון המניה של ATP במאגר קינאז מוצעת לאפשר פיפטה 1 כדי 2 μL, כדי להיות בטוח שעוצמת הקול נכונה.
- הוסף 2.5 μg של מצע (קופלין או חלבון מיאלין בסיסי, MBP במקרה המחקר הנוכחי).
- הוסף 5 μCi של γ [32P] ATP (3,000 Ci/ממול) כדי ליזום את התגובה. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה לאט.
התראה: מנקודה זו, יש לעשות את העבודה במקום בטיחות המוקדש למניפולציות רדיואקטיביות בזהירות זהירה, הגנות ייעודיות ובקרות מתאימות (מגינים רדיואקטיביים, מונה גייגר, איסוף פסולת ספציפית, חזה אישי ו תגי אצבע כדי לזהות חשיפה רדיואקטיבית, עצות סינון. - דגירה של 20 דקות ב 30 ° c.
- עצור את התגובה עם 6 μL של מאגר Laemmli 5x.
- חום ב 95 ° C עבור 5 דקות.
- צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- העמסה על SDS-דף. . המשך להעברה
הערה: שמור על השורה הקדמית של γ חינם [32P] ATP אינו יוצא מהג כדי למנוע זיהום של מיכל ההגירה. - הכתם את הג'ל בטמפרטורת החדר.
- . הסירי את הג מלוחות הזכוכית
- המשיכו עם שלוש אמבטיות במים בטמפרטורת החדר.
- הכתם את הג לילה עם Coomassie כחול כחול בטמפרטורת החדר.
- הדכתם את הג עם מספר אמבטיות כביסה עם מים בטמפרטורת החדר.
- עטפו את הג בעטיפת ניילון.
- לחשוף ללילה אחד או יותר על המסך פוספרואורימנגר.
- קרא את המסך על זרחן כדי לזהות להקות המסומנות בתווית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חלבון LIMK2-1 הוא מסונתז
LIMK2-1 מוזכר מאגר נתונים, אבל עד כה רק נייר אחד הראה את קיומו של mRNA שלה18. לעומת שלה שני הומויומנים שלה, LIMK2a ו LIMK2b, LIMK2-1 יש מתחם C-terminal נוסף המזוהה כמו חלבון פוספספטאז 1 תחום מעכבות (PP1i). עיצבנו נוגדן המטרה פפטיד של תחום זה, חומצות אמינו 671-684 (איור 1A).
מחקר הפיצוץ נגד מסדי נתונים חלבון האדם הראו כי רק חלבון אחד, פי-1 (פוספספטאז הולואנזים מעכב 1), יש דמיון רצף חזק עם 12 זה רצף של חומצות אמינו. עם זאת, PHI-1 נודד ב 23 kDa על SDS-דף ג ' לים, הרחק LIMK2-1, אשר צפוי לעבור סביב 75 kDa (כלומר, השניים לא צריך להפריע). זיהינו את הנוגדן הראשון עבור HEK-293 תאים מנוכר או עם LIMK2-1, LIMK2a, או LIMK2b והראה כי הנוגדן נגד PP1i היה מסוגל לזהות את LIMK2-1 (pCMV-LIMK2 -1) ו-המתויג LIMK2-1, אבל לא להגיב עם הLIMK2a או LIMK2b (איור 1B). הבחנו להקה של אנדודוגני LIMK2-1 בתאי hek מנוכר עם גירסאות המתויגים של LIMK2 איזופורמים (המצוין על ידי חץ באבן החשופה נגד PP1i; איור 1B). שנית, בדקנו אם האות הנגרמת על ידי הנוגדן anti-PP1i היה ספציפי LIMK2-1 באמצעות siRNA מיקוד שלוש גרסאות משולבים של LIMK2 (איור 1C). בנוכחות LIMK2 siRNA, ירידה משמעותית ומשמעותי בהרכב הריבית נצפתה (המצוין על ידי חץ באיור 1 ג) לעומת תנאי שליטה, הרומז כי הנוגדן הוא ספציפי LIMK2-1. לאחר מכן, השתמשנו בנוגדן anti-PP1i כדי לזהות LIMK2-1 בתמציות קו תאים שונים: HEK-293 (האדם בתאי כליה עובריים), הלה (האדם בתאי צוואר הרחם האנושי), ו-C6 (המוח העכבר Glial תאים). תאים אלה מופרת במאגר הליזה המכיל 1% טריטון X-100. שימוש בניתוח סיליקו, LIMK2-1 הוכח להיות הומינידיים ספציפיים לפרימטים19. ניתוח מערבי כתם באמצעות הנוגדן anti-PP1i הראה כי LIMK2-1 נראה להתבטא HEK-293 ו הלה אבל לא בקווי ה-C6 תא כצפוי ממחקרים סיליקו (איור 1D). ניסויים אלה חזרו על עצמם עם רקמות אנושיות שונות, מראה כי רמות של חלבון LIMK2-1 מגוונת בהתאם לרקמה: הרמות הגבוהות ביותר נמצאו בכבד, רמות פחותה בלבלב, ואת הנמוך ביותר בחזה ובריאות. LIMK2-1 לא היתה לגילוי ברקמת המוח (איור 1E). הבחנו להקות מולקולרית משקל נמוך יותר בכל דגימות רקמות מלבד הכבד, הרומז על השפלה של החלבון המלא כנראה בשל תנאי הפירוק של דגימות מסחריות אלה (מאגר לפירוק זה מכיל קוקטייל של מעכבי לא צוין ב גיליון נתונים, אשר עשוי להיות פחות יעיל מאשר מעכבי פרוטאז ופוספאטאז רבים אנו משתמשים במאגר תוצרת בית שלנו). נתונים אלה מראים כי חלבון LIMK2-1 הוא מסונתז ומבוטא באופן שונה ברקמות שנבדקו.
LIMK2-1 אינטראקציה עם הסלע שלה במעלה קינאז
LIMK2-1 הומויומנים, LIMK2a ו LIMK2b, תוארו כמוסדרות על ידי הסלע במעלה קינאז. העריכו את האינטראקציה של LIMK2-1 עם רוק באמצעות ניסויים coimmunoprecipitation. תאים HEK היו שכונתיות עם וקטורים קידוד cMyc-מתויג ROCK1 ואחת הגירסאות המתויגים של LIMK2 isoforms, או החלבון שאינו קשור המתויג Larp6. Larp6 משמש כשליטה שלילית, המתיר גילוי אינטראקציות לא ספציפיות. תאים היו לimmunoprecipitation ו anti-HA היתה בוצעה. Lysates (תמציות תאים שלמים) ו immunoprecipitates נותחו על ידי אבן החשופה המערבית, באמצעות נוגדנים anti-HA ו אנטי-cMyc. כפי שתואר באיור 2 (לוחות שמאל); Lysates), כל אחד מהחלבונים השונים המקודדים על ידי הווקטורים המתגברים מבוטאים היטב. שלושת האיזוטפסים של LIMK2, כמו גם Larp6, הם ביעילות immunoprecipitated (איור 2, הלוח הימני התחתון; הללויה. ב משחררות, סלע מזוהה ובכך coimmunoprecipitated עם שלושה איזופורמים של LIMK2, אבל לא עם Larp6 (איור 2, הלוח הימני העליון; הללויה. זה מדגים כי רוק מקיים אינטראקציה עם שלוש איזופורמים של LIMK2, במיוחד עם החדש שאפיינו את LIMK2-1. אינטראקציה זו היא ספציפית מאז השליטה השלילית (Larp6) אינו מתקשר עם ROCK.
בזאת, אנו מציגים נתונים עבור הimmunoprecipitation שבוצעו באמצעות נוגדנים נגד HA; עם זאת, האינטראקציה יכולה להיבדק בכיוון ההפוך על ידי immunoprecipitating ROCK עם חרוזים מצועם עם נוגדנים cMyc וניתוח משחררות עם הנוגדנים HA כדי לזהות LIMK coimmunoprecipitation.
פעילות קינאז
פואהו-קופלין בתאים שלמים
הומויומנים של LIMK2-1, LIMK2a ו LIMK2b, הוכחו קופלין זרחאני, גורם דפוליריזציה, על הSerine3 שלה. באמצעות נוגדן במיוחד מיקוד את פוספהו-Serine3 של קופלין, למדנו פעילות LIMK2 קינאז על ידי מדידת הרמה של זרחן אנדוגני-קופלין בתאי HEK לבטא את אחד מLIMK2 isoforms. תאים HEK היו מזוהמים עם וקטורים קידוד אחד הLIMK2 isoforms, או וקטור ריק המקביל כפקד שלילי. התאים היו מנותחים, ואת lysates שונים נותחו על ידי בלוק המערבי באמצעות נוגדן נגד פוספהו-Serine3 קופלין. ביטוי היתר של LIMK2a ו LIMK2b המושרה עלייה משמעותית ומ ברמות פוספאו-קופלין יחסית לתנאי שליטה, בעוד נוכחות של LIMK2-1 לא היה לגילוי השפעה (איור 3, שמאל פאנל).
חזרנו על אותו ניסוי עם C-טרמינל yfp-מתויג (חלבון פלורסנט צהוב) גרסה של שלושה LIMK2 איזופורמים וגירסה לא מתויגת של LIMK2-1 כדי לשלול הפרעה אפשרית על ידי תג N-terminal HA. התוצאות היו זהות לאלה שהושגו באמצעות הגירסאות המתויגים של שלושת הנוסחים (איור 3, הלוח הימני המציג את הגירסה המתויגת yfp). יעילות החצייה הוערך עבור הגרסה yfp-מתויג של limk איזופורמים באמצעות הזרימה cy, נסה לשלול כי תוצאה זו אולי היה עקב הבדל של הביטוי חלבון. שלושת האיזוטפסים הראו יעילות העברה דומה: 54% עבור LIMK2-1, 49% עבור LIMK2b ו-43% עבור LIMK2b.
במבחנים החוץ-גופית קינאז
לאחר מכן למדנו את הפעילות קינאז של LIMK2 איזופורמים על ידי תיוג חוץ גופית עם γ [32P] ATP. איור 4A מראה את התוכנית הכללית של זה תיוג מבחנה. תאי hek היו מזוהמים עם אחת הגרסאות HA-tagged של LIMK2 איזופורמים או חלבון לא קשור, Larp6, אשר שימש שליטה שלילית. פעילותו של קינאז בimmunoprecipitates האנטי-HA נמדדה באמצעות רקומביננטי GT-קופלין כמצע בנוכחות γ [32P] ATP. HA-immunoprecipitated Larp6 הראה לא הפעילות של קינאז על קופלין. HA-immunoprecipitated LIMK2a ומLIMK2b לקופלין, בעוד LIMK2-1 לא (איור 4B). הצלחנו להשיג תוצאות דומות באמצעות הגרסאות yfp-מתויג של שלושה איזופורמים immunoprecipitated עם חרוזי gfp-מלכודת בנוכחות רקומביננטי קופלין ו γ [32P] ATP (איור 4d).
לאחר מכן בדקנו אם LIMK2-1 לא הייתה פעילות של קינאז או אם הפעילות שלה על קופלין הייתה לקויה. חזרנו על הניסוי לתיוג באמצעות מבחנה באמצעות חלבון המיאלין Basic (MBP), מצע יעיל לקיסיסי חלבונים רבים, במקום קופלין. היה אות ברקע גבוה במצב השליטה כאשר היצע בוצע בנוכחות גירסאות המתויגים: השליטה השלילית, HA-immunoprecipitated Larp6, הפיק אות חזק של MBP זרחתי, למרות שזה לא קינאז ( איור 4 ג). התגברנו על בעיה זו באמצעות הגרסה YFP-מתויג של חלבונים אלה. בתנאים אלה, הרקע בפקד (YFP בלבד) היה נמוך, המאפשר מחקרים ספציפיים יותר להתבצע. GFP לכודים YFP-LIMK2a, LIMK2b, ו LIMK2-1 הראה פעילות קינאז לקראת MBP, למרות הפעילות של LIMK2 -1 היה נמוך (איור 4D). עם זאת, LIMK2-1 היה גם פחות ביעילות immunoprecipitated תחת תנאים אלה (ראה Coomassie כחול מבריק (CBB) כתמים בצבע המערבי). כך, שלושת איזופורמים הראו פעילות דומה ב-mbp כאשר פוספאו-mbp היה מנורמל לרמות immunoprecipitated LIMK2 על ידי כתמים cbb (איור 4d, הפאנל התחתון). Immunoprecipitates נותחו גם על ידי אבן החשופה המערבית באמצעות נוגדנים נגד סלע כדי לבדוק אם הפעילות ב MBP יכול להיות בשל נוכחותם של רוק, אשר היה מcoimmunoprecipitated עם LIMK2s. לא הצלחנו לזהות שום. אות רוק בLIMK2 immunoprecipitates אז הזרחון MBP אינו בשל רוק אלא LIMK2s כשלעצמה.
באופן כללי, נתונים אלה מראים כי LIMK2a ו LIMK2b יש פעילויות דומות על קופלין ו-MBP. למרות LIMK2-1 מראה פעילות קינאז לקראת MBP דומה לזה של שני isoforms אחרים, קופלין היא לא מצע טוב עבורו.
איור 1: ראיות לקיומו של חלבון LIMK2-1. (א) תרשים סכמטי של שלושת איזוצורות הLIMK2 האנושיות. LIMK2 איזופורמים מתוארים ביזם: LIMK2-1 (np_ 001026971.1), LIMK2a (np_ 005560.1), LIMK2b (np_ 057952.1). תחומים שונים של LIMK2 מוצגים: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM (מתחם LIM קצר), PDZ (PSD95, Dlg1, Zo-1), S/P (סרין פרוליין עשיר), קינאז (התחום הקצר קינאז), ו PP1i (חלבון פוספספטאז 1 מעכבות). הרצף שנבחר לעיצוב נוגדן anti-PP1i מוצג באדום. (B ו-C) ואלידציה של נוגדן anti-LIMK2-1. (ב) hek-293 תאים הLIMK2 עם מתויגות-1 (pcmv-LIMK2-1) או אחד מתוך מתויג איזופורמים של LIMK2. ליקוטים נותחו על ידי הכתמים המערביים באמצעות הנוגדנים המצוינים. (ג) hek-293 תאים היו מזוהמים גם עם LIMK2 sirna או בקרת sirna. ליקוטים נותחו על ידי אבן החשופה המערבית. LIMK2-1 מתבטא בקווים שונים של תאים אנושיים (D) ורקמות (E). HEK-293, התאים הלה ו-C6 שובשו ב 1% טריטון-X100 מאגר הליזה. תמציות רקמות נרכשו ודגימות ממנו נותחו על ידי בלוק המערבי. דמות זו שונתה מ-Vallee ואח ', היומן הביוכימי, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שלושת איזוצורות של LIMK2 אינטראקציה עם ROCK1. Hek-293 תאים היו שכונתיות עם cmyc-tagged ROCK1 ואחד השלושה המתויג LIMK2 איזופורמים (2-1, 2a, 2a) או חלבון לא קשור, Larp6. ליסטים ואנטי HA immunoprecipitates היו חשופים לכתמים המערביים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: LIMK2-1 יש אין קינאז פעילות כלפי קופלין בתאים שלמים. Hek-293 תאים היו מזוהמים עם אחד השלושה המתויג LIMK2 איזופורמים (1, 2a, 2a) או וקטור הורים ריק, pcDNA3 (הפאנל השמאלי), או עם אחד משלושת yfp-מתויג LIMK2 איזופורמים או yfp לבד (בלוח הימני). ליאטס היו חשופים. לבלוטים המערביים הכמת של היחס של פוספהו-קופלין נגד קופלין מוצג בגרף מימין. . הייתה מנורמלת ל-100 כל ערך מייצג את הממוצע ± SE של שלושה ניסויים עצמאיים. דמות זו שונתה מווללי ואח ', היומן הביוכימי 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: LIMK2-1 אין בפעילות חוץ גופית קינאז לעבר הקופלין, למרות שהוא מדגיש MBP. (א) הערכה כללית של γ [32P] ATP בתיוג מבחנה. (ב) LIMK2-1 אינה מזיכה את הקופלין במבחנה. Hek-293 תאים היו מזוהמים עם אחד משלושת המתויגים LIMK2 איזופורמים (2-1, 2a, 2a) או חלבון לא קשור המתויג, Larp6, כפקד שלילי. את החלבונים הimmunoprecipitated והgt-קופפלין שימשו באותו שיטת קינאז. הimmunoprecipitates נגד HA היו גם חשופים האנטי-HA חיסוני ו Coomassie כחול כתמים. (ג) HA-tagged immunoprecipitation יש אות רקע חזק כאשר mbp משמש כמצע. Hek-293 תאים היו מזוהמים עם אחד משלושת המתויגים LIMK2 איזופורמים (2-1, 2a, 2a) או חלבון לא קשור המתויג, Larp6, כפקד שלילי. החלבונים נגד HA immunoprecipitated ו MBP שימשו בתוך שיטת קינאז. הimmunoprecipitates נגד HA היו גם חשופים האנטי-HA חיסוני ו Coomassie כחול כתמים. (ד) שלושה LIMK2 יסוטפסים יש הפעילות קינאז לעבר חלבון בסיסי המיאלין (mbp). Hek-293 תאים היו מזוהמים עם אחד משלושת yfp-מתויג LIMK2 איזופורמים (2-1, 2a, 2a) או yfp לבד. אנטי-gfp immunoprecipitated LIMK2 איזופורמים ו קופלין או mbp שימשו בתוך שיטת קינאז. Immunoprecipitates anti-GFP היו גם נתון אנטי GFP חיסוני ו Coomassie כחול כתמים. הקוונפיקציה של פוספהו-קופלין ו-פוספהו-MBP מוצג בגרף התחתון. פוספאו-קופלין רמות שהתקבלו עם anti-GFP immunoprecipitated LIMK2a היו מנורמל 100. כל ערך מייצג את הממוצע ± SE של שלושה ניסויים עצמאיים. דמות זו שונתה מ-Vallee ואח ', היומן הביוכימי, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, השתמשנו בכלים ביוכימיים חזקים כדי לאפיין ברמה המולקולרית חלבון חדש, LIMK2-1, האמינו להיות קינאז מבוסס על הרצף שלה ועל יומני ההומויום שלה, LIMK2a ו LIMK2b20.
ראשית, הדגמנו את קיומו של LIMK2-1 ברמת החלבון באמצעות ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי. בעקבות זאת, הערכנו את האינטראקציה שלה עם המעלה קינאז ROCK1, אשר ידוע לווסת LIMK2a ו LIMK2b, הומופינים של LIMK2 -1. בסופו של דבר, העריכו את הפעילות הפוטנציאלית של קינאז של LIMK2-1 דרך מחוץ גופית γ [32P] התוויות ATP ו-צלוליטיס על ידי אבן החשופה המערבית באמצעות מסוים פוספאו נוגדן.
הרכב מאגר לוליזיס
כאשר לומדים חלבונים כדי לנתח אותם על ידי אבן החשופה המערבית, טיפול מיוחד נדרש ביחס לפירוק הרכב מאגר. יש לשקול מספר פרמטרים: (i) דטרגנטים סוג וריכוז21, ו (ii) מעכבי פרוטאז.
הרכב מאגר הליזה חייב להיות מותאם לחלבון היעד כדי להקל על פתרון מוחלט הקרוב שלה כדי לחלץ אותו ככל האפשר וכדי לאפשר את הזיהוי שלה על ידי אבן החשופה המערבית. עבור חלבונים מסיסים, תנאים מתונים (למשל, כביסה קלה בריכוז נמוך) מספיקים בדרך כלל כדי להשיג זאת. עבור חלבונים ממברנה, התנאים החזקים בדרך כלל נדרשים לעתים קרובות. סוגים שונים של חומרי ניקוי קיימים: (i) יונית, כגון נתרן dodecyl סולפט (SDS), cetyltrimethylammonium ברומיד (CTAB), (ii) לא יונית כגון פוליאתילן גליקול hexadecyl אתר (BRIJ), טריטון, octylGlucoside (OG), doDecylMaltoside (DDM), ו ( iii) zwitterionic כגון 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethlammonio] -1-propane, בחורים או בזיטרפרוניים. חומרי ניקוי חזקים עלולים לשבש את האינטראקציות והתסביכים. יתר על כן, עבור ניסויים immunoprecipitation, נוגדנים עשויים להיות רגישים לתנאים קשים. באופן דומה, ניתן להפריע לפעילות האנזימים בנוכחות חומרי ניקוי העשויים להתפתח או להעיק על החלבון הנלמד. הן סוג וכמות של חומרי הניקוי המשמשים עלול להשפיע על המאפיינים והפעילות של חלבון. עבור חלבונים מסוימים, מגוון מוגבל מאוד של ריכוז של חומרי ניקוי נסבל כדי לשמר את הפעילות של החלבון. מתחת לטווח זה החלבון נשאר בלתי מסיסים, בעוד שמעל טווח הריכוז הזה, החלבון כבר לא פעיל.
מעכבי פרוטאז יש להוסיף למאגר לפירוק כדי למנוע השפלה של חלבון היעד על ידי פרוטגני אנדוגני. קוקטיילים מעכבי פרוטאז הינם זמינים מסחרית. ניתן להשתמש בהם כנקודת התחלה של מחקר. אם נתקלים בצרות, אפשר לשקול את השימוש בתערובת של מעכבי המוכנים באופן זמני מפתרונות מניות המאוחסנים ב-20 ° c. מעכבי אלה חייבים למקד את סרין ואת ציסטאין הפרוטסייסים. PMSF (פנילמתיל פלולוניל) משמש בדרך כלל, אך הוא לא יציב מאוד בתמיסה מימית ויש להוסיף אותו ממש לפני החילוץ. מטאלופרוטסיס צריך גם להיות מעוכב: ריאגנטים מתכת כלטינג, כגון EDTA (Ethylenedinitrilotetraacetic חומצה) או EGTA (אתילן גליקול-bis (2-עמינח)-חומצה טטראצטט), אשר לאגד ל-Mg2 +, משמשים במטרה זו. כדי לשמור על חלבון שלהם זרחנת ובכך הפעיל טופס, זה גם מומלץ להוסיף מעכבי פוספספטאז למאגר לפירוק. מעכבי אלה חייבים לכוון בסיסי, חומצה, סרין, טראונין, ו טירופין פוספאטטיות. עבודה בטמפרטורה נמוכה (4 ° c) מומלצת גם כדי להאט את קצב הפרוטפוליזיס.
מטרה לחלבונים
בזאת, התמקדנו ב-אפירופה, חלבונים מתויגים. תגים (דגל, HA, cMyc, GFP, וכו ') הם שימושיים מאוד כדי לזהות ולטהר את החלבונים, כמו נוגדנים ונוגדן מצמידים חרוזים הם זמינים מסחרית הם חומרים לגנוזה בקלות. עם זאת, את הגודל ואת המיקום של התג צריך להיחשב כמו זה עשוי להשפיע על הפעילות, לוקליזציה או פונקציה של חלבון היעד6,7,8. ניתן גם לעבוד עם חלבונים אנדוגני. במקרה זה, יש להשתמש בנוגדנים המכוונים לחלבון מסוים זה. הם עשויים להיות מצמידים לחרוזים (חלבון A או חלבון G) ולרוב (חוצה קישור) או להיות מודבטים עם הליפוסט ולאחר מכן עם החרוזים. בעבודה עם חלבונים מתויגים, שהגן שלו מתבטא על פלסמיד, קל לעבור לגרסה מוטציה של חלבון זה על ידי מוטזיס של הגן. לאחר מכן ניתן לעבוד על מוטציות שונות כדי להעריך פונקציות ביולוגיות.
Immunoprecipitation
Immunoprecipitation היא טכניקה רבת עוצמה כדי לבודד את השותפים של חלבון היעד5. הרכב מאגר הליזה (בעיקר חומרי ניקוי) צריך להיות מבוסס בקפידה כדי לשמר את האינטראקציות (ראה לעיל). ניתן לזהות את האינטראקציה בין שני חלבונים מזוהים. זה יכול להיות חלבונים אנדוגני או חלבונים הביע יתר. כאשר חלבונים מבוטא בשפע נמוך, ייתכן שיהיה צורך לבטא אותם יתר על המטרה כדי לקבל אותות חזקים יותר. שוטף נרחב של חרוזים immunoprecipitated נדרשים כדי להסיר חלבונים אינטראקציה לא במיוחד או מזהמים. לפני קביעת היעילות immunoprecipitation או שיתוף immunoprecipitated נוכחות שותף, חשוב לבדוק כי השותפים השונים מבוטאים היטב ונוכחים בתוך הליפוסט על ידי ניתוח של התאים כולה או שבר הקלט של מערב מחוק. יתר על כן, באמצעות ניסויים immunoprecipitation, ניתן גם לזהות שותפים חדשים של חלבון היעד לבודד תסביכים חדשים. שותפים חדשים אלה עשויים להיות מזוהים על ידי ספקטרומטר מסה.
שותפים אלה עשויים למלא תפקיד חשוב כפעילות של חלבון היעד המאפשר פעילות מלאה לבדיקות ביולוגיות נוספות. מצד שני, חלבונים בלתי רצויים משותפים עשויים לשמש כטיעון כי אין אינטראקציה ישירה בין שני שותפים מזוהים, אך במקום זאת האינטראקציה המזוהה על ידי co-immunoprecipitation היא בשל שותף לא ידוע אחר. במקרה ספציפי זה, כדי להיות בטוח באינטראקציה ישירה, יש צורך במכשיר ניסיוני אחר, כגון עבודה על חלבונים מהיונקים המטוהרים מחיידקים.
פעילות קינאז
פעילות קינאז עשויה להיות מוערך על ידי טכניקות שונות. בזאת, התמקדנו בניתוח מבחנה על ידי γ [32P] שימוש בתוויות ATP ובניתוח לחילוץ התא כולו על-ידי אבן החשופה המערבית באמצעות נוגדן מסוים של פוספהו. γ [32P] התיוג של ATP הוא טכניקה מאוד רגישה וכמותית המאפשרת זיהוי של פעילות קינאז חלשה15. התאגדות רדיואקטיביות מ-ATP למצע היעד מאפשר מידה ישירה של פעילות אנזים להתבצע. ניתן לעבוד עם מצעים שונים כדי להעריך את הפעילות של קינאז של החלבון הנלמד על מטרות שונות. ניתן גם לזהות חומצות אמינו החיוניות לפעילות קינאז על ידי שינוי כאשר החלבון מתבטא מוגזם. פעילות קינאז דורשת קטיון דידיונטי כגון Mg2 +, שחייב להיות נוכח במאגר קינאז.
החיסרון העיקרי של גישה זו הוא טיפול ברדיואקטיביות, הדורשת מתקנים ייעודיים לניסויים ולאיסוף פסולת. שיטות אלטרנטיביות קיימות, כגון ערכות פלורסנט או מנורות אור המאתרות תוצרי לוואי של התגובה, כגון ADP (אדנוזין diphosphate)16. לעומת זאת, ניתן ללמוד גם את זרחון החלבון על ידי ספקטרומטר מסה, עם זאת, כמות גדולה יותר של חומרים נדרש עבור ניתוחים אלה. במקרה שלנו, ניסינו להעריך פעילות LIMK2 קינאז באמצעות אלקטרופורזה קפילר כדי להגביר את היעילות שלנו, אבל זה היה למרבה הצער לא הצליחו.
נוגדנים לזרחן הם כלי נוסף כדי ללמוד את זירחון של חלבון. כללי נגד פוספהו סרין ונוגדנים טירולי, מסוגלים לזהות פוספאו-זר או פוספהו-Tyrosine של חלבונים כלשהם. בשנים האחרונות, נוגדנים מיקוד אתר פוספאו מסוים של חלבון היעד פותחו באופן נרחב, בדרך כלל הם מזהים את קבוצת פוספהו ואת חומצות האמינו שמסביב. יש צורך בטיפול מיוחד כאשר מתחילים לעבוד עם נוגדנים כאלה, כמו הספציפיות שלהם יש לבדוק למשל עם שליטה שלילית, כגון חלבון היעד מוטציה באתר פוספהו. בעת בדיקת אבן חשופה עם נוגדן אנטי זרחן, הפתרון חוסם אסור להיות חלב, כמו זה מכיל פוספולירופנים שעשויים לתקשר עם הנוגדן. סרום של שור פרה (BSA) מומלץ, ומעכבי פוספספטאז ניתן להוסיף בפתרון חסימת כדי למנוע שחרור פוספט. אין להקפיא דגימות ולהפשפה, אלא להכין אותן כאילו הן מוכנות כ-80 ° c. . אכן, שינויי פוספלו הם לבנה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי La ligue דשנה סרטן, l ' האגודה נוירופיבאטוטוסס ורקלינגהאוזן, ואת מרכז העיר וואל דה לואר. תודות לAurélie קסון ולדבוראה קסס לגבי מידע מעמיק של כתבי היד ולקיירון היקמן-לואיס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for γ[32P] labeling |
| γ[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for γ[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for γ[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for γ[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
References
- Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
- Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
- Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
- Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
- Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
- Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
- Raykova, D., et al. Let There Be Light! Proteomes. 4, (2016).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
- Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
- Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
- Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
- Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
- Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
- Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).
